一種定量快速篩選抑制黃曲霉毒素產生的活性物質的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種定量快速篩選抑制黃曲霉毒素的活性物質的方法，將一定質量或濃度的微生物發(fā)酵產物、植物提取物、天然產物、或化學合成產物加入到液體培養(yǎng)基，取200-500微升加到微量液體培養(yǎng)器，以空白培養(yǎng)液為對照，接種5-10微升寄生曲霉DM菌株的孢子液，28度培養(yǎng)3-6天，目測DM菌株菌絲生長和橘紅色降散盤衣酸的產生，將目測有抑制效果的微量液體培養(yǎng)器于1000rpm離心1分鐘，稱量菌絲體鮮重，將菌絲體置入甲醇/氫氧化鈉溶液中，提取其中的降散盤衣酸30-40分鐘，于560nm處測量處理和對照提取液的吸光值，計算抑毒率和抑菌率，選擇抑制率在90-100%的處理為抑制黃曲霉毒素產生的活性物質。本發(fā)明可實現微量、直觀、快速、安全、低成本篩選高效抑制黃曲霉毒素的活性物質。
【專利說明】一種定量快速篩選抑制黃曲霉毒素產生的活性物質的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及天然產物、真菌毒素防控等【技術領域】，具體的說是一種定量快速篩選抑制黃曲霉毒素產生的活性物質的方法。

【背景技術】
[0002]黃曲霉毒素是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產生的有毒次級代謝產物，是自然界中已發(fā)現的毒性最強的真菌毒素，其急性毒性是砒霜的60多倍，還具有強致癌性，免疫抑制性和致畸形性，被國際癌癥機構列為一類致癌物質。黃曲霉毒素可廣泛污染糧食、飼料等，對人類和動物健康危害極大，目前主要是用物理和化學方法清除糧食和飼料中已污染的黃曲霉毒素，不僅成本大，而且效果也不理想，并會導致營養(yǎng)的損失，因此，抑制黃曲霉毒素在糧食和飼料中的產生成為有效防控黃曲霉毒素污染的首選方法。
[0003]有效抑制黃曲霉毒素產生的關鍵是篩選出能高效抑制黃曲霉毒素合成的活性物質，由于黃曲霉毒素是極毒的真菌代謝產物，產生后，肉眼又不能直接觀測到，必須借助相關儀器和分析手段才能檢測到毒素的產生情況，不僅手續(xù)繁瑣，而且容易造成環(huán)境污染，危害操作人員的健康，因此，建立一種微量、快速、安全、低成本篩選出能高效抑制黃曲霉毒素的活性物質的方法非常重要。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種適合于從微生物發(fā)酵產物、植物提取物、天然產物、化學合成產物等物質中微量、直觀、快速、安全、低成本篩選出能高效抑制黃曲霉毒素產生的活性物質的方法。
[0005]本發(fā)明解決上述技術問題采用的技術方案是:一種定量快速篩選抑制黃曲霉毒素產生的活性物質的方法，其特征包括如下步驟:
(1)所使用的黃曲霉毒素指不囷株為寄生曲霉DM囷株；
(2)所使用的液體培養(yǎng)基配方組成為酵母粉10g，蔗糖50g，去離子水100mL；
(3)將一定質量或濃度的微生物發(fā)酵產物、植物提取物、天然產物、或化學合成產物，力口入上述液體培養(yǎng)基中，混勻后取200-500微升加入到微量液體培養(yǎng)器中作為處理組，同時取200-500微升空白培養(yǎng)液加入到另一微量液體培養(yǎng)器中作為對照組；
(4)向微量液體培養(yǎng)器中無菌操作接入5-10微升寄生曲霉DM菌株的分生孢子懸液，在28度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-6天后，觀測培養(yǎng)結果；
