解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。該解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）SWJS22于2013年11月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8425。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）SWJS22產(chǎn)蛋白酶的條件，其培養(yǎng)、發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，并且該菌株分泌的蛋白酶在較低溫度和堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性較好，在制革、洗滌和食品等行業(yè)中有著廣泛的用途。
【專利說(shuō)明】解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及深海中微生物篩選及發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及解淀粉芽孢桿菌 SWJS22及其液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 海洋是生命之源，人類物質(zhì)資源的天然寶庫(kù)。它覆蓋著地球表面積的71%，海水總 體積占地球總水量的97%，生物量約占地球生物總量的80%，生物種類20萬(wàn)種以上，蘊(yùn)藏著 豐富的資源。為了尋求更廣泛的微生物及活性物質(zhì)資源，人類將目光投向了海洋，期望尋求 到符合要求的新型菌株及蛋白酶。其中，由于微生物幾乎能分泌所有現(xiàn)今已知的酶類，并且 微生物來(lái)源的酶制劑，相比于木瓜、豬胰臟等動(dòng)植物來(lái)源的酶制劑有其不可替代的優(yōu)勢(shì)，因 此對(duì)微生物菌株及其活性物質(zhì)的利用已成為了研究的熱點(diǎn)。
[0003] 蛋白酶（Protease)屬于水解酶類，是最重要的三大工業(yè)用酶之一，銷售額約占全 球酶制劑市場(chǎng)的60%。如今，在酶類市場(chǎng)中，在堿性條件下具有穩(wěn)定活性的堿性蛋白酶占據(jù) 了最大的份額。其應(yīng)用已經(jīng)深入到食品、釀造、醫(yī)藥、紡織、皮革、日用化學(xué)、洗滌劑、飼料以 及水產(chǎn)加工等多個(gè)行業(yè)，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起著重要的作用。目前，已被結(jié)晶和純化的蛋白 酶超過(guò)100種。
[0004] 正是由于海洋中所具有的低溫、高鹽、高壓的環(huán)境，使得海洋中的微生物及其所產(chǎn) 的胞外酶具有陸生微生物所不具備的特性。通常，海洋微生物所產(chǎn)酶具有作用pH范圍寬， 最適pH和反應(yīng)溫度適中，溫度對(duì)蛋白酶活力影響小等特點(diǎn)。因此，從中國(guó)南海的深海海泥 中篩選出了能分泌特殊性能或研究?jī)r(jià)值較高的蛋白酶的微生物菌株，并探討了其發(fā)酵性能 和條件。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的之一是提供了一種解淀粉芽孢桿菌
[0006] 本發(fā)明目的之二是提供了一種解淀粉芽孢桿菌r&ciBm SWJS22在液體發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明中可生產(chǎn)蛋白酶的深海菌株，為解淀粉芽孢桿菌 SWJS22,該菌于2013年11月1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中科院微生物研究所， 保藏編號(hào)為CGMCCNo. 8425。
[0008] 對(duì)保藏號(hào)為CGMCC No. 8425的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定，有以下特征： (1)菌落形態(tài)：白色，形狀不規(guī)則，表面有顆粒感，乳頭狀凸起，不透明，邊緣呈波狀；（2)細(xì) 胞形態(tài)：直桿狀，鏈狀排列，周生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性；（3)生理生化特征：可在4-40°C環(huán)境中 生長(zhǎng)，好氧，能耐受7% (wt)氯化鈉，能水解明膠、淀粉、酪素、檸檬酸鹽，能利用硫酸銨、硝酸 銨，可利用果糖、葡萄糖、甘露醇、木糖為碳源，吲哚反應(yīng)、V. P.反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)、接觸酶和 氧化酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，能產(chǎn)過(guò)氧化氫酶，不產(chǎn)硫化氫。
[0009] 保藏號(hào)為CGMCC No. 8425菌株經(jīng)16S rDNA鑒定，測(cè)得基因片段長(zhǎng)度為1449bp， 具體基因序列見(jiàn)序列表1。將獲得的基因序列輸入Genbank，應(yīng)用Blast程序?qū)@得 的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示與解淀粉芽孢桿菌 的16S rDNA序列同源性為99%。將此結(jié)果結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)及生理生 化鑒定特征，確定該菌為解淀粉芽孢桿菌入
[0010] 保藏號(hào)為CGMCC No. 8425菌株通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)其液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件進(jìn)行 了優(yōu)化。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：本發(fā)明公開(kāi)了解淀粉芽孢桿 菌rifeciBws 產(chǎn)蛋白酶的條件，其培養(yǎng)、發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，遺傳性 質(zhì)穩(wěn)定。由于該菌株來(lái)源于深海，所分泌蛋白酶具有特殊的性質(zhì)，并且關(guān)于該菌株的文獻(xiàn)報(bào) 道較少，在開(kāi)發(fā)新型深海菌株及酶制劑的研究中，具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為不同種子液培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解淀粉芽孢桿菌 SWJS22產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
[0013] 圖2為不同裝液量對(duì)解淀粉芽孢桿菌職e/aciea^SWJS22產(chǎn) 蛋白酶的影響曲線。
[0014] 圖3為不同發(fā)酵溫度對(duì)解淀粉芽孢桿菌SWJS22 產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。
[0015] 圖4為不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)解淀粉芽孢桿菌r&ciBiAs SWJS22 產(chǎn)蛋白酶的影響曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 富集及種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，硫酸鐵0· lg，人工海水1L，ρΗ7· 6-7. 8。
