專利名稱：一種檢測黃曲霉毒素b1含量的非標記免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素是一類結(jié)構(gòu)類似的化合物，自然界中的黃曲霉毒素主要是由黃曲霉菌和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有二十余種，其中以黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和Ml最為常見。黃曲霉毒素能對人及動物的肝臟組織產(chǎn)生破壞作用，嚴重時可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織劃定為I類致癌物，以黃曲霉毒素BI毒性最強，其毒性是砒霜的68倍。黃曲霉毒素可發(fā)生在熱帶或亞熱帶地區(qū)的農(nóng)產(chǎn)品出產(chǎn)過程中，同時在儲藏、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)也可能引入黃曲霉毒素的污染?；ㄉ亲钜装l(fā)現(xiàn)有黃曲霉毒素的農(nóng)產(chǎn)品，其他如玉米、無花果、果仁及谷物都有可能受黃曲霉毒素污染。由于我國小農(nóng)戶分散型的種植模式，農(nóng)產(chǎn)品從農(nóng)田到餐桌的各個環(huán)節(jié)都有可能受到黃曲霉毒素的污染。而黃曲霉毒素毒性大，危害嚴重，因此，世界各國對農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的含量制定了嚴格的限量標準，成為控制農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了更有力地監(jiān)測黃曲霉毒素含量，近年來分析檢測黃曲霉毒素的技術(shù)逐漸增多，靈敏度也逐漸提高。主要有儀器分析方法和免疫分析方法。免疫學(xué)方法克服了儀器方法費用高、操作條件要求高、對環(huán)境污染大等缺點，具有快速、簡便、特異性好、對操作人員和環(huán)境危害小等優(yōu)點?；诿庖叻椒ǖ脑嚰垪l層析技術(shù)和酶聯(lián)免疫試劑盒已被廣泛的應(yīng)用于現(xiàn)場的定性和定量檢測。試紙條層析技術(shù)可在15min內(nèi)實現(xiàn)檢測，但是只能進行定性分析，無法實現(xiàn)定量檢測；酶聯(lián)免疫試劑盒可進行定量檢測，但是耗時需幾個小時，操作步驟多。因此，研究建立一種簡單、快速、靈敏、可定量檢測黃曲霉毒素BI的方法對于快速、準確、在線監(jiān)控農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足而提供一種檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法。該方法可用于農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素BI檢測，與常規(guī)熒光和酶標記免疫分析方法相比具有無需標記的特點。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:
一種檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:包括以下步驟:
(1)提供待測樣品溶液，檢測待測樣品溶液在365nm激發(fā)波長激發(fā)下，加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll使黃曲霉毒素BI熒光充分淬滅前后的440nm處(熒光發(fā)射光譜中熒光強度最大處對應(yīng)的波長)的熒光強度值，所述抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll由保藏號為CCTCC NO:C201013的雜交瘤細胞株ICll產(chǎn)生；
(2)基于預(yù)先獲得的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線，由該待測樣品溶液的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度值即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅前后的440nm處的兩個熒光強度的差值，求得待測樣品溶液中黃曲霉毒素BI的含量。
該雜交瘤細胞株ICll已于2010年7月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC N0.C201013。按上述方案，所述的步驟(I)中黃曲霉毒素BI熒光充分淬滅后的440nm處的熒光強度值是在待測樣品溶液中加入適量抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11，使加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11后的待測樣品體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的濃度至少達到使體系中黃曲霉毒素BI的熒光充分淬滅的最小濃度，然后混勻，于37±5°C放置至少0.5h，再經(jīng)365nm激發(fā)波長激發(fā)測試得到測得的。按上述方案，所述的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線是采用以下方法得到的:
①配制得到一系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液，在365nm激發(fā)波長激發(fā)下獲得各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液的熒光發(fā)射光譜，記錄440nm處的熒光強度值；
②向上述各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液中加入等量的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11，所述抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll由保藏號為CCTCC NO:C201013的雜交瘤細胞株ICll產(chǎn)生，使加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后的各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體的濃度至少達到使最大濃度黃曲霉毒素BI標準品溶液中的黃曲霉毒素BI的熒光充分淬滅的最小濃度，而使黃曲霉毒素BI熒光在抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的作用下充分淬滅，然后在365nm激發(fā)波長激發(fā)下獲取各加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的黃曲霉毒素BI標準品溶液的熒光發(fā)射光譜，記錄440nm處的熒光強度值；
