一種甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株及其應(yīng)用，其命名為A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)，微生物保藏號為：CCTCCNO.V201253。該毒株能在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，血凝滴度保持在1:512~1:1024，感染性滴度保持在7.0～8.5log10TCID50/ml，經(jīng)鑒定具有Ca、Ts表型和Att特性。該毒株可以作為母本株與流行株遺傳重配或采用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將其6個(gè)內(nèi)部基因與流行株2個(gè)表面蛋白基因進(jìn)行基因重配，獲得含流行株表面抗原的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，可應(yīng)用于制備Vero細(xì)胞流感減毒活疫苗或流感減毒活疫苗，也可用于流感滅活疫苗的生產(chǎn)。
【專利說明】—種甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種甲型流感病毒VeiX)細(xì)胞冷適應(yīng)株，并涉及以此適應(yīng)株作為母本毒株與其他流行毒株進(jìn)行重配，從而獲得含有流行株表面抗原的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，以作為制備Veix)細(xì)胞流感減毒活疫苗或流感減毒活疫苗以及流感滅活疫苗的毒種，屬于生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒屬于正粘病毒科，其病毒顆粒呈球形或絲狀，核衣殼呈螺旋對稱，病毒基因組為單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA，有包膜。根據(jù)病毒核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)的抗原性，可將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型和乙型流感病毒的基因含有8個(gè)RNA片段，丙型流感病毒的基因含有7個(gè)片段；甲型流感病毒又可根據(jù)流感病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性不同，再分為若干亞型。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，乙型流感呈局部爆發(fā)，丙型流感主要是以散發(fā)形式出現(xiàn)。其中甲型和乙型流感病毒與人類有密切聯(lián)系，甲型流感病毒除感染人外，還可感染飛禽、豬、馬等動物。而人在生活中與這些動物接觸頻繁，為流感病毒產(chǎn)生變異提供有利條件，變異后的病毒會導(dǎo)致流感流行，變異程度大則導(dǎo)致大流行。
[0003]流感病毒表面抗原的變異是流感流行的主要原因，其表面抗原的變異存在兩種機(jī)制:一種被稱為抗原漂移，另一種變異被稱為抗原大變異?？乖圃诩仔土鞲胁《竞鸵倚土鞲胁《旧隙紩l(fā)生，主要是通過在HA和NA基因上的點(diǎn)突變和多種氨基酸選擇性突變，來逃過機(jī)體的免疫作用和以前感染病毒后獲得的抗體對病毒的抑制作用，抗原漂移會產(chǎn)生新的流行株，同時(shí)也是流感病毒能感染人類，并繼續(xù)進(jìn)化的原因?？乖笞儺悆H發(fā)生在甲型流感病毒上，當(dāng)宿主細(xì)胞同時(shí)被兩種不同亞型的甲型流感病毒感染時(shí)，新生的子代病毒可獲得來自兩個(gè)親代病毒的基因片斷，成為基因重配病毒?；蛑嘏洚a(chǎn)生甲型流感病毒抗原性突變株，如果該突變株在未接種免疫疫苗的易感人群中傳播，就會引起流感大流行。
[0004]在人群中廣泛流行的甲型流感病毒有H1N1, H2N2和H3N2三個(gè)亞型。甲型流感病毒的16種HA和9種NA組成的亞型也廣泛存在于一些野生動物,如水鳥中。如果病毒沒有經(jīng)過遺傳重配，禽流感亞型一般不對人產(chǎn)生有效的感染，但這種迅速擴(kuò)散的病毒由于經(jīng)常性的基因再分化，可能感染人類。例如，自從1997年香港爆發(fā)禽流感以來，H5N1亞型經(jīng)過遺傳修飾，除了導(dǎo)致在禽類中大規(guī)模爆發(fā)，還產(chǎn)生了多例人感染的事件。2003年發(fā)現(xiàn)了該病毒株的變異，出現(xiàn)了可以感染人的新變異株。據(jù)法新社的數(shù)據(jù)，H5N1禽流感病毒2003年至2011年間在全球共計(jì)致死超過300人，導(dǎo)致大約4億只家禽遭撲殺，造成大約200億美元損失。
[0005] 接種流感疫苗是預(yù)防和降低流感嚴(yán)重程度的最有效手段，包括滅活疫苗和減毒活疫苗。1941年雞胚制備的流感滅活疫苗在美國首次獲得批準(zhǔn)，在全世界得到廣泛應(yīng)用。目前使用的主要是用雞胚制備的滅活流感三聯(lián)裂解疫苗，包括甲型流感病毒H1N1株、H3N2株和乙型流感病毒毒株。疫苗株的組分是由WHO根據(jù)每年全球流感病毒的變化規(guī)律推薦的，用于下一年度疫苗生產(chǎn)用流感病毒流行株的表面抗原來確定的。甲型流感病毒聯(lián)合體實(shí)驗(yàn)室利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，采用雞胚高產(chǎn)株的六個(gè)內(nèi)部基因與野生流行株的HA和NA基因重配(6+2重配)得到的，含有流感病毒流行株的HA和NA表面糖蛋白的新疫苗株，具有在雞胚上高產(chǎn)的特性。
[0006]流感減毒活疫苗因具備滴鼻途徑接種，提供粘膜免疫和細(xì)胞免疫，且免疫保護(hù)更持久等特點(diǎn)而優(yōu)于滅活疫苗。目前只有美國和俄羅斯生產(chǎn)流感減毒活疫苗，其疫苗種子批均來源于雞胚高產(chǎn)的流感病毒冷適應(yīng)株，在美國為A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)和B/AnnArbor/1/66，在俄羅斯為 A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)和 B/USSR/60/69。但是，以雞胚作為培養(yǎng)基質(zhì)存在以下不足:(I)因潛在污染可能造成雞傳染病因接種疫苗而波散；(2)因連續(xù)傳代常發(fā)生變異，造成疫苗與人群中流行毒株不匹配，使疫苗效力降低；(3)因培養(yǎng)周期過長，難于大規(guī)模生產(chǎn)出能滿足流感大流行突發(fā)性需求；(4)純化過程復(fù)雜；(5)易引起過敏反應(yīng)。尤其是2003年以來全世界范圍內(nèi)高致病性禽流感的流行，使采用雞胚生產(chǎn)流感病毒疫苗風(fēng)險(xiǎn)性增加。因此，研究出安全有效的疫苗，已成為流感疫苗重要研究方向，尤其要應(yīng)對流感大流行時(shí)不受雞胚來源限制，世界衛(wèi)生組織建議用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒來替代雞胚制備流感疫苗。