[0017] 酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白l〇g，牛肉浸粉3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2g，瓊脂15g，去 尚子水 L，ρΗ7· 3-7· 5。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖5g，酵母粉10g，氯化鈣2. 8g，氯化鈉 lg，SE170 1. 5g，去離子 水 1L，ρΗ7· 5。
[0019] 編號(hào)CGMCC No. 8425菌株的分尚、篩選 細(xì)菌的富集：取少許海泥于含無(wú)菌去離子水的錐形瓶中，加入粒無(wú)菌玻璃珠，37°C、 150rpm搖床中分散30min。吸取lml上清液接種于富集培養(yǎng)基中（25ml/250ml)，37°C、 150rpm搖床中培養(yǎng)24h。
[0020] 初篩：取lml富集液適當(dāng)稀釋后涂布于酪蛋白培養(yǎng)基上。若細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶，在菌落 周圍出現(xiàn)透明水解圈，根據(jù)水解圈直徑（D)與菌落直徑（d)的比值（D / d)大小確定產(chǎn)蛋 白酶能力較強(qiáng)的菌株。
[0021] 分離純化：挑取D / d比值較大的菌株，連續(xù)劃線分離三次以上，得純培養(yǎng)物。將 其于接種于斜面上，4°C保藏。
[0022] 復(fù)篩：將上述保藏的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37°C，150r/min，活化12h后，以1% 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中（25ml/250ml )，發(fā)酵培養(yǎng)48h。將發(fā)酵完成液于4°C，lOOOOr/ min條件下高速離心lOmin，過(guò)濾得上清液，即粗酶液。采用福林-酚法測(cè)發(fā)酵液中性蛋白 酶酶活，篩選出酶活較高的菌株。
[0023] 編號(hào)CGMCC No. 8425菌株的鑒定 將活化的編號(hào)CGMCC No. 8425的菌株接種于L-B培養(yǎng)基中，37°C，150r/min培養(yǎng)12h， 經(jīng)L-B培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2-3次后，取1. 5mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的菌體培養(yǎng)物，4°C，10000r/min離 心5min，收集菌體，去盡培養(yǎng)液。菌體經(jīng)SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-異戊醇抽提、轉(zhuǎn) 移上清、0. 6倍體積異丙醇析出DNA沉淀后短暫離心、70%乙醇洗滌、TE溶解模板DNA。電 泳檢測(cè)后采用通用引物進(jìn)行PCR (正向引物：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物： 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。
[0024] 擴(kuò)增總反應(yīng)體系為（20 μ L):模板基因 DNA 0. 5 μ L ;上下游引物（20 μ mol/1)各 1. 0 μ L ;Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L ;10Xbuffer 2. 0 μ L ;4 種脫氧核苷酸混合物 dNTP (各 2. 5 臟〇1/1)1.6 4 1^，25臟〇1/1]\%(：12 1.6 4 1^，雙蒸水（(1(1!120)12.14 1^。？0?擴(kuò)增條件：951：5 min;95°C 30 s;55°C 30 s;72°C 1.5 min;72°C 10 min;10°C，共 30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物純 化后完成測(cè)定的16S rDNA基因基因片段長(zhǎng)度為1449bp，與 sirai/75·相似性最高，同源性達(dá)99%，具體序列見(jiàn)序列表。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特征， 判定編號(hào)CGMCC No. 8425的菌株為解淀粉芽孢桿菌r&ciBm 職e/acieas)。
[0025] 海水芽孢桿菌CGMCC No. 8425液體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化 種齡的優(yōu)化：將菌株接種于種子液中，37°C，150r/min，分別培養(yǎng)4h、8h、12h、16h、24h 后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵48h，測(cè)定其酶活。結(jié)果見(jiàn)圖1。種齡對(duì)發(fā)酵液中蛋白酶活力無(wú) 顯著影響。
[0026] 搖瓶裝液量的優(yōu)化：采用250ml錐形瓶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，裝液量分別為10%、20%、 30%、40%、60%、80%，在371：，1501'/1^11條件下發(fā)酵4811。測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶酶活，結(jié)果如圖 2, 裝液量為10%時(shí)酶活最高，隨著裝液量的增加，蛋白酶活力下降較快。
[0027] 發(fā)酵溫度的優(yōu)化：將發(fā)酵液分別置于25°C、30°C、37°C、40°C、45°C、5(rC^，150r/ min，裝液量為10%，發(fā)酵培養(yǎng)48h。測(cè)其發(fā)酵液中蛋白酶酶活，結(jié)果如圖3,在37°C的環(huán)境中 發(fā)酵，發(fā)酵液中蛋白酶活較高。
[0028] 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化：將接種后的裝液量為10%的發(fā)酵液放于37°C，150r/min，培養(yǎng)72h， 每隔6h取樣，測(cè)其蛋白酶酶活。結(jié)果如圖4,蛋白酶活在54h時(shí)達(dá)到最大，隨著時(shí)間進(jìn)一步 延長(zhǎng)，酶活力有較小幅度下降。
[0029] 編號(hào)CGMCC No. 8425菌株的遺傳穩(wěn)定性 表1

【權(quán)利要求】
1. 一株解淀粉芽抱桿菌Cfeci77^s*湖?j7c>7i識(shí)A9/^i<9/?6〇SWJS22,該菌于2013年11月 1日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 8425。
2. 權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌在液體發(fā) 酵生產(chǎn)蛋白酶的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104140939SQ201410349296
【公開(kāi)日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】崔春, 周池虹伶, 趙謀明, 趙強(qiáng)忠 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)