一種通過(guò)miR-200b調(diào)控GSK-3表達(dá)的方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種通過(guò)miR-200b調(diào)控GSK-3表達(dá)的方法及應(yīng)用。發(fā)明在缺氧缺血性腦損傷組織中轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miR-200b agomir或miR-200b antagomir，檢測(cè)GSK-3β蛋白的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示在缺氧缺血性腦損傷的組織中轉(zhuǎn)染miR-200b agomir組能明顯恢復(fù)GSK-3β蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-200b antagomir組GSK-3β蛋白表達(dá)有所下降。本發(fā)明提供一個(gè)在缺氧缺血性腦損傷的組織中miR-200b能夠有效調(diào)控GSK-3β蛋白表達(dá)的調(diào)控因子及調(diào)控方法，具有很好的開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種通過(guò)mi R-200b調(diào)控GSK-3表達(dá)的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種GSK-3表達(dá)的方法及應(yīng)用，更具體的， 涉及通過(guò)miR-200b調(diào)控GSK-3表達(dá)的方法及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖原合成酶激酶-3 (Glyeogensynthasekinase-3, GSK-3)是一種多功能的絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶，GSK-3主要有2種亞型：GSK-3a和GSK-3 0，其中GSK-3 0是細(xì)胞內(nèi)多 種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成分，尤其與細(xì)胞凋亡的發(fā)生關(guān)系密切。很少有酶能夠像GSK3 - 樣擁有廣泛的細(xì)胞調(diào)節(jié)影響力，它擁有超過(guò)四十種的蛋白可以被GSK3磷酸化，從如此眾多 的可能底物中可以看出GSK3影響細(xì)胞功能的巨大潛力。PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以影響 GSK-3 0活性，激活的Akt通過(guò)磷酸化GSK-3 0，從而抑制GSK-3 0的活性。GSK-3 0可進(jìn)一 步激活Bax、Bcl-2家族成員MCL-I (Myeloidcellleukemia-1，髓細(xì)胞淋巴瘤-1)，調(diào)控線粒 體通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔MPTP的開(kāi)放和關(guān)閉，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)多種凋亡相關(guān)蛋白的釋放，如Bcl-2可調(diào) 控線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)，維持線粒體內(nèi)膜電位，阻止MPTP開(kāi)放，抑制細(xì)胞色素 C及凋亡誘導(dǎo)因子 釋放，致使caspase-9、caspase_3激活最終引起細(xì)胞凋亡。在腦缺血損傷的研究中，糖原合 成酶激酶-3 β參與缺血對(duì)腦組織的損傷病理過(guò)程。體外和在體研究均發(fā)現(xiàn)特異性GSK-3 3 抑制劑氯化鋰可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，抑制由多種原因所引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
[0003] MicroRNAs是一類(lèi)內(nèi)源性表達(dá)的長(zhǎng)約21-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，在真核 生物中發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用。miRNAs以非完全互補(bǔ)的方式與靶mRNA的3'非編碼區(qū) (3'_untranslatedregion，3' -UTR)配對(duì)結(jié)合，從而引起翻譯抑制或祀mRNA降解。當(dāng)前研 宄表明，miRNAs參與調(diào)節(jié)生物體各種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖，分化，調(diào)亡和遷移等。miRNA 的異常表達(dá)與人類(lèi)腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌和膽管癌 等。
