專利名稱：用于elisa檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物、其制備方法及黃曲霉毒素elisa檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬黃曲霉毒素檢測領(lǐng)域，具體涉及用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物、其制備方法及黃曲霉毒素ELISA檢測方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素主要是由黃曲霉菌寄生曲霉菌
parasiticus)和集蜂曲霉菌(Aspergillus nonius)產(chǎn)生的一組高毒和強(qiáng)致癌的次生代謝產(chǎn)物，主要有黃曲霉毒素BI (Aflatoxin B1, AFB1),黃曲霉毒素Ml (Aflatoxin M1, AFM1),黃曲霉毒素Gl (Aflatoxin GpAFG1X其廣泛存在于各種農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料中，嚴(yán)重污染花生、稻米、玉米、小麥等糧油產(chǎn)品，極大威脅人民的身體健康和生命安全。由于黃曲霉毒素 對人類的潛在威脅日趨嚴(yán)重，世界上已有100多個國家對農(nóng)產(chǎn)品食品中黃曲霉毒素的含量進(jìn)行了嚴(yán)格的限量要求。因此迫切需要操作簡單、快速、高通量的檢測技術(shù)對污染物進(jìn)行監(jiān)控、檢測。免疫學(xué)檢測技術(shù)具有靈敏度高、樣品前處理簡單、操作方便的特點(diǎn)。其中酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)具有檢測通量高、樣品需要量少的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品及農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的檢測。由于ELISA法定量時(shí)需要競爭反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測過程中需應(yīng)用大量黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)控，且檢測不同的黃曲霉毒素需要不同的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品。并且，這些高毒強(qiáng)致癌物質(zhì)的使用會對操作人員和環(huán)境帶來極大的危害，且因價(jià)格昂貴、供應(yīng)緊張，經(jīng)常影響檢測過程的進(jìn)行。因此急需一種安全、低成本的ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物會大大降低檢測過程的風(fēng)險(xiǎn)，簡化檢測步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物、其制備方法及黃曲霉毒素ELISA檢測方法。該標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物無毒無害，可分別通過替代黃曲霉毒素ELISA檢測方法中的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品來定量檢測樣品中各相應(yīng)黃曲霉毒素濃度。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物，其特征在于它為可識別各鼠源抗黃曲霉毒素單克隆抗體的兔抗鼠抗體。按上述方案，所述抗黃曲霉毒素單克隆抗體優(yōu)選為抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體、抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體。用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的制備方法，其特征在于它是以鼠源抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體、抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體作為混合抗原，經(jīng)免疫新西蘭長耳大白兔，頸動脈取血，血清親和純化后獲得的。按上述方案，所述的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體為由保藏編號為CCTCC NO.C201014 的雜交瘤細(xì)胞株3G1分泌產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體3G1 ;所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為由保藏編號為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體2C9，所述的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體1C8為由保藏編號為CCTCC NO. C201017的雜交瘤細(xì)胞株1C8分泌產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體1C8 ;所述抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體3G1，抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體2C9和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體1C8為等摩爾量配比作混合抗原。用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物在黃曲霉毒素ELISA檢測中的應(yīng)用。黃曲霉毒素ELISA檢測方法，其特征在于它包括以下步驟
(1)采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，將標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物取代各黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別建立各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程a Cx1, Yl), ——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率；
(2)采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，測定待測樣品的抑制率；
(3)將步驟(2)得到的待測樣品抑制率相應(yīng)代入步驟(I)的曲線方程中，然后將計(jì)算得到的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度結(jié)果代入各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b Cx1, X2),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——，計(jì)算得到待測樣品中各相應(yīng)黃曲霉毒素的濃度。按上述方案，所述步驟(3)為相應(yīng)結(jié)合各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程a (X1, Y1),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率——，和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b (XljX2),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——，得到在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線下抑制率與各相應(yīng)黃曲霉毒素濃度的曲線方程e Cy1,X2), —Y1為抑制率，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素濃度；
將步驟(2)得到的待測樣品抑制率代入上述曲線方程e (yi，x2)，計(jì)算得到待測樣品中各相應(yīng)黃曲霉毒素的濃度。按上述方案，所述步驟(3)中的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b (X1, X2),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——，是采用以下方法得到的
①采用常規(guī)間接競爭ELISA方法分別建立各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程c (x2, y2),——X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，y2為抑制率；
②采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，將標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物替代各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別建立各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程d(Xl，yi)，——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率；
