非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。本申請的制備方法，包括用純化p54免疫蛋白對小鼠免疫，取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞，用三種篩選抗原進行篩選，獲得可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，再通過體內(nèi)或體外的方法制備單克隆抗體；三種篩選抗原包括，原核表達p54重組蛋白、真核表達p54重組蛋白和人工合成的Seq ID No.1所示序列多肽。本申請，用三種篩選抗原對雜交瘤細胞進行篩選，特別是人工合成所有非洲豬瘟病毒毒株共有的多肽作為篩選抗原，使制備的通用單克隆抗體能夠?qū)Σ煌赜騺碓吹亩局赀M行檢測，減小了毒株間地域差異造成的漏檢現(xiàn)象，提高了檢疫工作質(zhì)量和效率。
CCTCC No. C2014212
20141203
【專利說明】非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體及制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及單克隆抗體領(lǐng)域，特別是涉及一種用于非洲豬瘟病毒毒株的通用單克 隆抗體，以及該單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 非洲豬瘟（African Swine Fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，其臨床癥狀表現(xiàn)高熱、皮膚 充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血，致死率高達100%。但也有少數(shù)毒株感染家豬后，豬只出現(xiàn)亞 急性感染或者隱性帶毒。世界動物衛(wèi)生組織〔OIE〕將其列為A類動物疫病，受到世界各國 的高度重視，我國尚未發(fā)生該病，我國已將此病規(guī)定為一類動物傳染病，并作為動物外來疫 病進行研宄（孫懷昌.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，1999,21(21) :117-119)。
[0003] 近年來，非洲豬瘟已由非洲大陸橫跨到亞歐大陸的亞美尼亞、烏克蘭、俄羅斯，特 別是近年來高加索地區(qū)疫情嚴峻，對我國造成極大威脅。非洲豬瘟在西歐、南美洲和東歐的 發(fā)生已經(jīng)證實，非洲豬瘟一旦傳入將給養(yǎng)豬業(yè)帶來毀滅性的打擊。我國已將非洲豬瘟列入 2011年國家動物疫病監(jiān)測計劃，確定新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、西藏等為重點監(jiān)測 省區(qū)（王宏燕，養(yǎng)豬，2011，4:81-82)。
[0004]目前尚無有效的疫苗，因此通過快速診斷非洲豬瘟抗體水平來判斷豬只的感染情 況，從而制定有效的控制和消滅措施，進而及時準確的診斷檢測和嚴格有效的封鎖撲殺等 措施是成功消滅非洲豬瘟的有效方法。非洲豬瘟抗體診斷方法包括瓊脂擴散試驗、ELISA、 免疫印跡、免疫熒光等。目前，我國診斷非洲豬瘟的檢測試劑主要依賴進口，擁有自主知識 產(chǎn)權(quán)的方法和試劑很少，加之周邊國家嚴峻的疫情形勢，我國迫切需要建立自己的檢測方 法和試劑。
[0005] 并且，現(xiàn)有的抗體診斷方法中，由于采用活病毒感染細胞來制備抗原導(dǎo)致在臨床 運用時檢測程序無法標準化操作，且因操作活毒風(fēng)險大，因此不適合推廣運用。目前用于 檢測方法及試劑的開發(fā)多用基因工程方法表達抗原，主要集中在如p72、p54、p32、PP62、 A104R、B602L、K205R等基因的研宄，其中p72、p54等應(yīng)用較廣。而單克隆抗體的制備也主要 集中在這些結(jié)構(gòu)蛋白，由此建立的基于免疫學(xué)方法的商業(yè)試劑盒目前世界范圍內(nèi)僅四家。 但是，由于非洲豬瘟病病毒毒株間地域差異大，使得現(xiàn)有的商業(yè)試劑盒在使用過程中，容易 出現(xiàn)由某些毒株引起的非洲豬瘟病的漏檢現(xiàn)象。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本申請的目的是提供一種新的非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體，以及該通用單 克隆抗體的制備方法和應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案：
[0008] 本申請一方面公開了一種非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體的制備方法，包括采 用純化的p54免疫蛋白對小鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合制備雜 交瘤細胞，然后采用三種篩選抗原對陽性雜交瘤細胞株進行篩選，獲得可穩(wěn)定分泌抗非洲 豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞，然后通過體內(nèi)或體外的方法制備非洲豬瘟病毒毒株通 用單克隆抗體；其中，三種篩選抗原包括，原核表達P54重組蛋白、真核表達p54重組蛋白， 以及人工合成的Seq ID No. 1所示序列的多肽；
[0009] Seq ID No. I ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEV〇