[0004] 本發(fā)明旨在研究在缺氧缺血性腦損傷的組織中調(diào)控GSK-3 0的miR-200b。發(fā)明 首先建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，進(jìn)行相應(yīng)組的miRNA激動(dòng)劑或拮抗劑轉(zhuǎn)染，分 別過(guò)表達(dá)和低表達(dá)miR-200b，于不同時(shí)間點(diǎn)取大鼠腦組織進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，檢測(cè) GSK-3 0蛋白的變化趨勢(shì)，從而了解miR-200b對(duì)GSK-30的作用。結(jié)果顯示在缺氧缺血性 腦損傷的組織過(guò)表達(dá)miR-200b時(shí)GSK-3 0蛋白表達(dá)明顯升高，低表達(dá)miR-200b時(shí)GSK-3 3 蛋白表達(dá)有所下降。說(shuō)明miR-200b在缺氧缺血性腦損傷的組織中能夠有效調(diào)控GSK-3 β 蛋白表達(dá)。這對(duì)缺氧缺血性腦損傷的修復(fù)具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種抑制GSK-3 β蛋白表達(dá)的方法，包括：
[0006] 1)制備miRNA-200b模擬物和/或抑制劑；
[0007] 2)將上步制備的miRNA施用到表達(dá)GSK-3 β蛋白的細(xì)胞或組織中。
[0008] 所述 miRNA_200b 成熟序列為 mmu-mir-200b-3p (miRBase 登錄號(hào)為 MIMAT0000233) 〇
[0009] miRNA模擬物（miRNA mimics)已經(jīng)成為研究基因調(diào)控的工具之一。miRNA mimics 是一種RNA分子，可以通過(guò)載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，上調(diào)miRNA在細(xì)胞內(nèi)或者活體內(nèi)miRNA濃度， 從而調(diào)控基因表達(dá)。開(kāi)發(fā)的miRNA mimics有兩種，一種是如體分子60喊基以上的如體；一 種是雙鏈的成熟體分子。這兩種分子都已經(jīng)證實(shí)，能夠很好的上調(diào)miRNA在細(xì)胞內(nèi)的豐度。
[0010] miRNA抑制劑（miRNA inhibitor)是運(yùn)用化學(xué)方法合成的miRNA抑制劑，可通過(guò)與 成熟miRNA分子特異性結(jié)合而抑制miRNA作用，可以削弱細(xì)胞中內(nèi)源性miRNA導(dǎo)致的基因 調(diào)控作用。
[0011] 進(jìn)一步，所述的細(xì)胞或組織為缺氧缺血性腦損傷的細(xì)胞或組織。
[0012] 進(jìn)一步，所述 miRNA-200b 選自其 pri-miRNA、pre-miRNA、成熟 miRNA、dsmiRNA 及 其片段或變體的一種或幾種。
[0013] 本發(fā)明中miRNA_200b、miR_200b、microRNA_200b屬于同一物質(zhì)的不同表達(dá)形式， 所代表的意思相同。
[0014] 術(shù)語(yǔ)"miRNA"（微小RNA)是指任何類(lèi)型的干擾RNA，包括但不限于，內(nèi)源微小RNA 和人工微小RNA。內(nèi)源miRNA是在基因組中天然存在的小RNAs，其能夠調(diào)節(jié)mRNA的生產(chǎn)利 用。術(shù)語(yǔ)"人工的"或"合成的"miRNA包括除內(nèi)源miRNA之外的任何類(lèi)型的RNA序列，其能 夠調(diào)節(jié)mRNA的生產(chǎn)利用。
[0015] "微小RNA側(cè)翼序列"是指包括miRNA加工元件的核苷酸序列。miRNA加工元件是 促成從前體miRNA產(chǎn)生成熟miRNA的最小限度核酸序列。稱為pri-miRNAs的前體miRNA 在細(xì)胞核中被加工成大約15-70個(gè)核苷酸的pre-miRNAs，其折疊成不完全的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0016] 在前體miRNA分子內(nèi)的miRNA側(cè)翼序列可以處于包含微小RNA序列的莖-環(huán)結(jié)構(gòu) 的一側(cè)或兩側(cè)的側(cè)翼。優(yōu)選的結(jié)構(gòu)在莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的兩個(gè)末端處具有側(cè)翼序列。側(cè)翼序列可 以與莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的一個(gè)或兩個(gè)末端直接相鄰，或者可以通過(guò)接頭、額外的核苷酸或其他分 子與莖 _環(huán)結(jié)構(gòu)相連接。
[0017] 如本文中所使用的，"莖-環(huán)結(jié)構(gòu)"是指具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸，所述二級(jí)結(jié)構(gòu)包括 已知或預(yù)知形成雙鏈的核苷酸的區(qū)域（莖部分），所述雙鏈在一側(cè)通過(guò)主要地單鏈的核苷 酸的區(qū)域（環(huán)部分）相連接。術(shù)語(yǔ)"發(fā)夾"和"折回"結(jié)構(gòu)在本文中也用于指莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。 此類(lèi)結(jié)構(gòu)和術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域眾所周知的。在莖-環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的核苷酸的實(shí)際一級(jí)序列不是關(guān)鍵 的，只要存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。如本領(lǐng)域中已知的，二級(jí)結(jié)構(gòu)不需要精確的堿基配對(duì)。因此，莖可 以包含一個(gè)或多個(gè)堿基錯(cuò)配。備選地，堿基配對(duì)可以不包括任何錯(cuò)配。