(5)目測處理組和對照組的寄生曲霉DM菌株的菌絲生長和橘紅色降散盤衣酸的產生狀況，凡是能抑制DM菌株菌絲中橘紅色降散盤衣酸的產生和/或菌絲生長的處理組，即含有能抑制黃曲霉毒素產生的活性物質；
(6)定量測定抑毒率和抑菌率，將目測有抑制效果的微量液體培養(yǎng)器置入離心機中，在1000轉/分下離心I分鐘后，稱量處理組和對照組的菌絲體鮮重，計算抑菌率；然后，將菌絲體置入甲醇/氫氧化鈉(體積重量比為9:1)溶液中，提取菌絲體中的橘紅色降散盤衣酸30-40分鐘，在分光光度計中于560nm處測量處理組和對照組的提取液的吸光值，計算抑毒率；
(7)根據抑毒率和/或抑菌率的計算結果，選擇抑制率在90-100%的處理組為具有顯著抑制黃曲霉毒素產生的活性物質。
[0006]本發(fā)明的顯著特點在于第一是使用寄生曲霉DM菌株為指示菌株，DM菌株具有在菌絲體中累積人眼睛可見的橘紅色的黃曲霉毒素生物合成途徑中的中間產物降散盤衣酸的能力，因此，可以通過眼睛直接觀察寄生曲霉DM菌株的菌絲體中是否顯示橘紅色而判斷是否有中間產物降散盤衣酸的產生，進而進一步判斷是否有黃曲霉毒素的產生，凡是能抑制橘紅色降散盤衣酸產生的物質，即是抑制黃曲霉毒素產生的活性物質，因此，結果觀察直觀、簡單、方便、快速；第二菌絲體中積累的橘紅色降散盤衣酸可被甲醇/氫氧化鈉溶液提取，并可在560nm處測量其吸光值，根據與對照的吸光值的差異，可以定量計算活性物質的抑毒率，從而篩選出高活性抑制黃曲霉毒素的活性物質；第三是對抑制效果的定量檢測，只需一臺可見光分光光度計，不需要高效液相色譜等昂貴復雜的儀器設備，且從提取到分光光度值的測定可在I小時內完成，具有快速、低成本的特點，可對大量物質進行篩選；第四是DM菌株可產生黃曲霉毒素生物合成途徑中的中間產物降散盤衣酸，但不產生黃曲霉毒素，因此，不會對環(huán)境和操作人員帶來黃曲霉毒素的危害，因此，該發(fā)明操作安全，且結果可?目。

【具體實施方式】
[0007]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
[0008]實施例1:抑制黃曲霉毒素的微生物發(fā)酵產物的篩選
將含有微生物發(fā)酵產物的無細胞發(fā)酵上清原液按1:1的體積比(上清原液:液體培養(yǎng)基)加入到2倍濃縮的液體培養(yǎng)基中作為處理組，對照組用無菌水替代微生物發(fā)酵產物的無細胞發(fā)酵上清原液；無菌操作混勻后，取200微升加入到微量液體培養(yǎng)器中，分別向處理組和對照組微量液體培養(yǎng)器中接種5微升寄生曲霉DM菌株的分生孢子懸液，于28度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；肉眼觀察處理組和對照組的DM菌株生長情況和橘紅色降散盤衣酸的產生情況，將無橘紅色降散盤衣酸產生的處理組或橘紅色的程度明顯低于對照組的處理組，以及對照組，置入離心機中，在1000轉/分下離心I分鐘后，稱量處理組和對照組的菌絲體鮮重，計算抑菌率，抑菌率=(對照組菌絲體鮮重-處理組菌絲體鮮重)/對照組菌絲體鮮重X100% ;然后，將菌絲體置入甲醇/氫氧化鈉(體積重量比為9:1)溶液中，提取菌絲體中的橘紅色降散盤衣酸30分鐘，在分光光度計中于560nm處測量處理組和對照組的提取液的吸光值，計算抑毒率，抑毒率=(對照組的0D560-處理組的0D560)/對照組0D560xl00% ;選擇抑制率在90-100%的處理組為具有顯著抑制黃曲霉毒素產生的微生物發(fā)酵產物。
[0009]實施例2:抑制黃曲霉毒素的化學合成產物的篩選
