黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法及引物和探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法及引物和探針，其利用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）結(jié)合液相芯片來(lái)快速定性和定量檢測(cè)黃熱、乙型腦炎，基孔肯雅和西尼羅病毒，包括四對(duì)特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好的引物和探針。
【專利說(shuō)明】黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法及引物和探針
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物芯片和診斷試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種針對(duì)黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法及引物和探針，具體是一種采用基于微球的液相芯片技術(shù)用于快速檢測(cè)多種蚊媒病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃熱(Yellow fever virus)、流行性乙型腦炎(首先在日本從患者腦組織中分離獲得，因此稱為日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV))、西尼羅熱(WestNile fever)和基孔肯雅熱(Chikungunya fever)四種疾病是威脅人民健康的重要蟲(chóng)媒病毒性傳染病，分別因黃熱病毒(Yellow fever virus, YFV)、日本腦炎病毒(Japaneseencephalitis virus, JEV)、西尼羅病毒(West Nile virus, WNV)和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIK)所引起。
[0003]發(fā)病初期癥狀極其相似，難以鑒別；并且具有傳染快、易流行等特點(diǎn)，一旦發(fā)生，將嚴(yán)重威脅人們健康和社會(huì)安定。為了有效防控上述蟲(chóng)媒病毒性疾病的發(fā)生與傳播，在疾病發(fā)生早期實(shí)行快速診斷是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，而對(duì)于各出入境口岸來(lái)說(shuō)，在不影響入境人員和貨物快速通關(guān)前提下，如能在有效時(shí)間內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)人員以及船艙、貨物中可能攜帶的蚊子進(jìn)行快速篩查；同時(shí)，快速檢測(cè)各口岸周邊環(huán)境中蚊子攜帶病毒情況、建立有效防控網(wǎng)絡(luò)，以防上述病毒的傳入，將具有非常重大的意義。
[0004]目前常規(guī)的檢測(cè)手段包括分離培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法，以及核酸檢測(cè)方法，如PCR、多重PCR、RT-PCR和基于Taqman探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法等。但這些方法或多或少存在一些缺陷:如分離培養(yǎng)方法在技術(shù)上比較困難，且獲得病原學(xué)診斷和藥敏結(jié)果常需要3~5天以上，在臨床上難以及早進(jìn)行病原學(xué)診斷和耐藥性測(cè)定，無(wú)法滿足臨床救治危重感染者的需要；免疫學(xué)方法檢測(cè)病毒的特異性抗體時(shí)，不僅需分別在患者感染的急性期及恢復(fù)期采集雙份血清，并且還可能存在抗原抗體間的交叉反應(yīng)而干擾檢測(cè)，不利于疾病的早期診斷；在核酸檢測(cè)方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法及基于Taqman探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法等的靈敏度高，特異性好，適合于快速檢測(cè)鑒定，但這些方法大多基于單一反應(yīng)或較少數(shù)重?cái)?shù)的多重反應(yīng)的檢測(cè)，在對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)每一個(gè)樣本的數(shù)十種指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和排除時(shí)，需要耗費(fèi)大量的勞動(dòng)和成本。
[0005]對(duì)于分子實(shí)驗(yàn)室中大量樣本的常規(guī)檢測(cè)，研究者正致力于開(kāi)發(fā)和建設(shè)以多重快速檢測(cè)為目標(biāo)的檢測(cè)平臺(tái)， 典型的高通量多重分析技術(shù)包括生物芯片、毛細(xì)電泳和質(zhì)譜等，由于其能在同一反應(yīng)容器中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)核酸序列，因此在節(jié)約時(shí)間、勞動(dòng)和成本方面更具有優(yōu)勢(shì)，是高通量、特異、可靠、快速和經(jīng)濟(jì)的核酸檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法及引物和探針，其利用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合液相芯片來(lái)快速定性和定量檢測(cè)黃熱、乙型腦炎，基孔肯雅和西尼羅病毒，包括四對(duì)特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好的引物和探針。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)用探針，所述探針包括:黃熱病毒的探針YFV-PF、基孔肯雅病毒的探針CHIKV-PF、西尼羅病毒的探針WNV-PF和乙型腦炎病毒的探針JEV-PF，上述探針的核酸序列分別依次參見(jiàn)SEQ ID NO:1_4，具體參見(jiàn)表1。
