一種基于數(shù)字pcr平臺(tái)檢測基因缺失突變的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體為檢測基因缺失突變的方法和試劑盒；以數(shù)字PCR為平臺(tái)，在反應(yīng)體系中加入與野生型非突變模板序列互補(bǔ)的PNA探針，利用PNA探針的阻遏作用，使得只有發(fā)生了缺失突變的樣本才能被擴(kuò)增；并且利用TaqMan探針作為熒光定量標(biāo)記，根據(jù)熒光檢測判斷樣品中是否存在突變的模板及其數(shù)量和比例。
【專利說明】—種基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的方法和試劑盒
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和核酸檢測領(lǐng)域，具體為檢測基因缺失突變的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]缺失突變是基因變異中常見的類型，會(huì)給微生物、植動(dòng)物的生物性狀和人類的生理性狀帶來很多變化；包括蛋白質(zhì)功能的部分或全部失活，形成無活性的片段等，也有可能改變生物體的基因調(diào)控等其他功能?；蛲蛔兊难芯繉ι锏倪z傳、進(jìn)化和改造具有重要意義。
[0003]目前基因變異的檢測技術(shù)主要有直接測序法(亦稱Sanger測序法)和ARMS法?，F(xiàn)分別簡介于下:
[0004]Sanger測序法，即Sanger(桑格)雙脫氧鏈終止法是Frederick Sanger于1975年發(fā)明的。測序過程需要先做一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR過程中，雙脫氧核糖核苷酸可能隨機(jī)的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個(gè)氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個(gè)DNA鏈就不能繼續(xù)增加長度。最終的結(jié)果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進(jìn)的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進(jìn)行不同熒光標(biāo)記。將PCR反應(yīng)獲得的總DNA通過毛細(xì)管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光。由于ddATP，ddGTP, ddCTP, ddTTP (4種雙脫氧核糖核苷酸)熒光標(biāo)記不同，計(jì)算機(jī)可以自動(dòng)根據(jù)顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個(gè)。直接測序法耗時(shí)長且靈敏度低，僅能檢出突變比例在10%~20%以上的突變。
[0005]ARMS 法也稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)、等位基因特性PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)等，即等位基因特異性擴(kuò)增法(Allele Specific Amplif ication, ASA)建立于 1989 年,是 PCR 技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展。
[0006]ARMS法主要用于對已知突變基因進(jìn)行檢測。首先設(shè)計(jì)兩個(gè)5’端引物，該引物的3’末端設(shè)計(jì)為一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)。對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3’端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，只有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于上游引物的3’端，則引物與模板DNA不配對，導(dǎo)致PCR不能延伸，因此這種方法稱為ARMS，可選擇性地?cái)U(kuò)增野生型或突變型基因。
[0007]上述現(xiàn)有技術(shù)存在以下問題:
[0008]1.均為定性檢測，也就是說只能給出基因變異是否存在的結(jié)論。但無法測定攜帶基因變異的DNA量的比例，也就是說，無法進(jìn)行定量分析檢測，或者定量分析誤差較大。
[0009]2.均給出模擬圖結(jié)果，需要人工進(jìn)行判讀，判讀方面相對比較主觀。無法直接得到數(shù)字化的客觀結(jié)果。
[0010]3.靈敏度比較差，目前方法的靈敏最好為1%，無法滿足某些高靈敏度的檢測需求。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的試劑盒及方法。
[0012]肽核酸(P印tide Nucleic Acid, PNA)是一類以中性酰胺鍵(假肽鍵)代替DNA中的糖-磷酸二酯鍵作為骨架的脫氧核糖核酸類似物，保留其中的堿基部位。PNA的特殊結(jié)構(gòu)，使之可以不被蛋白酶或者核酸酶降解，有很高的穩(wěn)定性，是一種非離子、非手性、不易被水解和酶切的分子。