③經(jīng)擬合得到熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線c (x,y)——X黃曲霉毒素BI濃度，y為熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體淬滅前后440nm處熒光強度的差值。按上述方案，所述步驟①中一系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液是將黃曲霉毒素BI的甲醇儲備液稀釋配制得到的，濃度分別為10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75,0.5、0.3,0.1 ng/mL ;所述各溶液的黃曲霉毒素BI標準品溶液中加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后的溶液體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的濃度為>20 u g/mL，優(yōu)選為 20 u g/mL。按上述方案，所述步驟①中的稀釋液可為磷酸鹽緩沖液，按下述方法配制:0.Sg氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至lOOOmL。按上述方案，所述步驟②中為在各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液中加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll加入后混勻，并于37±5°C放置至少0.5h以使黃曲霉毒素BI熒光被充分淬滅，然后進行后續(xù)步驟。按上述方案，所述步驟③為分段擬合，分別得到小濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C1 Cx1, Y1)——X1黃曲霉毒素BI濃度，0.1-1 ng/ml, Y1為熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體前后的440nm處熒光強度的差值，和大濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C2 U2, Y2)——X2黃曲霉毒素BI濃度，1-10 ng/ml, y2為熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體前后的440nm處熒光強度的差值；
相應(yīng)地，在求算待測樣品中黃曲霉毒素BI濃度時根據(jù)待測樣品溶液中黃曲霉毒素BI的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度確定選用小濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C1 Cx1, yi)，還是大濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C2(x2, y2)，然后結(jié)合該待測樣品溶液的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度值計算待測樣品中黃曲霉毒素BI濃度。按上述方案，所述待測樣品溶液中黃曲霉毒素BI的濃度應(yīng)在該方法步驟(2)中的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線的有效檢測范圍內(nèi)即0.1-10 ng/mL，如超出，可對待測樣品溶液進行相應(yīng)濃縮或稀釋處理后再進行檢測；所述待測樣品溶液加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的濃度彡20 V- g/mL,優(yōu)選為20 ii g/mL。

本發(fā)明所述使體系中黃曲霉毒素BI的熒光充分淬滅的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll最小濃度的含義為:在體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll為某一濃度時，隨著該濃度的增加，體系中黃曲霉毒素BI的熒光淬滅率也不隨之增加，該濃度即為使體系中黃曲霉毒素BI的熒光充分淬滅的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll最小濃度。黃曲霉毒素BI熒光淬滅及基于其在黃曲霉毒素BI檢測中的應(yīng)用的工作原理:自然狀態(tài)下的黃曲霉毒素BI在受紫外光(365nm)激發(fā)時能發(fā)出熒光，熒光發(fā)射光譜中熒光強度最大處對應(yīng)的波長為440nm，而當(dāng)該黃曲霉毒素BI與其特異性的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll反應(yīng)后再受到紫外光(365nm)激發(fā)時，黃曲霉毒素BI的熒光絕大部分被淬滅。本方法直接利用黃曲霉毒素的熒光能被其抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅的特性即可實現(xiàn)對黃曲霉毒素BI的快速、定量檢測，不需要類似酶聯(lián)免疫吸附法的多步反應(yīng)步驟，也不需要添加額外的信號探針，如探針標記的抗體等。本發(fā)明的有益效果在于:
(I)直接定量檢測黃曲霉毒素BI。利用黃曲霉毒素BI的熒光能被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅的特性，結(jié)合黃曲霉毒素BI溶液與其抗體反應(yīng)前后的熒光強度值即可實現(xiàn)對黃曲霉毒素BI的定量檢測。(2)操作簡單快速，不需要類似酶聯(lián)免疫吸附法的多步反應(yīng)步驟。(3)無需標記、檢測成本低、污染危害小。該檢測方法中只需在待測樣品溶液(待測樣品經(jīng)常規(guī)的樣品前處理和黃曲霉毒素BI免疫親和柱凈化處理而得)中加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll即可進行檢測，不需要另外添加熒光物質(zhì)等有害化學(xué)試劑，也不需要探針標記的抗體或載體，對操作者和環(huán)境的危害和污染小，成本低廉。


圖1為系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液與其抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll反應(yīng)前后熒光強度的比較，圖中:每一濃度值對應(yīng)的兩列中:左列為各濃度黃曲霉毒素BI標準品溶液的熒光強度, 右列為加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll反應(yīng)淬滅后的熒光強度；
圖2為黃曲霉毒素BI濃度標準曲線C1 (X1, yi)，濃度范圍為0.1 Ing/mL ；
圖3為黃曲霉毒素BI濃度標準曲線c2 (x2, y2)，濃度范圍為I 10ng/mL。
具體實施例方式 下述所用抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll是采用保藏編號為CCTCC NO:C201013的雜交瘤細胞株ICll根據(jù)專利申請?zhí)枮镃N201010245095.5的專利中報道的方法預(yù)先制得，具體制備方法如下:
用保藏編號為CCTCC N0.C201013的雜交瘤細胞株ICll注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為:用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 u L,室溫混合30min，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0.lmol/L和pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的pH值至7.4，4 °C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0.277g/mL，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0.0lmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11，將抗體置_20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0.29g醋酸鈉，0.141mL醋酸，加水定容至IOOmL所得；所述的0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0.8g氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0.02g，加水定容至IOOOmL所得。實施例1:花生中黃曲霉毒素BI的添加檢測應(yīng)用實驗
I熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線c (X, y)的建立
(I)將濃度為500ng/mL的黃曲霉毒素BI甲醇儲備液用稀釋液磷酸鹽緩沖液稀釋，配制得到系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液(濃度分別為10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75、0.5、0.3、0.1和0 ng/mL),所述的磷酸鹽緩沖液配方如下:0.8g氯化鈉,0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至1000mL。取各系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液2mL在365nm激發(fā)波長下激發(fā)，獲取各系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液的熒光發(fā)射光譜，記錄波長440nm處的熒光強度值，見圖1。(2)向上述10ng/mL的黃曲霉毒素BI標準品溶液中分別加入不同量的抗黃曲毒素通用單克隆抗體1C11，獲得不同濃度抗黃曲霉毒通用單克隆抗體ICll的體系(體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體的濃度分別為0.1，0.5 ,5,10, 20，30，40ng/mL)，采用如上條件進行熒光淬滅，將熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度值與加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅前的熒光強度值相比，獲得不同濃度的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的熒光淬滅率。具體結(jié)果:抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll濃度為0.1ng/mL時，黃曲霉毒素BI的熒光淬滅率31% ;抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll濃度為
0.5 ng/mL時，淬滅率為37% ;抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll濃度為5ng/mL時，淬滅率為49% ;抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll濃度為10ng/mL時，淬滅率為78% ;抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll濃度為20ng/mL時，淬滅率均為91%，且體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體含量繼續(xù)增加時至抗體濃度為30或40ng/mL時，淬滅率仍為91%，說明體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll濃度為20ng/mL時，即可使黃曲霉毒素BI的熒光充分淬滅。故結(jié)合成本，選用下述體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的濃度為20ng/mL。(3)向步驟(I)的各黃曲霉毒素BI標準品溶液中分別加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICl I，使各體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的終濃度均為20 u g/mL，混勻，放置lh，取各體系溶液2mL，在365nm激發(fā)波長下激發(fā)，獲取各系體系的熒光發(fā)射光譜，取最大波長440nm處的熒光強度值，見圖1。(4)對黃曲霉毒素BI標準品濃度為0.1-lng/mL的范圍和l_10ng/mL的范圍分別進行擬合即分段擬合得到小濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C1 (X1, yi)，曲線方程為:yi=106Xl+8859，其中黃曲霉毒素BI濃度，0.1-lng/mL, Y1為熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll前后的440nm處熒光強度的差值，見圖2，和得到大濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C2(x2,y2),曲線方程為:y2=71535x2+106,其中:x2黃曲霉毒素BI濃度，l_10ng/mL,y2為突光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll前后的440nm處熒光強度的差值，見圖3。II花生中黃曲霉毒素BI的添加檢測:
稱取已磨好的花生空白樣品5克，加入100 u L黃曲霉毒素BI的甲醇儲備液，黃曲霉毒素BI的添加濃度為10 ng/g花生空白樣品，放置半小時，待甲醇揮發(fā)完后加入15mL體積濃度為80%的甲醇水(含質(zhì)量分數(shù)為4%的氯化鈉)，在50 60°C水浴下超聲10分鐘，定量濾紙過濾，取濾液4mL加入2mL石油醚，渦旋I分鐘，靜置分層，取下層甲醇水3mL，加入9 mL水，混勻，將該稀釋的樣品提取液用孔徑為0.45 y m的混合濾膜過濾，取IOmL濾液流過黃曲霉毒素BI免疫親和柱，用ImL甲醇洗脫親和柱，收集甲醇洗脫液，在60°C下用氮氣吹干，再用2mL上述稀釋液將黃曲霉毒素懸起，即為樣品溶液，掃描樣品溶液在365nm激發(fā)波長激發(fā)下的熒光發(fā)射光譜，再向樣品溶液中加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll至抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll終濃度為20 ii g/mL,混勻,放置I小時后,在365nm激發(fā)波長激發(fā)下獲得其熒光發(fā)射光譜，記錄440nm處的熒光強度值。檢測結(jié)果:根據(jù)加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后體系熒光被抗體淬滅強度值，將待測樣品溶液熒光被抗體淬滅強度值即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll前后的440nm處熒光強度的差值代入大濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C2 (x2,y2)(如圖3)中，得到樣品溶液中的黃曲霉毒素BI濃度，再結(jié)合樣品處理過程中的稀釋情況，根據(jù)樣品處理過程中濃度的變化關(guān)系計算出實際花生樣品中的黃曲霉毒素BI的添加濃度為9.4 ng/g。實施例2:花生樣品中黃曲霉毒素BI含量的檢測應(yīng)用實驗
I熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線c (X, y)的建立如上述實施例1所述。II花生中黃曲霉毒素BI含量的檢測:
稱取已磨好的待測花生樣品1#’ 2#或3# 5克，加入15mL體積濃度為80%的甲醇水(含質(zhì)量分數(shù)為4%的氯化鈉)，在50 60°C水浴下超聲10分鐘，定量濾紙過濾，取濾液4m L加A 2mL石油醚，渦旋I分鐘，靜置分層，取下層甲醇水3mL，加入9mL水，混勻，將該稀釋的樣品提取液用孔徑為0.45 y m的混合濾膜過濾，取IOmL濾液流過黃曲霉毒素BI的免疫親合柱，用ImL甲醇洗脫親和柱，收集甲醇洗脫液，在60°C下用氮氣吹干，再用2mL上述稀釋液將黃曲霉毒素懸起，即為樣品溶液，掃描樣品溶液在365nm激發(fā)波長激發(fā)下的熒光發(fā)射光譜，記錄440nm處的熒光強度值，再向樣品溶液中加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11，至抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll終濃度為20 V- g/mL,混勻,放置I小時后,在365nm激發(fā)波長激發(fā)下獲得其熒光發(fā)射光譜，記錄440nm處的熒光強度值。檢測結(jié)果:根據(jù)加入黃曲霉毒素通用單克隆抗體后體系熒光被抗體淬滅的值，確定將各樣品溶液的熒光被抗體淬滅的值即加入抗體前后的440nm熒光強度的差值代入小濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C1(Xl，yi)或大濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C2 (x2, y2)，得到樣品溶液中的黃曲霉毒素BI濃度，再結(jié)合樣品處理過程中的稀釋情況，根據(jù)樣品處理過程中濃度的變化關(guān)系計算出花生樣品中的黃曲霉毒素BI的濃度，得到花生樣品I的待測溶液中黃曲霉毒素BI濃度為檢出限0.1ng/mL以下，即樣品1#中黃曲霉毒素BI含量為未檢出；花生樣品2的待測溶液中黃曲霉毒素BI濃度為0.6ng/mL，SP樣品2#中黃曲霉毒素BI含量為2.16 u g/kg ;花生樣品3的待測溶液中黃曲霉毒素BI濃度為3.2ng/m L，即樣品3#中黃曲霉毒素BI含量為11.52 y g/kg。同時采用國家標準方法GB/T 18979-2003檢測上述花生樣品1#，2#或3#，其檢測結(jié)果依次為:花生樣品1#中黃曲霉毒素BI未檢出，花生樣品2#中黃曲霉毒素BI含量為2.g/kg，花生樣品3#中黃曲霉毒素BI含量為12.2 y g/kg。結(jié)合上述檢測可已看出:上述兩種檢測方法的檢測結(jié)果相對相差均在10%以內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)提供待測樣品溶液，檢測待測樣品溶液在365nm激發(fā)波長激發(fā)下，加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll使黃曲霉毒素BI熒光充分淬滅前后的440nm處的熒光強度值，所述抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll由保藏號為CCTCC NO:C201013的雜交瘤細胞株ICll產(chǎn)生； (2)基于預(yù)先獲得的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線，由該待測樣品溶液的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度值即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅前后的440nm處的兩個熒光強度的差值，求得待測樣品溶液中黃曲霉毒素BI的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:所述的步驟(I)中黃曲霉毒素BI熒光充分淬滅后的440nm處的熒光強度值是在待測樣品溶液中加入適量抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11，使加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后的待測樣品體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的濃度至少達到使體系中黃曲霉毒素BI的熒光充分淬滅的最小濃度，然后混勻，于37±5°C放置至少0.5h，再經(jīng)365nm激發(fā)波長激發(fā)測試得到測得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:步驟(2)所述的熒光 被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線是采用以下方法得到的: ①配制得到一系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液，在365nm激發(fā)波長激發(fā)下獲得各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液的熒光發(fā)射光譜，記錄440nm處的熒光強度值； ②向上述各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液中加入等量的抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11，所述抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll由保藏號為CCTCC