專利名稱：一種黃曲霉毒素b1降解劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家禽養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉毒素BI降解劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
全世界每年因霉菌毒素污染的糧食作物占糧食總產(chǎn)量得1/4以上，采取措施抑制霉菌毒素的產(chǎn)生并對污染的糧食和飼料進行脫毒處理，是減少損失及保護動物和人類健康的迫切要求。目前在動物生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的脫毒方法是通過添加吸附劑的方法對被污染的糧食和飼料作物進行脫毒處理。但是這種方法多是吸附劑與霉菌毒素的螯合，雖然可以有效的吸附霉菌毒素，但是這種簡單的吸附在條件改變時霉菌毒素極易從吸附劑上解離且毒性依然存在，同時吸附劑還會吸附飼料中的一些營養(yǎng)物質(zhì)而影響其利用率。因此采取更為有效和安全的方法對霉菌毒素進行脫毒處理便成為解決問題的關(guān)鍵。采用微生物降解霉菌毒素，由于其具有效率高、無殘留、成本低廉和操作簡便等優(yōu)點引起了研究人員的廣泛關(guān)注，尤其是利用微生物或者其產(chǎn)生的酶將霉菌毒素降解為無毒產(chǎn)物更成為目前研究的熱點。對被霉菌毒素污染的糧食作物和飼料進行脫毒處理是擴大飼料資源、降低損失的有效方法，而如果能采取措施抑制原料儲藏過程中霉菌的生長，則可從源頭上減少霉菌毒素產(chǎn)生。因此可以考慮利用微生物之間的競爭作用，將具有抑制霉菌生長的微生物或其代謝產(chǎn)物按比例添加到飼料原料中抑制霉菌的生長，進而抑制毒素的產(chǎn)生，從而達到預(yù)防畜
禽霉菌毒素中毒的目的。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種黃曲霉毒素BI降解劑，在對AFB1有降解作用的益生菌和降解酶的基礎(chǔ)上，將益生菌與AFB1降解酶配合應(yīng)用于肉雞生產(chǎn)中，觀察其對肉雞飼料中AFB1的解毒效果并探索其解毒機理，為其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。其技術(shù)方案如下:一種黃曲霉毒素B1降解劑，包括成分a和成分b，其組合比例為2: 3，其中所述成分a的制備方法為:乳酪桿菌CGMCC1.62、枯草芽孢桿菌CGMCC1.504、異常漢遜酵母CGMCC2.881，單獨培養(yǎng)48h后，以2: I: I的比例混合后加載體低溫干燥。所述成分b的制備方法為:以AFB1作為碳源和能源進行AFB1降解菌株的篩選，經(jīng)過26S rDNA的鑒定結(jié)果顯示，篩選到降解AFB1的真菌為米曲霉，在中國微生物菌種保藏中心的登記編號為CGMCC5817，對降解AFB1的真菌進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，提取AFBi降解酶粗酶液，加入載體后低溫干燥。成分a和成分b，按2: 3比例混合后制成黃曲霉毒素BI降解劑，其中乳酪桿菌、枯草芽孢桿菌和異常漢遜酵母三種菌的含量分別為2 X IO9個/g、I X IO9個/g和I X IO9個Zg^AFB1降解酶活力為135U/g。AFB1降解酶活力的定義為:在37°C的條件下每分鐘降解IngAFB1為一個酶活單位。
發(fā)明所述黃曲霉毒素B1降解劑在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過篩選得到對黃曲霉菌生長及AFB1降解效果較好的菌株，并對AFB1降解酶進行分離純化，之后將益生菌與AFB1降解酶配合應(yīng)用于肉雞生產(chǎn)中，觀察其對肉雞飼料中AFB1的解毒效果，最后運用基因芯片對肝臟中相關(guān)基因表達量進行了測定，為AFB1降解在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用，以及從基因水平上研究AFB1的致病機制并采取措施緩解其危害奠定了基礎(chǔ)。


圖1為益生菌組合與AFB1降解酶粗酶液配伍對AFB1的降解作用示意圖，A、B、C表示的是統(tǒng)計分析中差異顯著性，其中大寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)，有一個大寫字母相同表示差異不顯著(P > 0.05)；
具體實施例方式下面結(jié)合附圖具體實施方式
對本發(fā)明的方法作進一步詳細地說明。1、試驗菌株及材料實驗所用的乳酪桿菌(Lactobacillus casei)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、異常漢遜酵母(Hansenula anomala)均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，并由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與動物營養(yǎng)研究室保存。黃曲霉毒素BI購自Sigma公司，其測定采用德國RIDASCREEN公司Aflatoxin BI 30/15酶聯(lián)免疫測定試劑盒。2、單一益生菌的制備(I)乳酪桿菌培養(yǎng)液的制備:按4% (v/v)的接種量在MRS培養(yǎng)基中接種乳酪桿菌，置于37°C恒溫靜止培養(yǎng)，待培養(yǎng)48h時收獲。調(diào)節(jié)菌的含量為I X 109CFU/mL。(2)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的制備:按4% (v/v)的接種量在LB培養(yǎng)基中接種枯草芽孢桿菌，置于37°C恒溫振蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/分)，待培養(yǎng)48h時收獲。調(diào)節(jié)菌的含量為lX109CFU/mL。