一種基于血清miRNA的試劑盒及其使用方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于血清miRNA的試劑盒及其使用方法和在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒早期感染檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的miRNA分子包括hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p。通過Taqman低密度芯片和qRT-PCR方法，鑒別出上述4中miRNA在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒發(fā)病早期表達特異性地顯著升高。用這4種血清miRNA作為分子靶標，建立了一種快速、敏感、特異的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒急性感染的檢測方法。本發(fā)明涉及hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染早期診斷中的用途，以及檢測hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p所用的試劑盒。
【專利說明】-種基于血清miRNA的試劑盒及其使用方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于血清miRNA的試劑盒及其使用方法 和在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒早期感染檢測中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome， SFTS)是我國近年來新發(fā)現(xiàn)的由布尼亞病毒引起的一種出血性疾病，病原稱之為SFTS病 毒。本病主要分布山區(qū)和丘陵地帶的農(nóng)村，呈散發(fā)，人群普遍易感。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫 多在38°C以上，伴乏力、惡心、嘔吐等，部分病例有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉等。絕大部分患者預(yù) 后良好，但部分病例病情危重，出現(xiàn)意識障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、 呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等多臟器功能衰竭死亡，重癥死亡率高達15-30%。目前在我 國的河南、湖北、山東、安徽、遼寧、江蘇、浙江等地都發(fā)現(xiàn)了 SFTS病例。近期在日本、韓國和 美國都發(fā)現(xiàn)了由SFTS相關(guān)病毒引起的病例，表明病毒的分布范圍較廣，SFTS已成為威脅人 類健康和公共衛(wèi)生的重要新發(fā)傳染病。
[0003] 目前針對SFTS的診斷方法主要有病毒分離、血清學方法和病毒核酸檢測方法等。 病毒分離耗時費力，且試驗操作的生物安全要求高，一般實驗室難以開展。檢測特異性IgG 抗體的血清學方法適合回顧性診斷和流行病學調(diào)查，而檢測早期抗體IgM的方法敏感性較 差。基于PCR的病毒核酸檢測有快速、特異和敏感的特點，但要依賴于病毒血癥的出現(xiàn)。因 此，建立一種針對SFTS病毒感染早期的診斷方法，對于疾病的臨床救治和防控意義重大。 MicroRNA (miRNA)是一類人體內(nèi)天然存在的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因進行負調(diào)控， 參與調(diào)節(jié)細胞的多種重要的生命活動，包括發(fā)育、分化、生長、穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、細胞凋亡、免 疫激活以及腫瘤生成等。在各種疾病（包括病毒性疾?。┑陌l(fā)展過程中，miRNA也扮演著 重要角色。從疾病診斷的角度看，異常表達的miRNA可以作為疾病診斷的分子靶標，目前這 方面的研究主要集中在癌癥、代謝性疾病等方面。miRNA在病毒感染過程中也起著重要作 用，研究表明流感病毒、腸道病毒、乙肝病毒等感染，都能引起人體血清中miRNA的差異性 表達。血清中成熟的miRNA分子具有高度的穩(wěn)定性，而且在病毒血癥消失后依然可以檢出。 因此，建立一種基于血清miRNA的檢測方法，對于SFTS病毒急性感染的早期診斷具有重要 意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的問題是提供一種基于血清miRNA的試劑盒及其使用方法和在 發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒早期感染檢測中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供的檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒急性感染特異性miRNA的試劑 盒由AMV反轉(zhuǎn)錄體系、PCR反應(yīng)體系、miR-16內(nèi)參、陰性質(zhì)控品和4種miRNA特異性引物探 針組成；4 種 miRNA 名稱和序列分別是：hsa-miR-188-3p CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA、