[0013]PNA與DNA模板結(jié)合能力高于普通寡核苷酸，可作為阻遏物置于引物前面，并與PCR引物部分重合；若PNA與模板正確配對時(shí)可阻止聚合酶鏈反應(yīng)，野生型模板無法擴(kuò)增；若發(fā)生錯(cuò)配(例如模板為發(fā)生突變的DNA)，則結(jié)合能力迅速下降，失去阻遏作用。此時(shí)可用來擴(kuò)增突變模板。
[0014]數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量方法，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)，主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于I個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
[0015]本發(fā)明以數(shù)字PCR為平臺(tái)，在反應(yīng)體系中加入與野生型非突變模板序列互補(bǔ)的PNA探針，利用PNA探針的阻遏作用，使得只有發(fā)生了缺失突變的樣本才能被擴(kuò)增；并且利用TaqMan探針作為熒光定量標(biāo)記，根據(jù)熒光檢測判斷樣品中是否存在突變的模板。
[0016]本發(fā)明是一種高靈敏度的檢測基因缺失突變的方法，步驟包括:
[0017]1.制備數(shù)字PCR混合液:含有待檢測基因DNA模板的樣品、正向和反向檢測PCR擴(kuò)增引物、標(biāo)記TaqMan探針、PNA探針、正向和反向質(zhì)控PCR引物、質(zhì)控TaqMan探針以及PCR預(yù)混液混合，制備得到數(shù)字PCR混合液；
[0018]所述的正向和反向檢測PCR擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增含有缺失突變的基因；所述的標(biāo)記TaqMan探針與突變位點(diǎn)下游DNA模板結(jié)合；
[0019]所述的質(zhì)控PCR弓丨物用于擴(kuò)增待檢測的DNA模板上的保守序列；質(zhì)控TaqMan探針與質(zhì)控PCR引物所擴(kuò)增的序列結(jié)合；
[0020]標(biāo)記TaqMan和質(zhì)控TaqMan探針是連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的核苷酸，兩者的熒光基團(tuán)類型不同；
[0021]優(yōu)選的，熒光基團(tuán)選自6-羧基熒光素(FAM)、六氯-6-羧基熒光素(HEX)、Cy5 (美國 Life Techno1gies)>Cy3 (美國 Life Techno1gies)>VIC (美國 Life Technologies),熒光猝滅基團(tuán)選自6-羧基四甲基若丹明(TAMARA)、BHQl (美國Life Technologies),BHQ2(美國 Life Technologies)或 MGB (美國 Life Technologies)。
[0022]PNA探針與野生型未突變的DNA互補(bǔ)。
[0023]2.數(shù)字PCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；優(yōu)選的，數(shù)字PCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴的方法為:將數(shù)字PCR混合液加入微滴發(fā)生器，生成10000~20000個(gè)微反應(yīng)液滴。
[0024]3.收集信號并進(jìn)行結(jié)果判斷:對PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行信號收集，根據(jù)熒光信號的類型判斷則待測樣品中是否含有發(fā)生基因缺失突變的DNA模板，還可確定其中發(fā)生基因缺失突變的DNA模板的數(shù)量和含量。[0025]可用QuantaSoft (Biorad)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)算樣品中發(fā)生突變的拷貝數(shù)和含量，確定突變DNA樣本的比例。
[0026]由于質(zhì)控PCR引物的作用，PCR微反應(yīng)液滴中只要含有樣品DNA模板，不論是否發(fā)生缺失突變，都會(huì)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，并且結(jié)合了質(zhì)控TaqMan探針，因此會(huì)有熒光信號。發(fā)生了缺失突變的DNA模板，加入檢測PCR擴(kuò)增引物后，還結(jié)合了標(biāo)記TaqMan探針。質(zhì)控與標(biāo)記TaqMan探針的熒光基團(tuán)類型不同，因此根據(jù)不同的熒光信號可以分辨出樣品中是否含有發(fā)生了基因缺失突變的DNA模板。再根據(jù)發(fā)生了突變的熒光信號數(shù)量以及總的熒光信號數(shù)量，可確定基因缺失突變的DNA模板含量，進(jìn)行定量分析。
[0027]通過上述方法，可以檢測位于基因特定范圍內(nèi)的缺失突變。
[0028]本發(fā)明將PNA探針用于基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變以及制備基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的試劑盒，這種PNA探針與待檢測的基因發(fā)生突變的野生型DNA模板互補(bǔ)。。
