獲取綿羊激活素ii型受體基因及其突變體的方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲取綿羊激活素II型受體(ActRIIB)基因及其突變體的方法與應(yīng)用，包括克隆ActRIIB基因編碼區(qū)全長cDNA序列；ActRIIB及其定點(diǎn)突變型慢病毒載體的構(gòu)建；穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB及突變體的細(xì)胞系篩選。本發(fā)明在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)ActRIIB突變體對綿羊原代成肌細(xì)胞具有增殖作用，為進(jìn)一步探索ActRIIB在家畜肌肉細(xì)胞生長分化過程所涉及的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】獲取綿羊激活素11型受體基因及其突變體的方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物基因工程領(lǐng)域，具體是一種獲取綿羊激活素 II型受體基因及其 突變體的方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 激活素是最早在性腺發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族成員， 1986年首次從牛的卵泡液中分離、純化。激活素受體ActR屬于TGF-β超家族成員的絲氨 酸/蘇氨酸蛋白激酶型受體，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能上的特性，激活素受體可分為兩類，激活素 I型和II型受體。激活素 II型受體是一種糖蛋白，也是一種結(jié)構(gòu)激活型的受體。它由510 個氨基酸組成，含有一個富含半胱氨酸的N端胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域l_135aa，一個疏水跨膜 區(qū)和一個胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域159-510aa，包括兩個亞型，即激活素 II型受體A 和激活素 II型受體B。序列比對結(jié)果顯示，激活素 IIB型受體在不同物種間存在很高的同 源性，牛的ActRIIB與人、小鼠的序列同源性分別為93%和91%。
[0003] ActRIIB與配體結(jié)合后募集I型受體形成配體受體復(fù)合物從而啟動下游信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)，II型受體起著配體結(jié)合和特異性識別的雙重功能，因此II型受體的結(jié)構(gòu)和功能備受關(guān) 注。已有研究證明Myostatin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與TGF-β家族成員相似，都是通過I型和 II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異源二聚體來進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。和TGF-β家族成員一樣， Myostatin引發(fā)的信號傳導(dǎo)首先要與II型受體結(jié)合，然后再與I型受體結(jié)合，一旦異源二聚 體受體復(fù)合物形成，II型受體使I型受體磷酸化，磷酸化的受體I進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄 因子Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3會進(jìn)一步和Smad4結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)節(jié) 靶基因的表達(dá)。 ActRIIB有多種配體，如Myostatin,它屬于TGF-beta超家族成員，是公認(rèn)的肌肉生長 的負(fù)調(diào)控因子，可通過與其結(jié)合調(diào)節(jié)肌肉生長，目前拮抗肌肉生長抑制素已被證明可增加 動物的瘦肌肉質(zhì)量。而激活素受體IIB突變體與MSTN結(jié)合后形成的復(fù)合物不能與I型受 體結(jié)合，從而能夠達(dá)到阻斷MSTN下游信號傳導(dǎo)、抑制MSTN的功能。
[0004] ActRIIB在Myostatin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用得到了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步支持。Johns Hopkins大學(xué)的Se-Jin Lee等建立表達(dá)非活性結(jié)構(gòu)域ActRIIB的轉(zhuǎn)基因小鼠，這種非活性 結(jié)構(gòu)域的受體雖然能夠和Myostatin結(jié)合，但由于缺乏胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，使得ActRIIB不 能與I型受體結(jié)合，因此不能激活Smad蛋白功能從而阻斷Myostatin生物學(xué)功能，導(dǎo)致轉(zhuǎn) 基因小鼠體重與對照小鼠相比增加25%。此外，通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)的ActRIIB突變體能夠與 MSTN競爭性結(jié)合，阻斷或減弱MSTN與細(xì)胞膜上的內(nèi)源性ActRIIB的結(jié)合，從而抑制下游 信號傳導(dǎo)，最終阻斷或減弱MSTN對肌肉生長的抑制作用，造成轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉異常增生肥 大。Samuel Μ等用可溶性的ActRIIB注射8周的C57BL/6小鼠，28天后注射小鼠的平均 體重比對照組增加了 16 %。2005年Se-Jin Lee等又報道了將可溶性的Activin IIB受 體注射入野生型小鼠體內(nèi)，2周內(nèi)小鼠肌肉比對照組增加60%。ActRIIB突變體在轉(zhuǎn)基因 鼠上的表達(dá)引起骨骼肌肥大，說明ActRIIB受體在調(diào)節(jié)肌肉肥大方面起著關(guān)鍵作用。2010 年，Xiaolan Zhou等運(yùn)用生物工程技術(shù)制造了一個叫sActRIIB的可溶性受體蛋白，即一個 可以同時阻斷myostatin和activin A的大分子實(shí)驗(yàn)藥物，并將其注射到正常的小鼠肌肉 和癌癥模型小鼠肌肉內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管對腫瘤生長速率沒有影響，而且對脂肪的損耗以及 炎癥因子的增高也沒有影響，但有效地逆轉(zhuǎn)了肌肉消融，結(jié)果導(dǎo)致結(jié)腸癌小鼠的存活期大 大延長。此外，Raouia等的研究證實(shí)，ActRIIB突變體蛋白與天然的ActRIIB蛋白相比，前 者能顯著增加肌原細(xì)胞數(shù)量。這些結(jié)果提示ActRIIB突變體可能通過抑制Myostatin的基 因表達(dá)促進(jìn)肌肉生長。
[0005] 由于目前已經(jīng)報道的針對ActRIIB突變體阻斷myostatin促進(jìn)肌肉生長的研究結(jié) 果大多集中在低等脊椎動物和小鼠上，在畜禽等大動物上的研究未見報道，而且目前缺乏 綿羊ActRIIB全長序列，因此，克隆綿羊激活素 II型受體基因，解析ActRIIB基因及其突 變體在家畜肌肉細(xì)胞生長過程中的作用，為今后研制促肌肉生長制劑或轉(zhuǎn)基因動物奠定基 礎(chǔ)，也為提高家畜產(chǎn)肉性能提供新的思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種獲取綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法與 應(yīng)用，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 一種獲取綿羊激活素 II型受體基因全長編碼區(qū)及其突變體的方法，包括ActRIIB編碼 區(qū)全長cDNA序列克?。籄ctRIIB基因的定點(diǎn)突變及慢病毒載體的構(gòu)建；穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB 及突變體細(xì)胞系的篩選；所述克隆ActRIIB基因編碼區(qū)全長cDNA序列，采集綿羊肝臟組 織，用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計克隆引物P1 :5' -GGCACCGCGGAACAT GACGGCGCCCTGGGCGGCCC-3'，P2 :5' -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTC GACTC-3'，通過 RT-PCR 方法 擴(kuò)增綿羊ActRIIB全長編碼區(qū)序列，將符合預(yù)期大小片段克隆至pMD 18T載體，測序，陽性 質(zhì)粒命名為pMD 18T-ActRIIB ;所述的ActRIIB及其定點(diǎn)突變型慢病毒載體的構(gòu)建，以pMD 18T-ActRIIB 質(zhì)粒為模板，以引物 P3 :5' -ATAGGATCCGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTG-3' (Bam Η I)， P:5, -GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGATGCTCGACTC-3' (Notl)，將 ActRIIB亞克隆至慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS中，獲得慢病毒表達(dá)載體pLEX-ActRIIB，可表 達(dá)全長形式的綿羊ActRIIB。
