本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種海參膠原蛋白的提取方法。

背景技術(shù)：

海參，屬棘皮動物，是一種古老的海洋軟體生物。有著6億多年的存活史，因其“性溫補、足敵山參”而勝名，在“海味八珍”中居首位，價值昂貴，為久負盛名的滋補珍品。海參的營養(yǎng)價值極高，富含聚氨基葡萄糖、粘多糖、海洋生物活性鈣、高蛋白、黏蛋白、多肽、膠原蛋白、核酸、海參皂甙、硫酸軟骨素、多種維生素、及各種氨基酸和碳水化合物等50多種養(yǎng)分，是不可多得的不含膽固醇的高級滋補品。

海參中富含的聚氨基葡萄糖、生物活性鈣、海參粘多糖、多肽、海參素、海參皂苷、氨基酸、等活性成分，能有效修復受損關(guān)節(jié)軟骨，恢復骨關(guān)節(jié)的正常功能。同時海參中營養(yǎng)成分還具有擴張血管，增加血液流量；抑制血小板聚集，增強纖維蛋白的溶解，改善微循環(huán)；促進炎癥滲出物吸收；并有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗感染、提高機體免疫力的作用。蛋氨酸、?；撬?，微量元素釩、硒、鍺、維生素PP等，這些物質(zhì)都是人體生長發(fā)育不可缺少的物質(zhì)，在機體內(nèi)起到不可替代的生理功能，如蛋氨酸、?；撬?，能夠促進生長發(fā)育，緩解疲勞；微量元素釩，能夠使機體內(nèi)鐵元素更有效的吸收，改善各種貧血；元素硒、鍺等則具有清除人體自由基，防癌、抗癌的作用。

從海參中可提取很多對人體有益的物質(zhì)，如膠原蛋白，現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為CN101532044B的中國發(fā)明專利，公開了一種海參煮液提取海參膠原蛋白小肽凍干粉的制備方法，其采用海參煮液作原料，經(jīng) A 海參煮液獲得 ；B生物酶解 ；C 海參膠原蛋白小肽的純化 ；D 凍干干燥及包裝成品。該方法提高海參加工率和營養(yǎng)價值，采用 FD 航天生物冷凍干燥技術(shù)，保持海參膠原蛋白小肽的活性、抗氧化、抗復聚、抗潮結(jié)性、水份低易保存。該方法膠原蛋白的獲取量不大，制備時間長，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種海參膠原蛋白提取率高，能得到純度高，活性強，能達到皮膚真皮層，增加皮膚彈性，淡化皺紋的膠原蛋白的海參膠原蛋白的提取方法。

本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：

一種海參膠原蛋白的提取方法，具體步驟為：

1）去腥：將海參切成小塊，加入去腥劑，浸泡，浸泡時間為10~15h，瀝干；

2）脫脂：將去腥后的海參勻漿，加入脫脂劑，回流提取，脫脂劑為丙酮-乙酸乙酯混合液，丙酮：乙酸乙酯體積比為1:2~4，勻漿液：混合液體積比為1:20~25，回流溫度為70~80℃，回流時間為50~60min，重復脫脂1~3次。干燥，得到脫脂海參粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導致酶解液的色澤、氣味發(fā)生變化；其次，脂肪與蛋白乳化會造成水解后的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利制備的重要條件。采用上述脫脂劑對海參進行脫脂，脫脂率高?；厥栈亓饕海羧コ撝瑒?，得到海參中脂溶性物質(zhì)，如不飽和脂肪酸；

3）分步酶解：在脫脂海參粉末中按質(zhì)量體積比為1g：（10~15）mL：（0.02~0.04）g加入蒸餾水和助溶劑，再加入0.002~0.004%木瓜蛋白酶，酶解，酶解溫度為53~56℃，pH為6.5~7.2，酶解時間為2.7~3.2h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶。調(diào)節(jié)pH，加入0.004~0.007%胰凝乳蛋白酶，酶解，酶解溫度為57~70℃，pH為7.1~7.6，酶解時間為1.2~1.5h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶。調(diào)節(jié)pH，加入0.003~0.006%風味蛋白酶，酶解，酶解溫度為46~52℃，pH為6.0~6.7，酶解時間為1.8~2.3h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾。先用內(nèi)切酶木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解，使海參蛋白的氨基酸酶切位點暴露率增加，再用外切酶風味蛋白酶進行酶解，將海參蛋白充分酶解，增加海參膠原蛋白的量，提高產(chǎn)率；