③相應(yīng)結(jié)合各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品分析曲線方程c(x2, y2)和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程d (Xl，yi)，得到各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b Cx1, X2),——Xl為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。所述各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b (Xl，X2)是恒定不變的，在后續(xù)檢測實(shí)驗(yàn)中無需重新建立。按上述方案，所述步驟③為相應(yīng)結(jié)合各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品分析曲線方程c(x2, y2), X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，y2為抑制率，和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程d Cx1, Y1),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率——，計(jì)算20% 80%的抑制率范圍內(nèi)同一抑制率所對應(yīng)的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度，然后以各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度X2為橫坐標(biāo)，各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度X1為縱坐標(biāo)，分別作圖擬合而得到各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b Cx1, X2),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物 的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。按上述方案，所述的常規(guī)間接競爭ELISA法中抑制率的測定方法如下取包被各黃曲霉毒素相應(yīng)的黃曲霉毒素完全抗原的微孔包被板，加入各黃曲霉毒素相應(yīng)的抗黃曲霉毒素單克隆抗體，然后加入待測樣品或各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物，反應(yīng)后，洗滌液洗滌，加酶標(biāo)記羊抗鼠二抗，進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌后，加顯色液，暗處靜置后加終止液，在450 nm下測定光吸收值，根據(jù)待測孔光吸收值為B，對照孔的光吸收值為Btl，計(jì)算抑制率為B/Bm按上述方案，所述各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程d (XijY1),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，yi為抑制率——的建立中，各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度布設(shè)范圍為0. 4-100 u g/mL。以待測樣品中黃曲霉毒素BI測量為例，黃曲霉毒素BI的ELISA典型檢測方法為
(1)黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程bCx1,X2)的建立，X1為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；
(I. I)采用常規(guī)間接競爭ELISA方法建立黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程c (x2, J2),——X2為黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，y2為抑制率；
(I. 2)采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，將標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物取代黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品，建立黃曲霉毒素BI相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程d Cxij7i),——X1為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率；
(I. 3)結(jié)合黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品分析曲線方程c (x2，y2)和其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程d (X1J1)，計(jì)算20% 80%的抑制率范圍內(nèi)同一抑制率所對應(yīng)的黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度，然后以黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度X2為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度X1為縱坐標(biāo)，作圖擬合而得相應(yīng)的黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b Cx1, X2),——X1為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品；
(2)采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，將標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物取代黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品，建立黃曲霉毒素BI相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程a Cxij7i),——X1為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率；
(3)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程aCx1, Yl),——X1為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率——，和黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的換算方程b (X1, x2),——X1為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——，得到在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線下抑制率與黃曲霉毒素BI濃度的曲線方程e Cy1, x2),——Y1為抑制率，X2為黃曲霉毒素BI濃度；
(4)采用常規(guī)間接競爭ELISA法，測定待測樣品的抑制率；
(5)將步驟(4)得到的待測樣品抑制率代入上述曲線方程eCy1, x2)，計(jì)算得到待測樣品中黃曲霉毒素BI的濃度。在待測樣品中黃曲霉毒素BI的首次檢測中，步驟(2)中的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程a (Xl，yi)可直接采取步驟(I. 2)得到的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程d (Xl，yi)，無需重復(fù)。在后續(xù)檢測分析中，因黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程是恒定不變的，可直接采用預(yù)先建立的黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b(X1, X2),而無需為獲得黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程重新建立黃曲 霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程c (x2，y2)，減少了黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品使用環(huán)節(jié)，降低黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品的使用對環(huán)境造成的危害，降低檢測成本，簡化操作步驟。其它黃曲霉毒素的分析檢測亦如此。傳統(tǒng)的競爭性ELISA定量模式是基于樣品中游離黃曲霉毒素與包被于酶標(biāo)板上的固定黃曲霉毒素抗原競爭結(jié)合抗黃曲霉毒素單克隆抗體，樣品中的游離黃曲霉毒素越多，與黃曲霉毒素單克隆抗體競爭結(jié)合越多，留在酶標(biāo)板上與固定抗原結(jié)合的抗黃曲霉毒素單克隆抗體越少，則可結(jié)合在抗黃曲霉毒素單克隆抗體上的酶標(biāo)二抗也越少，最終顯色程度越弱。本發(fā)明基于的工作模式為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物與酶標(biāo)二抗競爭結(jié)合抗黃曲霉毒素單克隆抗體，標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物越多，最終結(jié)合到抗黃曲霉毒素單克隆抗體上的酶標(biāo)二抗就越少，顯色反應(yīng)時(shí)酶越少，顯色程度越弱。由此可知，標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品之間存在著正相關(guān)的關(guān)系，只要探明二者之間量的對應(yīng)關(guān)系，即可將標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物替代黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行ELISA分析曲線的校準(zhǔn)，檢測黃曲霉毒素含量。由于標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物為黃曲霉毒素單克隆抗體的非標(biāo)記二抗，其可識別各抗黃曲霉毒素單克隆抗體包括抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體、抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體，因此該標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物能夠應(yīng)用于基于各黃曲霉毒素的ELISA檢測方法中包括黃曲霉毒素BI、黃曲霉毒素Ml和抗黃曲霉毒素G1，具有通用性。本發(fā)明的有益效果在于
(1)該黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的本質(zhì)是一種抗體，無毒，對人體無害，成本
低；
