專利名稱：：一種基孔肯雅病毒的檢測(cè)方法一種基孔肯雅病毒的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本領(lǐng)域?qū)儆诜肿由飳W(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基L肯雅病毒的檢測(cè)方法。技術(shù)背景基孔肯雅病(Chikungunyadisease)是由基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus)引起的一種急性傳染病。該病繊于非洲，第一次已知的暴發(fā)是1952年在坦桑尼亞。到了上世紀(jì)60年代以后，基孔肯雅病東移東南亞地區(qū)。1965年，印度發(fā)生大流行，30萬(wàn)人感染。2005年3月，法屬留尼旺島暴發(fā)基孔肯雅病，至2006年3月，已有18.6萬(wàn)人受到感染，93人直接或間接因此病而死亡。2006年3月份，基L肯雅病還在印度洋4個(gè)島國(guó)(法屬留尼旺島等)全面爆發(fā)，30多萬(wàn)人受到感染并患病，法國(guó)大陸也有約40人感染了該病毒。"基L肯雅"是斯瓦西里語(yǔ)，意為"彎曲"，因?yàn)榈貌〉娜顺霈F(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，最后彎腰曲背。感染者的典型癥狀是肌肉酸痛，尤其是腳部疼痛，一周后會(huì)自愈，但是期間病情較重，嚴(yán)重影響勞動(dòng)能力。除了關(guān)節(jié)和肌肉疼痛外，發(fā)病者有時(shí)還發(fā)熱，惡心嘔吐，可能并aH膜炎而喪命。本病潛伏期3~12天。發(fā)熱病人常突然起病，寒戰(zhàn)、發(fā)熱，鄉(xiāng)可達(dá)39"，伴有頭痛、惡心、嘔吐、f欲減退，淋巴結(jié)腫大。基孔肯雅病毒是單股RNA病毒，屬病毒科甲病毒屬。1973年首先在印度尼西亞爪哇島發(fā)現(xiàn)。其動(dòng)物宿主有綠猴、狒狒、黑猩猩、牛、馬、豬、兔等，受感染的動(dòng)物宿主和病人都是傳染源。蚊蟲是基L肯雅熱的主要傳播媒介。此病目前沒有有效藥物可以治療，滅蚊為最重要的防范工作。隨著與世界各國(guó)交通往來(lái)的日益頻繁，該病隨時(shí)有在我國(guó)傳播的危險(xiǎn)，因此，需要建立一種基孔肯雅的檢驗(yàn)方法，并應(yīng)用于該病毒的監(jiān)測(cè)，可進(jìn)一步加強(qiáng)防止該病傳入我國(guó)的監(jiān)測(cè)工作，具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種基L肯雅病毒的檢測(cè)方法。本發(fā)明的一種基L肯雅病毒的檢測(cè)方法包括如下步驟(1)待測(cè)樣品的前處理；(2)待測(cè)樣品RNA的提??；(3)設(shè)計(jì)并合成引物、探針正向引物5，一TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG—3';反向引物5，一CCGTGTTCGGGATCACTGTTA—3';熒光探針5'—F層-TGC^CACA^TGiGA-BHQl—3',下劃線斜黑體字母表示鎖核酸(LNA)修飾鵬；(4)熒光定量核酸擴(kuò)增體系在反應(yīng)管中加入所述步驟(3)的正向引物、所述步驟(3)的反向引物，所述步驟(3)的熒光探針，2XRT-PCR緩沖液，25X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)酶混合物、步驟(2)得到的RNA和DEPC水，混合均勻；(5)熒光定量核酸擴(kuò)增將步驟(4)得到的混合溶液置于熒光定量PCR儀上反應(yīng)；(6)結(jié)果判定無(wú)Ct值或Ct〉45，且無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，判定為陰性；Ct《40,并有明顯擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性；40<Ct《45，重做，若重做結(jié)果有明顯擴(kuò)增曲線，則為陽(yáng)性，否則為陰性。所述步驟(1)為用標(biāo)本研磨液研磨所述的待測(cè)樣品，至所述的待觀,品的組織碎片鄰失，得到研磨混合液。所述標(biāo)本研磨液為Hank's液。Hanks液按如下成分配制KH2P040.06g，Nacl8.0g，NaHC030.35g，KC10.4g，葡萄糖1.0g，Na2HP04.H200.06g，加朋至1000ml。Hanks液可以高壓滅菌，分裝于化下保存。所述步驟(4)的正向引物的終濃度為500nM.。所述步驟(4)的反向引物的終濃度為lOOOnM.。所述步驟(4)的熒光探針的終濃度為250nM.。所述步驟(5)的擴(kuò)增條件為在熒光定量?jī)x5(TC，IO分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95'C熱啟動(dòng)10分鐘后，進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)95。C10秒，62。C30秒循環(huán)45次。用Lase巧ene軟件包中的SeqMan禾旨分析從GenbankJ:獲得的37株基孔肯雅病毒核苷酸序列，選擇有核苷酸高度保守的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，用PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異性弓嫩和探針設(shè)計(jì)。