4）醇沉：在濾液中加入95~98%的乙醇，濾液：乙醇體積比為1:3.5~4.5，攪拌，靜置，離心。高濃度乙醇能使蛋白質(zhì)沉淀的同時不會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不會影響其活性。醇沉能使海參膠原蛋白進行初步的純化，回收離心所得上清液，旋蒸去除乙醇和水，可得到海參中既能溶于水，又能溶于高濃度乙醇的物質(zhì)；

5）超濾、干燥：在步驟4得到的沉淀中加入蒸餾水，沉淀：蒸餾水質(zhì)量體積比為1g：（5~8）mL。超濾，先用6~9kDa超濾膜超濾，取濾過液，再用300~500Da超濾膜超濾，取滯留液，旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到海參膠原蛋白粉末?；厥盏谝淮纬瑸V的滯留液可得到分子量大于6~9kDa的物質(zhì)，如海參粘多糖；回收第二次超濾濾過液，可得到分子量小于300~500Da的物質(zhì)，如?；撬帷⑽⒘吭剽C、硒、鍺。最后得到的海參膠原蛋白的純度高，分子量小，能夠直達皮膚真皮層，鎖住水分，增加皮膚的彈性，淡化皺紋；活性強，抗氧化能力強，清除體內(nèi)自由基，起到抗衰老的作用。

優(yōu)選的，去腥液成份及其重量份為：15~20份紫蘇提取物、10~12份姜提取物、5~10份蒜提取物、1~3份乙醇、4~8份肉桂棒提取物、3~5份甲魚膽汁提取物。上述去腥液既能與三甲胺反應(yīng)產(chǎn)生季銨鹽，又能溶解三甲胺，且溶解度高，浸泡時間短，去腥效果顯著。

優(yōu)選的，助溶劑成份及其重量份：0.04~0.07份辛烯基琥珀酸淀粉鈉、0.001~0.003份沒食子酸、0.001~0.002份酪蛋白酸鈉、0.002~0.005份毛地黃皂苷和0.001~0.003份吐溫-80。助溶劑既能將膠原蛋白的疏水段包裹起來，減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，又能增強蛋白質(zhì)-水之間的離子相互作用，增加膠原蛋白在水中的溶解度，提高膠原蛋白的提取率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：采用丙酮-乙酸乙酯混合液作為脫脂劑，對海參的脫脂率高；毛地黃皂苷和沒食子酸通過烯基琥珀酸淀粉鈉促進增強蛋白質(zhì)-水之間的離子相互作用，膠原蛋白在水中的溶解，提高膠原蛋白提取率；先用內(nèi)切酶木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解，使海參蛋白的氨基酸酶切位點暴露率增加，再用外切酶風味蛋白酶進行酶解，將海參蛋白充分酶解，增加海參膠原蛋白的量，提高產(chǎn)率；通過醇沉對膠原蛋白進行初步分離純化；通過超濾，對膠原蛋白再次分離純化，提高膠原蛋白的純度；最后得到的海參膠原蛋白的純度高，分子量小，能夠直達皮膚真皮層，鎖住水分，增加皮膚的彈性，淡化皺紋；活性強，抗氧化能力強，清除體內(nèi)自由基，起到抗衰老的作用；將制備海參膠原蛋白的過程中產(chǎn)生的廢棄物進行回收純化，得到經(jīng)濟價值高的產(chǎn)品，如聚氨基葡萄糖、生物活性鈣、海參粘多糖、多肽、海參素、海參皂苷、氨基酸；本發(fā)明操作步驟簡單，得到的產(chǎn)品經(jīng)濟價值高，增加了海參的經(jīng)濟附加值，為海參的處理增加了一條新的途徑。