[0010] 需要說明的是，本申請的關(guān)鍵在于采用三種篩選抗原對雜交瘤細胞株進行篩選， 其中Seq ID No. 1所示序列人工合成的多肽，是針對現(xiàn)有所有非洲豬瘟病毒毒株而特別設(shè) 計的，該序列經(jīng)過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，為所有非洲豬瘟病毒毒株所共有，因此，由其 篩選出的雜交瘤細胞株所制備的單克隆抗體具備通用性，能夠?qū)Σ煌赜騺碓吹姆侵挢i瘟 病毒進行檢測，從而避免漏檢的問題。
[0011] 還需要說明的是，本申請的關(guān)鍵是采用三種篩選抗原對雜交瘤細胞株進行篩選， 尤其是創(chuàng)造性的設(shè)計了一條人工合成多肽，從而使得制備的單克隆抗體具備通用性；至于 P54免疫蛋白的制備和純化、原核表達p54重組蛋白的制備、真核表達p54重組蛋白的制備、 制備融合雜交瘤細胞的具體條件和步驟、雜交瘤細胞的免疫篩選等都可以參考現(xiàn)有的常規(guī) 方法進行，在此不累述。篩選獲得可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞后， 單克隆抗體的體內(nèi)或體外的制備方法，也可以參考現(xiàn)有的常規(guī)方法；例如，將雜交瘤細胞腹 腔注射動物，如小鼠，采集腹水，分離純化單克隆抗體；或者，通過體外培養(yǎng)該雜交瘤細胞收 集分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0012] 經(jīng)篩選獲得的可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞，命名為雜交 瘤細胞株SZCIQASFV1，其微生物保藏號為：CCTCC No. C2014212 ;分類命名為：雜交瘤細胞 hybridoma cell ;保藏時間為：2014年12月3日；保藏單位是：中國典型培養(yǎng)物保藏中心； 保藏地址是：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心。
[0013] 本申請中，p54免疫蛋白通過以下方式獲取，將pMD18-T-p54質(zhì)粒中p54基因片段 轉(zhuǎn)入pET-52b(+)質(zhì)粒，并在大腸桿菌DH5a中進行可溶性表達，然后提取純化表達蛋白，即 P54免疫蛋白。
[0014] 本申請中，原核表達p54重組蛋白為利用pET-52b(+)質(zhì)粒在大腸桿菌中原核表達 后提取純化的P54重組蛋白；真核表達p54重組蛋白為利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系 統(tǒng)真核表達獲得的P54重組蛋白。
[0015] 本申請的另一面公開了一種非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體，該通用單克隆抗 體由保藏號CCTCC No. C2014212的雜交瘤細胞株SZCIQASFV1分泌產(chǎn)生。
[0016] 需要說明的是，實際上，本申請的非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體就是由本申 請的制備方法制備獲取的。
[0017] 本申請的再一面公開了本申請的通用單克隆抗體在制備非洲豬瘟病毒檢測試劑 或設(shè)備中的應(yīng)用。
[0018] 本申請的再一面具體公開了一種含有本申請的通用單克隆抗體的非洲豬瘟病毒 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0019] 在以上研宄的基礎(chǔ)上，本申請還提供了一種分泌本申請的非洲豬瘟病毒毒株通用 單克隆抗體的雜交瘤細胞，其保藏號為CCTCC No. C2014212。
[0020] 需要說明的是，本申請的分泌非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體的雜交瘤細胞， 實際上，就是非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體的制備方法中篩選獲得的可穩(wěn)定分泌抗非 洲豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞。
[0021] 由于采用以上技術(shù)方案，本申請的有益效果在于：
[0022] 本申請的制備方法，采用三種篩選抗原對雜交瘤細胞進行篩選，特別是設(shè)計并人 工合成了一條所有非洲豬瘟病毒毒株共有的多肽作為篩選抗原，使得制備出的單克隆抗體 能夠?qū)Σ煌赜騺碓吹姆侵挢i瘟病毒毒株進行檢測，大大減小了毒株間地域差異造成的漏 檢現(xiàn)象，提高了檢驗檢疫工作質(zhì)量和效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1 :是本申請實施例中重組表達質(zhì)粒pET-52b(+)3C/LIC-p54的PCR鑒定結(jié)果；
[0024] 圖2 :是本申請實施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中的誘導(dǎo) 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果；
[0025] 圖3 :是本申請實施例中pET-52b(+)3C/LIC-p54重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中的誘導(dǎo) 表達產(chǎn)物的純化及免疫印跡分析結(jié)果；
[0026] 圖4 :是本申請實施例中pFastBac-p54重組質(zhì)粒和Bacmid-p54重組粘粒的PCR鑒 定結(jié)果；
