汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、表皮生長因子、三碘甲狀腺原氨酸、氫化可的松、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、肝細(xì)胞生長因子以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白4。采用本發(fā)明的汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以成功誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為汗腺樣細(xì)胞，為大面積燒傷病人的救治提供足夠數(shù)量的汗腺細(xì)胞，大大改善病人的生活質(zhì)量。也為研究汗腺的分化發(fā)育提供的理論依據(jù)，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞中的應(yīng)用，屬于汗腺細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]我國燒傷年發(fā)病率約為1.5%?2%，即每年約有千萬人遭受不同程度燒傷，近萬人嚴(yán)重?zé)齻?，其中約10%病人由于缺乏皮源無法挽救其性命。大面積燒傷獲救病人由于無功能的疤痕組織取代皮膚使其終生喪失正常皮膚功能，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。大面積皮膚嚴(yán)重?zé)齻木戎问悄壳柏酱鉀Q的醫(yī)學(xué)和社會問題。
[0003]皮膚是人體最大的器官，具有保護(hù)身體，排汗，感覺冷熱和壓力等功能。其中汗腺作為重要的功能性皮膚附屬器，在調(diào)節(jié)體溫，分泌汗液及排出人體部分代謝產(chǎn)物的過程中發(fā)揮著重要的作用。人體中汗腺分為兩種，頂泌汗腺和外泌汗腺。頂泌汗腺較大，有較大的官腔，與體溫調(diào)節(jié)無關(guān)。外泌汗腺較小，分布于人體全身，參與體溫調(diào)節(jié)。
[0004]外泌汗腺分為導(dǎo)管部和分泌部。分泌部位于真皮層或皮下組織內(nèi)，是卷曲的小管，而導(dǎo)管部開口于表皮層，連接分泌部和外界環(huán)境。
[0005]輕度燒傷，汗腺的導(dǎo)管細(xì)胞可以其深部未受創(chuàng)部分為模版，通過干細(xì)胞的分化形成它特有的三維結(jié)構(gòu)而完全修復(fù)。但是，全層皮膚大面積深度燒傷，汗腺則不能依賴干細(xì)胞的分裂增殖與終末分化來自我更新而重建其復(fù)雜結(jié)構(gòu)。
[0006]人體內(nèi)存在的汗腺數(shù)量是一定的，由于其發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，一旦大面積受損，將無法快速有效的恢復(fù)有功能性的汗腺。故創(chuàng)面雖經(jīng)覆蓋，但無排汗功能，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。
[0007]皮膚組織修復(fù)和功能重建在國內(nèi)和國際上都是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研宄的核心和熱點(diǎn)。目前，汗腺組織的發(fā)育機(jī)制還不明確，無法實(shí)現(xiàn)臨床大量移植。研宄表明，干細(xì)胞可以定向分化為并構(gòu)建具有覆蓋保護(hù)能力的表皮層組織；然而對于真皮層組織中的功能性皮膚附屬器，目前干細(xì)胞汗腺細(xì)胞定向分化尚未見報道。
[0008]利用膠原酶消化皮膚，待汗腺個體游離出來在倒置顯微鏡下吸取分離出至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)可以形成汗腺細(xì)胞。但目前對此研宄存在一些問題，如汗腺分離純化困難且在體外培養(yǎng)傳代有限，限制其應(yīng)用；同時，體外培養(yǎng)汗腺所用的培養(yǎng)基目前還沒有確定，對于汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)效果均不理想。
[0009]現(xiàn)有研宄發(fā)現(xiàn)，與汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)的干細(xì)胞可分化為汗腺細(xì)胞。將汗腺細(xì)胞進(jìn)行熱休克處理，收集熱休克后汗腺細(xì)胞的培養(yǎng)上清，與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成具有汗腺表型的細(xì)胞。但是這一方法也存在問題，由于汗腺細(xì)胞分離純化和傳代培養(yǎng)效率低，獲取大量培養(yǎng)上清存在困難；而且培養(yǎng)上清成分不清楚，其具體作用機(jī)制也不明；特別是能否獲得具有功能性的汗腺細(xì)胞還不確定。
[0010]因此研發(fā)新的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，建立新型高效的干細(xì)胞汗腺細(xì)胞定向分化方法十分必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供一種可以將干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；并公開了利用其將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞的方法，從而解決大面積燒傷病人救治過程中對汗腺的需求。
[0012]為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括體積比為(0.8?I): I的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基；還包括以下成分，各成分的用量為:
胎牛血清3?6%
表皮生長因子40?55 μ g/L
三碘甲狀腺原氨酸0.5?1.5mmol/L
氫化可的松0.1?0.3mg/L
胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞砸酸鈉 0.5?2%