[0029]本發(fā)明還將標(biāo)記TaqMan探針用于基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變以及制備基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的試劑盒，這種標(biāo)記TaqMan探針與突變位點(diǎn)下游DNA模板結(jié)合。
[0030]一種基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的試劑盒，含有以下物質(zhì)中的至少一種:
[0031](I)與未發(fā)生突變的野生型DNA模板互補(bǔ)的PNA探針；
[0032](2)與突變位點(diǎn)下游DNA模板結(jié)合的標(biāo)記TaqMan探針；
[0033](3)用于擴(kuò)增待檢測基因的正向和反向檢測PCR擴(kuò)增引物；
[0034](4)用于擴(kuò)增待測基因所在DNA模板上保守序列的正向和反向質(zhì)控PCR引物；
[0035](5)與待測基因所在DNA模板上保守序列結(jié)合的質(zhì)控TaqMan探針。
[0036]這種試劑盒可以用來檢測基因組特定范圍內(nèi)的缺失突變，既可以進(jìn)行定性分析，靈敏度可達(dá)1/2500，又可以進(jìn)行定量分析，即使在突變樣本含量極低，也具有很高的檢測精度。
[0037]與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0038]1.結(jié)果判讀方式:以前的技術(shù)方法結(jié)果的判讀需要人工參與，肉眼依據(jù)相關(guān)圖形作出最后的判斷，這種判讀的方式嚴(yán)重依賴經(jīng)驗(yàn)，速度慢且很容易產(chǎn)生假陽性和假陰性的判讀結(jié)果。我們的技術(shù)方式給出的是數(shù)據(jù)信息，可以借助軟件完全自動(dòng)化的進(jìn)行結(jié)果判讀，從而加快了數(shù)據(jù)分析的速度，也減少了產(chǎn)生假陰性和假陽性判讀的可能。
[0039]2.結(jié)果描述的方式:以前的技術(shù)方式對基因變異的描述是定性的方式，也就是說，只是描述某個(gè)特異的基因變異是否存在于檢測樣本。本技術(shù)方法對基因變異的描述是絕對定量的方式，可以給出樣本所攜 帶某種特異基因變異DNA的絕對數(shù)量和比例。而且，即使在突變樣本含量極低的情況下，定量分析的誤差也很小。
[0040]3.檢測靈敏度(數(shù)值越小靈敏度越好):以前技術(shù)方法的靈敏度一般在I % — 50%之間，而我們提出的技術(shù)方法對基因變異的檢測靈敏度提升非常明顯，為1/2500?？梢栽诜浅８弑尘暗囊吧鶧NA中檢測出極其微量的攜帶基因變異的DNA。
【專利附圖】

【附圖說明】[0041]圖1為實(shí)施例1中，不同含量突變樣本的熒光檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042]實(shí)施例1
[0043](I)準(zhǔn)備待測DNA樣品:含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外顯子19缺失的突變陽性DNA與野生型DNA混合的樣本(其中突變體與野生型的含量比分別為1/1、1/100、1/1000、1/2500)。DNA來源可以是血清、血漿、外周血、口腔黏膜、胸腔積液、體液或者組織等。突變DNA來源于攜帶EGFR19突變的陽性細(xì)胞系。其中EGFR19外顯子上c.2238 —c.2255位缺失突變。
[0044](2)室溫融解用于檢測EGFR外顯子19缺失的正向和反向檢測PCR擴(kuò)增引物及對應(yīng)的標(biāo)記TaqMan探針和PNA探針，以及正向和反向的質(zhì)控PCR引物和質(zhì)控TaqMan探針。
[0045]正向和反向PCR擴(kuò)增弓丨物的序列為:
[0046]Fl: 5，-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3，
[0047]Rl:5，-ATGGACCCCCACACAGCA-3，
[0048]標(biāo)記TaqMan探針的序列包括熒光基團(tuán)、核苷酸部分及猝滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別為FA M和MGB，核苷酸部分如SEQ ID N0.11所示，為:Pl: 5’ -ACTCACATCGAGGATTTCC-3’。
[0049]PNA 的序列如 SEQ ID N0.16 所示，PNAl: 5’ -GAATTAAGAGAAGCA-3’ ；
[0050]質(zhì)控PCR引物用于擴(kuò)增EGFR外顯子2，正向和反向質(zhì)控PCR引物的序列為:
[0051 ] CF2:5，-GCCAAGGCACGAGTAACAAGC-3 ’
[0052]CR2:5， -CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT-3，
[0053]質(zhì)控TaqMan探針的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分別為VIC和MGB，核苷酸部分如SEQ IDN0.26所示,質(zhì)控TaqMan探針為:
[0054]CP2:VIC-ACGCAGTTGGGCACTT - MGB。