本發(fā)明建立了一種基L肯雅的檢驗(yàn)方法，可應(yīng)用于該病毒的監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步加強(qiáng)防止該病傳入我國(guó)的監(jiān)測(cè)工作，具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。圖l是最佳引物濃度的確定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2是最佳探針濃度的確定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3是熒光RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4是重復(fù)性測(cè)試結(jié)果；圖5是模擬基L肯雅病毒感染蚊標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增圖；圖6是基孔肯雅病毒RNA模板系列稀釋RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。具體實(shí)駄式實(shí)施例l、引物、探針的設(shè)計(jì)與合成用Laseigene軟件包中的SeqMangJ^分析從Genbank上獲得的37株基孔肯雅病毒核苷,列，選擇有核苷酸高度保守的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，用PrimerExpress2.0軟件設(shè)計(jì)特異性弓l物和探針設(shè)計(jì)，引物和探針序列見表l。表l引物和Sfr位置'序列(5'to3')備注正向引物CHIK-FP9933-9953TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG反向引物CHIK-RP10003-9983CCGTGTTCGGGATCACTGTTA熒光微C孤-probe9954"9967FAM-TGQgCACAgTG2GA-BHQl弓l物和探針在基孔肯雅病毒基因組上的定位依據(jù)的是GenBank序列號(hào)為AF490259的毒株序列。實(shí)施例2、陽(yáng)'t^照RNA模板的制備及用^lt異性荊古的病毒RNA提取根據(jù)基L肯雅病毒(GenBank序列號(hào)AF490259)的序列，合成包含熒^RT-PCR檢測(cè)片段序列的大小為120bp的DNA片段，克隆于T載^(TOPOTAcloningkit)上，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒純化質(zhì)豐加NA,測(cè)序證實(shí)插入片段正確后，隨后進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄先用NotI酶切質(zhì)粒使線性化以排除下^RNA產(chǎn)物，接著用MAXIscriptT7Ki戰(zhàn)行體外轉(zhuǎn)錄，生成目的RNA，然后用TurboDNase進(jìn)行DNase處理，去除未轉(zhuǎn)錄完的質(zhì)^DNA模板，最后用乙醇沉淀，提^RNA產(chǎn)物，即為陽(yáng)'齡寸照腿賺，保存于-70。C超低溫職待用。5擴(kuò)增片段大小為71bpLNA探針，下劃線斜黑體字母表示LNA條鵬取5pl體外轉(zhuǎn)錄模板RNA，稀釋250倍，測(cè)定OD250值為0.395，根據(jù)公式"RNA濃度(ng/pl):OD湖X稀釋倍數(shù)X40"計(jì)換算得到RNA模板原液濃度為790ng/)al，再根據(jù)單鏈RNA的拷貝數(shù)的計(jì)算公式"拷貝數(shù)(copies/nl)-RNA濃度(ng/|al)X6.02X1014/(330X單鏈RNA堿基數(shù))"計(jì)算得到體外轉(zhuǎn)錄模板RNA原液的拷貝數(shù)約為3.6X1011copies4d。用鄉(xiāng)行方、賺異性評(píng)估的14型登革病毒、乙腦病毒、西尼羅病毒、黃熱病病毒等毒株分別由廣東省疾病預(yù)防控制中心和廣東檢驗(yàn)檢疫局衛(wèi)生保健中心提供。病毒RNA的提取用QIAampViralRNAKit(德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品)進(jìn)行，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)施例3、擴(kuò)增,的確定TaqManRT-PCR反應(yīng)選用的試劑盒為Ag-Path-IDOnestepRT-PCRKit(美國(guó)Ambion公司產(chǎn)品)，擴(kuò)增和檢測(cè)在全自動(dòng)熒光定量?jī)xAppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystems上或StotageneMx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等儀器上進(jìn)4亍。