具體實施例

下面通過實施例對本發(fā)明方案作進一步說明：

實施例1：

一種海參膠原蛋白的提取方法，具體步驟為：

1）去腥：將海參切成小塊，加入去腥劑，浸泡，浸泡時間為10~15h，瀝干；

2）脫脂：將去腥后的海參勻漿，加入脫脂劑，回流提取，脫脂劑為丙酮-乙酸乙酯混合液，丙酮：乙酸乙酯體積比為1:2~4，勻漿液：混合液體積比為1:20~25，回流溫度為70~80℃，回流時間為50~60min，重復脫脂1~3次。干燥，得到脫脂海參粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導致酶解液的色澤、氣味發(fā)生變化；其次，脂肪與蛋白乳化會造成水解后的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利制備的重要條件。采用上述脫脂劑對海參進行脫脂，脫脂率高?；厥栈亓饕海羧コ撝瑒?，得到海參中脂溶性物質(zhì)，如不飽和脂肪酸；

3）分步酶解：在脫脂海參粉末中按質(zhì)量體積比為1g：（10~15）mL：（0.02~0.04）g加入蒸餾水和助溶劑，再加入0.002~0.004%木瓜蛋白酶，酶解，酶解溫度為53~56℃，pH為6.5~7.2，酶解時間為2.7~3.2h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶。調(diào)節(jié)pH，加入0.004~0.007%胰凝乳蛋白酶，酶解，酶解溫度為57~70℃，pH為7.1~7.6，酶解時間為1.2~1.5h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶。調(diào)節(jié)pH，加入0.003~0.006%風味蛋白酶，酶解，酶解溫度為46~52℃，pH為6.0~6.7，酶解時間為1.8~2.3h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶，過濾。先用內(nèi)切酶木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解，使海參蛋白的氨基酸酶切位點暴露率增加，再用外切酶風味蛋白酶進行酶解，將海參蛋白充分酶解，增加海參膠原蛋白的量，提高產(chǎn)率；

4）醇沉：在濾液中加入95~98%的乙醇，濾液：乙醇體積比為1:3.5~4.5，攪拌，靜置，離心。高濃度乙醇能使蛋白質(zhì)沉淀的同時不會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不會影響其活性。醇沉能使海參膠原蛋白進行初步的純化，回收離心所得上清液，旋蒸去除乙醇和水，可得到海參中既能溶于水，又能溶于高濃度乙醇的物質(zhì)；

5）超濾、干燥：在步驟4得到的沉淀中加入蒸餾水，沉淀：蒸餾水質(zhì)量體積比為1g：（5~8）mL。超濾，先用6~9kDa超濾膜超濾，取濾過液，再用300~500Da超濾膜超濾，取滯留液，旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到海參膠原蛋白粉末?；厥盏谝淮纬瑸V的滯留液可得到分子量大于6~9kDa的物質(zhì)，如海參粘多糖；回收第二次超濾濾過液，可得到分子量小于300~500Da的物質(zhì)，如牛磺酸、微量元素釩、硒、鍺。最后得到的海參膠原蛋白的純度高，分子量小，能夠直達皮膚真皮層，鎖住水分，增加皮膚的彈性，淡化皺紋；活性強，抗氧化能力強，清除體內(nèi)自由基，起到抗衰老的作用。

去腥液成份及其重量份為：15~20份紫蘇提取物、10~12份姜提取物、5~10份蒜提取物、1~3份乙醇、4~8份肉桂棒提取物、3~5份甲魚膽汁提取物。上述去腥液既能與三甲胺反應(yīng)產(chǎn)生季銨鹽，又能溶解三甲胺，且溶解度高，浸泡時間短，去腥效果顯著。

助溶劑成份及其重量份：0.04~0.07份辛烯基琥珀酸淀粉鈉、0.001~0.003份沒食子酸、0.001~0.002份酪蛋白酸鈉、0.002~0.005份毛地黃皂苷和0.001~0.003份吐溫-80。助溶劑既能將膠原蛋白的疏水段包裹起來，減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，又能增強蛋白質(zhì)-水之間的離子相互作用，增加膠原蛋白在水中的溶解度，提高膠原蛋白的提取率。