(2)在黃曲霉毒素檢測中，應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物進(jìn)行ELISA分析曲線校準(zhǔn)，減少了劇毒強(qiáng)致癌的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品使用環(huán)節(jié)，有利于保護(hù)操作人員身體不受黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的侵害；降低各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的使用對環(huán)境造成的危害；降低檢測成本；
(3)基于該標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的ELISA檢測方法具有通用性，可用于檢測各種黃曲霉毒素，如黃曲霉毒素B1、G1和Ml。


圖I 各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線，圖中_ ■ _AFBl ；- ▼ -AFGl ；- - AFMl ；
圖2 各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn) 品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線，圖中-■- mab:3G1 ；- ▼ -mab: 2C9 ；- - mab: 1C8 ；
圖3黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度與標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度間的對應(yīng)關(guān)系曲線；
圖4黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品濃度與標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度間的對應(yīng)關(guān)系曲線；
圖5黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度與標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度間的對應(yīng)關(guān)系曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的制備
I.雜交瘤細(xì)胞株3G1，該細(xì)胞株已于2010年7月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO. C201014。其篩選方法，抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體的制備及其亞型特性如下
(I)雜交瘤細(xì)胞株3G1的篩選
①抗原合成及動物免疫
購買市售黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行完全抗原合成，具體合成步驟如下將4 mg AFBl溶于2 mL丙酮，加入40 UL 10% H2SO4Jg合物在56 V攪拌反應(yīng)4 h;產(chǎn)物蒸干后，加入5 mL的1120，用25 mL氯仿提取兩次，然后用20 mL H2O洗滌有機(jī)層，保留有機(jī)層；蒸去有機(jī)溶劑，得黃色固體產(chǎn)物。取I. 0 mg產(chǎn)物，向其中加入2 mL 0. 5% BSA溶液(4 mL PBS (磷酸鹽緩沖液，PH7. 4)溶解 20 mg BSA) 37 °C反應(yīng) 30 min ;加入 100 U L 6. 5 mM NaBH4,4°C反應(yīng)30 min ;加入50 u L 0. IM HCl，除去過量的NaBH4。在4°C條件下，PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7. 4)透析3d，除去AFBl及AFB2a，最后進(jìn)行常規(guī)紫外掃描法鑒定，鑒定結(jié)果表明制備得到了黃曲霉毒素BI完全抗原AFB2a-BSA。購買6周齡雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黃曲霉毒素BI完全抗原AFB2a-BSA。第一次免疫將完全抗原AFB2a-BSA與等量福氏完全佐劑混合乳化，然后小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于首免4周后進(jìn)行，采用福氏不完全佐劑與等體積完全抗原AFB2a-BSA乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔時(shí)間4周，免疫方式及劑量與第二次相同，第四次免疫于第三次免疫3周后進(jìn)行，免疫方式及免疫劑量與第二次免疫相同，每次免疫劑量為每鼠50ii g。前3次每次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價(jià)。第4次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價(jià)，并用間接競爭ELISA法測定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對較高的血清對應(yīng)的小鼠進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為之前的2倍。AFBl 購于 Sigma-Aldrich 公司。②細(xì)胞融合
最后一次加強(qiáng)免疫3天后，采用50% (重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即PEG (分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下
頸椎脫白法處死免疫小鼠，在無菌條件下取脾臟，分離脾細(xì)胞，與鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5 : I的個數(shù)比混合，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，然后用50%PEG融合，融合時(shí)間I分鐘，然后加滿RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，移去上清，小鼠脾細(xì)胞和鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0形成的融合細(xì)胞用72mL RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，將重懸起來的細(xì)胞滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，2滴/孔，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有20% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，2% (重量百分?jǐn)?shù))生長因子和1% (重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷。上述SP2/0購于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液購于Hyclone公司；1%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)購于 Sigma-Aldrich 公司。③細(xì)胞株的篩選及克隆
待細(xì)胞融合后第12天左右，細(xì)胞集落長到占孔底1/2面積大小，培養(yǎng)液變黃，即可進(jìn)行抗體檢測。采用ELISA方法對有雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選，篩選分兩步進(jìn)行，第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素BI而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔進(jìn)行檢測，用黃曲霉毒素BI作為競爭原，選擇 吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競爭原為0的孔即陰性對照孔的最終測定值較高，靈敏度較高指抑制率為50%時(shí)的競爭原濃度亦即IC5tl值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測，如此重復(fù)克隆2-3次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株 3G1。(2)抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株系3G1抗體可變區(qū)序列測定
①提取總RNA:采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株系3G1的總RNA ；
②合成cDNA:以步驟I獲得的總RNA為模板，oligo (dT) 15為引物，按照SuperScript -2 II反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈；引物oligo (dT) 15由Invitrogen 購得；
③PCR法克隆可變區(qū)基因根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模版擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序?yàn)?4°C 30s,55°C lmin、72°C Imin，擴(kuò)增30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)過I % (重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接到載體pMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。其中引物的序列分別為重鏈可變區(qū)引物為 5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3’(22mer)和 5'-TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，輕鏈可變區(qū)引物為 5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC _3’(24mer)和 5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。得到的基因序列結(jié)果重鏈可變區(qū)編碼基因序列長347bp，序列如SEQ ID NO: I所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由115個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長338bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由110個氨基酸組成，序列如 SEQ ID NO:4 所示。(3)抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體的制備、亞型及特性鑒定
將抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株系3G1注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 u L,室溫混合30min，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7. 4,4 °C預(yù)冷,緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0. 277g/mL，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株3G1分泌的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體的亞型為IgG2a。用常規(guī)非競爭酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測得3G1的鼠腹水抗體的效價(jià)可達(dá)
6.4X106,即鼠腹水抗體稀釋6. 4X IO6倍時(shí)的溶液測定結(jié)果為陽性。用常規(guī)間接競爭ELISA法鑒定其對黃曲霉毒素BI的靈敏度為I. 6ng/mL，與黃曲霉毒素B2交叉反應(yīng)率為6. 4%，黃曲霉毒素Gl與G2的交叉反應(yīng)率均小于1%。2.雜交瘤細(xì)胞株1C8，該細(xì)胞株已于2010年7月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO. C201017。其篩選方法，抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體的制備及其亞型特性如下
(I)雜交瘤細(xì)胞株1C8的制備
①抗原合成及動物免疫
購買市售黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)CN101270146.X中的具體實(shí)施方式
的實(shí)施例I中公開的AFGl-BSA的合成方法進(jìn)行AFGl-BSA完全抗原的合成；
購買6周齡雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黃曲霉毒素Gl完全抗原AFG1-BSA。第一次免疫將完全抗原AFGl-BSA與等量福氏完全佐劑混合乳化，然后小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第二次免疫于首免4周后進(jìn)行，采用福氏不完全佐劑與等體積完全抗原AFGl-BSA乳化，小鼠腹腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔時(shí)間4周，免疫方式及劑量與第二次相同，第四次免疫于第三次免疫3周后進(jìn)行，免疫方式及免疫劑量與第二次免疫相同，每次免疫劑量為每鼠50 ii g。前3次每次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價(jià)。第4次免疫后一周，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測小鼠血清抗體效價(jià)，并用間接競爭ELISA法測定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對較高的血清對應(yīng)的小鼠進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為之前的2倍。②細(xì)胞融合
于最后一次加強(qiáng)免疫3天后，采用50%(重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450)作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟無菌條件下殺死免疫小鼠，分離脾細(xì)胞，與鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5 : I的個數(shù)比混合，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，用、50%PEG融合，融合I分鐘，然后加滿RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，移去上清，小鼠脾細(xì)胞和鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0形成的融合細(xì)胞用72mLRPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，將重懸起來的細(xì)胞滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，2滴/孔，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有20% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，2% (重量百分?jǐn)?shù))生長因子和1% (重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0購于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液購于Hyclone公司；1%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即 HAT 購于 Sigma-Aldrich 公司。③細(xì)胞株的篩選及克隆待細(xì)胞融合后第12天左右，細(xì)胞集落長到占孔底1/2大小，培養(yǎng)液變黃，即可進(jìn)行抗體檢測。采用ELISA方法對有雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)孔進(jìn)行 篩選，篩選分兩步進(jìn)行，第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素Gl而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔進(jìn)行檢測，用黃曲霉毒素Gl作為競爭原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競爭原為0的孔即陽性對照孔的最終測定值較高，靈敏度較高指抑制率為50%時(shí)的競爭原濃度亦即IC5tl值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測，如此重復(fù)克隆2-3次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株1C8。(2)抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株系1C8抗體可變區(qū)序列測定
①提取總RNA:采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株系1C8的總RNA ；
②合成cDNA:以步驟I獲得的總RNA為模板，oligo (dT) 15為引物，按照SuperScript -2 II反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一鏈；引物oligo (dT) 15由Invitrogen 購得；
③PCR法克隆可變區(qū)基因根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模版擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序?yàn)?4°C 30s,55°C lmin、72°C Imin，擴(kuò)增30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1% (重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接到載體PMD18-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序。其中引物的序列分別為重鏈可變區(qū)引物為 5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3’(22mer)和 5'-TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，輕鏈可變區(qū)引物為 5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC _3’(24mer)和 5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。得到的基因序列結(jié)果輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長332bp，序列如SEQ ID NO: I所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由110個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:3所示。重鏈可變區(qū)編碼基因序列長362bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由120個氨基酸組成，序列如 SEQ ID NO:4 所示。(3)抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將實(shí)施例2獲得的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株系1C8注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 u L，室溫混合30min，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7. 4，4°C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0. 277g/mL, 4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。