[0055](3)按照以下配比制備PCR反應(yīng)液:2X數(shù)字PCR預(yù)混液(Biorad，#186-3022)與檢測PCR擴(kuò)增引物和質(zhì)控PCR引物(600nM)、標(biāo)記和質(zhì)控TaqMan探針(300nM)以及PNA探針(300nM)與待檢測DNA (IOng)配制成數(shù)字PCR混合液，用雙蒸水補(bǔ)足至終體積為20 μ L。配制的數(shù)字PCR混合液中，正向和反向檢測PCR擴(kuò)增引物含量分別為600ηΜ，標(biāo)記TaqMan探針含量為300nM，PNA探針含量300ηΜ，正向和反向質(zhì)控PCR引物含量分別為600ηΜ，質(zhì)控TaqMan探針含量為300ηΜ。
[0056](4)配制好的20 μ L數(shù)字PCR混合液加入到8_道的液滴制作板內(nèi)，然后加入60 μ L液滴制作油到制作板，再放入QX200微滴發(fā)生器中，用于制備PCR微反應(yīng)液滴。
[0057](5)將制備好的PCR微反應(yīng)液滴轉(zhuǎn)移至96孔反應(yīng)板，并用封板膜進(jìn)行熱封，生成的微反應(yīng)液滴數(shù)量為10000~20000個(gè)。
[0058](6)將96孔PCR板放入PCR儀按照下面條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng):
[0059]94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，10°C終止反應(yīng)。
[0060](7)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后將PCR反應(yīng)板放置于PCR微反應(yīng)液滴信號讀取儀(QX200微滴熒光信號收集系統(tǒng))中進(jìn)行信號收集，結(jié)果如圖1。用QuantaSoft (Biorad)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出樣本中突變DNA的絕對含量以及相對全部DNA的比例。
[0061]含有突變型DNA模板的微反應(yīng)液滴中，同時(shí)出現(xiàn)FAM和VIC熒光信號，記為一個(gè)信號數(shù)；含未發(fā)生突變的野生型DNA模板的微反應(yīng)液滴中，僅出現(xiàn)VIC熒光信號。通過上述步驟檢測，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變。
[0062]定量檢測結(jié)果，突變型DNA模板含量不同的樣本中，突變陽性信號數(shù)(即FAM信號數(shù))與總信號數(shù)即總微反應(yīng)液滴的數(shù)量比例如下:
[0063]1/1樣品6477/13028計(jì)算值突變/野生=0.989/1，誤差1.2%
[0064]1/100樣品186/18700計(jì)算值突變/野生=0.01/1，誤差0.2%
[0065]1/1000 樣品 23/19854 計(jì)算值突變 / 野生=0.00116/1，誤差 16%
[0066]1/2500 樣品 11/19928 計(jì)算值突變 / 野生=0.00055/1，誤差 37%
[0067]突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時(shí)，定量檢測誤差低于2%。
[0068]選用以下各組之一的正向和反向PCR引物時(shí)，按上述步驟檢測，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變:
[0069](I)正向 F2:5，-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3 ’
[0070]反向R2:5，-GGACCCCCACACAGCAAA-3 ’
[0071 ] (2 )正向 F3:5，-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3 ’
[0072]反向R3:5 ’ -ACCCCCACACAGCAAAGC-3，
[0073](3 )正向 F4:5，-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3 ’
[0074]反向R4:5 ’ -CCCCACACAGCAAAGCAG-3 ’
[0075](4 )正向 F5:5，-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3 ’
[0076]反向R5:5，-CCACACAGCAAAGCAGAA-3 ’。
[0077]改用以下序列之一的PNA探針時(shí)(SEQ ID N0.17~20)，按上述步驟檢測，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變:
[0078](I) PNA2:5 ’ -ATTAAGAGAAGCAAC-3 ’
[0079](2 ) PNA3:5 ’ -TAAGAGAAGCAACAT-3 ’
[0080](3 ) PNA4:5，-AGAGAAGCAACATCT-3，
[0081 ] (4) PNA5:5’ -AGAAGCAACATCTCC-3’。
[0082]當(dāng)標(biāo)記TaqMan探針的核苷酸部分改用以下序列之一時(shí)，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出突變:
[0083](I)P2:5，-TCACATCGAGGATTTCCTT-3，
[0084](2 ) P3:5，-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3，
[0085](3) P4:5，-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3，