[0018] 核酸遞送系統(tǒng)包含所希望的核酸，例如但不限于，以作為"裸露"核酸的"裸露"形 式，或者配制在適合于遞送的媒介物中，例如在具有陽(yáng)離子分子或脂質(zhì)體形成性脂質(zhì)的復(fù) 合物中，或者作為載體的組分，或者作為藥物組合物的組分。可以將核酸遞送系統(tǒng)直接地 (例如通過(guò)使其與細(xì)胞相接觸）或間接地（例如通過(guò)任何生物學(xué)過(guò)程的作用）提供給細(xì)胞。 例如但不限于，可以通過(guò)下列方式將核酸遞送系統(tǒng)提供給細(xì)胞：胞吞作用，受體靶向，與天 然或合成細(xì)胞膜片段相偶聯(lián)，物理手段例如電穿孔，使核酸遞送系統(tǒng)與聚合物載體例如控 釋薄膜或納米顆?；蛭㈩w粒相組合，使用載體，將核酸遞送系統(tǒng)注射到圍繞細(xì)胞的組織或 流體中，核酸遞送系統(tǒng)簡(jiǎn)單擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜，或者通過(guò)任何主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制而穿過(guò)細(xì) 胞膜。另外，可以通過(guò)使用諸如病毒載體的與抗體相關(guān)的靶向和由抗體介導(dǎo)的固定化的技 術(shù)來(lái)將核酸遞送系統(tǒng)提供給細(xì)胞。
[0019] 進(jìn)一步，將所述miRNA整合到載體中。
[0020] 載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或細(xì)菌來(lái)源的其他媒介物， 其已經(jīng)通過(guò)插入或摻入用于產(chǎn)生微小RNA的核酸序列和可以附著至這些核酸序列的游離 核酸片段而進(jìn)行了操作。病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是優(yōu)選的載體類(lèi)型，并且包括但不限于 來(lái)自下列病毒的核酸序列：逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如：莫洛尼鼠白血病病毒；鼠干細(xì)胞病毒，哈維 (Harvey)鼠肉瘤病毒；鼠乳腺腫瘤病毒；勞斯肉瘤病毒；腺病毒；腺伴隨病毒；SV40-型病 毒；多瘤病毒；EB病毒；乳頭狀瘤病毒；皰疫病毒；痘苗病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒；和RNA病毒 例如任何逆轉(zhuǎn)錄病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地采用本領(lǐng)域已知的其他載體。
[0021] 載體優(yōu)選質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色體中的一種或幾種。
[0022] miRNA可以合成獲得，例如通過(guò)經(jīng)由技術(shù)人員已知的任何合成方法來(lái)化學(xué)合成核 酸。然后，所合成的miRNA可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行純化。用于化學(xué)合成核酸的 方法包括但不限于，體外化學(xué)合成，其使用磷酸三酯、磷酸酯或亞磷酰胺化學(xué)和固相技術(shù)， 或者經(jīng)由脫氧核苷氫膦酸酯中間體。
[0023] 進(jìn)一步，所述的miRNA為經(jīng)化學(xué)修飾的合成RNA。所述的化學(xué)修飾包括糖基修飾、 磷酸鏈修飾、堿基修飾、突出和末端修飾、雙螺旋結(jié)構(gòu)修飾等。
[0024] 核糖上的修飾最為廣泛，因?yàn)?'_0H不是活性SiRNA所必需的。RNA的2'-0甲基 化可以提高結(jié)合親和力和抗核酸酶的穩(wěn)定性，并且在雙螺旋中有很好的相容性，這些優(yōu)點(diǎn) 使其成為應(yīng)用最為廣泛的修飾之一。2' -0-甲氧乙基修飾已經(jīng)用于一個(gè)siRNA的3'端突 出和正義鏈上，但不適用于反義鏈。2' -0-烯丙基修飾除了可以應(yīng)用在3'端突出外，其他 大部分位點(diǎn)修飾都會(huì)引起活性降低。siRNA雙鏈上70%的2' -OH被隨機(jī)替換為2,4-二硝 基苯基醚可以改善其諸多性質(zhì)，如高親和性、抗核酸酶穩(wěn)定性和效價(jià)。
[0025] 2' -F-RNA在正義鏈和反義鏈上的部分取代都是可以耐受的，有些全取代的siRNA 同樣具有活性。此外，2' -F-RNA修飾還大大提高siRNA的血漿穩(wěn)定性，改善雙螺旋的結(jié)合 親和性。改變2' -F-RNA的氟原子的立體化學(xué)得到2' -F-ANA，它在siRNA雙螺旋中也有很 好的耐受性，包括對(duì)正義鏈的全修飾和反義鏈的部分修飾，它的引入也帶來(lái)高親和性和抗 核酸酶穩(wěn)定性。