L-谷氨酰胺0.5?2mmol/L
青霉素0.02?0.08U/L
鏈霉素0.02?0.09 μ g/L
肝細(xì)胞生長因子20?30 μ g/L
骨形態(tài)發(fā)生蛋白48?12 μ g/L。
[0013]優(yōu)選的，所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括體積比為0.9: I的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基；還包括以下成分，各成分的用量為:
胎牛血清5%
表皮生長因子50 μ g/L
三碘甲狀腺原氨酸lmmol/L
氫化可的松0.2mg/L
胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞砸酸鈉 1%
L-谷氨酰胺lmmol/L
青霉素0.05U/L
鏈霉素0.05 μ g/L
肝細(xì)胞生長因子25 μ g/L
骨形態(tài)發(fā)生蛋白410 μ g/L。
[0014]上述技術(shù)方案中，所述角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基為KGM2細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0015]本發(fā)明還公開了上述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0016]上述技術(shù)方案中，所述干細(xì)胞為羊水干細(xì)胞或者多潛能干細(xì)胞。
[0017]利用上述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞的方法，包括取干細(xì)胞鋪于培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng)；待所述干細(xì)胞貼壁后，添加汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)干細(xì)胞；然后每天更換汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的干細(xì)胞生長至匯合率為70~80%，進(jìn)行消化傳代，按I傳3的比例接種至新的培養(yǎng)皿中，添加汗腺定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基；誘導(dǎo)分化一段時間后得到汗腺樣細(xì)胞，并對其進(jìn)行汗腺指標(biāo)的檢測。干細(xì)胞的數(shù)量與培養(yǎng)器具有關(guān)，如果太多細(xì)胞的生長會太快導(dǎo)致消化傳代的次數(shù)會增多，比如取I X 15干細(xì)胞種在6孔板里，密度比較合適。
[0018]本發(fā)明中，羊水干細(xì)胞(Amn1tic Fluid Stem Cell, AFS)具有良好的增殖效率以及低免疫源性，是一種新型的干細(xì)胞。
[0019]由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明公開了一種新的汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能有效的誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞；運(yùn)用本發(fā)明的汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基可很好地將干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為具有汗腺細(xì)胞表型的汗腺樣細(xì)胞，并且該汗腺樣細(xì)胞在膠中可形成類似于汗腺結(jié)構(gòu)的管狀結(jié)構(gòu)。
[0020]2.本發(fā)明以DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置新的汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用于誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為汗腺細(xì)胞時的培養(yǎng)設(shè)備簡單，操作步驟簡便、快速，成本低，適用于大量干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，易于推廣普及。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]附圖1為實(shí)施例一中人羊水干細(xì)胞、誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞、人汗腺細(xì)胞的形態(tài)圖； 附圖2為實(shí)施例一中mRNA水平上檢測誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的汗腺指標(biāo)圖；
附圖3為實(shí)施例一中誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的分化比率圖；
附圖4為實(shí)施例一中人羊水干細(xì)胞、誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞、人汗腺細(xì)胞的透射電鏡圖；附圖5為實(shí)施例一中人汗腺組織、誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞、人汗腺細(xì)胞的汗腺樣導(dǎo)管結(jié)構(gòu)圖；
附圖6為實(shí)施例一中人羊水干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成管腔的過程圖；
附圖7為實(shí)施例二中多潛能干細(xì)胞、誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞、人汗腺細(xì)胞的形態(tài)圖；