[0008] 以引物 P5 :5 ' -GCCGGATCCATGGCCCTCGCCCTCCTCTG-3 '（BamHI)，P6 :5 ' -CCCCTCGAG TTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTACACCTGGGGGTT CTCCTCG-3'（Xhol)，亞克隆入慢病毒 載體pLEX-MCS，獲得慢病毒表達(dá)載體pLEX-dnActRIIB，可表達(dá)截短的ActRIIB，即第7-100 位氨基酸序列。將上下游分別是Agel和Xhol酶切位點(diǎn)的IgG-Fc基因片段，與經(jīng)Agel和 Xhol雙酶切的pLEX-dnActRIIB大片段進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc， 可表達(dá)帶 IgG-Fc 標(biāo)簽的截短型 ActRIIB(7-100aa)質(zhì)粒 dnActRIIB-IgG Fc。
[0009] 利用Stratagene定點(diǎn)突變試劑盒將dnActRIIB-IgG Fc序列的第79位氨基酸 賴氨酸（L)分別定點(diǎn)突變?yōu)楦彼幔≒)和谷氨酸（E)，L79P定點(diǎn)突變正向引物是P7 : 5 ' -GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3'，反向引物是 P8 :5' -AGTTGAAGTCGTCCGGCCAGCAG CCCTTC-3'，L79E 定點(diǎn)突變正向引物分別是 P9 :5' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACT GC-3 '，反向引物是 P10 :5 ' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCCAGCAGCCCTTCTTG-3 '。分別構(gòu)建獲得 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒； 所述穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB基因及突變體細(xì)胞系的篩選，是將構(gòu)建的ActRIIB基因及突變 體的慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝，并感染分離培養(yǎng)的綿羊原代 成肌細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)綿羊ActRIIB全長及突變體的成肌細(xì)胞系。
[0010] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的綿羊ActRIIB基因的三種突變體，突變形式為 氨基端截短及其單堿基突變。
[0011] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB基因及突變體細(xì)胞系的 篩選具體步驟是：a、293T細(xì)胞培養(yǎng)：條件37 °C，5%的C02，完全培養(yǎng)液（DMEM+10%的 胎牛血清)，六孔板每孔鋪6-7 X 105個細(xì)胞，20小時后細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90% ;b、 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：加入25〇μ?預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例分 別加入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 2 μ g、包裝質(zhì)粒 psPAX2 1· 5 μ g、包膜質(zhì)粒 pMD2. G 0· 5 μ g、 輕輕混勻；另取25〇μ? Opti-MEM培養(yǎng)基，向其中加入8μ?脂質(zhì)體，室溫放置5min后，將上 述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養(yǎng)基清洗 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物加入細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育； 2-4小時后，移去脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，在每孔加入2ml新鮮的完全培養(yǎng)液，重新將細(xì)胞培 養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；c、病毒包裝：培養(yǎng)48h后收集含慢病毒的上清液，用0. 45Mm 過濾器過濾，收集濾過液，此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存；收集細(xì)胞，提取蛋白 進(jìn)行Western blotting檢測ActRIIB全長和ActRIIB突變體的表達(dá)；d、病毒感染：6孔板 中每孔鋪4. 5-5 X 105個綿羊原代成肌細(xì)胞；次日待匯合度達(dá)到70%左右時，棄去培養(yǎng)液，力口 入50〇μ?病毒（c步驟濾過液)、50〇μ?完全培養(yǎng)液、同時加入1PL polybrene，將細(xì)胞置于5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；e、穩(wěn)定細(xì)胞系篩選：病毒感染24h后棄去病毒液，0. 05%胰酶消化 6孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后，加入0. 25μ g/mL Puromycin進(jìn)行 篩選；為了獲得穩(wěn)定整合外源基因的表達(dá)細(xì)胞系，每隔2-3天更換含Puromycin的選擇性 培養(yǎng)基，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，對照組細(xì)胞全部死亡，實(shí)驗(yàn)組存活下來的細(xì)胞即是感染 外源基因的細(xì)胞；7-10天即可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將其繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，取部分細(xì)胞進(jìn)行 Western blotting 檢測。
[0012] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的應(yīng) 用，即ActRIIB及突變體對綿羊原代成肌細(xì)胞生長的作用，將上述篩選的穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB 全長及突變體的細(xì)胞系，分別以2 X 103個細(xì)胞/每孔接種至96孔板中，每種細(xì)胞設(shè)4個重 復(fù)，同時設(shè)置空白對照組，利用Cell Counting Kit-8法測定細(xì)胞生長曲線；每隔24h向?qū)?驗(yàn)組及對照組孔各加入1〇μ1的CCK- 8試劑，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，酶標(biāo)儀測定450 nm波 長處的吸光度，連續(xù)測定7天，計各細(xì)胞系4孔重復(fù)的平均值，以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)、 〇D45(l值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明獲得了綿羊ActRIIB基因序列，為綿羊ActRIIB基因 的序列釋放提供相關(guān)數(shù)據(jù)；獲得綿羊ActRIIB基因融合至IgG分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域即Fc結(jié)構(gòu)域 的可溶性ActRIIB突變體，其包括氨基端截短的ActRIIB突變體和單堿基突變的突變體。 目前關(guān)于綿羊激活素受體IIB基因及突變體研究還未見任何報道，而本發(fā)明在細(xì)胞水平發(fā) 現(xiàn)ActRIIB及突變體對綿羊原代成肌細(xì)胞的增殖作用，為進(jìn)一步探索ActRIIB突變體在家 畜肌肉細(xì)胞生長分化過程中的作用以及ActRIIB突變體阻斷MSTN信號通路的分子機(jī)制研 究奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是綿羊ActRIIB基因 PCR擴(kuò)增； 圖2是pLex-ActRIIB重組質(zhì)粒酶切檢測； 圖3是pLex-dnActRIIB-Fc重組質(zhì)粒酶切檢測； 圖 4 是 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-Fc 突變體的 western blot 檢測； 圖5是細(xì)胞生長曲線測定。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0016] 本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括：慢病毒載體PLEX-MCS由美國克羅拉多大 學(xué)李川源教授實(shí)驗(yàn)室贈送；細(xì)胞：293T、綿羊成肌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；動物材料：綿 羊肝臟采自烏魯木齊市華凌家畜屠宰市場。Trizol、大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5 α、鼠抗ΗΑ單 抗、小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自北京天根公司；IRDye? 800CW標(biāo)記的羊抗 鼠 IgG抗體購自美國LI-COR Biosciences公司；高保真DNA聚合酶、Tag DNA聚合酶、反轉(zhuǎn) 錄酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、IPTG等試劑均購自大連TaKaRa公司；中量質(zhì)粒提取 試劑盒購自 QIAGEN公司；QuickChange site-Directed Mutagenesis kit 購自 Stratagene 公司；LipofectamineTM 2000 購自 Invitrogen 公司；高糖 DMEM、Opti-MEM 購自 GIBCO 公 司；胎牛血清購自HYCL0NE公司；CCK-8試劑購自Dojindo公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純 產(chǎn)品。所述基因的克隆及其慢病表達(dá)毒載體的構(gòu)建，選用的試劑盒、試劑均為市售產(chǎn)品。