[0007] 目前，用于制備流感疫苗的哺乳動物細(xì)胞主要是狗腎細(xì)胞(MDCK)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)。雖然MDCK細(xì)胞是培養(yǎng)和分離流感病毒較好的哺乳動物細(xì)胞系，但其存在潛在的致瘤性，使得其應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)顧慮重重。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)是世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)的可用于人用疫苗生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，其遺傳背景較為清楚，無潛在的致瘤性，安全可靠，且能利用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，短期內(nèi)供給量大。目前VeiO細(xì)胞已廣泛用于狂犬、乙腦、脊髓灰質(zhì)炎、腎綜合征出血熱等疫苗的生產(chǎn)。但是，Vero細(xì)胞并不是流感病毒的敏感培養(yǎng)基質(zhì)，產(chǎn)量較低且多數(shù)病毒不能在VeiO細(xì)胞上連續(xù)增殖。我們研究VeiO細(xì)胞流感多年，現(xiàn)已成功篩選出一株甲型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，可以使機(jī)體產(chǎn)生相對較強(qiáng)的體液免疫效應(yīng)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，如何進(jìn)一步選育出流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，使其能夠在25°C也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)，成為了 Vero細(xì)胞流感減毒活疫苗研發(fā)的難題。
[0008]反向遺傳學(xué)，相對于經(jīng)典遺傳學(xué)而言，是在獲得生物體基因組全部序列的基礎(chǔ)上，通過對靶基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點(diǎn)突變、基因插入/缺失及基因置換等，再按組成順序構(gòu)建含生物體必需元件的修飾基因組，讓其裝配出具有生命活性的個(gè)體，研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能，以及這些修飾可能對生物體的表型、性狀有何種影響等方面的內(nèi)容。目前反向遺傳學(xué)已應(yīng)用于流感病毒跨種屬傳播機(jī)制、病毒毒力及其致病性研究和疫苗研發(fā)。應(yīng)用于疫苗研發(fā)，即6+2重配，例如將雞胚高產(chǎn)株的六個(gè)內(nèi)部基因(PB2、PB1、PA、NP、Μ、NS)和當(dāng)前流行毒株的HA和NA加以重配，獲得流行株的雞胚高產(chǎn)株，用以生產(chǎn)疫苗。相對于傳統(tǒng)流感疫苗研制方法耗時(shí)繁瑣，并且要求足夠的雞胚供應(yīng)，反向遺傳學(xué)可以使疫苗的研制周期縮短、工藝簡化。因此反向遺傳學(xué)是應(yīng)對流感大流行的一個(gè)重要手段。
[0009]綜上所述，流感仍是人類尚不能有效控制的世界性傳染病，接種流感疫苗是預(yù)防流感的主要手段，流感疫苗中減毒活疫苗又優(yōu)于滅活疫苗。目前使用雞胚作為制備流感疫苗的基質(zhì)，存在很多不足之處，而使用非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)制備流感疫苗已成為流感疫苗發(fā)展的重要方向。如何選育出流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，使其不僅在33°C而且在25°C也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)，成為了 Veix)細(xì)胞流感減毒活疫苗研發(fā)的難題。因?yàn)橥ǔＧ闆r下，25°C是Veix)細(xì)胞維持正常生長的最低溫度，在這個(gè)溫度下，細(xì)胞的代謝都趨于緩慢，因此會影響流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，而流感病毒的復(fù)制是需要細(xì)胞提供支持的。
[0010]目前所用的流感疫苗生產(chǎn)毒種都是與雞胚高產(chǎn)株重配或天然的雞配適應(yīng)株，其一般在Vero細(xì)胞上不敏感。國內(nèi)和國外有廠家直接將WHO提供的流感疫苗生產(chǎn)毒種接種Vero細(xì)胞產(chǎn)毒量低或產(chǎn)量不穩(wěn)定，制約了利用Vero細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒制備流感疫苗的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的甲型流感病毒VeiX)細(xì)胞冷適應(yīng)株，且在Vero細(xì)胞上25°C可連續(xù)傳代并保持穩(wěn)定高產(chǎn)，該甲型流感病毒Veix)細(xì)胞冷適應(yīng)株具有G、7?表型和特性。
[0012]本發(fā)明提供的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，命名為A/Yunnan/l/2005Vca(H3N2),其保藏號為:CCTCC N0.V201253，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為:武漢市，武漢大學(xué)；保藏時(shí)間為:2012年12月20日。