附圖8為實(shí)施例二中mRNA水平上檢測誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的汗腺指標(biāo)圖；
附圖9為實(shí)施例二中誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的分化比率圖；
附圖10為實(shí)施例二中多潛能干細(xì)胞、誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞、人汗腺細(xì)胞的透射電鏡圖；
附圖11為實(shí)施例二中人汗腺組織、誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞、人汗腺細(xì)胞的汗腺樣導(dǎo)管結(jié)構(gòu)圖；
附圖12為實(shí)施例二中多潛能干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成管腔的過程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例與附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
實(shí)施例一:誘導(dǎo)人羊水干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞
汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括450mL DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone，SH30023.01B),500mL角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基(KGM2) (Lonza，CC-3107)，額外添加50mL特級胎牛血清、lmmol/L三碘甲狀腺原氨酸、0.2mg/L氫化可的松、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞砸酸鈉、lmmol/L L-谷氨酰胺、0.05U/L青霉素和0.05 μ g/L鏈霉素；再加入50 μ g/L表皮生長因子(EGF)，25 μ g/L肝細(xì)胞生長因子(HGF)以及10 μ g/L骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (BMP4)。
[0023]誘導(dǎo)羊水干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞，包括以下步驟:
(1)取5X14個/孔的人羊水干細(xì)胞鋪于6孔板中，使用羊水干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；
羊水干細(xì)胞培養(yǎng)基:a -MEM培養(yǎng)基中添加15%胎牛血清(FBS)，I mM L-谷氨酰胺和
0.05U/L 青霉素，0.05 μ g/L 鏈霉素，18%Chang B 和 2%Chang C 培養(yǎng)基；
(2)20h后，待羊水干細(xì)胞貼壁后，添加汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；然后每天更換培養(yǎng)汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)待誘導(dǎo)后的羊水干細(xì)胞生長至匯合率為80%，吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，使用ImL 0.25%胰酶對細(xì)胞消化2分鐘，使用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶的作用，將消化下來的細(xì)胞吸入離心管中離心，1200轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。棄去上清，加入汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀混勻，按I傳3的比例接種細(xì)胞至新的培養(yǎng)皿中；
(4)重復(fù)步驟(3)，誘導(dǎo)分化28天后得到汗腺樣細(xì)胞，并對其進(jìn)行汗腺指標(biāo)的檢測。
[0024]附圖1為體外培養(yǎng)的人羊水干細(xì)胞，人羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞以及人汗腺細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)圖?？梢钥闯鋈搜蛩杉?xì)胞，細(xì)胞較小，呈梭型，排列無規(guī)則；由人羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的汗腺樣細(xì)胞，細(xì)胞變大，成上皮細(xì)胞樣，排列規(guī)則?’人汗腺細(xì)胞，細(xì)胞較大，具有明顯的上皮細(xì)胞形態(tài)，呈鋪路石狀生長，細(xì)胞排列整齊。人羊水干細(xì)胞經(jīng)過汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后得到的汗腺樣細(xì)胞在形態(tài)上接近體外培養(yǎng)的人汗腺細(xì)胞。
[0025]附圖2為mRNA水平上檢測誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的汗腺指標(biāo)圖。Realtime-PCR結(jié)果顯示，人羊水干細(xì)胞在誘導(dǎo)的過程中，逐漸表達(dá)汗腺細(xì)胞指標(biāo)EDA、EDAR、K8和CEA，且在分化的過程中逐漸接近汗腺細(xì)胞。人羊水干細(xì)胞(hAFS)作為陰性對照，人汗腺細(xì)胞(hSG)作為陽性對照。