[0006] hsa-miR-5 17a-3p AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU、h s a_m i R-5 1 8 f-5p CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC 和 hsa-miR-511-3p AAUGUGUAGCAAAAGACAGA。
[0007] 本發(fā)明所述一種基于miRNA的試劑盒在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒早期感染 檢測中的使用方法：
[0008] SFTS急性感染血清miRNA差異表達的檢測：收集SFTS急性期病人血清6份、健 康正常血清6份，將兩組血清（每份200 μ L)分別混合，采用酚氯仿法提取總RNA。miRNA 差異表達的檢測米用 TaqMan Array Human ν3·0 芯片（Applied Biosystems, USA)進行 檢測。提取的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄米用 Taqman MiRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA)。得到的 cDNA 進行 PCR，然后進行 qRT-PCR 反應(yīng)。.采用 SDS software ν2· 3和RQ Manager vl. 2· 1 (Applied Biosystems)軟件進行數(shù)據(jù)分析。CT值大于或等于40 定義為未檢出
[0009] 血清差異表達miRNA驗證：通過qRT-PCR對SFTS急性感染者血清差異表達顯著 miRNA進行驗證。驗證的miRNA特異性引物探針有美國Applied Biosystems設(shè)計合成，采 用人工合成的單鏈miR-16作為標準品。試驗結(jié)果采用SPSS18. 0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù) 據(jù)表示方法為median 土 SD，組間比較采用t檢驗，P〈0. 05為差異顯著。結(jié)果篩選出6種 miRNA可以作為SFTS感染的早期診斷的分子靶標。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0011] 通過檢測SFTS病毒感染相關(guān)的血清miRNA表達，可以對病毒感染做出早期診斷， 而且不依賴于病毒血癥的出現(xiàn)，具有快速、敏感、特異等特點，為臨床救治和疾病控制提供 一種新的檢測方法和重要的實驗依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖 lqRT-PCR 檢測急性感染血清中 hsa-miR-188_3p、hsa-miR-517a_3p、 hsa_miR-518f-5p 和 hsa-miR-511_3p 的表達水平
[0013] 圖 2R0C 曲線評價 hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p 和 hsa-miR-511-3p在SFTSV急性感染中的診斷價值

【具體實施方式】
[0014] 下面提供具體實施例進一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于 實施例。
[0015] 實施例1 :血清總RNA提取
[0016] 收集SFTS急性期病人血清6份、健康正常血清6份，將兩組血清（每份200 μ L) 分別混合，采用酚氯仿法提取總RNA，具體步驟：1.取100ul血清樣品加入含有300ul DEPC 水的1. 5ml EP中，后加入lull0f/ul cel-miR-238用于參數(shù)校準，充分混勻后加入200ul水 飽和酚，劇烈震蕩混勻，靜置3min，加入200ul氯仿，再次充分震蕩混勻后16000g室溫離心 15分鐘。2.吸取上清液，加入兩倍上清體積的異丙醇，再加入1/10上清體積3M醋酸鈉約 40111，充分混勻后-201：靜置211，后于41：下，1600(^，離心201^11。3.棄上清，加入75%乙 醇lml，4°C，16000g，離心20min。4.棄上清，室溫干燥，加入20ulDEPC水溶解RNA。
[0017] 實施例2 :SFTS急性感染血清miRNA差異表達檢測