[0013]本發(fā)明的目的之二是提供所述甲型流感病毒VeiO細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的制備方法。
[0014]本發(fā)明提供的保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)通過下列方法獲得:
A.在24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的血凝滴度達(dá)到1:1024的甲型流感病毒 A/kunming/l/2005Va (H3N2)；
B.在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬U/ml，谷氨酰胺溶液
0.3 - 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 - 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，30 ± I °C條件下，培養(yǎng)步驟A的甲型流感病毒72小時(shí)后，收獲病毒液；
C.將步驟B收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再接種到24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟B和C，如此在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳20代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:1024，得傳代甲型流感病毒；
D.在24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟C的傳代甲型流感病毒；
E.在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬U/ml，谷氨酰胺溶液
0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，25±1°C條件下，培養(yǎng)步驟D的傳代甲型流感病毒120-168小時(shí)后，收獲病毒液；
F.將步驟E收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再接種到24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟E和F，如此在VeiO細(xì)胞上連續(xù)傳72代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:1024，得甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株。
[0015]所述步驟A的甲型流感病毒A/kunming/l/2005Va (H3N2)為現(xiàn)有的甲型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，其保藏號為=CCTCC N0.V200514，專利號為ZL 2009 I 0094223.8。
[0016]本發(fā)明提供的保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Vca ( H3N2)的基本特征:(a)透射電鏡觀察到所得的流感病毒直徑約為80-120nm,具有囊膜的較為典型的流感病毒形態(tài)；(b)基因序列分析表明在連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，不易產(chǎn)生流感病毒基因變異；(c)流感病毒在25°C Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，血凝滴度可保持在1:1024 ;(d)HI實(shí)驗(yàn)表明病毒的HA抗原可被羊抗或其它動物抗H3亞型流感病毒高免血清特異性識別；(e) A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)活病毒經(jīng)自然途徑感染SPF雞后，感染雞無發(fā)病和死亡。
[0017]本發(fā)明的目的之三是提供保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的應(yīng)用，即以甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株作為母本株與其他流行毒株進(jìn)行重配，從而獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，具體通過以下兩種方法實(shí)現(xiàn):
第一種方法:用常規(guī)的重配技術(shù)獲得流感病毒流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株:
Al.以1:100-100:1的體積比，將保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)與其他亞型流感病毒混合，得混合病毒，具體比例由病毒血凝滴度和不同毒株生長性而定；
A2.在9-10日齡SPF雞胚上，按每胚接種0.1-0.3ml的量，接種步驟Al的混合病毒，于33±1°C孵育12-48小時(shí)，2-8°C過夜冷胚，收集雞胚尿囊液，得病毒液；
或者在新鮮的Vero細(xì)胞上，按0.004-0.008ml/cm2Vero細(xì)胞的量，接種步驟Al的混合病毒，置于33±1°C培養(yǎng)48-72小時(shí),得病毒液；
或者在新鮮的MDCK細(xì)胞上，按0.004-0.008ml/cm2MDCK細(xì)胞的量，接種步驟Al的混合病毒，置于33±1°C培養(yǎng)48-72小時(shí),得病毒液；
A3.將步驟A2的病毒液中加入抗A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的抗血清至抗血清濃度為1_80%(體積比)，具體濃度視抗體效價(jià)為1:10240 - 1:2560而定，并在Vero細(xì)胞上25°C傳代篩選，從而選育出流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株；
第二種方法:用現(xiàn)有的反向遺傳學(xué)技術(shù)重配獲得流感病毒流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)
株:
B1.將保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的6個(gè)內(nèi)部基因，即PB2、PB1、PA、NP、M、NS，分別克隆于雙向轉(zhuǎn)錄載體pHW2000上或其它雙向轉(zhuǎn)錄載體上，得克隆的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株6個(gè)內(nèi)部基因質(zhì)粒；將流行株的2個(gè)表面蛋白基因HA和NA，也克隆于此雙向轉(zhuǎn)錄載體上，得流行株2個(gè)表面蛋白基因質(zhì)粒；
B2.將步驟BI所得克隆的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株6個(gè)內(nèi)部基因質(zhì)粒與流行株2個(gè)表面蛋白基因質(zhì)?；旌虾?，共轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞297T、Cosl、Vero或MDCK細(xì)胞上，37 ± I °C培養(yǎng)48-72小時(shí)，收獲細(xì)胞液；
B3.在9-10日齡SPF雞胚上，按每胚接種0.1-0.2ml的量，接種步驟B2的收獲細(xì)胞液，25±1°C培養(yǎng)96-120小時(shí)，收獲病毒液，即獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株；
或者在24小時(shí)長成致密單層的MDCK細(xì)胞上，按0.04-0.08ml /cm2MDCK細(xì)胞的量，接種步驟B2的收獲細(xì)胞液，置于25± 1°C培養(yǎng)120-168小時(shí)，收獲病毒液，即獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株；
或者在24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，按0.04-0.08ml/cm2Vero細(xì)胞的量，接種步驟B2的收獲細(xì)胞液，置于25± 1°C培養(yǎng)120-168小時(shí)，收獲病毒液，即獲得流行株的Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株。
[0018]本發(fā)明的難點(diǎn)在于:
(!)甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株在25°C培養(yǎng)時(shí)也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)。[0019](2)對甲型流感病毒A/Yunnan/1/2005 Vca (H3N2)在Vero細(xì)胞上的種毒培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。
[0020](3)甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株在雞胚25°C培養(yǎng)時(shí)也能大量復(fù)制且連續(xù)高產(chǎn)，同時(shí)具有減毒特征。
[0021](4)如何應(yīng)用甲型流感病毒A/Yunnan/1/2005 Vca (H3N2)與其他病毒株遺傳和反向遺傳學(xué)重配，進(jìn)而獲得Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株進(jìn)行了研究。
[0022]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果:
(I)本發(fā)明提供的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，可采用微載體發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)Vero細(xì)胞和流感病毒，以制備流感減毒活疫苗和大流行流感疫苗。較現(xiàn)有的以雞胚作為培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)出的流感疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn):
①可以采用微載體發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)Vero細(xì)胞和流感病毒，生產(chǎn)工藝易于標(biāo)準(zhǔn)化②采用標(biāo)準(zhǔn)化的Veix)細(xì)胞，不含外源生物因子污染；③不含易于引起人體過敏的雞胚蛋白；④
避免了流感病毒在雞胚培養(yǎng)后病毒的血凝素抗原易產(chǎn)生變化使疫苗效力降低；⑤在流感
大流行突發(fā)性時(shí)，不受雞胚來源的影響，能夠生產(chǎn)出足夠的疫苗滿足需求。
[0023](2)本發(fā)明在保藏號為CCTCC N0.V200514的甲型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株A/kunming/1/2005Va (H3N2)基礎(chǔ)上，采用連續(xù)梯度降溫法，連續(xù)傳72代，成功選育出保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/1/2005Vca (H3N2),其能在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，血凝滴度保持在1:512 — 1:1024，感染性滴度保持在
7.0 - 8.51og10TCID50/ml，經(jīng)鑒定具有ca、Ts表型和ATT特性。將其作為母株與流行株流感病毒重配，可獲得Vero細(xì)胞甲型流感病毒疫苗生產(chǎn)用毒種，大大促進(jìn)了 Vero細(xì)胞流感減毒活疫苗和VeRo細(xì)胞大流行流感疫苗的開發(fā)與生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為A/Yunnan/l/2005Va (H3N2)在30°C的連續(xù)傳代血凝效價(jià)圖。
[0025]圖2為A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)在25°C連續(xù)傳代血凝效價(jià)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
[0027]實(shí)施例1
保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的制備方法:
1.在24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的血凝滴度達(dá)到1:1024的保藏號為 CCTCC N0.V200514 的甲型流感病毒 A/kunming/l/2005Va (H3N2)；
2.在維持母液成分為MEM,青霉素-鏈霉素2萬U/ml,谷氨酰胺溶液0.6mg/ml,牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml, pH7.2，30± 1°C條件下，培養(yǎng)步驟I的甲型流感病毒72小時(shí)后,收獲病毒液；3.將步驟2收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再接種到24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟2和3，如此在VeiO細(xì)胞上連續(xù)傳20代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:1024，得傳代甲型流感病毒；
4.在24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI步驟3的傳代甲型流感病毒；
5.在維持母液成分為MEM,青霉素-鏈霉素2萬U/ml,谷氨酰胺溶液0.6mg/ml,牛血清白蛋白lmg/ml，TPCK-胰酶濃度1.0ug/ml, pH7.2，25± I°C條件下，培養(yǎng)步驟4的傳代甲型流感病毒72小時(shí)后,收獲病毒液；
6.將步驟5收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再接種到24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟5和6，如此在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳72代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:1024，得保藏號為CCTCC N0.V201253的甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，命名為A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)。
[0028]該甲型流感病毒A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖1 一圖2和表I 一表2，證明此毒株具有在Vero細(xì)胞上25°C培養(yǎng)時(shí)高效穩(wěn)定增殖的特性。
[0029]表1，溫度降低過程中的流感病毒病變時(shí)間
【權(quán)利要求】
1.一種甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株，命名為A/Yunnan/l/2005Vca (H3N2)，該毒株的微生物保藏號為:CCTCC N0.V201253。
2.如權(quán)利要求1所述甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株在制備流行株的Vero細(xì)胞適應(yīng)株中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株在制備流感疫苗中的應(yīng)用。
4.一種甲型流感病毒VeiO細(xì)胞冷適應(yīng)株的制備方法，其特征在于經(jīng)過以下步驟: A.在24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種IMOI的血凝滴度達(dá)到1:1024的甲型流感病毒 A/kunming/l/2005Va (H3N2)； B.在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 - 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml, TPCK-胰酶濃度 0.5 - 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，30 ± I °C條件下，培養(yǎng)步驟A的甲型流感病毒72小時(shí)后，收獲病毒液； C.將步驟B收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，再接種到24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟B和C，如此在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳20代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:1024，得傳代甲型流感病毒； D.在24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，接種 IMOI步驟C的傳代甲型流感病毒； E.在維持母液成分為MEM或DMEM/F12，青霉素-鏈霉素2萬U/ml，谷氨酰胺溶液0.3 — 0.6mg/ml，牛血清白蛋白 lmg/ml，TPCK-胰酶濃度 0.5 — 1.5ug/ml, ρΗ7.0 — 7.2，25±1°C條件下，培養(yǎng)步驟D的傳代甲型流感病毒120 - 168小時(shí)后，收獲病毒液； F.將步驟E收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，接種到24小時(shí)長成致密單層的Vero細(xì)胞上，再重復(fù)步驟E和F，如此在VeiO細(xì)胞上連續(xù)傳72代，并維持種毒細(xì)胞收獲液的血凝滴度在1:1024，得甲型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟A的甲型流感病毒A/kunming/l/2005Va (H3N2)為現(xiàn)有的甲型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，其保藏號為:CCTCC N0.V200514。
【文檔編號】C12R1/93GK103898066SQ201410039468
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】廖國陽, 李衛(wèi)東, 楊景暉, 周芳燁, 馬磊, 周健, 蔡瑋, 寸怡娜, 高菁霞, 張新文, 戴宗祥, 姜述德 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所