[0026]附圖3為誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的分化比率圖。經(jīng)過28天的誘導(dǎo)，用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞在汗腺細(xì)胞指標(biāo)上的表達(dá)。經(jīng)過分析，人羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞表達(dá)EDA大約36%，EDAR大約43%，K8大約45%，CEA大約32%。人羊水干細(xì)胞可以很好的被誘導(dǎo)分化為汗腺養(yǎng)細(xì)胞。
[0027]附圖4為透射電鏡在細(xì)胞器水平上檢測人羊水干細(xì)胞，人羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞以及人汗腺細(xì)胞的汗腺指標(biāo)圖。人羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在細(xì)胞器水平上接近人汗腺細(xì)胞，具體表現(xiàn)在誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞具有人汗腺細(xì)胞有的微絨毛(黑色箭頭)，而人羊水干細(xì)胞則沒有微絨毛。
[0028]附圖5為人汗腺組織，人羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞以及人汗腺細(xì)胞的汗腺樣導(dǎo)管結(jié)構(gòu)圖，圖中可見汗腺管狀結(jié)構(gòu)的橫截面，能觀察到汗腺管腔；人羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成的汗腺管狀結(jié)構(gòu)，可見管狀結(jié)構(gòu)橫截面以及管腔；人汗腺細(xì)胞在膠中形成的管狀結(jié)構(gòu)，可見管狀結(jié)構(gòu)橫截面以及管腔。
[0029]附圖6為人羊水干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成管腔的過程。汗腺樣細(xì)胞在膠中增殖成團(tuán)，中間的細(xì)胞逐漸凋亡，形成管腔。
[0030]實(shí)施例二:誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞
汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括450mLDMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、450mL角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基(KGM2)，額外添加55mL特級胎牛血清、1.5mmol/L三碘甲狀腺原氨酸、0.3mg/L氫化可的松、2%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞砸酸鈉、1.5mmol/L L-谷氨酰胺、0.08U/L青霉素和0.09 μ g/L鏈霉素；再加入55 μ g/L表皮生長因子(EGF)，30 μ g/L肝細(xì)胞生長因子(HGF)以及8 μ g/L骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (BMP4)。
[0031]誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞，包括以下步驟:
(I)取IX 15個/孔的多潛能干細(xì)胞鋪于6孔板中，使用多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)基:含20%Knock0ut血清、1%非必需氨基酸、0.lmmol/L β -2-巰基乙醇、4 μ g/L FGF-based、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1U/L 青霉素和 0.lug/L鏈霉素的 DMEDF12細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0032](2) 24h后，待多潛能干細(xì)胞貼壁后，添加汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；然后每天更換培養(yǎng)汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；
(3)待誘導(dǎo)后的多潛能干細(xì)胞生長至匯合率為70%，吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，使用0.8mL 0.25%胰酶對細(xì)胞消化2分鐘，使用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶的作用，將消化下來的細(xì)胞吸入離心管中離心，1200轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。棄去上清，加入汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將細(xì)胞沉淀混勻，按I傳4的比例接種細(xì)胞至新的培養(yǎng)皿中；
(4)重復(fù)步驟(3)，誘導(dǎo)分化21天后得到汗腺樣細(xì)胞，并對其進(jìn)行汗腺指標(biāo)的檢測，利用汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以成功將多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)為汗腺樣細(xì)胞。
[0033]附圖7為體外培養(yǎng)的多潛能干細(xì)胞，多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞以及人汗腺細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)圖。可以看出多潛能干細(xì)胞，細(xì)胞較小，呈克隆樣生長，細(xì)胞核質(zhì)比較高；由多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的汗腺樣細(xì)胞，細(xì)胞變大，成上皮細(xì)胞樣，核質(zhì)比變??；人汗腺細(xì)胞，細(xì)胞較大，具有明顯的上皮細(xì)胞形態(tài)，呈鋪路石狀生長，細(xì)胞排列整齊。多潛能干細(xì)胞經(jīng)過汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后得到的汗腺樣細(xì)胞在形態(tài)上接近體外培養(yǎng)的人汗腺細(xì)胞。