用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株1C8分泌的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體的亞型為IgG2a。用常規(guī)非競爭酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測得1C8的鼠腹水抗體的效價(jià)可達(dá)8. 19X105，即鼠腹水抗體稀釋8. 19X IO5倍時(shí)的溶液測定結(jié)果為陽性。用常規(guī)間接競爭ELISA法鑒定其對黃曲霉毒素Gl的靈敏度(IC5tl)為13. 92ng/mL，與黃曲霉毒素B1，B2及Ml沒有交叉反應(yīng)。3.標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的制備
將鼠源抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體3G1、抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體2C9和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體1C8等摩爾量混合，并用作混合抗原，采用常規(guī)方法免疫新西蘭長耳大白兔，頸動脈取血，血清親和純化，所純化的血清即為標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物；
所述的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體3G1由保藏編號為CCTCC NO. C201014的雜交瘤細(xì)胞株3G1分泌產(chǎn)生，所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體2C9由保藏編號為CCTCC NO.C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌產(chǎn)生，所述的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體是由保藏編號為CCTCC NO. C201017的雜交瘤細(xì)胞株1C8分泌產(chǎn)生。下述實(shí)施例2-4中
所述包被緩沖液為=Na2CO3 I. 59 g，NaHCO3 2.93 g，加純水定容至I L。所述OVA為卵清白蛋白。所述PBST 溶液為=KH2PO4 0. 2 g, KCl 0. 2 g, Na2HPO4 Iffi2O 2. 9 g, NaCl 8. 0 g,0. 5mL Tween-20，加純水定容至I L。所述顯色液為9. 5 mL底物緩沖液+ 0.5 mL底物使用液+ 32 y L濃度為3%的雙氧水
組成。底物緩沖液為=Na2HPO4 12H20 I. 841 g, C6H7O8 H2O 0. 933 g 溶于 100 mL 超純水中。底物使用液為2 mg TMB溶解在100 mL無水乙醇中。實(shí)施例2花生樣品中黃曲霉毒素BI的測定
(I)標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程的建立 ①黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程首先用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素BI完全抗原(AFB1-OVA, 2 u g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 yL，4 ° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 u L 1.5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板三次，每孔加入50 UL抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體溶液，再加入黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品(2. 4到600 pg/mL)。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次,每孔加入100 U L商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 uL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B,無黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品孔的光吸收值為Btl,抑制率為B/Bm黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品ELISA分析曲線見圖I部分，經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸擬合得黃曲霉毒素BI
標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程為
y2 = 75. 78/[I + (x2/25 . 25 ) 2.37] + 15.89方程(I) 其中I2表示抑制率，X2表示黃曲霉毒素BI濃度。②標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程
用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素BI完全抗原(AFB1-OVA, 2 u g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 uL, 4° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 U L I. 5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)lh。PBST洗板三次，每孔加入50 UL抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體溶液，再加A 50 UL標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物(0. 4到100 u g/mL)。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次，每孔加入100 U L商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 uL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物孔的光吸收值為Btl，抑制率為B/Bm用標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物替代黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品，得到的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線見圖2中■-，，部分，經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸擬合得標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程為
Y1= 86.22 / [I + (Xl/5. 26)L23] + 12.92方程(2)
其中Y1表示抑制率，X1表示標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度。③標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程
根據(jù)方程(I)和方程(2)，計(jì)算出20% 80%抑制率范圍內(nèi)同一抑制率所對應(yīng)的黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度，間隔為5%抑制率。然后以黃曲霉毒素BI濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度為縱坐標(biāo)作圖，得到同一抑制率下黃曲霉毒素BI濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系曲線，見圖3，并經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸分析擬合得到標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系方程
X1 = 98. 26 / [I + (x2/115. 97) 1 89] + 0. 54方程(3)
其中X1表示標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度，X2表示黃曲霉毒素BI濃度。(2 )花生樣品中AFB1濃度的測定
①在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做標(biāo)準(zhǔn)曲線下，抑制率與黃曲霉毒素BI濃度曲線方程根據(jù)方程(2)和(3)求出在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做標(biāo)準(zhǔn)曲線下，抑制率與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線方程為
Y1 = 86.22 / (I + ((98. 26 / (I + (x2/115. 97) 1 89) + 0. 54)/ 5. 26) 1 23) + 12.92方程(4)
其中I1表示抑制率，X2表示黃曲霉毒素BI濃度。②花生樣品中AFBi濃度的測定稱取5 g花生樣品(記為1#)溶于15 mL 80%甲醇水溶液(含4% NaCl )，漩渦30 s混勻，放于超聲波振蕩器中，50 ° C水浴振蕩15 min。取上清過0.45 Pm有機(jī)濾膜。濾液用PBS稀釋10倍，取50 ii L上樣作檢測樣品液。用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素BI完全抗原(AFB1-OVA, 2 U g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 uL, 4° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 u L I. 5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)lh。PBST洗板三次，每孔加入50 UL抗AFB1單克隆抗體溶液，再加入50 UL花生樣品液。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次，每孔加入100 y L商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 uL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無待測樣品孔的光吸收值為Btl，計(jì)算出樣品的抑制率。將花生樣品1#的抑制率值代入方程(4)中，求得花生樣品1#中黃曲霉毒素BI濃度為15. 6吒/kg ;采用農(nóng)業(yè)部公布的標(biāo)準(zhǔn)方法NY/T 1286-2007檢測所得花生樣品1#中黃 曲霉毒素BI濃度為14. 3 Mg/kg,兩個結(jié)果的相對偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的誤差范圍。稱取5 g花生樣品2 (記為2#)溶于15 mL 80%甲醇水溶液(含4% NaCl )，漩渦30s混勻，放于超聲波振蕩器中，50 ° C水浴振蕩15 min。取上清過0. 45 Pm有機(jī)濾膜。濾液用PBS稀釋10倍，取50 ii L上樣作檢測樣品液。根據(jù)如上花生樣品1#的檢測方法測得花生樣品2#的抑制率并代入方程(4)中求得該花生樣品2#中黃曲霉毒素BI的濃度為9. 6呢/kg ;采用農(nóng)業(yè)部公布的標(biāo)準(zhǔn)方法NY/T1286-2007檢測所得花生樣品2#中黃曲霉毒素BI濃度為8. 7呢/kg，兩個結(jié)果的相對偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的誤差范圍。實(shí)施例3花生樣品中黃曲霉毒素Gl濃度的測定