(3)異常漢遜酵母培養(yǎng)液的制備:按4% (v/v)的接種量在LB培養(yǎng)基中接種異常漢遜酵母，置于30°C恒溫振蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)，待培養(yǎng)48h時收獲。調(diào)節(jié)菌的含量為 lX109CFU/mL。其中，MRS培養(yǎng)基的組成:胰蛋白胨10g、牛肉蛋白胨10g、酵母5g、葡萄糖20g、K2HPO4 2g、乙酸鈉5g、檸檬酸銨2g、MgSO4 0.2g、MnSO4 0.05g，用800mL蒸餾水溶解后加入ImL Tween80，調(diào) pH 為 6.2 6.6，之后定容至 IOOOmL,在 121。。、1.034X IO5Pa 條件下高壓蒸汽滅菌20min ；LB培養(yǎng)基的組成:胰蛋白胨10g，酵母5g，NaCl 10g，用800mL蒸餾水溶解后調(diào)pH為7.0，之后定容至IOOOmL,在121 °C、1.034X IO5Pa條件下高壓蒸汽滅菌20min。3、AFB1降解菌株的篩選以AFB1作為碳源和能源進行AFB1降解菌株的篩選。經(jīng)過26S rDNA的鑒定結(jié)果顯示，篩選到降解AFB1的真菌為米曲霉，在中國微生物菌種保藏中心的登記編號為CGMCC5817。
4、降解AFB1的米曲霉所產(chǎn)粗酶液的提取挑取降解AFB1米曲霉菌株，將其涂布于PDA固體平皿，置于30°C恒溫培養(yǎng)至孢子大量產(chǎn)生時收獲(約96h)。在平皿中加入適量滅菌生理鹽水(含體積分數(shù)0.05%的TweenSO)，用涂布棒將平皿上的孢子刮下，用四層紗布過濾以除去菌絲殘體，將孢子濃度調(diào)整為I X 108CFU/mL,按每瓶5mL接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻后置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后收獲。按照固液比1: 2的比例將固體發(fā)酵培養(yǎng)物與生理鹽水混合均勻，室溫浸泡Ih (浸泡過程中間斷攪拌)。浸泡完成后先用8層紗布過濾發(fā)酵培養(yǎng)物，之后將濾液IOOOOXg條件下離心5min,再用定性濾紙過濾,最后用0.20 μ m的濾膜過濾除菌后保存于4°C冰箱，即為米曲霉所產(chǎn)降解AFB1的粗酶液。5、粗酶液對AFBi的降解作用選取粗酶液6mL (另取6mL高溫滅活的粗酶液作為對照組)，加入AFB1使其濃度約為100 μ g/L，混合均勻后置于30°C恒溫培養(yǎng)，48h后取樣測定其中AFB1含量。經(jīng)測定粗酶液對AFB1的降解率為77.05%。經(jīng)過熱變性試驗證明AFBi降解酶的粗酶液為蛋白質(zhì)。6、益生菌與粗酶液配合對AFB1的降解作用(I)試驗設(shè)計將益生菌組合(按上文推薦的比例組合，每種菌的含量為lX109CFU/mL)與降解AFB1粗酶液按表I的組合比例進行調(diào)配，使反應(yīng)體系的最終體積均為60mL。加入AFB1使其在體系中的最終濃度約為50μ g/L，將其置于37°C恒溫氣浴振蕩器中振蕩培養(yǎng)。以相同體積的PBS緩沖液加同等劑量的AFB1作為空白對照。表I益生菌組合與降解AFB1粗酶液配伍對AFBl的降解的試驗設(shè)計
權(quán)利要求
1.一種黃曲霉毒素B1降解劑，其特征在于，包括成分a和成分b，其組合比例為2: 3，其中: 所述成分a的制備方法為:乳酪桿菌CGMCC1.62、枯草芽孢桿菌CGMCC1.504、異常漢遜酵母CGMCC2.881，單獨培養(yǎng)48h后，以2: I: I的比例混合后加載體低溫干燥； 所述成分b的制備方法為:以AFB1作為碳源和能源進行AFB1降解菌株的篩選，經(jīng)過26SrDNA的鑒定結(jié)果顯不，篩選到降解AFB1的真囷為米曲霉，在中國微生物囷種保減中心的登記編號為CGMCC5817，對降解AFB1的真菌進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，提取AFBi降解酶粗酶液，力口入載體后低溫干燥； 成分a和成分b，按2: 3比例混合后制成黃曲霉毒素BI降解劑，其中乳酪桿菌、枯草芽孢桿菌和異常漢遜酵母三種菌的含量分別為2 X IO9個/g、I X IO9個/g和I X IO9個/g，AFB1降解酶活力為135U/g，AFB1降解酶活力的定義為:在37°C的條件下每分鐘降解IngAFB1為一個酶活單位。
2.權(quán)利要求1所述黃曲霉毒素B1降解劑在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃曲霉毒素B1降解劑，包括成分a和成分b，其組合比例為2∶3，其中所述成分a的制備方法為乳酪桿菌CGMCC1.62、枯草芽孢桿菌CGMCC1.504、異常漢遜酵母CGMCC2.881，單獨培養(yǎng)48h后，以2∶1∶1的比例混合后加載體低溫干燥。所述成分b的制備方法為以AFB1作為碳源和能源進行AFB1降解菌株的篩選，經(jīng)過26S rDNA的鑒定結(jié)果顯示，篩選到降解AFB1的真菌為米曲霉，在中國微生物菌種保藏中心的登記編號為CGMCC5817，對降解AFB1的真菌進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，提取AFB1降解酶粗酶液，加入載體后低溫干燥。本發(fā)明為黃曲霉毒素B1降解劑在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用，以及從基因水平上研究AFB1的致病機制并采取措施緩解其危害奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/245GK103190538SQ201310067190
公開日2013年7月10日 申請日期2013年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月23日
發(fā)明者尹清強, 左瑞雨, 王平, 常娟, 鄭秋紅, 劉智勇, 范首武 申請人:鄭州歐克拜生物技術(shù)有限公司