[0086](4 ) P5:5，-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3，。
[0087]將突變型的DNA樣品換為在EGFR19外顯子上c.2238—c.2250位缺失突變的DNA，用上述方法檢測，檢出限也可達(dá)到1/2500，且定量分析的誤差低于5%。
[0088]通過上述方法，可以檢測EGFR19外顯子上c.2230 一 c.2260位缺失突變，檢出限達(dá)到 1/2500。
[0089]正向和反向的質(zhì)控PCR引物，以及質(zhì)控TaqMan探針可改用以下序列，效果相同。
[0090]正向質(zhì)控PCR 引物 CFl: 5 ’ -GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC-3 ’[0091 ]反向質(zhì)控 PCR 引物 CRl: 5’ -TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA-3’
[0092]質(zhì)控TaqMan 探針 CP1VIC-TCACGCAGTTGGGCAC-MGB。
[0093]使用熒光定量PCR的方法檢測，檢出限為1/100，而且在突變樣本含量大于1%的情況下，定量分析的誤差大于 10%。
【權(quán)利要求】
1.一種基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備數(shù)字PCR混合液:含有待檢測基因DNA模板的樣品、正向和反向檢測PCR擴(kuò)增引物、標(biāo)記TaqMan探針、PNA探針、正向和反向質(zhì)控PCR引物、質(zhì)控TaqMan探針以及PCR預(yù)混液混合，制備得到數(shù)字PCR混合液； 所述的正向和反向檢測PCR擴(kuò)增引物用于擴(kuò)增含有缺失突變的基因；所述的標(biāo)記TaqMan探針與突變位點(diǎn)下游DNA模板結(jié)合； 所述的質(zhì)控PCR引物用于擴(kuò)增待檢測的DNA模板的保守序列；質(zhì)控TaqMan探針與質(zhì)控PCR引物所擴(kuò)增的序列結(jié)合； 標(biāo)記TaqMan和質(zhì)控TaqMan探 針是連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的核苷酸，兩者的熒光基團(tuán)類型不同； (2)數(shù)字PCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； (3)收集信號并進(jìn)行結(jié)果判斷:對PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行信號收集，根據(jù)熒光信號的類型判斷則待測樣品中是否含有發(fā)生基因缺失突變的DNA模板及其數(shù)量和含量。
2.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的方法，其特征在于，所述熒光基團(tuán)選自6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素、Cy5、Cy3或VIC，猝滅基團(tuán)選自6-羧基四甲基若丹明、BHQl、BHQ2或MGB。
3.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的方法，其特征在于，所述PNA探針與待檢測的基因發(fā)生突變的野生型DNA模板互補(bǔ)。
4.PNA探針用于制備基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的試劑盒，其特征在于，所述PNA探針與待檢測的基因發(fā)生突變的野生型DNA模板互補(bǔ)。
5.PNA探針用于基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變，其特征在于，所述PNA探針與待檢測的基因發(fā)生突變的野生型DNA模板互補(bǔ)。
6.標(biāo)記TaqMan探針用于制備基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記TaqMan探針與突變位點(diǎn)下游DNA模板結(jié)合。
7.標(biāo)記TaqMan探針用于基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變,所述的標(biāo)記TaqMan探針與突變位點(diǎn)下游DNA模板結(jié)合。
8.一種基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測基因缺失突變的試劑盒，其特征在于，包括以下物質(zhì)中的至少一種: Cl)與未發(fā)生突變的野生型DNA模板互補(bǔ)的PNA探針； (2)與突變位點(diǎn)下游DNA模板結(jié)合的標(biāo)記TaqMan探針； (3)用于擴(kuò)增待檢測基因的正向和反向PCR擴(kuò)增引物； (4)用于擴(kuò)增待測基因所在DNA模板上保守序列的正向和反向質(zhì)控PCR引物； (5)與待測基因所在DNA模板上保守序列結(jié)合的質(zhì)控TaqMan探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923973SQ201410041181
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】王世亨 申請人:上海涌泰生物醫(yī)藥科技有限公司