(I)標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程的建立 ①黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品ELISA分析曲線方程
首先用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素Gl完全抗原(AFG1-OVA, 2 u g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 yL，4 ° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 u L 1.5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板三次，每孔加入50 UL抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體溶液，再加入黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品(82. 3到20000pg/mL)。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次，每孔加入100 UL商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 uL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品孔的光吸收值為Btl，抑制率為B/Bm黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線見圖I部分，經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸擬合得黃曲霉
毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程為
y2 = 79. 52/[1 + (x2/3150. 46) 1 03] + 18.59方程(5)
其中I2表示抑制率，X2表示黃曲霉毒素G1。②標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程
用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素Gl完全抗原(AFG1-OVA, 2 u g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 uL, 4° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 U L I. 5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)lh。PBST洗板三次，每孔加入50 UL抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體溶液，再加入50 ii L標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物((0. 4到100 u g/mL)。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次,每孔加入100 UL商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 uL 2 M硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物孔的光吸收值為Btl，抑制率為B/Bm用標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物替代黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線見圖2 ▼-，，部分，經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸擬合得標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程為
Y1= 261.72 / [I + (Xl/471.09)°.37] 149.45方程(6)
其中Y1表示抑制率，X1表示標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度。③標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程 再根據(jù)方程(5)和方程(6)，將20% 80%抑制率范圍內(nèi)同一抑制率所對應(yīng)的黃曲霉毒
素Gl濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度算出，間隔為5%抑制率。然后以黃曲霉毒素Gl濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度為縱坐標(biāo)作圖，得到同一抑制率下所對應(yīng)的黃曲霉毒素Gl濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系曲線，見圖4，并經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸分析擬合得到標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程
X1 = 86.11 / [I + (x2/11200. 22) 1 39] 0.43方程
(7)
其中X1表示標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度，X2表示黃曲霉毒素Gl濃度。(2)花生樣品中AFGl濃度的測定
①在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做標(biāo)準(zhǔn)曲線下，抑制率與黃曲霉毒素Gl濃度曲線方程根據(jù)方程(6)和(7)求出在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做標(biāo)準(zhǔn)曲線下，抑制率與黃曲霉毒素Gl濃度的關(guān)系曲線方程為
Y1 = 261. 72/(1 + ((86. 11/(1 + (x2/11200. 22) 139) 0.43)/471.09) 0 37)149.45 方程(8)
其中I1表示抑制率，X2表示黃曲霉毒素Gl濃度。②花生樣品中AFGi濃度的測定
稱取5 g花生樣品(記作1#)溶于15 mL 80%甲醇水溶液(含4% NaCl )，漩渦30 s混勻，放于超聲波振蕩器中，50 ° C水浴振蕩15 min。取上清過0.45 Pm有機(jī)濾膜。濾液用PBS稀釋10倍，取50 ii L上樣作檢測液。用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素Gl完全抗原(AFG1-OVA, 2 U g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 iiL，4 ° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 u L 1.5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)lh。PBST洗板三次，每孔加入50 iiL抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體溶液，再加入50 ii L花生樣品液。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次，每孔加入100 u L商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 UL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無待測樣品孔的光吸收值為Btl，抑制率為，計(jì)算出樣品的抑制率。將花生樣品1#的抑制率值代入方程(8)中，求出花生樣品1#中黃曲霉毒素Gl的濃度為4. 2呢/kg ;采用國家質(zhì)檢總局公布的標(biāo)準(zhǔn)方法SN 0637-1997測定花生樣品1#中黃曲霉毒素Gl的濃度為3. 9呢/kg，兩個結(jié)果的相對偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的誤差范圍。稱取5 g花生樣品(記作2#)溶于15 mL 80%甲醇水溶液(含4% NaCl )，漩渦30 s混勻，放于超聲波振蕩器中，50 ° C水浴振蕩15 min。取上清過0.45 Pm有機(jī)濾膜。濾液、用PBS稀釋10倍，取50 ii L上樣作檢測液。根據(jù)如上花生樣品1#的檢測方法測得花生樣品2#的抑制率并代入方程(8)中計(jì)算，最終求得該花生樣品2#中的黃曲霉毒素Gl濃度為I. 2|ag/kg，采用國家質(zhì)檢總局公布的標(biāo)準(zhǔn)方法SN 0637-1997測定花生樣品2#中黃曲霉毒素Gl的濃度為I. I呢/kg，兩個結(jié)果的相對偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的誤差范圍。實(shí)施例4牛奶樣品中黃曲霉毒素Ml濃度的測定
(I)標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程的建立 ①黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程