[0034]附圖8為mRNA水平上檢測誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的汗腺指標(biāo)圖。Realtime-PCR結(jié)果顯示，多潛能干細(xì)胞在誘導(dǎo)的過程中，逐漸表達(dá)汗腺細(xì)胞指標(biāo)EDA、EDAR、K8和CEA，且在分化的過程中逐漸接近汗腺細(xì)胞。多潛能干細(xì)胞(SG-1PS)作為陰性對照，人汗腺細(xì)胞(SG)作為陽性對照。
[0035]附圖9為誘導(dǎo)得到的汗腺樣細(xì)胞的分化比率圖。經(jīng)過21天的誘導(dǎo)，用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞在汗腺細(xì)胞指標(biāo)上的表達(dá)。經(jīng)過分析，多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞表達(dá)EDA大約63%，EDAR大約65%，K8大約76%，CEA大約56%。多潛能干細(xì)胞可以被高產(chǎn)率的誘導(dǎo)分化為汗腺養(yǎng)細(xì)胞。
[0036]附圖10為透射電鏡在細(xì)胞器水平上檢測多潛能干細(xì)胞，多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞以及人汗腺細(xì)胞的汗腺指標(biāo)圖。多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在細(xì)胞器水平上接近人汗腺細(xì)胞，具體表現(xiàn)在誘導(dǎo)后的汗腺樣細(xì)胞具有人汗腺細(xì)胞有的微絨毛(黑色箭頭)，而多潛能干細(xì)胞則沒有微絨毛。
[0037]附圖11為人汗腺組織，多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細(xì)胞以及人汗腺細(xì)胞的汗腺樣導(dǎo)管結(jié)構(gòu)圖，圖中可見汗腺管狀結(jié)構(gòu)的橫截面，能觀察到汗腺管腔；多潛能干細(xì)胞誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成的汗腺管狀結(jié)構(gòu)，可見管狀結(jié)構(gòu)橫截面以及管腔；人汗腺細(xì)胞在膠中形成的管狀結(jié)構(gòu)，可見管狀結(jié)構(gòu)橫截面以及管腔。
[0038]附圖12為多潛能干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細(xì)胞在膠中形成管腔的過程。汗腺樣細(xì)胞在膠中增殖成團(tuán)，中間的細(xì)胞逐漸凋亡，形成管腔。
[0039]綜上所述，可以使用本發(fā)明的汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為汗腺樣細(xì)胞，為大面積燒傷病人的救治提供足夠數(shù)量的汗腺細(xì)胞，大大改善病人的生活質(zhì)量。也為研宄汗腺的分化發(fā)育提供的理論依據(jù)，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于:所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括體積比為(0.8?I): I的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基；還包括以下成分，各成分的用量為:胎牛血清3?6% 表皮生長因子40?55 μ g/L 三碘甲狀腺原氨酸0.5?1.5mmol/L 氫化可的松0.1?0.3mg/L 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞砸酸鈉 0.5?2% L-谷氨酰胺0.5?2mmol/L 青霉素0.02?0.08U/L 鏈霉素0.02?0.09 μ g/L 肝細(xì)胞生長因子20?30 μ g/L 骨形態(tài)發(fā)生蛋白48?12 μ g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于:所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括體積比為0.9: I的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基；還包括以下成分，各成分的用量為:胎牛血清5% 表皮生長因子50 μ g/L 三碘甲狀腺原氨酸lmmol/L 氫化可的松0.2mg/L 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞砸酸鈉1% L-谷氨酰胺lmmol/L 青霉素0.05U/L 鏈霉素0.05 μ g/L 肝細(xì)胞生長因子25 μ g/L 骨形態(tài)發(fā)生蛋白410 μ g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于:所述角質(zhì)化細(xì)胞培養(yǎng)基為KGM2細(xì)胞培養(yǎng)基。
4.權(quán)利要求1或者2所述汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基在誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述干細(xì)胞為羊水干細(xì)胞或者多潛能干細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/071GK104450606SQ201410786562
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】張學(xué)光, 秦明德, 梁含思, 李芳 , 孫青
申請人:蘇州大學(xué)