專利名稱：酶法合成順，順-己二烯二酸新工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于利用鄰苯二酚-1，2-雙加氧酶轉化鄰苯二酚制取順，順-己二烯二酸的工藝方法。
1955年Hayaishi及其同工作者證明，人體中含有一種酶，此酶斷裂鄰苯二酚的苯環(huán)，生成順，順-己二烯二酸是由于底物直接結合了分子氧的兩個氧原子的結果。進行催化的酶是一種雙加氧酶，稱做鄰苯二酚1，2-雙加氧酶，其催化反應是
近年來，發(fā)現(xiàn)微生物細胞內(nèi)也含有這種酶，可用來進行有機物的合成和轉化以及用于消除芳環(huán)化合物對環(huán)境的污染。順，順-己二烯二酸是新一代精細化工原料，可用于生產(chǎn)特殊性能的工程塑料、樹脂、尼龍等，以及合成抗菌素、抗組胺劑、乳化劑等。隨之，對于微生物來源的鄰笨二酚1，2-雙加氧酶進行了許多研究，包括酶的菌種篩選分離，酶的提純、性質(zhì)、結構與功能等。然而文獻報道的該酶都是胞內(nèi)酶，而且酶氧化產(chǎn)物己二烯二酸均為三種異物體(順，順-式、反，反-式和順反-式)的混合物。例如美國專利U.S.4，588，688(1986年)，利用A型惡臭假單胞菌的胞內(nèi)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶將有機底物轉化成己二烯二酸(未說明為何種異構體或者是三種的混合物)。本發(fā)明人曾經(jīng)在國際上首次報道過產(chǎn)胞外鄰苯二酚1，2-雙加氧酶菌種篩選和發(fā)酵條件的研究。關于用酶法合成順，順-己二烯二酸，國內(nèi)外未見報道。本發(fā)明的目的就是利用該假單胞菌新菌種所產(chǎn)胞外鄰苯二酚1，2-雙加氧酶，催化制取順，順-己二烯二酸。結果說明，該酶催化轉化專一性強，工藝簡單，產(chǎn)品收率和純度均較高。生產(chǎn)原料只用化學品，不用糧食和農(nóng)副產(chǎn)品，因此成本較低。
本發(fā)明提供了一種酶法合成順，順-己二烯二酸的新工藝。首先制得產(chǎn)胞外鄰苯二酚1，2-雙加氧酶菌株，在發(fā)酵過程中該酶被自動分泌到細胞外的發(fā)酵液中。這樣可以方便地獲得此酶。用此酶催化鄰苯二酚一步得到順，順-己二烯二酸。產(chǎn)品的濃度和純度均較高。經(jīng)過簡單提取工藝即可得到順，順-己二烯二酸的結晶。順，順-己二烯二酸的整個合成生產(chǎn)過程分為三步工序整個生產(chǎn)工藝獨特新穎，未見報道。
1.酶的制備本發(fā)明制得的產(chǎn)胞外鄰苯二酚1，2-雙加氧酶新菌株新穎，生產(chǎn)技術獨特。從大量菌株中經(jīng)過變異和反復篩選，制得產(chǎn)胞外鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的菌株，該菌為假單胞菌(Pseudomonas sp.)，一般在5℃以下保存，可在冰箱中保存。它是無芽孢桿菌，菌落表面光滑，園形，濕潤，米黃色，不透明。使用時菌種經(jīng)活化以后，接種在種子瓶中，得到種子液。再將種子液接種到發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)3至5天，即得到鄰苯二酚1，2-雙加氧酶液，該酶位于細胞外的酶液中。例如使用時首先將菌種在洋菜斜面上活化，在溫箱中培養(yǎng)。然后將斜面上的菌種接在種子瓶中，在搖床上培養(yǎng)24小時，得到種子液。向搖瓶中加入一定體積的培養(yǎng)基，再加入種子液，在搖床上培養(yǎng)3至5天，即得到鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶液。發(fā)酵液培養(yǎng)基百分比組成為苯甲酸鈉0.15，琥珀酸鈉0.27，KH2PO40.2，Na2HPO40.2，(NH4)2SO40.1，微量Mg2+、Ca2+、Fe2+和Mn2+。
2.固定化酶的制備將鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶液調(diào)至PH6-8，加入已活化的固定化載體(有機或無機)，按4-6%(W/V)加入，在室溫下攪拌1-2小時，酶便掛在載體上，形成固定化酶，這一步的酶活化收率為85-90%。一般已有技術多使用未固定化的發(fā)酵液酶劑，我們將此酶制備成固定化酶，可多次反復使用增加了酶的使用次數(shù)和壽命，且酶與產(chǎn)物容易分離。