[0017] 本發(fā)明實(shí)施例中，一種獲取綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法，包括以 下步驟：克隆ActRIIB基因編碼區(qū)全長cDNA序列；ActRIIB基因的定點(diǎn)突變及慢病毒載體 的構(gòu)建；穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB及突變體細(xì)胞系的篩選。所述克隆ActRIIB基因編碼區(qū)全長 cDNA序列，首先是采集綿羊肝臟組織，用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄，參考 NCBI 數(shù)據(jù)庫中公布牛的 ActRIIB 序列（GenBank Accession No. U57707)，設(shè)計綿羊 Ovine ActRIIB克隆引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增綿羊ActRIIB全長編碼區(qū)序列，將符合預(yù)期大小片 段克隆至pMD 18T，測序，陽性質(zhì)粒命名為pMD 18T-ActRIIB。所述的ActRIIB及其定點(diǎn)突 變型慢病毒載體的構(gòu)建，以pMD 18T-ActRIIB質(zhì)粒為模板，以引物P3 :5，-ATAGGATCCGCACCG CGGAACATGACGGCGCCCTG-3'（BamH I)，P4 :5'-GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGG TAGATGCTCGACTC-3'（Notl)，將ActRIIB亞克隆至慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS中，獲得慢病毒 表達(dá)載體pLEX-ActRIIB，可表達(dá)全長形式的綿羊ActRIIB。
[0018] 以引物 P5 :5，-GCCGGATCCATGGCCCTCGCCCTCCTCTG-3'（BamHI)，P6 :5，-CCCCTCGAG TTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTACACCTGGGGGTT CTCCTCG-3'（Xhol)，亞克隆入慢病毒 載體pLEX-MCS，獲得慢病毒表達(dá)載體pLEX-dnActRIIB，可表達(dá)截短的ActRIIB，即第7-100 位氨基酸序列。
[0019] 將上下游分別是Agel和Xhol酶切位點(diǎn)的IgG-Fc基因片段，與經(jīng)Agel和Xhol雙 酶切的pLEX-dnActRIIB大片段進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc，可表達(dá) 帶 IgG-Fc 標(biāo)簽的截短型 7-lOOaa ActRIIB 序列 dnActRIIB-IgG Fc。
[0020] 利用Stratagene定點(diǎn)突變試劑盒將dnActRIIB-IgG Fc序列的第79位氨基酸賴 氨酸L分別定點(diǎn)突變?yōu)楦彼酨和谷氨酸E，經(jīng)測序鑒定后分別構(gòu)建pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒。所述穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB基 因及突變體細(xì)胞系的篩選，是將上述構(gòu)建的ActRIIB及突變體的慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝，并感染綿羊原代成肌細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)綿羊ActRIIB全 長及突變體的成肌細(xì)胞系：a、293T細(xì)胞培養(yǎng)：條件37°C，5%的C0 2，完全培養(yǎng)基（DMEM+10% 的胎牛血清)，六孔板每孔鋪6-7 X 105個細(xì)胞，20小時后細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90% ;b、 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：加入25〇μ?預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例分 別加入轉(zhuǎn)染載體 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 2ug、包裝質(zhì)粒 psPAX2 1.5ug、包膜質(zhì)粒 pMD2G 0.5ug、輕輕 混勻；另取25〇μ? Opti-MEM培養(yǎng)基，向其中加入8PL脂質(zhì)體，室溫放置5min后，將上述 稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，置于室溫孵育20min ;在此期間，用Opti-MEM培養(yǎng)基清洗待 轉(zhuǎn)染細(xì)胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物加入細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育； 2-4小時后，移去脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，在每孔加入2ml新鮮的培養(yǎng)液，重新將細(xì)胞培養(yǎng)板 放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；c、病毒包裝：培養(yǎng)48h后收集含慢病毒的上清液，用0. 45Mm過濾 器過濾，收集濾過液，此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存。收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行 Western blotting檢測ActRIIB全長和ActRIIB突變體的表達(dá)。d、病毒感染：6孔板中每孔 鋪4.5-5 X105個綿羊原代成肌細(xì)胞；24h待匯合度達(dá)到70%左右時，棄去培養(yǎng)液，加入500ul 收集病毒、500ul完全培養(yǎng)基、同時加入luL polybrene，終濃度達(dá)到10ug/mL，將細(xì)胞置于 5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；e、穩(wěn)定細(xì)胞系篩選：病毒感染24h后棄去病毒，將6孔板中的細(xì) 胞，0. 05%胰酶消化轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后，加入0. 25 μ g/mL Puromycin進(jìn) 行篩選。為了獲得穩(wěn)定整合外源基因的表達(dá)細(xì)胞系，每隔2-3天更換含Puromycin的選擇 性培養(yǎng)基，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，對照組細(xì)胞全部死亡，實(shí)驗(yàn)組存活下來的細(xì)胞即是感 染外源基因的細(xì)胞。通常7-10天即可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將其繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，取部分細(xì) 胞進(jìn)行Western blotting檢測。本發(fā)明所述的綿羊ActRIIB基因的三種突變體，突變形式 為氨基端截短和單堿基突變。
[0021] 本發(fā)明實(shí)施例中，所述克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的應(yīng)用，即穩(wěn)定 表達(dá)ActRIIB基因及突變體的細(xì)胞系對綿羊原代成肌細(xì)胞生長的作用，是將上述篩選的穩(wěn) 定表達(dá)ActRIIB全長及突變體蛋白的細(xì)胞，分別以2 X 103個細(xì)胞/每孔接種至96孔板中， 每種細(xì)胞設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組，利用Cell Counting Kit-8法測定細(xì)胞生長曲 線。每隔24h向?qū)嶒?yàn)組及對照組細(xì)胞每孔各加入1〇μ?的CCK- 8試劑，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度，連續(xù)測定7天。求4孔的平均值，以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù) 為橫坐標(biāo)、〇D45(l值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
[0022] 本發(fā)明獲得了綿羊ActRIIB基因序列，為綿羊ActRIIB基因的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；還包 括獲得綿羊ActRIIB基因融合至IgG分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域即Fc結(jié)構(gòu)域的可溶性ActRIIB突變 體，其包括氨基端截短的ActRIIB突變體和單堿基突變的突變體。目前還未見任何關(guān)于綿 羊激活素受體IIB基因及突變體研究報道，而本發(fā)明在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)ActRIIB及突變體對 綿羊原代成肌細(xì)胞的增殖作用，為進(jìn)一步探索ActRIIB突變體在家畜肌肉細(xì)胞生長分化過 程中的作用以及ActRIIB突變體阻斷MSTN信號通路的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