將化學合成產物碳-12、碳-14和碳-16三種化合物用無菌水配制成適宜濃度的溶液，無菌操作加入液體培養(yǎng)基中，配制成含藥濃度分別為0、6.25、12.5、25、50和10ppm的液體培養(yǎng)基；取500微升加入到微量液體培養(yǎng)器中，接種10微升寄生曲霉DM菌株的分生孢子懸液，于28度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天；肉眼觀察不同藥物濃度的微量液體培養(yǎng)器中的DM菌株生長情況和橘紅色降散盤衣酸的產生情況，將微量液體培養(yǎng)器置入離心機中，在1000轉/分下離心I分鐘后，將菌絲體置入甲醇/氫氧化鈉(體積重量比為9:1)溶液中，提取菌絲體中的橘紅色降散盤衣酸40分鐘，在分光光度計中于560nm處測量各個含藥物組和不含藥物組的提取液的吸光值，計算抑毒率，抑毒率=(不含藥物組的0D560-含藥物組的0D560)/不含藥物組的0D560xl00% ;該實例中，碳-12化學合成產物在10ppm下對橘紅色降散盤衣酸產生的抑制率為68.3%、碳-14化學合成產物在10ppm下對橘紅色降散盤衣酸產生的抑制率為100%，在12.5ppm濃度下為42.6%、碳-16化學合成產物在10ppm下對橘紅色降散盤衣酸產生的抑制率為100%，在12.5ppm下的抑制率也為100%，在6.25ppm下的抑制率為83.8%，因此，篩選出碳-16化學合成產物是最有效的抑制黃曲霉毒素產生的化學合成產物。
【權利要求】
1.一種定量快速篩選抑制黃曲霉毒素產生的活性物質的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)所使用的黃曲霉毒素指不囷株為寄生曲霉DM囷株； (2)所使用的液體培養(yǎng)基配方組成為酵母粉10g，蔗糖50g，去離子水100mL； (3)將一定質量或濃度的微生物發(fā)酵產物、植物提取物、天然產物、或化學合成產物，力口入上述液體培養(yǎng)基中，混勻后取200-500微升加入到微量液體培養(yǎng)器中作為處理組，同時取200-500微升空白培養(yǎng)液加入到另一微量液體培養(yǎng)器中作為對照組； (4)向微量液體培養(yǎng)器中無菌操作接入5-10微升寄生曲霉DM菌株的分生孢子懸液，在28度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-6天后，觀測培養(yǎng)結果； (5)目測處理組和對照組的寄生曲霉DM菌株的菌絲生長和橘紅色降散盤衣酸的產生狀況，凡是能抑制DM菌株菌絲中橘紅色降散盤衣酸的產生和/或菌絲生長的處理組，即含有能抑制黃曲霉毒素產生的活性物質； (6)定量測定抑毒率和抑菌率，將目測有抑制效果的微量液體培養(yǎng)器置入離心機中，在1000轉/分下離心I分鐘后，稱量處理組和對照組的菌絲體鮮重，計算抑菌率；然后，將菌絲體置入甲醇/氫氧化鈉(體積重量比為9:1)溶液中，提取菌絲體中的橘紅色降散盤衣酸30-40分鐘，在分光光度計中于560nm處測量處理組和對照組的提取液的吸光值，計算抑毒率； (7)根據抑毒率和/或抑菌率的計算結果，選擇抑制率在90-100%的處理組為具有顯著抑制黃曲霉毒素產生的活性物質。
【文檔編號】C12Q1/18GK104293882SQ201410508087
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權日:2014年9月29日
【發(fā)明者】閆培生, 王凱, 曹立新, 高秀君, 吳晗琪 申請人:哈爾濱工業(yè)大學（威海）