[0027] 圖5 :是本申請實施例中pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統(tǒng)真核表達p54重組蛋白 的Western-blot鑒定結(jié)果；
[0028] 圖6 :是本申請實施例中采用ProteinOn XPR36大分子互作儀分析非洲豬瘟病毒 毒株通用單克隆抗體與非洲豬瘟病毒P54蛋白中特定抗原表位多肽A的親和性的結(jié)果圖；
[0029] 圖7 :是本申請實施例中非洲豬瘟病毒p54蛋白序列的比對分析結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0030] 由于非洲豬瘟病毒毒株間地域差異大，使得現(xiàn)有的商業(yè)試劑盒在使用過程中，容 易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象；亟需一種能夠?qū)Σ煌赜騺碓吹姆侵挢i瘟病病毒毒株都具有良好檢測效 果的單克隆抗體，因此，本申請旨在研制出一株單克隆抗體，該單抗能與目前世界范圍內(nèi)流 行的所有已知的非洲豬瘟病毒毒株作用，從而為建立基于單克隆抗體的競爭ELISA方法等 免疫學(xué)方法提供關(guān)鍵材料與方法，解決現(xiàn)有商業(yè)試劑盒漏檢的問題，并減少或不用依賴國 夕卜檢測試劑，使我國擁有自主的檢測能力和檢測試劑，嚴防非洲豬瘟疫情傳入我國。
[0031] 基于以上需求和目的，本申請?zhí)貏e設(shè)計并人工合成了一條所有已知非洲豬瘟病毒 毒株所共有的多肽，即Seq ID No. 1所示序列的多肽，用于雜交瘤細胞篩選，同時，采用原核 表達P54重組蛋白和真核表達p54重組蛋白進行篩選，使得最終制備的單克隆抗體能夠?qū)?現(xiàn)有的所有已知非洲豬瘟病毒毒株進行檢測，即非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體。其中， 人工合成的作為篩選抗原的多肽，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對證實，理論上，尤其篩選獲取的單克 隆抗體可以對所有已知非洲豬瘟病毒毒株進行檢測；本申請的試驗中也對不同地域來源的 毒株進行了測試，結(jié)果與理論相符。
[0032] 需要說明的是，本申請中，人工合成的Seq ID No. 1所示序列的多肽是針對抗原位 點"EDIQFINPYQ"設(shè)計的，為了保障免疫效果，所以設(shè)計成Seq ID No. 1所示序列多肽；可以 理解，在本申請的基本構(gòu)思上，在保障抗原位點"EDIQFINPYQ"完整的情況下，可以在Seq ID No. 1所示序列多肽的基礎(chǔ)上，在多肽序列前后增減約20個氨基酸，都屬于本申請的保護范 圍；在不考慮人工合成成本的情況下，還可以在本申請的Seq ID No. 1所示序列多肽基礎(chǔ)上 增加更多的氨基酸。
[0033] 在以上研宄的基礎(chǔ)上，本申請?zhí)峁┝朔侵挢i瘟病毒毒株通用單克隆抗體，及其應(yīng) 用?？梢岳斫?，本申請的單克隆抗體具有良好的通用性，能夠?qū)Σ煌赜騺碓吹亩局赀M行檢 測，大大減小了因毒株地域差異造成的漏檢；因此，可以制備成試劑盒廣泛用于檢驗檢疫工 作；該試劑盒除了含有本申請的單克隆抗體以外，當然也含有其它酶聯(lián)免疫檢測的常規(guī)試 劑，在此不累述。
[0034] 下面通過具體實施例和附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請 進行進一步說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。
[0035] 實施例1免疫抗原的制備
[0036] 1.目的基因的擴增與純化
[0037] 設(shè)計一對引物，從克隆有非洲豬瘟病毒p54基因的pMD18-T-p54質(zhì)粒中擴增靶標 基因；其中pMD18-T-p54質(zhì)粒由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心保存提 供，該質(zhì)粒中含有如Seq ID No. 10所示序列的552bp的p54基因。該引物的上游引物為 Seq ID No. 2所不序列，下游引物為Seq ID No. 3所不序列。
[0038] Seq ID No. 2 :5, -CAGGGACCCGGTTATACTATTCTCATTGCTATCG-3'
[0039] Seq ID No. 3 :5, -GGCACCAGAGCGTTCAAGGAGTTTTCTAGGTC-3'
[0040] 在引物合成公司合成以上引物后，以pMD18-T-p54質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，反應(yīng) 條件為 94°C lmin，58°C lmin，30cycles，72°C 5min。
[0041] 反應(yīng)結(jié)束后采用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產(chǎn)物，并用膠回收試劑盒回收 純化目的DNA，即獲得靶標基因。
[0042] 2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0043] 在上述步驟獲得的靶標基因中加入T4DNA聚合酶，22 °C孵育30min，75 °C孵育 20min，加入 3C/LIC 載體，22°C孵育 5min，加入 EDTA 后 22°C孵育 5min，構(gòu)建 pET-52b (+) 3C/ LIC-p54重組質(zhì)粒。