首先用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素Ml完全抗原(AFM1-OVAJ. 06 u g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 yL，4 ° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 u L 1.5% OVA水溶液作 為封閉液，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板三次，每孔加入50 UL抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液，再加入黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品(4. I到1000 pg/mL)。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次，每孔加入100 UL商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 uL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品孔的光吸收值為Btl，抑制率為B/Bm黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線見圖I部分，經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸擬合得黃曲
霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程為
Y2= 78. 84/[I + (x2/121. 97) l 19] + 12. 27方程(9)
其中I2表示抑制率，X2表示黃曲霉毒素Ml濃度。②標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程
用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素Ml完全抗原(AFM1-OVAJ. 06 u g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 yL，4 ° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 u L 1.5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板三次，每孔加入50 u I抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液，再加入50 UL標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物((0.4到100 iig/mL)。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次，每孔加入100 UL商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，力口入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 uL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物孔的光吸收值為Btl，抑制率為B/Bm用標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物替代黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA分析曲線見圖2部分，經(jīng)非線性邏輯
斯蒂回歸擬合得標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程為
Y1 = 133.42 / [I + (Xl/61.81)0-80] 30.98方程(10)
其中Y1表示抑制率，X1表示標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度。③標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程的建
根據(jù)方程(9 )和方程(10 )，將20% 80%抑制率范圍內(nèi)同一抑制率所對應(yīng)的黃曲霉毒素Ml濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度計(jì)算出，間隔為5%抑制率。以黃曲霉毒素Ml濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度為縱坐標(biāo)作圖，得到同一抑制率下所對應(yīng)的黃曲霉毒素Ml濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系曲線，見圖4，并經(jīng)非線性邏輯斯蒂回歸擬合得到標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度和黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程
X1 = 146.41 / [I + (x2/340. 89) L3CI] + 3. 22方程(11)其中X1表示標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度，X2表示AFM1濃度。(2 )牛奶樣品中AFM1濃度的測定
①在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做標(biāo)準(zhǔn)曲線下，抑制率與黃曲霉毒素Ml濃度曲線方程根據(jù)方程(10)和(11)求出在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做標(biāo)準(zhǔn)曲線下，抑制率與黃曲霉毒素Ml濃度的關(guān)系曲線方程為
Y1 = 133. 42/(1 + ((146. 41/(1 + (x2/340. 89) L3CI) + 3. 22)/61. 81) 0 8CI) 30.98方程(12)
其中I1表示抑制率，X2表示AFM1濃度。②牛奶樣品中AFM1濃度的測定
取20 mL牛奶樣品(記作1#)加入50 mL離心管中，在3500 g下離心15 min,去掉上 層油脂層，舍去下層沉淀物，取中間層，取50 y L上樣檢測。用包被緩沖液稀釋黃曲霉毒素M1完全抗原(AFM1-OVA, 2 U g/mL)，加入酶標(biāo)板中，每孔100 yL，4 ° C過夜。PBST溶液洗板三次后，每孔加200 u L 1.5% OVA水溶液作為封閉液，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板三次，每孔加入50 UL抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體溶液，再加入50 ii L牛奶樣品液。37 ° C反應(yīng)I h后，PBST洗板三次，每孔加入100 u L商品化羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ° C反應(yīng)I h。PBST洗板六次，加入顯色液反應(yīng)15 min。加入50 UL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm下測定光吸收值，待測孔光吸收值為B，無待測樣品孔的光吸收值為Btl，抑制率為，算出樣品的抑制率。將牛奶樣品1#的抑制率值代入方程(12)中，求出牛奶樣品1#中黃曲霉毒素Ml的濃度為0. 92呢/kg ;采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23212-2008測得牛奶樣品1#中黃曲霉毒素Ml的濃度為0. 95Pg/kg，兩個結(jié)果的相對偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的誤差范圍。取20 mL牛奶樣品(記作2#)加入50 mL離心管中，在3500 g下離心15 min，去掉上層油脂層，舍去下層沉淀物，取中間層，取50 y L上樣檢測。根據(jù)如上牛奶樣品1#的檢測方法測得牛奶樣品2#的抑制率并代入方程(12)中計(jì)算，最終求得該牛奶樣品中的黃曲霉毒素Ml濃度為0. 37呢/kg ;采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23212-2008測得牛奶樣品2#中黃曲霉毒素Ml的濃度為0. 3仙g/kg，兩個結(jié)果的相對偏差符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的誤差范圍。上述實(shí)施例2-4皆是相應(yīng)測定待測樣品中黃曲霉毒素BI、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素Ml的首次實(shí)驗(yàn)。在后續(xù)檢測中包括放置長時(shí)間后，因各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程恒定不變，無需重新建立。故具體步驟可直接簡化為建立各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程，然后相應(yīng)結(jié)合各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程(如以樣品中黃曲霉毒素BI測量為例，則該黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程見方程(3))，得到在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線下，抑制率與各相應(yīng)黃曲霉毒素濃度的曲線方程e Cy1, x2)，然后測定待測樣品的抑制率值，相應(yīng)代入上述方程計(jì)算即可得。
權(quán)利要求