[0023] 實(shí)施例1克隆ActRIIB基因編碼區(qū)全長cDNA序列 (1)實(shí)驗(yàn)樣品采集與總RNA提取 采集綿羊肝臟組織，裝入凍存管中并迅速置于液氮中保存帶回。取約l〇〇mg組織樣在 液氮中研碎后移至1.5 mL離心管中，加入1 mL Trziol試劑，室溫靜置5 min,按照Trizol 試劑盒使用說明進(jìn)行總RNA的提取。
[0024] (2) RT-PCR 按照大連寶生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，對綿羊肝臟組織RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn) 錄體系參照說明書進(jìn)行。
[0025] (3)引物設(shè)計 參考NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的牛的ActRIIB序列（GenBank Accession No. U57707), 利用 01ig〇6. 0 軟件設(shè)計綿羊 Ovine ActRIIB 克隆引物，P1 :5' -GGCACCGCGGAACATGACG GCGCCCTGGGCGGCCC-3'，P2 :5' -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTCGACTC-3'，如序列表中序列表 5 所 示，通過RT-PCR方法擴(kuò)增綿羊ActRIIB全長序列。
[0026] (4) PCR 擴(kuò)增 ?〇?擴(kuò)增體系：5父811打61'1(^1^(1階132.5111111、44 1^?1、？2均141^、10|^〇1/1，高保 真DNA聚合酶0. 5 μ L，cDNA 2 μ L補(bǔ)水至50 μ L ;PCR擴(kuò)增程序：95°C預(yù)變性10min ;95°C變 性30 s，60°C退火45s，72°C延伸90 s，35個循環(huán)；最后72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電泳結(jié)果見圖1。
[0027] (5)克隆和測序 將綿羊ActRIIB基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后，利用T4 DNA連接酶將其與pMD-18T 載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5ci ;利用氨芐青霉素平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法 鑒定，陽性克隆測序由上海生物工程有限公司完成；測序鑒定后的陽性質(zhì)粒命名為PMD 18T-ActRIIB，測序結(jié)果見序列表中序列表1，同時將此序列提交至GeneBank，登陸號為： JX422071. 1。
[0028] 實(shí)施例2 ActRIIB基因的定點(diǎn)突變及慢病毒載體的構(gòu)建 請參閱圖2與圖3,根據(jù)實(shí)施例1獲得的綿羊ActRIIB全長序列，設(shè)計引物Pl，P2, 將目的基因克隆至慢病毒表達(dá)載體中，獲得綿羊ActRIIB基因慢病毒載體；同時以PMD 18T-ActRIIB質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物P3, P4,構(gòu)建截短的7-100aa ActRIIB序列并插入慢 病毒載體PLEX-MCS，命名pLEX-dnActRIIB ;將實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的IgG-Fc基因片段經(jīng)Agel和 Xhol雙酶切，膠回收目的基因片段，與同樣Agel和Xhol雙酶切的pLEX-dnActRIIB進(jìn) 行連接，獲得重組質(zhì)粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc，通過雙酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒；利用 Stratagene公司突變試劑盒將dnActRIIB-IgG Fc序列的第79位氨基酸賴氨酸L分別 定點(diǎn)突變?yōu)楦彼酨和谷氨酸E，經(jīng)測序鑒定后分別構(gòu)建pLEX-dnActRIIB-IgG FC-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒。具體步驟如下： (1)弓丨物設(shè)計： 根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計克隆ActRIIB至慢病毒表達(dá)載體的引物，上游引物P3 :5'-ATAGGATC ￡GCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTG-3，BamH I，下游引物 P4 :5，-GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTG GGACGTCGTATGGGTAGATGCTCGACTC-3' Not I :同時設(shè)計 h.游引物P5 :5'_GCCGGATCCATGGCCCT CGCCCTCCTCTG -3' BamH I，下游引物 P6 :5 ' -CCCCTCGAGTTMGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGT AG TACACCTGGGGGTTCTCCTCG-3' Xho I，黑色正體為 HA-Tag，構(gòu)建截短的 7-100aa ActRIIB 序列并插入慢病毒載體pLEX-MCS，如序列表6所示。
[0029] (2)構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體： ①慢病毒表達(dá)載體pLEX-ActRIIB的構(gòu)建： 以pMD 18T-ActRIIB為模板，分別利用特異性上下游引物P1、P2進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng) 體系為：1KL pMD 18T-ActRIIB 質(zhì)粒，2·5μ? 10XPCR buffer，2PL dNTP 均 2.5mM，上下游 引物 10 mM 均 ?μ?，?μ? DMS0，lUTaq 酶，用 ddH20 調(diào)整至 25μ?。PCR 反應(yīng)條件為：95°C 5min， 95°C 30 s，61°C 45 s，72°C 90 s，35 個循環(huán)，72°C 10 min;取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 5μ? 經(jīng) 1% 瓊 脂糖凝膠電泳檢測。BamH I和Not I雙酶切、膠回收目的片段，與同樣BamH I和Not I雙 酶切的pLEX-MCS載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a ;利用氨芐青霉素進(jìn)行平板篩 選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定。經(jīng)過測序驗(yàn)證后，獲得重組質(zhì)粒pLEX-ActRIIB。
[0030] ②慢病毒表達(dá)載體pLEX-dnActRIIB-Fc的構(gòu)建： a、以pMD 18T-ActRIIB質(zhì)粒為模板，利用特異性上游引物P5、下游引物P6進(jìn)行PCR反 應(yīng)，其反應(yīng)體系為：1PL pMD-18T-ActRIIB 質(zhì)粒，2·5μ? 10XPCR buffer，2PL dNTP(2.5mM each)，上下游引物10 mM均?μ?，?μ? DMS0，1U Taq酶，用ddH20調(diào)整至25μ?。PCR反應(yīng)條 件為：95°C 5min，95°C 30 s，61°C 30 s，72°C 30 s, 35 個循環(huán)，72°C 10 min;取 PCR 擴(kuò) 增產(chǎn)物5PL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。BamH I和Xho I雙酶切、膠回收目的基因片段，與同 樣BamH I和Xho I雙酶切的pLEX-MCS載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a ;利用 氨芐青霉素進(jìn)行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒 pLEX-dnActRIIB。
[0031] b、將上下游分別是Agel和Xhol酶切位點(diǎn)的IgG-Fc基因片段，與經(jīng)Agel和Xhol 雙酶切的PLEX-dnActRIIB大片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a ;利用氨芐青 霉素進(jìn)行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定。經(jīng)過測序驗(yàn)證后，獲得重組質(zhì)粒 pLEX-dnActRIIB-IgG-Fc，測序結(jié)果見序列表中序列表2。
[0032] (3) ActRIIB基因定點(diǎn)突變 ①引物設(shè)計 利用 http://www. genomics, agilent. com/primerDesignProgram. jsp 在線設(shè)計弓|物， 將ActRIIB基因序列的第79位氨基酸賴氨酸（L)分別定點(diǎn)突變?yōu)楦彼幔≒)和谷氨酸（E)。 L79P的上下游引物分別為：上游引物P7 :5'-GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3';下游引 物 P8 :5' -AGTTGAAGTCGTCCGGCCAGCAGCCCTTC-3' ；L79E 的上下游引物分別為：上游引物 P9 : 5' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACTGC-3'；下游引物 P10 :5' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCC AGCAGCCCTTCTTG-3'，如序列表中序列表7所示。