[0026] DNA本身也是一種修飾，在它的2' -位沒(méi)有電負(fù)性取代基，這種修飾同樣可以被 siRNA雙螺旋所接受，在3' -突出端，或者堿基配對(duì)區(qū)域。全部用DNA嘌呤和2' -F-RNA嘧 啶修飾的反義鏈有沉默活性。對(duì)反義鏈5'端的8個(gè)堿基區(qū)域用dsDNA進(jìn)行替換有沉默活 性，并可降低脫靶效應(yīng)。
[0027] 糖環(huán)氧也可修飾，4'S-RNA具有高親和性，而且對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性大大提高。它在 siRNA雙螺旋末端有很好的耐受性。在2條鏈末端用4' S-RNA和2' -0-甲基、2' -0-甲氧 乙基組合修飾顯示出很好的效果和血漿穩(wěn)定性。對(duì)2' -和4' -位進(jìn)行修飾的4' S-FANA插 入到2條鏈的各個(gè)位置也顯示出siRNA活性。但它的較低親和性只允許少量插入雙螺旋。
[0028] LNA修飾同樣也應(yīng)用于siRNA修飾，其構(gòu)象的剛性特點(diǎn)顯著增強(qiáng)了其親和性。在 siRNA上小心引入此種修飾可得到多種類(lèi)型的功能雙螺旋。最常用于修飾的位點(diǎn)是正義鏈 的末〗而和反乂鏈的3' _關(guān)出$而。
[0029] 磷酸鏈的幾種變化也可被RNAi機(jī)制接受。硫代磷酸酯鍵（PS)修飾后與未修飾的 siRNA相比，效價(jià)相當(dāng)或有所降低。是否可以全部進(jìn)行PS修飾依賴于鏈的結(jié)構(gòu)。已經(jīng)觀察 到大量PS修飾后的細(xì)胞毒性。但PS修飾對(duì)siRNA的生物分布似乎沒(méi)有明顯影響。
[0030] 硼烷磷酸酯鍵修飾的SiRNA有基因沉默活性，與PS修飾和未修飾的SiRNA相比可 提高沉默效能。但為了達(dá)到最大效能，反義鏈中心區(qū)不宜修飾。這種修飾能顯著提高siRNA 的抗核酸酶穩(wěn)定性。
[0031] 核苷酸的2'，5'連接方式（2'，5' -DNA，或2'，5' -RNA)可以替換3'，5'連接方 式，但只適用于正義鏈，并且會(huì)導(dǎo)致部分活性喪失。非離子性的酰胺鍵已經(jīng)應(yīng)用在siRNA的 3 ' _關(guān)出立而。
[0032] 堿基修飾。siRNA的堿基修飾更受限制，能穩(wěn)定A-U堿基配對(duì)（5-Br-尿嘧啶和 5-1-尿嘧啶代替尿嘧啶，二氨基嘌呤代替腺嘌呤）的修飾可被siRNA接受，但是這種改造會(huì) 導(dǎo)致活性有所降低。4-硫脲嘧啶修飾已有應(yīng)用。2-硫脲嘧啶和C-連接的偽尿嘧啶可以提 高親和性，并且可以提高效價(jià)和特異性，前提是在雙螺旋的合適位置引入。嘧啶的5-甲基 化（使用T和5-Me-C代替U和C)常常和糖環(huán)的修飾如DNA，2' -F-ANA和LNA修飾聯(lián)用。
[0033] -些非標(biāo)準(zhǔn)的堿基結(jié)構(gòu)也用于siRNA中。例如二氟代苯基，它與胸腺嘧啶形狀相 同但不能形成氫鍵，可以在整個(gè)siRNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中代替某個(gè)位置的尿嘧啶堿基，而不會(huì) 大幅度降低效價(jià)或者改變裂解機(jī)制。非芳香性的二氫尿嘧啶也可使用，但是由于其對(duì)堿基 堆積作用沒(méi)有貢獻(xiàn)，所以會(huì)降低雙螺旋的親和力，最好插入雙螺旋的5'端。
[0034] 突出和末端修飾。早期研究表明，理想的siRNA由2條21個(gè)堿基的鏈組成，包括 2個(gè)堿基的3'-突出。這些突出可以用各種方式進(jìn)行修飾：最初常常使用脫氧殘基修飾，既 可以降低成本，還可能提高其抗3'-外切核酸酶能力。前述的多數(shù)修飾在突出上都可行， 還可使用平末端siRNA。平末端siRNA更能抗3' -核酸外切酶。
[0035] 鏈末端同樣可以進(jìn)行改造。反義鏈5'端的化學(xué)磷酸化可以確保高效價(jià)。此外，在 siRNA雙螺旋的末端可以連接各種各樣的基團(tuán)，尤其是正義鏈的末端。這些基團(tuán)包括翻轉(zhuǎn)的 非堿基封端，它有助于增強(qiáng)抗外切核酸酶穩(wěn)定性。一般認(rèn)為反義鏈的5'端對(duì)修飾最敏感。
[0036] 雙螺旋結(jié)構(gòu)修飾。雙螺旋結(jié)構(gòu)本身可以通過(guò)化學(xué)合成進(jìn)行修飾。雖然多數(shù)siRNA 雙螺旋由2條鏈組成，但已經(jīng)證明由3條鏈組成的（1條完整的反義鏈和2條9-13個(gè)堿基 的正義鏈）siRNA可以減少脫靶效應(yīng)并增加活性；它被稱為小中心片段化干擾RNA(small internally segmented interfering RNA，sisiRNA)。siRNA 也可由一條鏈以多種方式形 成，如發(fā)卡型雙螺旋和啞鈴型RNA或納米環(huán)結(jié)構(gòu)，它不但保持了 RNAi活性，同時(shí)還完全避 免了核酸外切酶對(duì)其的降解。已有研究表明單鏈反義RNA(沒(méi)有折疊成雙螺旋）可以進(jìn)入 RNAi通路，在一定情況下，其效價(jià)接近雙螺旋siRNA。
[0037] siRNA雙螺旋的長(zhǎng)度是可以改變的。增加 siRNA雙螺旋長(zhǎng)度作為Dicer的底物，可 以提高其效價(jià)。重要的是保持長(zhǎng)度在30個(gè)堿基以下，以避免觸發(fā)干擾素反應(yīng)。