[0044] 3.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定
[0045] 將上述步驟獲得的pET-52b (+) 3C/LIC-p54重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，并接種 于含100mg/L氨芐青霉素的LB營養(yǎng)瓊脂上，37°C培養(yǎng)12h，挑取單個菌落于含50mg/L氨芐 青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h后，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定和測序，檢測靶標基因 的完整性。
[0046] 其中PCR鑒定分別采用了兩對引物進行，第一對即擴增靶標基因的Seq ID No. 2 和Seq ID No. 3所示引物對，第二對引物為pET_52b(+)3C/LIC質(zhì)粒自帶的T7引物對。PCR鑒 定的凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，圖中，M泳道為DNAmarker，1泳道為第一對引物PCR擴增的 電泳結(jié)果，2泳道為第二對引物PCR擴增的電泳結(jié)果；可見，本例的pET-52b (+) 3C/LIC-p54 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，含有約462bp的靶標基因，與理論預(yù)期相符。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中 含有462bp的p54基因，其序列與Seq ID No. 10所示序列相符，進一步驗證了本例構(gòu)建的 pET-52b (+) 3C/LIC-p54重組質(zhì)粒含有我們所需要的p54基因。
[0047] 需要說明的是，p54基因的前端包含兩個啟動子，而本例原核表達時只克隆了其中 一個啟動子，即P54基因的前端90bp大小的信號肽核苷酸序列未有進行克隆，所以第一對 即擴增靶標基因的Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示引物對擴增產(chǎn)物大小為462bp，該基因 同樣包含了 P54蛋白的全部基因序列，只是未包含前端90bp的信號肽核苷酸序列；對本例 來說，不影響p54蛋白的原核表達。
[0048] 4.重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達
[0049] 制備BL21(DE3)細菌感受態(tài)細胞，將重組質(zhì)粒pET-52b(+)3C/LIC-p54轉(zhuǎn)化入 BL21 (DE3)細胞后，在含100mg/L氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)，挑取單個菌落，接種于2mL 含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C，200r/min恒溫搖床振蕩培養(yǎng)至0D600值為0. 6 左右。加入終濃度為2mM的IPTG，培養(yǎng)2h后收取菌液。將培養(yǎng)液在4°C離心15min，去上 清，收集菌體。用PBS重懸沉淀，4°C IOOOOg離心15min，去上清。用破菌緩沖液重懸菌體， 冰上超聲破碎，4°C離心15min，收集上清。用變性不連續(xù)的SDS-PAGE對表達產(chǎn)物進行考馬 斯亮藍染色，觀察結(jié)果。
[0050] 結(jié)果如圖2所示，圖中，M泳道為蛋白分子質(zhì)量標準；1-5泳道分別為0. 5mM，ImM， 2mM，4mM，8mM IPTG誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時后細菌裂解上清的分析結(jié)果；6泳 道為未加 IPTG誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時后細菌裂解上清的分析結(jié)果；7泳道為 ImMIPTG誘導(dǎo)BL21 (DE3)兩小時后細菌裂解上清的分析結(jié)果；8-12泳道分別為ImM IPTG 誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p541h，2h，3h，4h，5h后細菌裂解上清的分析結(jié)果；13泳道為未加 IPTG誘導(dǎo)pET-52b (+) 3C/LIC-p54兩小時后細菌裂解上清的分析結(jié)果；14泳道為ImMIPTG 誘導(dǎo)BL21 (DE3)兩小時后細菌裂解上清。結(jié)果顯示，本例構(gòu)建的pET-52b(+)3C/LIC-p54重 組質(zhì)粒能夠穩(wěn)定的表達所需的P54重組蛋白。
[0051] 5.表達產(chǎn)物的鑒定
[0052] 將上述步驟培養(yǎng)的菌液，在4°C離心15min，去上清，收集菌體。用PBS重懸沉淀， 4°C IOOOOg離心15min，去上清。用破菌緩沖液重懸菌體，冰上超聲破碎，4°C離心15min，收 集上清。采用非洲豬瘟標準陽性血清對表達產(chǎn)物進行免疫印跡分析，以檢測目的蛋白的抗 原性。免疫印跡分析結(jié)果如圖3所示，圖中，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準，1為樣品洗液，2為 目的蛋白純化樣品，3為樣品裂解液，4為目的蛋白免疫印跡分析；結(jié)果顯示，本例獲取的重 組蛋白確實為P54重組蛋白。
[0053] 6.表達產(chǎn)物的純化
[0054] 采用Ni柱親和層析方法純化冰上超聲破碎的上清液，純化產(chǎn)物即本例所需要的 免疫抗原，即P54免疫蛋白。