根據(jù)試劑盒的推薦和引物、探針的具體特性，儀器上的反應(yīng)禾驕在退火延伸斜牛選擇上試驗(yàn)了3種溫度和3種時(shí)間逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為50。C10射巾，95'C熱啟動(dòng)10^H中后，進(jìn)入45次二步法PCR循環(huán):95°C10秒4(5眺0/62)。C(30/40/60)秒;各種試劑的加樣量分別為每個(gè)反應(yīng)管中含2xRT-PCR緩沖液10^d，20nM的正向引物CHIK-FPM，20nM的反向引物CHK-RP1^1，5pM探針CHK-Probe0.5|jl，25xRT-PCREnzymeMix0.8nl，RNA的量為5pl，用試劑盒提供的水補(bǔ)足到反應(yīng)總體積^0^1,熒光信號(hào)采集設(shè)在退火延伸階段。結(jié)果均可見陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，但考慮到使弓l物擴(kuò)增有更好的特異性和縮短反應(yīng)時(shí)間，最后確定擴(kuò)增程序?yàn)?0。C10分鐘，95。C10^H中，95'C10秒—62。C30秒45次循環(huán)。實(shí)施例4、最佳引度的確定應(yīng)用以上擴(kuò)增,，先固定探針終濃度為250nM，正、反向引物濃度在125nM、500nM、1000nM之間選擇。按表2所列濃度加上、下游引物終濃度選擇^S的引物濃度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如圖1所示，是最佳引物濃度的確定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。以Ct值最小，擴(kuò)增曲線也最明顯的曲線所對(duì)應(yīng)的弓l物濃度為最佳濃度，見圖l。最終確定CHIK-FP終濃度500nM，CHDC-RP終濃度為1000nM。實(shí)施例5、最佳探針濃度的確定應(yīng)用以上擴(kuò)增程序，根據(jù)選擇好的最佳正、反向引物濃度CHIK-FP終濃度500nM，CHIK-RP終濃度為1000nM，進(jìn)一步進(jìn)行探針濃度的確定，在50nM、125nM、250nM、500nM、750nM、1000nM之間選擇。圖2是最佳探針濃度的確定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。以Ct值最小，擴(kuò)增曲線也最明顯的曲線所Xf應(yīng)的探針濃度為最佳濃度，見圖2。圖中可見，各種Ct值基本一致，以1000nM終濃度熒光強(qiáng)度最高，同時(shí)終濃度250nM也有較高的熒光^S，最終確定CHIK-Probe終濃度250nM。實(shí)施例6、靈iC^、檢測(cè)P艮及標(biāo)準(zhǔn)曲線體外轉(zhuǎn)錄基孔肯雅病毒RNA模板用水進(jìn)行10倍系列稀釋G.6X101Q、3.6X109、3.6X108、3.6X107、3.6X106、3.6X105、3.6X104、3,6X103、3,6X102、3.6X101、3.6X100copies/W)，經(jīng)優(yōu)化好的反應(yīng)體系檢測(cè)，結(jié)果最低可檢測(cè)到3.6X102copies4il稀釋度的RNA，最低檢測(cè)限約為100copies/反應(yīng)。3.6XIO1、3.6X1(fropies^1稀釋度已檢測(cè)不至!J，線性范圍有9個(gè)數(shù)量級(jí)(3.6X1023.6X101Qcopies/nl)，根據(jù)此9個(gè)稀釋度模板RNA的檢測(cè)結(jié)果由軟件自動(dòng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的f值為0.998，斜率為-3.40，見圖3,根賠'E-10",，％效率=(E-l)><100%"計(jì)算，PCR擴(kuò)增效率為96.8%。實(shí)施例7、重復(fù)性測(cè)試體外轉(zhuǎn)錄基孔肯雅病毒RNA模板用水稀釋成3.6X109、3.6X106、3.6X1()2copies/nl高、中、低三種濃度，每種濃度重復(fù)檢測(cè)4次，用優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行，結(jié)果見圖4。由圖4可見，三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均具有很好的重復(fù)性，組內(nèi)擴(kuò)增曲線Ct值差異很小，其均，標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3，表3為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)基孔肯雅病毒的重復(fù)性。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例8、模擬染毒附示本的檢測(cè)及特異性測(cè)試從國(guó)境口岸監(jiān)測(cè)采集的蚊子，每份各50只，分別^&加5W、lOpl、50^1和250pl濃度為3.6X101Qcopies4il的基孔肯雅病毒RNA模板，按^}加lml標(biāo)本研磨M行研磨處理，取140^1研磨自QIAampViralRNAKit提取RNA，按優(yōu)化好的禾i/^進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果4份模擬基L肯雅病毒感染蚊子標(biāo)本均能擴(kuò)增到基L肯雅病毒核酸，見圖5。