[0018] 米用 TaqMan Array Human ν3· 0 芯片（Applied Biosystems, USA)進行檢測。每 組樣品在4?^7 4板上檢測212種111丨1?隱，內(nèi)參選用1168111?隱。1.反轉(zhuǎn)錄采用1391]^11 MiRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA):將 50ng 總 RNA 加入 4. 5ul Megaplex pool 反轉(zhuǎn)錄混合液，包括 Megaplex RT Primers (10 X) 0· 8 μ 1，dNTPsO. 2 μ 1， MultiScribe Reverse Transcriptase(50U/ul)1.5ul, RT Buffer(10X)0.8ul, MgC12(25mM)0.9ul, RNase inhibitor(20U/μ 1)0. 1μ 1, Nuclease-free water。· 2μ 1。2.預(yù)擴增：TaqMan PreAmp Mastermix(2X) 12. 5μ 1 與 Megaplex PreAmp Primer (10 X) 2. 5 μ 1 進行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2. 5 μ 1，Nuclease-free water7. 5 μ 1。3. qRT-PCR 反應(yīng)在7900HT儀器上（Applied Biosystems)進行：用0. IXTE pH8. 0稀釋預(yù)擴增反應(yīng)液 4 倍，每個稀釋產(chǎn)物 9 μ 1 與 TaqMan2X Universal PCR Master Mix450 μ 1、Nuclease-free water441 μ 1 混合，取 100 μ 1 reaction mix 加入 Array A 板上樣點，1200rpm 離心 2 次， 每次lmin。4.數(shù)據(jù)分析：采用SDS software ν2· 3, miRNA表達水平分析采用RQ Manager vl. 2. 1 (Applied Biosystems)，CT值大于或等于40定義為未檢出。
[0019] 結(jié)果顯示，與健康人血清相比，SFTS急性感染者血清miRNA特異性表達上調(diào)的有 30個。
[0020] 實施例3 :血清差異表達miRNA驗證
[0021] 對實施例2中所得到的SFTS急性感染者血清特異性表達的30種miRNA進行 qRT-PCR驗證。驗證實驗選用58份血清，其中29份為SFTS感染急性期血清，29份為健康 人血清。檢測30種miRNA特異性引物探針有美國Applied Biosystems設(shè)計合成，采用人工 合成的單鏈miR-16作為內(nèi)參基因標準品。檢測22中miRNA的每份樣本都做三個重復，差 異表達水平用2-(ACtmiRNA_ACtcontrol)計算。本實驗采用SPSS18. 0軟件進行統(tǒng)計學 分析，數(shù)據(jù)表示方法為median 土 SD，組間比較采用t檢驗，P〈0. 05為差異顯著。
[0022] 表1病例組和對照組中SFTS患者和正常人血淸miRNA的表達差異對比。
[0023]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于血清miRNA的試劑盒，其特征是試劑盒的組成部分為AMV反轉(zhuǎn)錄體 系、PCR反應(yīng)體系、miR-16內(nèi)參、陰性質(zhì)控品和4種miRNA特異性引物探針；4種miRNA 名稱和序列分別是：hsa-miR-188-3p CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA、hsa-miR-517a-3p AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU、hsa-miR-518f-5p CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC 和 hsa-miR-511-3p AAUGUGUAGCAAAAGACAGA 〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種基于血清miRNA的試劑盒的使用方法，其特征是由以下步 驟構(gòu)成： (1) 反轉(zhuǎn)錄：按照AMV逆轉(zhuǎn)錄體系配置除RNA、RT-Primer之外的母液，將7μ 1母液、 2μ 1RNA與1μ 1引物混合均勻，反應(yīng)程序為：第一步：16°C，15min ;第二步：42°C，60min ; 第三步：85°C，5min ;第四步：降溫至4°C，陰性對照cDNA制備與樣本cDNA制備同時進行， 用DEPC水代替RNA ; (2) qRT-PCR檢測：配置qRT-PCR體系中除cDNA和probe以外的母液，將1 μ 1 cDNA、 0. 33 μ 1 Probe與14. 77 μ 1母液均勻混合，并且每個樣本每種miRNA檢測三復孔，加入96孔 PCR板中，每板中分別加入10-3、10-4、10-5、10-6的miR-16樣本體系混合物各三復孔，混合 均勻，在ABI7900熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95°C 5min ;95°C 15s， 60°C lmin，40 個循環(huán)； (3) 結(jié)果判定：檢測標本和陰性對照間比較采用t檢驗，P〈0. 05為差異顯著，判為標本 檢測陽性。
3. 權(quán)利要求1所述一種基于血清miRNA的試劑盒在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒早期 感染檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059994SQ201410337082
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】祁賢, 湯奮揚, 鮑倡俊, 崔侖標, 宋勇春, 周明浩 申請人:江蘇省疾病預(yù)防控制中心