[0055] 實施例2篩選抗原的制備
[0056] 本例采用了三種篩選抗原對雜交瘤細胞進行篩選，一是實施例1中作為免疫抗原 的原核表達P54重組蛋白，將經(jīng)過鎳柱純化后的p54免疫蛋白作為篩選抗原；二是利用人工 合成的方法合成的Seq ID No. 1所示多肽；三是利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統(tǒng)真核 表達P54重組蛋白，將感染重組桿狀病毒細胞超聲破碎上清作為篩選抗原。
[0057] 其中人工合成的Seq ID No. 1所示多肽是本例在比對了目前已經(jīng)公開的所有非洲 豬瘟病毒的P54蛋白序列的基礎(chǔ)上提出的，所有非洲豬瘟病毒共有的多肽序列，因此，其作 為篩選抗原，理論上可以篩選出所有非洲豬瘟病毒的通用單克隆抗體，對比結(jié)果如圖7所 不O
[0058] 抗原的具體制備如下：
[0059] Seq ID No. I ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQffAEV
[0060] 1.引物的合成
[0061] 根據(jù)pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統(tǒng)合成3組引物，第一組為p54基因擴增引 物對，上游引物NT-T0P0-ASFV54F為Seq ID No. 4所示序列，下游引物NT-T0P0-ASFV54R 為Seq ID No. 5所示序列；第二組為對pFastBac/NT-T0P0-p54重組質(zhì)粒進行PCR鑒定 的引物對，其上游引物Polyhedrin forward primer為Seq ID No. 6所示序列，下游引物 SV40polyA reverse primer為Seq ID No. 7所不序列；第三組為對Bacmid_p54重組粘粒 進行PCR鑒定的引物對，其上游引物pUC/M13Forward為Seq ID No. 8所示序列，下游引物
[0062] Seq ID No. 4 :5' -ATGGATTCTGAATTTTTTCAACC-3'
[0063] Seq ID No. 5 :5' -TTACAAGGAGTTTTCTAGGTCT-3'
[0064] Seq ID No. 6 :5, -AAATGATAAC CATCT CGC-3，
[0065] Seq ID No. 7 :5, -GGTAT GGCTGATTAT GATC-3'
[0066] Seq ID No. 8 :5' -CCCAG TCACGACGTT GTAAAACG-3'
[0067] Seq ID No. 9 :5' -AGCGGATAAC AATTT CACAC AGG-3'
[0068] 2. pFastBac_p54重組轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建
[0069] 以與實施例1相同的pMD18T-p54重組質(zhì)粒作為PCR模板，用第一組引物，即p54 基因擴增引物對p54基因進行擴增，用PureLink HiPure Mini Plasmid Purification Kit 回收PCR產(chǎn)物，即獲得靶標基因。取4 μ L靶標基因與1 μ L pFastBac/NT-T0P0載體進行連 接，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞。
[0070] 挑取陽性克隆細菌，采用上述兩組引物進行PCR鑒定：一是采用擴增目標基因的 引物對NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R進行PCR，即第一組引物。二是采用引物對 NT-T0P0-ASFV54F 和 SV40polyAreverse primer。結(jié)果顯不，第一組引物擴增得到約 552bp 的片段，與預(yù)期的552bp的p54基因相符；第二組引物擴增得到片段大小約為758bp，說明 目的基因已經(jīng)連接到了載體適合位置，且連接方向正確，獲得pFastBac-p54重組質(zhì)粒。PCR 擴增的部分凝膠電泳結(jié)果如圖4的A圖所示，其中，M為DNAMarker、泳道1和2均是第二組 引物擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，1為陰性菌落質(zhì)粒擴增產(chǎn)物、2為陽性菌落質(zhì)粒擴增產(chǎn)物。
[0071] 3.重組粘粒Bacmid_p54構(gòu)建
[0072] 將10 μ L重組質(zhì)粒pFastBac_p54轉(zhuǎn)化E. coli DH IOBac感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化完后 往EP管中加入900 μ L LB培養(yǎng)液，37°C搖床225rpm培養(yǎng)4h。以室溫，LB培養(yǎng)液按1 :10、 I :100和I :1000三種濃度稀釋菌液，分別涂布在含有50 μ g/mL卡那霉素（以下簡稱K+)、 7 μ g/mL慶大霉素（以下簡稱G+)、10 μ g/mL四環(huán)素（以下簡稱Tet+)、100 μ g/mL的X-Gal 和40 μ g/mL的IPTG的LB篩選平板上，37°C倒置培養(yǎng)48h。挑取至少10個白斑，接種到上述 組成的篩選平板上，劃線分單菌落，37°C倒置培養(yǎng)過夜，確認是否仍為白斑。最終確定為白 斑的菌落重新接種到20mL的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液含有K+、G+和Tet+，37°C搖床225rpm培養(yǎng) 過夜。