3.順，順-己二烯二酸產(chǎn)品的酶法合成。產(chǎn)品合成采用分批反應或連續(xù)反應方式，其合成過程如圖1所示，將上述固定化酶裝在反應柱中，通過循環(huán)泵將柱與底物溶液槽相連。底物溶液中含有鄰苯二酚和緩沖液，PH為中性。在室溫常壓下用泵驅動底物溶液通過固定化酶柱，反復循環(huán)，使底物中鄰苯二酚在固定化酶催化下轉化為產(chǎn)品順，順-己二烯二酸。多循環(huán)幾次，使反應進行完全為止。反應物溶液經(jīng)濃縮，蒸發(fā)脫水并于20-40℃干燥后，可得粉末狀順，順-己二烯二酸產(chǎn)品。也可將其溶于乙醇，形成順，順-己二烯二酸結晶。上述固定化酶反應是分批式進行的，一批原料反應完了再進行下一批反應，可多次反復反應。該固定化酶可使用3-5天，約5至10次。
應物鑒定用酶法合成的順，順-己二烯二酸，經(jīng)結晶形狀鑒定(圖2)，紙色譜分析、薄板層析、熔點測定、摩爾消光系數(shù)測定、紫外吸收光譜分析(圖3)、質(zhì)譜分析(圖4)、紅外吸收光譜分析(圖5)、核磁共振波譜分析(圖6)、化學元素組成分析、化學結構測定等多種物理和化學分析，證明產(chǎn)物為順，順-己二烯二酸，其各項分析指數(shù)與標準樣品一致。它的化學結構為
經(jīng)以上三步工序，可以得到相當純的順，順-己二烯二酸產(chǎn)品。其產(chǎn)率一般為1.5-2.5g/l(發(fā)酵液)。這是實驗室結果，如果工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)率還會增加。


圖1為產(chǎn)物合成示意圖。其中(1)為底物溶液槽，(2)為循環(huán)泵，(3)為固定化酶反應柱，(4)為底物溶液，(5)為底物溶液，(6)為固定化酶。從圖可看出。含鄰苯二酚等的底物溶液(4)經(jīng)過循環(huán)泵(2)循環(huán)通過固定化酶反應柱(3)，進行反應。圖2是順，順-己二烯二酸結晶的顯微照相。顯微放大倍數(shù)40×3.3，光學放大2x。因系正交偏光照相，樣品呈現(xiàn)白色針狀，證明該樣品確為結晶，說明本發(fā)明所制備的樣品達到結晶純。圖3為順，順-己二烯二酸產(chǎn)品的紫外吸收光譜圖，從圖可看出該產(chǎn)物在258nm的特征吸收峰。此峰反映了該產(chǎn)物中存在共軛雙鍵，與順，順-己二烯二酸標準樣品的吸收光譜一致。圖4是該產(chǎn)品的質(zhì)譜，其分子峰為142，與順，順-己二烯二酸理論分子量一致。主峰質(zhì)量數(shù)為97，是失去一個羧基的碎片HOOCCHCHCHCH-，A+1，A+2同位素豐度與理論值符合。根據(jù)分子峰值142，再結合元素分析結果C占50.98%，H占4.23%，即可得出該化合物的分子式為C6H6O4。圖5為該產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖。圖中的1681cm-1譜峰為產(chǎn)物結構中C＝O基的特征吸收峰。產(chǎn)物結構中的C＝C伸縮振動峰在589cm-1，而C＝C面彎曲振動峰在919和819cm-1，這些正是順式結構的特征吸收峰，再結合質(zhì)譜結果，可定出該產(chǎn)物為順，順-已二烯二酸，其結構為

圖6為該樣品的NMR譜。7.88ppm和5.97ppm處有兩組二重峰，7.84ppm代表

，5.97ppm代表

，兩組積分值也相同。NMR分析進一步證明該樣品結構確為順，順-已二烯二酸。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比所具有的優(yōu)點或者積極效果如下1.本發(fā)明采用分泌到細胞外的胞外酶，其純度高、專一性強，因此與已有技術的發(fā)酵法相比，所得產(chǎn)品純度高，后提取工藝簡單，成本低。
2.現(xiàn)有技術未說明所得的已二烯二酸產(chǎn)品是否為順，順式的，本發(fā)明技術所得到的是順，順-已二烯二酸，不混有反，反式和順，反式的，這是其他技術所未做到的。鑒于順，順式實際用途大，所以本發(fā)明應用前景廣闊。