[0038] 所述miRNA可以作為裸露的RNA即在鹽水進(jìn)行施用，或者將siRNA包裹在轉(zhuǎn)運(yùn)載 體上。直接施用包括以靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)鼻、腹膜內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)肛門(mén)、經(jīng)口、眼內(nèi)或鞘內(nèi) 方式將所述miRNA直接施用至患病組織。載體方面在siRNA給藥方面顯示出良好有殼聚 糖、樹(shù)狀聚酰胺-胺、聚乙烯亞胺、樹(shù)狀聚賴氨酸、聚乳酸聚乙醇酸共聚物、atelocollagen、 環(huán)糊精以及基于脂質(zhì)體或囊泡的siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和包裹siRNA的雙分子脂膜等。
[0039] 脂質(zhì)體是體外轉(zhuǎn)染時(shí)最常用的轉(zhuǎn)染試劑之一，然而，因其毒性、非特異性攝取和免 疫反應(yīng)，使得其很難實(shí)現(xiàn)體內(nèi)安全和高效的轉(zhuǎn)染。多數(shù)非特異反應(yīng)及毒性均源于其微粒表 面的正電荷，而這些正電荷正是與核酸結(jié)合所必需的。目前市售的幾種以脂質(zhì)體為基礎(chǔ)的 靶向miRNA的體外轉(zhuǎn)染試劑均應(yīng)用了這種原理。研究者們開(kāi)發(fā)了聚陽(yáng)離子脂質(zhì)體-透明質(zhì) 酸（LPH)的納米顆粒作為miRNA的運(yùn)輸系統(tǒng)。這種輸送系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染siRNA和/或 miRNA可以同時(shí)抑制幾個(gè)不同的致癌途徑。
[0040] 聚乙烯亞胺（Polyethyleni-mine, PEI):聚乙烯是用于基因轉(zhuǎn)染研究最多的聚 合物之一。在生理環(huán)境下，PEI由于胺基質(zhì)子化帶正電荷，從而可以與核酸聚合。在細(xì)胞表 面，PEI與核酸形成的帶正電荷的陽(yáng)離子聚合物與細(xì)胞表面的帶負(fù)電荷的多糖聚合，通過(guò)內(nèi) 吞作用進(jìn)入細(xì)胞。該多聚物在體內(nèi)通過(guò)所謂的質(zhì)子海綿效應(yīng)解聚，PEI大量捕獲質(zhì)子，水進(jìn) 入細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮腫脹，最終釋放多聚物到細(xì)胞質(zhì)中。使用PEI作為轉(zhuǎn)染試劑，已經(jīng)成功將 DNA和siRNA轉(zhuǎn)染到在體動(dòng)物模型中各個(gè)組織器官。除了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法，以PEI為基礎(chǔ)的 基因傳輸系統(tǒng)經(jīng)進(jìn)一步修飾還可透過(guò)血腦屏障（blood-brain barrier, BBB)。從狂犬病 病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG)提取短肽，連接PEI組成的PEI-RVG，能夠 結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞表面煙堿乙酰膽堿特異性受體。RVG通過(guò)二硫鍵（RVG-SSPEI)與PEI連接，轉(zhuǎn) 染miR-124a，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。為克服PEI載體因體積太大無(wú)法穿過(guò)血腦屏障，可用甘露醇通 透血腦屏障。
[0041] 樹(shù)枝狀聚合物（dendrimer)在基因傳輸中也引起了較大的關(guān)注，其獨(dú)特的球形結(jié) 構(gòu)和較高的表面積與體積比，最大程度減小了細(xì)胞毒性，提高了轉(zhuǎn)染效率。用聚酰胺-胺 型樹(shù)枝狀高分子（PAMM)轉(zhuǎn)染miR-21和5-氟尿嘧啶（5-FU)后增加了細(xì)胞凋亡。與只用 5-FU治療相比，腫瘤細(xì)胞的遷移能力下降。與用紫杉醇相比，用PAMM轉(zhuǎn)染抗miR-21后，增 加了人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療敏感性。雖然不是體內(nèi)轉(zhuǎn)染，這仍表明樹(shù)枝狀聚合物可以用于 體內(nèi)miRNA的轉(zhuǎn)染。
[0042] 聚乳酸聚乙醇酸共聚物（poly (D，L-lactide-co-glycolideacid)，PLGA)兼具結(jié) 合miRNA的能力和非特異性進(jìn)入細(xì)胞的能力。在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)，PLGAs是一類(lèi)廣泛用于 生物領(lǐng)域的非水溶性聚合物。PLGAs聚合物易被制成微?；蚣{米顆粒結(jié)合生物活性分子。 用PLGA為材料制得的納米?？梢云鸬奖Ｗo(hù)藥物、提高生物利用度的作用，達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間的 緩控釋目的，在臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)了極大的潛力。在這種情況下，有必要將PLGA微粒聚乙二 醇化，穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)，并且加強(qiáng)細(xì)胞滲透能力。PLGA微粒容易被非特異性降解，聚乙二醇化 進(jìn)一步削弱了其進(jìn)入細(xì)胞的能力，所以在病變器官中的累積不足5%。有學(xué)者提出RNA降解 發(fā)生在周?chē)膬?nèi)涵體和溶酶體內(nèi)，如果這個(gè)假說(shuō)屬實(shí)，那么一系列關(guān)于miRNA的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn) 將被修改。