[0008]表1黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的探針
【權(quán)利要求】
1.一種黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)用探針，其特征在于所述探針包括:黃熱病毒的探針YFV-PF、基孔肯雅病毒的探針CHIKV-PF、西尼羅病毒的探針WNV-PF和乙型腦炎病毒的探針JEV-PF，上述探針的核酸序列分別依次參見(jiàn)SEQ ID N0:l_4。
2.一種黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)用引物，其特征在于所述引物包括下述PCR擴(kuò)增引物對(duì): 黃熱病毒的引物對(duì)YFV-F和YFV-R，其序列分別參見(jiàn)SEQ ID NO:5~6 ； 基孔肯雅病毒的引物對(duì)CHIKV-F和CHIKV-R，其序列分別參見(jiàn)SEQ ID NO:7_8 ； 西尼羅病毒的引物對(duì)WNV-F和WNV-R，其序列分別參見(jiàn)SEQ ID NO:9-10 ； 乙型腦炎病毒的引物對(duì)JEV-F和JEV-R，其序列分別參見(jiàn)SEQ ID NO:11_12。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)用引物，其特征在于每對(duì)引物對(duì)中下游引物的5’端修飾有生物素標(biāo)記，每個(gè)探針5’端均帶有胺基化修飾且連有C12鄰接臂序列、并分別與相應(yīng)熒光標(biāo)記的微球偶聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)用引物，其特征在于所述引物還包括下述反轉(zhuǎn)錄引物:YFV-RT、CHIKV-RT、WNV-RT和JEV-RT，其核酸序列分別參見(jiàn) SEQ ID NO:13-16。
5.一種黃熱、乙型 腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法，基于微球的液相芯片技術(shù)，其特征在于具體包括以下步驟: ①合成權(quán)利要求1和2所述的引物對(duì)和探針，將每對(duì)引物中的下游引物5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；將每個(gè)探針5’端進(jìn)行胺基化修飾且連有C12鄰接臂序列； ②將所述探針?lè)謩e與相應(yīng)熒光編碼的微球偶聯(lián)、然后等數(shù)目混合，制得偶聯(lián)有特異性核酸探針的微球組； ③抽提待測(cè)樣本的RNA，并采用多重反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法對(duì)RNA病毒的特定基因序列反轉(zhuǎn)錄成cDNA ； ④以cDNA為模板、采用步驟①中的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； ⑤將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與微球組溫育雜交，然后加入鏈霉親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE的復(fù)合物，利用液相芯片系統(tǒng)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性和定量分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法，其特征在于步驟③中所述反轉(zhuǎn)錄采用權(quán)利要求4所述的反轉(zhuǎn)錄引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法，其特征在于步驟④中的PCR擴(kuò)增采用不對(duì)稱擴(kuò)增，每對(duì)引物對(duì)中下游引物的濃度是上游引物濃度的3~8倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃熱、乙型腦炎、基孔肯雅、西尼羅的鑒別檢測(cè)方法，其特征在于步驟④中所述PCR擴(kuò)增采用兩個(gè)PCR反應(yīng)體系，分別為PCR反應(yīng)體系1、和PCR反應(yīng)體系II ;其中PCR反應(yīng)體系I含有西尼羅病毒的引物對(duì)WNV-F和WNV-R，PCR反應(yīng)體系II含有黃熱病毒的引物對(duì)YFV-F和YFV-R、基孔肯雅病毒的引物對(duì)CHIKV-F和CHIKV-R、乙型腦炎病毒的引物對(duì)JEV-F和JEV-R ； 步驟⑤中，首先從PCR反應(yīng)體系I和PCR反應(yīng)體系II中取等體積的擴(kuò)增產(chǎn)物加入至同一試管內(nèi)，然后再與微球組溫育雜交。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多種蚊媒病原體的檢測(cè)方法，其特征在于步驟⑤中溫育雜交的條件為:96°C變性5分鐘，55°C雜交30分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103911462SQ201410131452
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】李云, 史玲莉, 閆冀煥, 滑娜, 沈軍, 吳志茹, 蘭景, 李薇, 付曉昀 申請(qǐng)人:河北國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心