(1)待測(cè)樣品的前處理；(2)待測(cè)樣品RNA的提取；(3)設(shè)計(jì)并合成引物、探針正向引物5'—TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG—3，；反向引物5'—CCGTGTTCGGGATCACTGTTA—3，；熒光探針5'—FAM-TGCfACA^TGiGA-BHQ1—3',下劃線斜黑體字母表示LNA修飾堿基；(4)熒光定量核酸擴(kuò)增體系每20nl反應(yīng)體系中加入20^M所述步驟(3)中的正向引物0.5nl，20^M所述步驟(3)中的反向引物lpl，5nM所述歩驟(3)中的熒光探針0.5^1，2XRT-PCR緩沖液10…，25X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)酶混合物0.8^11、所述步驟(2)得到的RNA5pl、DEPC水2.2pl，混合均勻；(5)熒光定量核酸擴(kuò)增^K牛在全自動(dòng)熒光定量?jī)x5(TC，10射中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95'C熱啟動(dòng)IO辦中后，進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)95。C10秒，62。C30秒循環(huán)45次；(6)結(jié)果判定無(wú)Ct值或Ct〉45，且無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，判定為陰性；Ct《40，并有明顯擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性；40<Ct《45，必須重做，若重做結(jié)果仍然有明顯擴(kuò)增曲線，貝,斷為陽(yáng)性，否則為陰性。所述的待測(cè)樣品的前處理為用標(biāo)本研磨液研磨所述的待測(cè)樣品，至所述的待測(cè)樣品的組織碎片消失，得到研磨混合液。所述的標(biāo)本研磨液為Hank's液。Hanks液按如下成分配制KH^CX0.06g，Nacl8.0g，NaHC030.35g，KC10.4g,葡萄糖1.0g，Na肌恥0.06g，她0至lOOOral。Hanks液可以高壓滅菌，分裝于4。C下保存。所述的正向引物的最佳終濃度為500nM.。所述的反向弓(物的最佳終濃度為lOOOnM.。所述的熒光探針的最佳終濃度為250nM.。同時(shí)，用熒光RT-PCR方法檢測(cè)與基孔肯雅病毒傳播途徑類似的14型登革病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、黃熱病毒等蚊媒病毒，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明本方法有較好的特異性。為研究熒光定量PCR法與常規(guī)PCR在檢驗(yàn)基L肯雅病毒的靈敏度，利用相同的模板，即體外轉(zhuǎn)錄基孔肯雅病毒RNA模板用7乂進(jìn)行10倍系列稀釋(3.6X10IQ、3.6X109、3.6X108、3.6X107、3.6X106、3.6X105、3.6X104、3.6X103、3.6X102、3.6X10'、3.6X100copies/nl)，用QIAGENOneStepRT-PCRKit進(jìn)行常規(guī)RT-PCR，與熒光RT-PCR反應(yīng)體系-樣，20正向引物CHIK-FP0.5pl，20nM反向引物CHIK-RPM，模板RNA同祥加5mL反應(yīng)總體積20nl，其余i式劑按試劑盒說(shuō)明，除了逆轉(zhuǎn)錄和熱啟動(dòng)時(shí)間稍長(zhǎng)，反應(yīng)^f牛也與熒光RT-PCR方法基本一致50。C30分鐘，95°C15射中，95°C10秒—62°C30秒45次循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖在0.5XTBE中電泳80伏40分鐘后，利用凝膠成像系統(tǒng)照相，結(jié)果見圖6，圖中可見當(dāng)RNA濃度為3.6Xl(^copies/ial時(shí)已不能得到目的擴(kuò)增片段，靈鵬約比熒光RT-PCR方齒氐10倍。圖6為基L肯雅病毒RNA,系歹iJ稀釋RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，繊RNA濃度(單位copies/l4)分別為1.3.6X10";2.3.6X1010;3.3.6x109;4.3.6x108;5.3.6x107;6.3.6x106;7.3.6x105;8.3.6x104;9.3.6x103;10.3.6X102;M:100bpMarker。權(quán)利要求1.一種基孔肯雅病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)待測(cè)樣品的前處理；(2)待測(cè)樣品RNA的提??