[0043] 本發(fā)明的目的在于提供miRNA-200b模擬物/抑制劑在制備GSK-3 β蛋白表達(dá)調(diào) 節(jié)劑中的應(yīng)用。
[0044] 所述miRNA-200b模擬物促進(jìn)GSK-3 β蛋白表達(dá)，miRNA-200b抑制劑抑制GSK-3 β 蛋白表達(dá)。
[0045] 所述 miRNA_200b 選自其 pri-miRNA、pre_miRNA、成熟 miRNA、dsmiRNA 及其片段或 變體中的一種或幾種。
[0046] 所述的miRNA-200b可以經(jīng)化學(xué)修飾的RNA。
[0047] miRNA優(yōu)選地與合適的藥物載體組合地用于治療用途。此類(lèi)組合物包含有效量的 化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。制備制劑以適宜于施用方式。藥學(xué)上可接受的 載體部分地由待施用的特定組合物以及用于施用該組合物的特定方法來(lái)決定。因此，存在 有廣泛多樣的包含核酸的藥物組合物的合適制劑。
[0048] 在本發(fā)明中所提的反義阻斷是抑制microRNA功能最常應(yīng)用的手段。Krutzfeldt 等發(fā)現(xiàn)一類(lèi)新的可以特異且有效地抑制microRNA表達(dá)的化學(xué)修飾的寡核苷酸，稱為 antagomirs。antagomirs是膽固醇共軛單鏈RNA分子（21_23nt)，與成熟的革E microRNA互 補(bǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的miR_200b antagomir和antagomir NC后檢測(cè)結(jié)果（突光顯 微鏡）A :miR-200b antagomir ;B :miR-200b antagomir NC ;
[0050] 圖2不同時(shí)間點(diǎn)miR_200b表達(dá)量折線圖
[0051] 圖3不同組別轉(zhuǎn)棒時(shí)間變化
[0052] 圖4不同組別逃避潛伏期（EL)變化
[0053] 圖5不同組別GSK-3 β蛋白表達(dá)水平
[0054] 圖6不同組別GSK-3 β蛋白表達(dá)量折線圖

【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0056] 實(shí)施例1
[0057] -、材料與方法
[0058] 主要試劑與耗材：
[0059] microON? miR_200b agomir、microONTM miR_200b agomir NC、Cy3標(biāo)記microOFF? miR-200b antagomir、Cy3 標(biāo)記 microOFF? miR-200b antagomir NC、Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer、U6snRNA qRT-PCR Primer (上述試劑均來(lái)自廣州瑞博生物科技有限公 司）、EntransterTM-in vivo RNA轉(zhuǎn)染試劑（北京英格恩生物科技有限公司）、miRNA提取 試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒（上述試劑均來(lái)自 Cffbio. Co. Ltd)
[0060] 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備：
[0061] 持針器、眼科解剖鑷、眼科手術(shù)剪、手術(shù)臺(tái)（美國(guó)Shor-line)、Ritter無(wú)影手術(shù)燈 (美國(guó)MidMark)、微量注射器、分光光度計(jì)、帶非吸收性外科縫線縫合針（臺(tái)灣佳合醫(yī)材股 份有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD)、熒光顯微鏡（Olympus)、電泳儀（北京六一儀器 廠）、實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀7500 (美國(guó)ABI公司）、超凈工作臺(tái)（北京冠鵬凈化設(shè)備有限公 司）、電熱恒溫水浴箱（北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠）、冰凍組織切片機(jī)（德國(guó)leica)
[0062] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源：
[0063] SPF級(jí)新生3日齡SD大鼠（雌雄不計(jì)，體重8-10g)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù) 有限公司提供[SCXK(京）2012-0001]。
[0064] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0065] (1)隨機(jī)分組：
[0066] 正常對(duì)照組（control):新生3日齡SD大鼠，不予特殊處理。