同時將Bacmid-CAT和Bacmid-HTA做同樣的操作，分別設(shè)為陽性和陰性對照。取出1 份菌液，米用大質(zhì)粒提取試劑盒PureLink HiPure Plasmid DNAMiniprep Kit提取Bacmid， 其余菌液4°C保存。用兩組引物進行PCR鑒定：一是采用第一組引物，即擴增目標基因的引 物對NT-T0P0-ASFV54F和NT-T0P0-ASFV54R進行PCR ;二是采用第三組引物，即引物對pUC/ M13Forward和pUC/M13Reverse進行PCR。PCR擴增產(chǎn)物的部分凝膠電泳圖如圖4的B圖所 示，其中 M 為 DNA Marker、3 為第一組引物即引物對 NT-T0P0-ASFV54F 和 NT-T0P0-ASFV54R 的擴增產(chǎn)物、4為第三組引物即引物對pUC/M13Forward和pUC/M13Reverse的擴增產(chǎn)物、5 為陰性對照。結(jié)果顯示，第一組引物擴增得到約552bp的片段，與預(yù)期的552bp的p54基 因相符；第三組引物擴增得到大小約為2988bp的片段，說明p54基因已經(jīng)連接到了桿狀病 毒載體上。鑒定完成后將4°C保存的余下菌液制備成甘油菌并凍存在_80°C。
[0073] 4.重組桿狀病毒AcNPV_p54的獲得
[0074] 按 Cellfectil'l? II Reagent 轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明，將 Bacmid_p54， Bacmid-CAT，Bacmid-HTA脂質(zhì)化。脂質(zhì)化后轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，同時把沒有轉(zhuǎn)染Bacmid DNA 的正常Sf9昆蟲細胞設(shè)為空白對照。把細胞置28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大約72h，期間注意觀 察細胞病變情況。大約36小時后細胞出現(xiàn)病變，72小時左右80%細胞出現(xiàn)病變，收集細胞 培養(yǎng)上清，其中含有重組桿狀病毒。上清再感染正常細胞，觀察細胞病變情況，72小時左右 80%細胞出現(xiàn)病變，收集上清和細胞。將感染重組桿狀病毒的細胞超聲破碎，提取上清作為 篩選抗原。
[0075] 對篩選抗原進行Western-blot鑒定，結(jié)果圖圖5所示，圖中，M為蛋白質(zhì)marker、 1為正常sf9細胞蛋白、2為p54重組蛋白；結(jié)果顯示，上清液中含有預(yù)期的真核表達p54重 組蛋白
[0076] 實施例3單克隆抗體的制備
[0077] 1.動物免疫
[0078] 將實施例1中制備的純化p54免疫蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合并乳化，皮下 注射7周齡BALB/c雌鼠，每只0. 2 μ g。14d后用等量弗氏不完全佐劑與p54蛋白混合并乳 化，皮下多點注射。21d后用等量弗氏不完全佐劑與p54蛋白混合并乳化，皮下多點注射。 在計劃和SP2/0細胞融合前3d進行不加任何佐劑的加強免疫注射。
[0079] 2.陽性雜交瘤細胞株的建立
[0080] 取效價高的免疫小鼠，將其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按10 : 1比例混合，常規(guī) PEG融合法制備雜交瘤細胞。采用實施例2中制備的篩選抗原進行間接ELISA方法檢測每 孔雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，并設(shè)大腸桿菌、Sf9細胞蛋白作為篩選抗原的陰性對照。
[0081] 取同時滿足實施例2中的三種篩選抗原間接ELISA結(jié)果強陽性的孔，采用有限稀 釋法進行亞克隆，連續(xù)5次的雜交瘤細胞稀釋和連續(xù)5次的單克隆抗體測試，并且最后3次 抗體測試，全部陽性率孔穴達100 %，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0082] 3.單克隆抗體的制備
[0083] 取10周齡BALB/c雌鼠，腹腔注射液體石蠟，每只0. 5mL，l周后向腹腔注射 5父106個陽性雜交瘤細胞。7-10(1后小鼠腹部明顯脹大，收集腹水并以200017^11離心 5min，上清液即為含抗非洲豬瘟p54蛋白單克隆抗體的腹水，即本例的非洲豬瘟病毒毒株 通用單克隆抗體，一 80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0084] 4.單克隆抗體亞類的鑒定
[0085] 將用Sigma公司的單抗亞類鑒定試劑盒內(nèi)的試劑恢復(fù)至室溫，在裝有試紙卡的小 試管中先加入500 μ L緩沖液，再加500 μ L收集的小鼠腹水，輕輕晃動小試管使試紙卡充分 浸沒。再加入ImL抗小鼠抗體膠體金結(jié)合物，保持試紙卡有字的一面始終浸在液體中，于室 溫下輕輕晃動小試管，直到出現(xiàn)小點。經(jīng)鑒定，該株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體為IgGl 亞類，與預(yù)期相符。
[0086] 5.單克隆抗體特異性鑒定
[0087] 分別米用豬瘟病毒、豬藍耳病病毒、口蹄疫病毒、豬流感病毒、豬偽狂犬病病毒的 全病毒蛋白包被ELISA板，作為檢測抗原，采用本例制備的非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆 抗體作為被檢抗體，經(jīng)間接ELISA方法檢測，結(jié)果顯示本例制備的非洲豬瘟病毒毒株通用 單克隆抗體與上述常見豬病病原均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。