；(3)設(shè)計(jì)并合成引物、探針正向引物5’-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3’；反向引物5’-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3’；熒光探針5’-FAM-TGCid="icf0001"file="S2008100278702C00011.gif"wi="3"he="3"top="94"left="75"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>ACAid="icf0002"file="S2008100278702C00012.gif"wi="3"he="3"top="94"left="85"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>Gid="icf0003"file="S2008100278702C00013.gif"wi="3"he="3"top="94"left="91"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>A-BHQ1-3’，下劃線斜黑體字母表示鎖核酸修飾堿基；(4)熒光定量核酸擴(kuò)增體系在反應(yīng)管中加入所述步驟(3)的正向引物、所述步驟(3)的反向引物，所述步驟(3)的熒光探針，2×RT-PCR緩沖液，25×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)酶混合物、所述步驟(2)得到的RNA以及DEPC水，混合均勻；(5)熒光定量核酸擴(kuò)增將所述步驟(4)得到的混合溶液置于熒光定量PCR儀上反應(yīng)；(6)結(jié)果判定無(wú)Ct值或Ct＞45，且無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，判定為陰性；Ct≤40，并有明顯擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性；40＜Ct≤45，重做，若重做結(jié)果有明顯擴(kuò)增曲線，則為陽(yáng)性，否則為陰性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基L肯雅病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(1)為用標(biāo)本研磨液研磨所述的待觀,品，至所述的待領(lǐng),品的組織碎片消失，得到研磨混合液。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基L肯雅病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述標(biāo)本研磨液為Hank's液。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基L肯雅病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)的正向引物的終濃度為500nM.。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基孔肯雅病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)的反向引物的終濃度為lOOOnM.。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基L肯雅病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)的熒光探針的終濃度為250nM.。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基孔肯雅病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(5)的擴(kuò)增條件為在熒光定量?jī)x50。C，IO射中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95"熱啟動(dòng)10射中后，進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)95°C10秒，62°C30秒循環(huán)45次。全文摘要本發(fā)明提供了一種基孔肯雅病毒的檢測(cè)方法，包括如下步驟待測(cè)樣品的前處理；待測(cè)樣品RNA的提??；設(shè)計(jì)并合成引物、探針；確定的最佳的熒光定量PCR反應(yīng)體系為正向引物CHIK-FP終濃度500nM，反向引物CHIK-RP終濃度1000nM，探針CHIK-Probe終濃度250nM；擴(kuò)增程序?yàn)?0℃10min，95℃10min，95℃10s→62℃30s45次循環(huán)；最后根據(jù)Ct值來(lái)判定結(jié)果。本發(fā)明建立了一種基孔肯雅的檢驗(yàn)方法，并應(yīng)用于該病毒的監(jiān)測(cè)，可進(jìn)一步加強(qiáng)防止該病傳入我國(guó)的監(jiān)測(cè)工作，具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101270394SQ200810027870公開日2008年9月24日申請(qǐng)日期2008年5月5日優(yōu)先權(quán)日2008年5月5日發(fā)明者師永霞,幸蘆琴,李小波,燁洪,相大鵬,夔鄭,郭波旋,鐘玉清,黃吉城申請(qǐng)人:廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心