[0067] 缺氧缺血組（HI):新生3日齡SD大鼠，永久結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，并缺氧2. 5h，缺氧 缺血12h后雙側(cè)側(cè)腦室分別注射2ul的無(wú)菌PBS。
[0068] 激動(dòng)劑組（ΗΙ+agomir):缺氧缺血（具體方法及實(shí)驗(yàn)控制因素同缺氧缺血組）12h 后，雙側(cè)側(cè)腦室分別注射2ul的miR-200b agomir和納米轉(zhuǎn)染復(fù)合物的混合物。
[0069] 激動(dòng)劑陰性對(duì)照組（ΗΙ+agomir NC):缺氧缺血12h后，雙側(cè)側(cè)腦室分別注射2ul的 miR-200b agomir NC(Negative control)和納米轉(zhuǎn)染復(fù)合物的混合物。
[0070] 拮抗劑組（ΗΙ+antagomir):缺氧缺血12h后，雙側(cè)側(cè)腦室分別注射2ul的 miR_200b antagomir和納米轉(zhuǎn)染復(fù)合物的混合物。
[0071] 拮抗劑陰性對(duì)照組（ΗΙ+antagomir NC):缺氧缺血12h后，雙側(cè)側(cè)腦室分別注射 2ul的miR_200b antagomir NC和納米轉(zhuǎn)染復(fù)合物的混合物。
[0072] (2)建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型：
[0073] 缺血：3日齡SD大鼠，4%的水合氯醛腹腔注射麻醉（40ul/只）。小鼠仰位固定于 手術(shù)操作臺(tái)上，無(wú)菌單固定，頸前部皮膚消毒后，剪開(kāi)此處皮膚，作頸前正中切口，逐層分離 暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，從分離好的左側(cè)頸總動(dòng)脈下方穿過(guò)2條手術(shù)線，分別結(jié)扎后從中間剪 短?？p合切口。術(shù)后在37°C的水浴箱內(nèi)休息30分鐘保暖，完全蘇醒后回母籠休息3小時(shí)。
[0074] 缺氧：缺血處理3. 5小時(shí)后置于密閉的塑料箱中，持續(xù)通以氮氧混合氣（8%氧氣 +92%氮?dú)猓?. 5小時(shí)，保持箱內(nèi)溫度37°C。缺氧完成后送回母籠。
[0075] (3)在體動(dòng)物轉(zhuǎn)染miRNA :
[0076] 1、核酸的稀釋?zhuān)簩⒑怂嵊眉兯♂屩?ug/ul，取IOul核酸，加入10%的葡萄糖溶 液IOul，使葡萄糖終濃度為5 %，終體積為20ul，充分混勻。
[0077] 2、轉(zhuǎn)染試劑的稀釋?zhuān)喝?ul的轉(zhuǎn)染試劑Entranster?_in vivo RNA，用IOul的 10 %葡萄糖溶液稀釋?zhuān)⒂眉兯?ul補(bǔ)足，得到葡萄糖終濃度為5 %，終體積為20ul的液體， 充分混勻。
[0078] 3、轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成：將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋后的核酸溶液中，立即充分 混勻。
[0079] 4、室溫靜置15分鐘。
[0080] 5、動(dòng)物注射：大鼠雙側(cè)側(cè)腦室注射，每側(cè)2ul (留針30秒，保證液體全部滲入腦組 織）。
[0081] 6、轉(zhuǎn)染后ld，在轉(zhuǎn)染核酸的各組中隨機(jī)選取3只大鼠，斷頭取腦，放入4%多聚甲 醛溶液，4度冰箱內(nèi)固定8小時(shí)，20%、30%蔗糖溶液梯度脫水各8小時(shí)，行冰凍切片（切片 厚度約15 μ m)后于突光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。
[0082] 7、分別在注射完成后011、1211、1(1、3(1、5(1、7(1后斷頭處死，剝離腦組織（去除嗅球和 小腦），存于液氮中，待提取RNA。
[0083] (4)實(shí)時(shí)定量熒光PCR
[0084] 液氮中取出留取的各時(shí)間點(diǎn)的腦組織，行實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)miRNA的變化。具 體方法如下：
[0085] 1、提取樣本總miRNA :
[0086] 用miRNA提取試劑盒（CWbio. Co. Ltd，Cat#CW0627)提取組織樣本中總RNA。
[0087] 1)將組織在液氮中磨碎，20mg組織加入Iml的Buffer RLM，震蕩混勻。室溫放置 5分鐘，使核酸復(fù)合物完全分離。
[0088] 2)以每Iml Buffer RLM加入200ul氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩 15s，室溫放置5min。
[0089] 3)4度12, OOOrpm離心15分鐘，樣品分為三層：紅色有機(jī)相，中間層和無(wú)色水相， 將上層水相移到一個(gè)新離心管中，進(jìn)行下一步操作。
[0090] 4)加入1. 25倍體積的無(wú)水乙醇，混勻。
[0091] 5)將上步得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入已裝入收集管的吸附柱RM中，（可以分多次 轉(zhuǎn)入）。12000rpm離心30s，棄收集管廢液，將吸附柱重新重新放回收集管內(nèi)。