實施例2：

一種海參膠原蛋白的提取方法，最優(yōu)選步驟為：

1）去腥：稱取10kg海參，用清水洗凈，將海參切成1cm×1cm×1cm的小塊，加入去腥劑，將海參小塊浸沒，去腥液成份及其最優(yōu)選重量份為：18份紫蘇提取物、12份姜提取物、7份蒜提取物、3份乙醇、6份肉桂棒提取物、4份甲魚膽汁提取物。上述去腥液既能與三甲胺反應(yīng)產(chǎn)生季銨鹽，又能溶解三甲胺，且溶解度高，浸泡時間短，去腥效果顯著。浸泡，浸泡時間為15h，瀝干；

2）脫脂：將去腥后的海參勻漿，加入脫脂劑，回流提取，脫脂劑為丙酮-乙酸乙酯混合液，丙酮：乙酸乙酯體積比為1:3，勻漿液：混合液體積比為1: 25，回流溫度為76℃，回流時間為60min，重復脫脂2次。干燥，得到脫脂海參粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導致酶解液的色澤、氣味發(fā)生變化；其次，脂肪與蛋白乳化會造成水解后的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利制備的重要條件。采用上述脫脂劑對海參進行脫脂，脫脂率高?；厥栈亓饕?，旋蒸去除脫脂劑，得到海參中脂溶性物質(zhì)，如不飽和脂肪酸；

3）分步酶解：在脫脂海參粉末中按質(zhì)量體積比為1g：14mL：0.04g加入蒸餾水和助溶劑，助溶劑成份及其最優(yōu)選重量份：0.05份辛烯基琥珀酸淀粉鈉、0.003份沒食子酸、0.001份酪蛋白酸鈉、0.004份毛地黃皂苷和0.002份吐溫-80。助溶劑既能將膠原蛋白的疏水段包裹起來，減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，又能增強蛋白質(zhì)-水之間的離子相互作用，增加膠原蛋白在水中的溶解度，提高膠原蛋白的提取率。再加入0.003%木瓜蛋白酶，酶解，酶解溫度為55℃，pH為6.9，酶解時間為3.0h，酶解結(jié)束后沸水浴7min滅酶。調(diào)節(jié)pH，加入0.006%胰凝乳蛋白酶，酶解，酶解溫度為58℃，pH為7.4，酶解時間為1.3h，酶解結(jié)束后沸水浴7min滅酶。調(diào)節(jié)pH，加入0.005%風味蛋白酶，酶解，酶解溫度為50℃，pH為6.2，酶解時間為2.1h，酶解結(jié)束后沸水浴8min滅酶，過濾。先用內(nèi)切酶木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解，使海參蛋白的氨基酸酶切位點暴露率增加，再用外切酶風味蛋白酶進行酶解，將海參蛋白充分酶解，增加海參膠原蛋白的量，提高產(chǎn)率；

4）醇沉：在濾液中加入98%的乙醇，濾液：乙醇體積比為1:3.9，攪拌，靜置，離心。高濃度乙醇能使蛋白質(zhì)沉淀的同時不會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不會影響其活性。醇沉能使海參膠原蛋白進行初步的純化，回收離心所得上清液，旋蒸去除乙醇和水，可得到海參中既能溶于水，又能溶于高濃度乙醇的物質(zhì)；

5）超濾、干燥：在步驟4得到的沉淀中加入蒸餾水，沉淀：蒸餾水質(zhì)量體積比為1g：7mL。超濾，先用8kDa超濾膜超濾，取濾過液，再用400Da超濾膜超濾，取滯留液，旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到海參膠原蛋白粉末?；厥盏谝淮纬瑸V的滯留液可得到分子量大于8kDa的物質(zhì)，如海參粘多糖；回收第二次超濾濾過液，可得到分子量小于400Da的物質(zhì)，如牛磺酸、微量元素釩、硒、鍺。最后得到的海參膠原蛋白的純度高，分子量小，能夠直達皮膚真皮層，鎖住水分，增加皮膚的彈性，淡化皺紋；活性強，抗氧化能力強，清除體內(nèi)自由基，起到抗衰老的作用。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進行贅述。

以上所述的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行了詳細說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。