1.用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物，其特征在于它為可識別各鼠源抗黃曲霉毒素單克隆抗體的兔抗鼠抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物，其特征在于所述抗黃曲霉毒素單克隆抗體為抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體、抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的制備方法，其特征在于它是以鼠源抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體、抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體作為混合抗原，經(jīng)免疫新西蘭長耳大白兔，頸動脈取血，血清親和純化后獲得的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的制備方法，其特征在于所述的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體為由保藏編號為CCTCC NO. C201014的雜交瘤細(xì)胞株3G1分泌產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體3G1 ;所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為由保藏編號為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體2C9，所述的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體1C8為由保藏編號為CCTCCNO. C201017的雜交瘤細(xì)胞株1C8分泌產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體1C8 ;所述抗黃曲霉毒素BI單克隆抗體3G1，抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體2C9和抗黃曲霉毒素Gl單克隆抗體1C8為等摩爾量配比作混合抗原。
5.用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物在黃曲霉毒素ELISA檢測中的應(yīng)用。
6.黃曲霉毒素ELISA檢測方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，將標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物取代各黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別建立各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程a Cx1, Yl), ——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率； (2)采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，測定待測樣品的抑制率； (3)將步驟(2)得到的待測樣品抑制率相應(yīng)代入步驟(I)的曲線方程中，然后將計(jì)算得到的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度結(jié)果代入各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b Cx1, X2),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——，計(jì)算得到待測樣品中各相應(yīng)黃曲霉毒素的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃曲霉毒素ELISA檢測方法，其特征在于所述步驟(3)為相應(yīng)結(jié)合各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程a CxijY1),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率——，和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b (Xl，X2)，——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——，得到在標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物做ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線下抑制率與各相應(yīng)黃曲霉毒素濃度的曲線方程e Cy1, x2),——Y1為抑制率，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素濃度； 將步驟(2)得到的待測樣品抑制率代入上述曲線方程e (yi，x2)，計(jì)算得到待測樣品中各相應(yīng)黃曲霉毒素的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的黃曲霉毒素ELISA檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b (XijX2),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度——，是采用以下方法得到的 ①采用常規(guī)間接競爭ELISA方法分別建立各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程c (x2, y2),——X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，y2為抑制率； ②采用常規(guī)間接競爭ELISA方法，將標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物替代各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，分別建立各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程d(Xl，yi)，——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率； ③相應(yīng)結(jié)合各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品分析曲線方程c(x2, y2)和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程d (Xl，yi)，得到各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b Cx1, X2),——Xl為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的黃曲霉毒素ELISA檢測方法，其特征在于所述步驟③為相應(yīng)結(jié)合各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品分析曲線方程c (x2, y2),——X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，Y2為抑制率——，和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA分析曲線方程d (X1, Y1), -X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率-，計(jì)算20% 80%的抑制率范圍內(nèi)同一抑制率所對應(yīng)的各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度，然后以各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度X2為橫坐標(biāo)，各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度X1為縱坐標(biāo)，分別作圖擬合而得到各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度和各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物濃度的對應(yīng)關(guān)系換算方程b Cx1,X2),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，X2為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的黃曲霉毒素ELISA檢測方法，其特征在于所述的常規(guī)間接競爭ELISA法中抑制率的測定方法如下取包被各黃曲霉毒素相應(yīng)的黃曲霉毒素完全抗原的微孔包被板，加入各黃曲霉毒素相應(yīng)的抗黃曲霉毒素單克隆抗體，然后加入待測樣品或各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物，反應(yīng)后，洗滌液洗滌，加酶標(biāo)記羊抗鼠二抗，進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌后，加顯色液，暗處靜置后加終止液，在450 nm下測定光吸收值，根據(jù)待測孔光吸收值為B，對照孔的光吸收值為Btl，計(jì)算抑制率為B/Bm
11.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的黃曲霉毒素ELISA檢測方法，其特征在于所述各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物ELISA標(biāo)準(zhǔn)分析曲線方程d Cx1, Y1),——X1為各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度，Y1為抑制率——的建立中，各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物的濃度布設(shè)范圍為0.4-100 iig/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物、其制備方法及黃曲霉毒素ELISA檢測方法。用于ELISA檢測黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物，其特征在于它為可識別各鼠源抗黃曲霉毒素單克隆抗體的兔抗鼠抗體。它是以鼠源抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體、抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體和抗黃曲霉毒素G1單克隆抗體作為混合抗原，經(jīng)免疫新西蘭長耳大白兔，頸動脈取血，血清親和純化后獲得。該標(biāo)準(zhǔn)品通用替代物無毒無害，可分別通過替代黃曲霉毒素ELISA檢測方法中各相應(yīng)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品來定量檢測樣品中的各相應(yīng)黃曲霉毒素濃度。
文檔編號C07K16/06GK102746403SQ20121011761
公開日2012年10月24日 申請日期2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月20日
發(fā)明者丁小霞, 張奇, 張文, 李培武, 管笛 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所