[0088] 6.單克隆抗體親和性分析
[0089] 利用ProteinOnXPR36大分子相互作用系統(tǒng)，研宄本例制備的非洲豬瘟病毒毒株 通用單克隆抗體與非洲豬瘟病毒P54蛋白中特定抗原表位多肽A的親和性，來判斷抗原抗 體之間的結(jié)合解離程度，從而判斷抗原抗體復(fù)合物的穩(wěn)定性。首先活化芯片，將本例制備的 非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體通過化學(xué)鍵結(jié)合在芯片上，然后將芯片去活化并測試單 克隆抗體結(jié)合是否牢固。將配制好的不同濃度的多肽A作為液相，以25 μ L/min流速通過 結(jié)合了單克隆抗體的固相芯片，當抗原抗體的結(jié)合達到峰值后再將抗原抗體復(fù)合物解離， 測試其解離速率。
[0090] 結(jié)果如圖6所示，圖中，橫坐標0S-150S為不同濃度多肽A與單克隆抗體的相互結(jié) 合作用，150s-500s為抗原抗體復(fù)合物的解離；1是濃度為150nM的多肽A、2是濃度為75nM 的多肽A、3是濃度為37. 5nM的多肽A、4是濃度為18. 75nM的多肽A、5是濃度為9. 375nM 的多肽A、6為PBST緩沖液。
[0091] 結(jié)果顯示，本例制備的非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體與非洲豬瘟病毒p54蛋 白中特定抗原表位多肽A在室溫時的解離速率常數(shù)（Kd)為6. 13 X ΙΟ-41/s，其平衡結(jié)合常 數(shù)（KD)為2. 97X 10-9M，以及結(jié)合速率常數(shù)（Ka)為2. 06X 1051/Ms ;表明本例制備的非洲 豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體與特定抗原表位多肽A的結(jié)合較好，親和力較強，適合用于 檢測診斷。
[0092] 實施例4單克隆抗體的應(yīng)用
[0093] 1.材料與方法
[0094] I. 1血清和c-ELISA試劑盒
[0095] 非洲豬瘟標準陽性血清購自英國IAH Pirbright實驗室；153份陰性血清收集于 國內(nèi)多個豬場；c-ELISA商品化試劑盒購自西班牙INGENASA公司。
[0096] 1.2包被抗原的制備
[0097] 采用實施例1制備的純化抗原，即p54免疫蛋白，測定蛋白濃度，用于包被ELISA 板。
[0098] 1. 3單克隆抗體的制備
[0099] 采用實施例3制備的非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體，并標記上辣根過氧化物 酶（HRP)，一 80 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0100] 1. 4競爭ELISA操作程序
[0101] 包被：將P54免疫蛋白抗原用包被液稀釋至2. 5 μ g/mL，分別加入到96孔酶標板 中，每孔l〇〇yL，置4°C冰箱過夜，或37°C作用lh。
[0102] 洗板：取出酶標板棄去液體，每孔加洗液200 μ L，洗板，共三次。最后一次倒置拍 干。
[0103] 封閉：每孔加封閉液100 yL，37°C反應(yīng)lh，洗板。
[0104] 加樣：樣品和弱陽性對照、陽性對照、陰性對照用稀釋液作1 :5稀釋，混勻，分別加 入ELISA反應(yīng)板，每孔50 μ L ;37°C反應(yīng)Ih，洗板。
[0105] 加1. 3中的酶標單抗結(jié)合物：每孔加50 μ L IgG-HRP，輕輕混勻。酶標板置37°C作 用30min，反應(yīng)完成，洗板。
[0106] 加底物液：每孔加10(^1^底物液，37°0作用1〇1^11。
[0107] 終止反應(yīng)：取出反應(yīng)板，每孔快速加入50 μ L終止液，在30min內(nèi)測其OD值。
[0108] 測吸光值：用酶標儀在450nm波長下，測定其吸光值。
[0109] 1. 5競爭ELISA方法實驗條件的優(yōu)化
[0110] L 5. 1抗原包被濃度篩選
[0111] 按間接ELISA實驗操作程序，采用矩陣式排列，分別將純化后的p54按濃度梯度包 被：5、2. 5、1. 25、0. 625 μ g/mL，50 μ!7孔，4°C下包被過夜。酶標單抗06-HRP豎排倍比稀釋： 25 X -3200 X，37°C下0· 5h，顯色3min，加0· 5M硫酸50 μ L/孔終止顯色，選取ODL 5左右， 并綜合考慮包被成本和使用酶標單抗的數(shù)目，選擇最佳包被濃度。
[0112] L 5. 2酶標單抗工作濃度篩選
[0113] 按上述1.4競爭ELISA實驗操作程序，采用2.5 μ g/mL的ρ54純化蛋白包被酶標 板，待檢標準陽性血清分別按40 X，80 X，160 X，320 X縱向倍比稀釋，并做重復(fù)；待檢標 準陰性血清按40X稀釋作對照，也做重復(fù)孔。橫向加入競爭06-HRP單抗，并按梯度稀釋： 100 X，200 X，400 X，800 X。測定OD值，計算抑制率，取抑制率最高的單抗稀釋倍數(shù)作為酶 標單抗的最佳工作濃度。
[0114] 1. 6競爭ELISA方法結(jié)果判定閾值確定
[0115] 為確定競爭ELISA試驗方法判定陰陽性結(jié)果的臨界值，本實驗采用20份陰性血清 作為被檢血清，該20份血清經(jīng)西班牙INGENASA公司的非洲豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒檢 測為陰性血清，按上述優(yōu)化好的競爭ELISA方法試驗程序進行試驗，然后測定每份血清的 OD值。按照下列公式計算該20份血清的阻斷率，即PI值：