[0092] 6)向吸附柱RM中加入700μ1 Buffer RWT((檢查是否加入無(wú)水乙醇），RT， 12000rpm離心30S，棄廢液。將吸附柱重新重新放回收集管內(nèi)。
[0093] 7)向吸附柱RM中加入500μ1 Buffer RW2((檢查是否加入無(wú)水乙醇）RT， 12000rpm離心30S，棄廢液。將吸附柱重新重新放回收集管內(nèi)。
[0094] 8)重復(fù)步驟7。
[0095] 9) 12000rpm離心lmin，棄收集管廢液。將吸附柱RS置于室溫?cái)?shù)分鐘，晾干。
[0096] 10)將吸附柱 RM 轉(zhuǎn)入新的 I. 5ml RNase-free Collection Tube 中，力口 30 μ lRNase-free Water，室溫放置1分鐘，12, OOOrpm離心1分鐘，收集RNA溶液，得到的 RNA溶液保存在-70度，防止降解。
[0097] 2、電泳：
[0098] 取5ulRNA用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。
[0099] 3、加尾，反轉(zhuǎn)錄
[0100] 用 miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（CWbio. Co. Ltd，Cat#CW2141)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0101] A. miRNA 加 Poly (A)尾：
[0102] 1.首先根據(jù)所用RNA的量，按如下公式，用ImM Tris (PH8. 0)來(lái)稀釋IOmM ATP。
[0103] 2.向冰浴中預(yù)冷的無(wú) RNase反應(yīng)管中加入以下試劑至總體積25ul。
[0104] 3.輕輕混勻上述反應(yīng)液，短暫離心將液體收集于管底。37°C，孵育15分鐘， 于-20°C。
[0105] B.修飾后的miRNA cDNA第一鏈合成的過(guò)程：
[0106] 1.向冰浴中預(yù)冷的無(wú) RNase反應(yīng)管中加入下表中試劑，至終體積20ul :
[0107]

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控GSK-30蛋白表達(dá)的方法，包括： 1) 制備miRNA-200b模擬物和/或抑制劑； 2) 將上步制備的miRNA施用到表達(dá)GSK-3 0蛋白的細(xì)胞或組織中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞或組織為缺氧缺血性腦損傷 的細(xì)胞或組織。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述制備的miRNA包括其pri-miRNA、 pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或變體中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所述制備的miRNA整合到載體上進(jìn)而施 用到表達(dá)GSK-3 0蛋白的細(xì)胞或組織中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)所述制備的miRNA-200b進(jìn)行化學(xué)修飾 后施用到表達(dá)GSK-3 0蛋白的細(xì)胞或組織中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的化學(xué)修飾包括糖基修飾、磷酸鏈修 飾、堿基修飾、突出和末端修飾、雙螺旋結(jié)構(gòu)修飾中的一種或幾種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)脂質(zhì)體、基于聚合物的納米顆粒、 膽固醇綴合物、環(huán)狀葡聚糖復(fù)合物、聚乙烯亞胺聚合物或蛋白質(zhì)復(fù)合物施用miRNA到表達(dá) GSK-3P蛋白的細(xì)胞或組織中。 8. miRNA-200b模擬物和/或抑制劑在制備GSK-3 0蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，miRNA-200b模擬物促進(jìn)GSK-3 0蛋白表 達(dá)，miRNA-200b抑制劑抑制GSK-3 0蛋白表達(dá)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA-200b選自其pri-miRNA、 pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或變體中的一種或幾種。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA-200b為經(jīng)化學(xué)修飾的RNA。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miRNA與藥學(xué)上可接受的載體或 賦形劑組合制備GSK-3 3蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104371978SQ201410568056
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】崔紅, 馬東青, 楊麗君, 楊?lèi)?ài)君, 朱琳涵 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院