[0033] ②PCR擴(kuò)增 利用Stratagene定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為：10 XBuffer 5 μ L, dNTP (2.5禮63(*)、4以1^上下游引物均1.25 41^邛1^乂-(11^(^1?1184(3質(zhì)粒1以1^邛包譏釷3冊 DNA聚合酶1.0 yL，補(bǔ)水至50 yL;PCR反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性30 s;95°C變性30 s，55°C 退火60s，68°C延伸12min，16個循環(huán)；最后4°C 5 min。
[0034] ③消化 取1. 0 μ L Dpnl內(nèi)切酶加入上述50 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中混勻，37°C水浴3h。
[0035] ④轉(zhuǎn)化 a、取50yL XL Ι-Blue感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入5yL步驟3中消化的PCR產(chǎn)物混勻， 冰浴30min。
[0036] b、42°C水浴45s后冰浴2min，加入500 μ L S0C培養(yǎng)基混勻后置于37°C搖床震蕩 培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速：200rpm。
[0037] c、利用氨芐青霉素進(jìn)行平板篩選，挑取單菌落至S0C培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12_16h 后測序鑒定，獲得的陽性慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒命名為：pLEX-dnActRIIB-IgG FC-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E，測序結(jié)果見序列表中序列表3與序列表4。
[0038] 實(shí)施例3穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB基因及突變體蛋白細(xì)胞系的篩選 請參閱圖4,將上述構(gòu)建的ActRIIB及突變體的慢病毒重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn) 行慢病毒的包裝，并感染原代分離培養(yǎng)的綿羊成肌細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)綿羊ActRIIB和三 種ActRIIB突變體的成肌細(xì)胞系 ： 在293T細(xì)胞中包裝重組慢病毒步驟： (1) 第1日：293T細(xì)胞培養(yǎng)條件： 37°C，5%的C02，培養(yǎng)基采用DMEM+10%的胎牛血清，六孔板每孔鋪6-7 X 105個293Τ細(xì) 胞，保證第2天細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中匯合度達(dá)到80-90% ; (2) 第 2 日：Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染： 首先，在24孔板里準(zhǔn)備脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物。
[0039] 加入25〇μ?預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下列比例分別加入目的載 體 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 及病毒包裝載體。
[0040] 轉(zhuǎn)染載體 2 ug 包裝質(zhì)粒PSPAX2 1. 5ug 包膜質(zhì)粒PMD2G 0. 5ug 在使用Lipofectamine 2000之前先輕輕混勻脂質(zhì)體，然后在24孔板中加入25〇μ?預(yù) 熱的Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入8ul Lipofectamine 2000,輕輕混勻后室溫放置5min后，將 上述稀釋好的DNA與脂質(zhì)體混合，混合物置于室溫孵育20min ;在此期間，用Opti-MEM培 養(yǎng)基清洗六孔板中待轉(zhuǎn)染細(xì)胞一次，將脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物加入細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)板放回 37°C培養(yǎng)箱中孵育，2-4小時后，移去脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物，在六孔板每孔中加入2ml新鮮的 培養(yǎng)液，重新將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0041] (3)第4日：收集病毒 培養(yǎng)48h后收集含慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。將細(xì)胞上清用0. 45Mm過濾器過濾，收 集濾過液，此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存。收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行Western blotting檢測ActRIIB基因全長和ActRIIB各突變體的表達(dá)，分別檢測到53KDa、38KDa、 38KDa、38KDa的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致。
[0042] (4)病毒感染：在6孔板中鋪4. 5-5X 105個綿羊原代成肌細(xì)胞；次日待匯合度 達(dá)到70%左右時，棄去培養(yǎng)液，加入500ul收集病毒、500ul完全培養(yǎng)基，同時加入lul polybrene，終濃度達(dá)到10ug/ml，將細(xì)胞置于5% C02、37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0043] (5)穩(wěn)定細(xì)胞系篩選：病毒感染24h后棄去，0. 05%胰酶消化轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中， 待細(xì)胞完全貼壁后，加入〇.25yg/mL Puromycin進(jìn)行篩選。為了獲得穩(wěn)定整合外源基因的 表達(dá)細(xì)胞系，每隔2-3天更換含Puromycin的選擇性培養(yǎng)基，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，正 常細(xì)胞對照組全部死亡，實(shí)驗(yàn)組存活下來的細(xì)胞即是感染外源基因的細(xì)胞，通常7-10天即 可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
[0044] 實(shí)施例4穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB基因及突變體的細(xì)胞系在綿羊原代成肌細(xì)胞生長中 的作用 請參閱圖5,為了比較ActRIIB基因及突變體細(xì)胞系的生長狀況、ActRIIB基因及突變 體在綿羊原代成肌細(xì)胞生長中的作用，將獲得的穩(wěn)定感染目的基因的細(xì)胞系進(jìn)行生長曲線 的繪制，實(shí)驗(yàn)共分4組，測7天。使用CCK-8法測定細(xì)胞增殖，具體步驟如下： (1)將獲得的穩(wěn)定感染目的基因的細(xì)胞系在匯合度達(dá)到90%左右進(jìn)行消化并計數(shù)，分 別以每孔2000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置4個重復(fù)，置于5% C02、37°C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。同時，設(shè)置只含培養(yǎng)基不含細(xì)胞的對照孔，得到背景發(fā)光值，測定7次，即第0天至 第6天，需鋪7個相同的96孔板。
[0045] (2)當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后，向每孔細(xì)胞加入10 μ 1 CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱孵育 3. 5-4h后，使用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的吸光。
[0046] (3)每隔24h測定一次，每隔2天更換一次培養(yǎng)液，連續(xù)測定7天，最后把7天 的數(shù)值繪制成圖，制作出一條以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，〇D 45(l值為縱坐標(biāo)的細(xì)胞生長曲 線。結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)三種突變體的成肌細(xì)胞均比穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB全長的細(xì)胞生長 速度快。用SPSS13. 0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，表明鋪板第0天四種細(xì)胞生長差異均不 顯著；穩(wěn)定表達(dá) pLEX-dnActRIIB-Fc-L79Pl 的細(xì)胞與穩(wěn)定表達(dá) pLEX-dnActRIIB-Fc-L79E3 細(xì)胞相比，第1-6天差異均不顯著，P > 0. 05 ;穩(wěn)定表達(dá)pLEX-dnActRIIB-Fc-L79Pl、 pLEX-dnActRIIB-Fc-L79E3 細(xì)胞比穩(wěn)定表達(dá) pLEX-dnActRIIB-Fc、pLEX-ActRIIB 細(xì)胞生長 速度均顯著加快，第1天差異均顯著，P < 〇. 05,第2-6天均差異極顯著，P < 0. 01。