[0116] PI (%) = (1-樣品血清平均OD值+陰性血清對照平均OD值）X 100%
[0117] 計算20份血清的平均PI值以及其標準差S。按平均PI值加上3倍標準差S的值 作為陽性結(jié)果判定臨界值；按平均PI值加上2倍標準差S的值作為陰性結(jié)果判定臨界值； 位于兩者間則判定為可疑樣品。
[0118] 1. 7競爭ELISA方法應(yīng)用于檢測田間樣本
[0119] 取來源于不同國家的107份血清樣品，其中包括53份感染不同毒株的陽性血清樣 品和54份陰性血清樣品，按上述優(yōu)化好的操作規(guī)程及判定標準檢測，并與商業(yè)檢測試劑盒 進行符合性比較。
[0120] 2 結(jié)果
[0121] 2. 1包被抗原濃度的篩選
[0122] 按間接ELISA實驗操作程序，采用矩陣式排列，分別將純化后的ρ54按濃度梯度 包被：5、2. 5、1. 25、0. 625 yg/mL，50 μ!7孔，4°C下包被過夜。上述酶標單抗豎排倍比稀釋： 25\-3200父，37°0下0.511，顯色31^11，加0.51硫酸5(^17孔終止顯色。結(jié)果如表1所示。
[0123] 表1抗原濃度篩選結(jié)果
[0124]

【權(quán)利要求】
1. 一種非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體的制備方法，其特征在于：包括采用純化的 p54免疫蛋白對小鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞， 然后采用三種篩選抗原對陽性雜交瘤細胞株進行篩選，獲得可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒單 克隆抗體的雜交瘤細胞，然后通過體內(nèi)或體外的方法制備非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗 體；所述三種篩選抗原包括，原核表達P54重組蛋白、真核表達p54重組蛋白和人工合成的 Seq ID No. 1所示序列的多肽； Seq ID No. 1 ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEV〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述p54免疫蛋白通過以下方式獲 取，將pMD18-T-p54質(zhì)粒中p54基因片段轉(zhuǎn)入pET-52b(+)質(zhì)粒，并在大腸桿菌DH5a中進 行可溶性表達，然后提取純化表達蛋白，即P54免疫蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述原核表達p54重組蛋白為利用 pET-52b(+)質(zhì)粒在大腸桿菌中原核表達后提取純化的p54重組蛋白；所述真核表達p54重 組蛋白為利用pFastBac/NT-TOPO昆蟲表達系統(tǒng)真核表達獲得的p54重組蛋白。
4. 一種非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體，其特征在于：所述通用單克隆抗體由保藏 號CCTCC No. C2014212的雜交瘤細胞株SZCIQASFV1分泌產(chǎn)生。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的通用單克隆抗體，其特征在于：所述通用單克隆抗體由權(quán)利 要求1-3任一項所述的方法制備。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的通用單克隆抗體在制備非洲豬瘟病毒檢測試劑或設(shè)備中 的應(yīng)用。
7. -種非洲豬瘟病毒酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權(quán)利要求 4或5所述的通用單克隆抗體。
8. -種分泌非洲豬瘟病毒毒株通用單克隆抗體的雜交瘤細胞，其保藏號為CCTCC No.C2014212。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的雜交瘤細胞的制備方法，包括采用純化的p54免疫蛋白對小 鼠進行免疫，取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞，然后采用三種篩 選抗原對陽性雜交瘤細胞株進行篩選，對三種篩選抗原均為強陽性的樣品進行有限稀釋法 細胞亞克隆，連續(xù)若干次的雜交瘤細胞稀釋和連續(xù)若干次的單克隆抗體測試，并且最后三 次抗體測試全部陽性率孔穴達100%的雜交瘤細胞，即獲得可穩(wěn)定分泌抗非洲豬瘟病毒單 克隆抗體的雜交瘤細胞； 所述三種篩選抗原包括，原核表達P54重組蛋白、真核表達p54重組蛋白和人工合成 的Seq ID No. 1所不序列的多狀； Seq ID No. 1 ：SSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEV〇
【文檔編號】C12N5/20GK104497137SQ201410736335
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】曹琛福, 花群義, 劉建利, 唐金明, 呂建強, 宗卉, 張彩虹, 楊俊興, 孫潔, 廖立珊 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心