NO:C201013的雜交瘤細胞株ICll產(chǎn)生，使加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后的各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體的濃度至少達到使最大濃度黃曲霉毒素BI標準品溶液中的黃曲霉毒素BI的熒光充分淬滅的最小濃度，而使黃曲霉毒素BI熒光在抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的作用下充分淬滅，然后在365nm激發(fā)波長激發(fā)下獲取各加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的黃曲霉毒素BI標準品溶液的熒光發(fā)射光譜，記錄440nm處的熒光強度值； ③經(jīng)擬合得到熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線c (x,y)——X黃曲霉毒素BI濃度，y為熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體淬滅前后440nm處熒光強度的差值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:所述步驟①中一系列濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液是將黃曲霉毒素BI的甲醇儲備液稀釋配制得到的，濃度分別為10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75,0.5,0.3,0.1 ng/mL ;所述各溶液的黃曲霉毒素BI標準品溶液中加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后的溶液體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的濃度為> 20 u g/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:所述步驟①中的稀釋液為磷酸鹽緩沖液，按下述方法配制:0.Sg氯化鈉，0.29g十二水磷酸氫二鈉，0.02g氯化鉀，0.02g磷酸二氫鉀，加水定容至lOOOmL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:所述步驟②中為在各濃度的黃曲霉毒素BI標準品溶液中加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll加入后混勻，并于37±5°C放置至少0.5h以使黃曲霉毒素BI熒光被充分淬滅，然后進行后續(xù)步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:所述步驟③為分段擬合，分別得到小濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C1 Cx1, Y1)——X1黃曲霉毒素BI濃度，0.1-1ng/ml, Y1為熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體前后的440nm處熒光強度的差值，和大濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C2 (x2,y2)——X2黃曲霉毒素BI濃度，1-10 ng/ml, y2為熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度即加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體前后的440nm處熒光強度的差值； 相應(yīng)地，在求 算待測樣品中黃曲霉毒素BI濃度時根據(jù)待測樣品溶液中黃曲霉毒素BI的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度確定選用小濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C1 Cx1, yi)，還是大濃度時熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線C2(x2, y2)，然后結(jié)合該待測樣品溶液的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll淬滅強度值計算待測樣品中黃曲霉毒素BI濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的檢測黃曲霉毒素BI含量的非標記免疫分析方法，其特征在于:所述待測樣品溶液中黃曲霉毒素BI的濃度應(yīng)在該方法步驟(2)中的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體IClI淬滅強度與黃曲霉毒素BI濃度的關(guān)系曲線的有效檢測范圍內(nèi)即.0.1-10 ng/mL，如超出，可對待測樣品溶液進行相應(yīng)濃縮或稀釋處理后再進行檢測；所述待測樣品溶液加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll后體系中抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體ICll的濃度彡20 ilg/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測黃曲霉毒素B1含量的非標記免疫分析方法。它包括以下步驟檢測待測樣品溶液在365nm激發(fā)波長激發(fā)下，加入抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11使黃曲霉毒素B1熒光充分淬滅前后的440nm處的熒光強度值，所述抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體由保藏號為CCTCCNO.C201013的雜交瘤細胞株1C11產(chǎn)生；基于預(yù)先獲得的熒光被抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體抗黃曲霉毒素通用單克隆抗體1C11淬滅強度與黃曲霉毒素B1濃度的關(guān)系曲線，由該待測樣品溶液的熒光被抗體淬滅強度求得待測樣品溶液中黃曲霉毒素B1的含量。該方法可用于直接定量檢測黃曲霉毒素B1；操作簡單快速；無需標記、檢測成本低、污染危害小。
文檔編號G01N33/577GK103217528SQ20121050166
公開日2013年7月24日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者李培武, 李鑫, 張奇, 丁小霞, 張文, 張兆威, 李冉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所