[0047] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論 從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[〇〇48] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個實(shí)施方式僅包 含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說明書作為一個整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解的其他實(shí)施方式。 序列表1 : PMD 18T-ActRIIB基因的測序結(jié)果 ATGACGGCGCCCTGGGCGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCG AGACGCGG 81 1 MTAPWAALALLWGSLCAGSGRGE A E T R GAGTGCATCTACTACAACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCG AGCGGGAC 162 28 ECIYYNANWELERTNQSDLERCE G E R D AAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGC TGGACGAC 243 55 KRLHCYASWRNSSGTIELVKKGC ff L D D TTCAACTGCTACGACAGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTTCTGCTGCTGCGAAG GCAACTTC 324 82 FNCYDRQECVATEENPQVYFCCC E G N F TGCAACGAGCGCTTCACCCACCTTCCCGAGGCGGGCGGCCCAGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCC CCACCCTG 405 109CNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTA P T L CTCACTGTGCTGGCCTACTCGCTGCTGCCCGTCGGGGGCCTCTCCCTCATTGCCCTGCTGGCCTTCTGGA TGTACCGACAT 486 136LTVLAYSLLPVGGLSLIALLAFWM Y R H CGCAAGCCCCCCTACGGCCACGTGGACATCCACGAGGACCCTGGACCTCCACCCCCGTCCCCTCTGGTGGGCC TGAAGCCT 567 163RKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVG L K P CTGCAGCTGCTGGAGATCAAGGCTCGGGGGCGCTTCGGTTGTGTCTGGAAGGCGCAGCTCATGAACGACTTCG TGGCTGTC 648 190LQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDF V A V AAGATCTTCCCACTCCAGGACAAGCAGTCGTGGCAGAGTGAGCGGGAGATCTTCAGCACGCCTGGCATGAAGC ACGAGAAC 729 217KIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMK HEN CTGCTGCAGTTCATTGCCGCTGAGAAGCGAGGCTCCAGCCTGGAGGCGGAGCTGTGGCTCATCACAGCCTTCC ACGACAAG 810 244 LLQFIAAEKRGSSLEAELWLITAF H D K GGCTCCCTCACGGATTACCTCAAGGGGAACATCATCACATGGAACGAGCTGTGTCACGTGGCGGAGACCATGT CTAGAGGC 891 271GSLTDYLKGNI ITWNELCHVAETM S R G CTCTCATACCTACACGAGGATGTGCCCTGGTGCCGGGGCGAGGGCCACAAGCCGTCTATTGCCCACAGGGACT TCAAGAGC 972 298 LSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRD F K S AAGAATGTATTGCTGAAGAGTGACCTCACTGCTGTGCTGGCTGACTTTGGCCTGGCTGTTCGGTTTGAGCCAG GGAAACCT 1053 325 KNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEP G K P CCGGGGGACACTCACGGGCAGGTGGGCACGCGGCGGTACATGGCCCCCGAGGTGCTCGAGGGAGCCATCAACT TCCAGAGA 1134 352 PGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAIN F Q R GACGCCTTTCTGCGCATCGACATGTACGCCATGGGGCTGGTGCTCTGGGAGCTCGTGTCCCGCTGCAAAGCTG CCGACGGA 1215 379 DAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKA A D G CCTGTGGATGAGTACATGCTGCCTTTTGAGGAGGAGATCGGCCAGCACCCGTCACTGGAGGAGCTGCAGGAGG TTGTGGTG 1296 406 PVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQE V V V CATAAGAAGATGCGGCCGGCCATCAAGGATCACTGGCTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGCTCTGCGTGACAA TCGAGGAG 1377 433 HKKMRPAIKDHWLKHPGLAQLCVT I E E TGCTGGGACCACGACGCGGAGGCTCGCCTGTCCGCGGGCTGCGTGGAGGAGCGAGTGTCCCTGATTCGGAGGT CGGTCAAC 1458 460 CWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRR S V N GGCACTACCTCGGACTGTCTCGTCTCCCTGGTGACCTCCGTCACCAACGTGGACCTGCCCCCGAAGGAGTCGA GCATCTAA 1539 487 GTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKES S I - 序列表2 :pLEX-dnActRIIB_IgG Fc基因的測序結(jié)果 ATGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCGAGACGCGGGAGTGCA TCTACTAC 81 1 MALALLWGSLCAGSGRGEAETRE C I Y Y AACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCGAGCGGGACAAGCGGC TGCACTGC 162 28 NANWELERTNQSDLERCEGERDK R L H C TACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGCTGGACGACTTCAACT GCTACGAC 243 55 YASWRNSSGTIELVKKGCWLDDF N C Y D AGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCTCG AGCCCAGA 324 82 RQECVATEENPQVYYPYDVPDYA L E P R GGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTT CATCTTCCCT 405 109GPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF I F P CCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGG ATGACCCA 486 136PKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE D D P GATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATT ACAACAGT 567 163DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRED V N S ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGG TCAACAAC 648 190TLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK V N N AAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATG TCTTGCCT 729 217KDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVY V L P CCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACA TTTACGTG 810 244 PPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPED I Y V GAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTT ACTTCATG 891 271EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS Y F M TACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCAC 972 298 YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHE G L H AATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAA 1017 325 NHHTTKSFSRTPGK- 序列表3 :PLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P基因的測序結(jié)果 ATGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCGAGACGCGGGAGTGCA TCTACTAC 81 1 MALALLWGSLCAGSGRGEAETRE C I Y Y AACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCGAGCGGGACAAGCGGC TGCACTGC 162 28 NANWELERTNQSDLERCEGERDK R L H C TACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT GCTACGAC 243 55 YASWRNSSGTIELVKKGCWPDDF N C Y D AGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCTCG AGCCCAGA 324 82 RQECVATEENPQVYYPYDVPDYA L E P R GGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTT CATCTTCCCT 405 109GPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF I F P CCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGG ATGACCCA 486 136PKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE D D P GATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATT ACAACAGT 567 163DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRED Y N S ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGG TCAACAAC 648 190TLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK V N N AAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATG TCTTGCCT 729 217KDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVY V L P CCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACA TTTACGTG 810 244 PPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPED I Y V GAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTT ACTTCATG 891 271EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS Y F M TACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCAC 972 298 YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHE G L H AATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAA 1017 325 NHHTTKSFSRTPGK- 序列表4 :PLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E基因的測序結(jié)果 ATGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCGAGACGCGGGAGTGCA TCTACTAC 81 1 MALALLWGSLCAGSGRGEAETRE C I Y Y AACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCGAGCGGGACAAGCGGC TGCACTGC 162 28 NANWELERTNQSDLERCEGERDK R L H C TACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACT GCTACGAC 243 55 YASWRNSSGTIELVKKGCWEDDF N C Y D AGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCTCG AGCCCAGA 324 82 RQECVATEENPQVYYPYDVPDYA L E P R GGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTT CATCTTCCCT 405 109GPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF I F P CCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGG ATGACCCA 486 136PKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE D D P GATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATT ACAACAGT 567 163DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRED Y N S ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGG TCAACAAC 648 190TLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK V N N AAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATG TCTTGCCT 729 217KDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVY V L P CCACCAGAAGAAGAGATGACTAATAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACA TTTACGTG 810 244 PPEEEMTNKQVTLTCMVTDFMPED I Y V GAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTT ACTTCATG 891 271EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS Y F M TACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCAC 972 298 YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHE G L Η AATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAA 1017 325 NHHTTKSFSRTPGK- 序列表 5:參考牛的 ActRIIB 序列（GenBank Accession No. U57707)利用 01igo6.0 軟件設(shè)計綿羊Ovine ActRIIB克隆引物 克隆引物 PI :5' -GGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTGGGCGGCCC-3' 克隆引物 P2 :5' -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTCGACTC-3' 序列表6:克隆ActRIIB、截短的ActRIIB至慢病毒表達(dá)載體的引物 P3 :5'-ATAGGATCCGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTG-3' （BamH I) P4 :5'-GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGATGCTCGACTC-3'（Not I ) P5:5'-GCCGGATCCATGGCCCTCGCCCTCCTCTG (BamH 1)-3' P6 :5'-CCCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTACACCTGGGGGTTCTCCTCG-3' (Xhol) 序列表7: ActRIIB基因序列的第79位氨基酸賴氨酸（L)分別定點(diǎn)突變?yōu)楦彼幔≒) 和谷氨酸（E)的引物設(shè)計 L79P 定點(diǎn)突變的正向引物 P7 :5' -GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3' L79P 定點(diǎn)突變的下游引物 P8 :5' -AGTTGAAGTCGTCCGGCCAGCAGCCCTTC-3' L79E 定點(diǎn)突變的正向引物 P9 :5' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACTGC-3' L79E 定點(diǎn)突變的下游引物 P10 :5' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCCAGCAGCCCTTCTTG-3'
【權(quán)利要求】
1. 一種獲取綿羊激活素 II型受體(ActRIIB)基因及其突變體的方法，其特征在于， 包括克隆ActRIIB基因編碼區(qū)全長cDNA序列；ActRIIB基因的定點(diǎn)突變及慢病毒載體的 構(gòu)建；穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB基因及突變體細(xì)胞系的篩選；所述克隆ActRIIB基因編碼區(qū)全長 cDNA序列，采集綿羊肝臟組織，用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計克隆引 物，P1 :5, -GGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTGGGCGGCCC-3，，P2 :5, -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTC GACTC-3'，通過RT-PCR方法擴(kuò)增綿羊ActRIIB全長編碼區(qū)序列，將符合預(yù)期大小片段克隆 至pMD 18T載體，測序，陽性質(zhì)粒命名為pMD 18T-ActRIIB ;所述的ActRIIB及其定點(diǎn)突變 型慢病毒載體的構(gòu)建，以pMD 18T-ActRIIB質(zhì)粒為模板，以引物P3 :5' -ATAGGATCCGCACCGC GGAACATGACGGCGCCCTG-3' （BamH I)， P4 :5' -GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGG GTAGATGCTCGACTC-3'（Notl)，將ActRIIB亞克隆至慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS中，獲得慢病 毒表達(dá)載體pLEX-ActRIIB，可表達(dá)全長形式的綿羊ActRIIB ;以引物P5 :5' -GCCGGATCCATG GCCCTCGCCCTCCTCTG-3'（BamHI)，P6 :5' -CCCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTA CACCTGGGGGTT CTCCTCG-3'（Xhol)，亞克隆入慢病毒載體pLEX-MCS，獲得慢病毒表達(dá)載體 pLEX-dnActRIIB，可表達(dá)截短的ActRIIB，即第7-100位氨基酸序列；將上下游分別是Agel 和Xhol酶切位點(diǎn)的IgG-Fc基因片段，與經(jīng)Agel和Xhol雙酶切的pLEX-dnActRIIB大片段 進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc，可表達(dá)帶IgG-Fc標(biāo)簽的截短型7-100aa ActRIIB 序列 dnActRIIB-IgG Fc ;利用 Stratagene 定點(diǎn)突變試劑盒將 dnActRIIB-IgG Fc 序列的第79位氨基酸賴氨酸（L)分別定點(diǎn)突變?yōu)楦彼幔≒)和谷氨酸（E)，L79P定點(diǎn)突變 正向引物是 P7 :5 ' -GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3 '，反向引物是 P8 : 5 ' -AGTTGAAGT CGTCCGGCCAGCAGCCCTTC-3 '，L79E 定點(diǎn)突變正向引物是 P9 : 5 ' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACG ACTTCAACTGC-3 '，反向引物是 P10: 5' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCCAGCAGCCCTTCTTG-3 ' ；分別 構(gòu)建獲得PLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E慢病毒重組表達(dá)質(zhì) 粒；所述穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB及突變體細(xì)胞系的篩選，是將構(gòu)建的重組表達(dá)ActRIIB及突變體 的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝，并感染分離培養(yǎng)的綿羊原代成肌細(xì)胞， 獲得穩(wěn)定表達(dá)綿羊ActRIIB全長及突變體的成肌細(xì)胞系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法，其特 征在于，所述的綿羊ActRIIB基因的三種突變體，突變形式為氨基端截短和單堿基突變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法，其特 征在于，所述穩(wěn)定表達(dá)ActRIIB基因及突變體細(xì)胞系的篩選，具體步驟是： a、 293T細(xì)胞培養(yǎng)：條件37°C，5%的C02，完全培養(yǎng)液（DMEM+10%的胎牛血清)，六孔板每 孔鋪6-7 X 105個細(xì)胞，20小時后細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90% ; b、 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：加入25〇μ?預(yù)熱的Opti-MEM培養(yǎng)基后，按下 列比例分別加入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 2ug、包膜質(zhì)粒pMD2G 0.5ug、輕輕混勻，另取25〇μ? Opti-MEM培養(yǎng)基，向其中加入8μ?脂質(zhì)體，室溫放置5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質(zhì) 體混合，置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養(yǎng)基清洗待轉(zhuǎn)染細(xì)胞一次，將脂質(zhì) 體和DNA復(fù)合物加入細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中孵育；2-4小時后，移去脂質(zhì)體 和DNA復(fù)合物，在每孔加入2ml新鮮的完全培養(yǎng)液，重新將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)； C、病毒包裝：包裝48h后收集含慢病毒的上清液，用0. 45Mm過濾器過濾，收集濾過液， 此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存；收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行Western blotting檢 測ActRIIB全長和ActRIIB突變體的表達(dá)； d、 病毒感染：6孔板中每孔鋪4. 5-5 X 105個綿羊原代成肌細(xì)胞；次日待匯合度達(dá)到70% 左右時，棄去培養(yǎng)液，加入500ul收集病毒、500ul完全培養(yǎng)基（c步驟濾過液)、同時加入lul polybrene，將細(xì)胞置于5% C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； e、 穩(wěn)定細(xì)胞系篩選：病毒感染24h后棄去病毒液，0. 05%胰酶消化6孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)入 10cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后，加入0. 25 μ g/mL Puromycin進(jìn)行篩選；每隔2-3天更 換含Puromycin的選擇性培養(yǎng)基，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，對照組細(xì)胞全部死亡，實(shí)驗(yàn)組 存活下來的細(xì)胞即是感染外源基因的細(xì)胞；7-10天即可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，將其繼續(xù)擴(kuò) 大培養(yǎng)，取部分細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測。
4. 一種根據(jù)權(quán)利要求1-3所述綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的應(yīng)用，即 ActRIIB及突變體對綿羊原代成肌細(xì)胞生長的作用，其特征在于，將上述篩選的穩(wěn)定表達(dá) ActRIIB全長及突變體的細(xì)胞系，分別以2 X 103個細(xì)胞/每孔接種至96孔板中，每種細(xì)胞 設(shè)4個重復(fù)，同時設(shè)置空白對照組，利用Cell Counting Kit-8法測定細(xì)胞生長曲線；每隔 24h向?qū)嶒?yàn)組及對照組孔各加入1〇μ1的CCK- 8試劑，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，酶標(biāo)儀測定 450 nm波長處的吸光度，連續(xù)測定7天，計各細(xì)胞系4孔重復(fù)的平均值，以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為 橫坐標(biāo)、0D45(I值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
【文檔編號】C12N15/867GK104087594SQ201410338143
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】劉明軍, 張雪梅, 李文蓉, 張寧, 賀三剛, 吳陽升, 安靜 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心