3.本發(fā)明采用固定化酶技術，酶可以反復多次使用，產(chǎn)品純度也高，已有發(fā)酵法，不具備上述優(yōu)點。
4.本發(fā)明采用酶法合成順，順-已二烯二酸，產(chǎn)品純度高，副產(chǎn)物少，合成工藝和提取工藝均簡單，因此成本也低。
5.本發(fā)明在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中不用糧食和農(nóng)副產(chǎn)品，只用純化學品，因此成本低，生產(chǎn)不受糧食產(chǎn)量影響。
本發(fā)明提供的實施例為利用本發(fā)明技術生產(chǎn)順，順-已二烯二酸的工藝過程分為以下三步1.酶的制備產(chǎn)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的菌株為假單胞菌(Pseadmonas sp.)一般在5℃以下保存。使用時首先在牛肉汁洋菜斜面上活化，在30℃溫箱中，培養(yǎng)24小時，然后將斜面菌種接在種子瓶中，在30℃搖床上培養(yǎng)24小時，得到種子液。在搖瓶中加30%體積的培養(yǎng)基，再加種子液，在30℃搖床上培養(yǎng)72小時，即得到鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶液。發(fā)酵液培養(yǎng)基的百分比組成為苯甲酸鈉0.15、琥珀酸鈉0.27、KH2PO40.2、Na2HPO40.2、(NH4)SO40.1、微量Mg2+、Ca2+、Fe2+和Mn2+。
2.固定化酶的制備將以上鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶液調(diào)至微酸性，將已活化的固定化載體按4-6%(W/V)加入，在室溫下攪拌1-2小時，酶即掛到載體上制成了固定化酶。這一步的酶活收率為85-90%。
3.順，順-已二烯二酸的酶法合成將上述固定化酶裝在柱子中，通過循環(huán)泵將柱與底物溶液槽相連，如圖1所示。底物溶液中包含鄰苯二酚和緩沖液，PH為中性。通過循環(huán)泵使底物溶液通過固定化酶柱，在酶的催化下，鄰苯二酚轉化為順，順-已二烯二酸，多循環(huán)幾次，該反應就進行完全了。將此產(chǎn)物溶液經(jīng)濃縮和干燥后，可得粉末狀順，順-已二烯二酸樣品。也可將其溶于乙醇，形成順，順-己二烯二酸結晶。上述固定化酶反應是批式的，一批原料反應完了，還可進行下一批反應，可多次反復反應。該固定化酶可使用3-5天。
權利要求
1.一種酶法合成順，順-己二烯二酸新工藝，其特征在于利用胞外酶鄰苯二酚1，2-雙加氧酶合成順，順-己二烯二酸的三步工藝方法(1)酶的制備，(2)固定化酶的制備，(3)順，順-己二烯二酸產(chǎn)品的酶催化合成；其中所說的(1)酶的制備，是首先從大量菌株中經(jīng)過變異和反復篩選，制得產(chǎn)胞外鄰苯二酚1，2-雙加氧酶菌株，即假單胞菌的無芽孢桿菌型菌株，其菌落形狀外表特征為圓形，米黃色，將本發(fā)明得到的該菌種在溫度5℃以下保存待使用，使用時菌種經(jīng)過活化后，接種在種子瓶中，得到種子液，再將種子液接種到發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)得到鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶液，即該酶位于細胞外的酶液中，所說的(2)固定化酶的制備，是將鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶液調(diào)至微酸性，加入已活化的固定化載體，按4-6%(W/V)加入，在室溫下攪拌，酶便掛在載體上形成固定化酶，所說的(3)順，順-己二烯二酸的酶催化合成，是將固定化酶裝在反應柱中，用循環(huán)泵將含鄰苯二酚的底物溶液多次循環(huán)通過酶反應柱，使鄰苯二酚在固定化酶催化下轉化成順，順式己二烯二酸；反應產(chǎn)物溶液經(jīng)濃縮、干燥即可得到粉末狀順，順-己二烯二酸產(chǎn)品或將其溶于乙醇，形成順，順-己二烯二酸結晶；
2.如權利要求1所述的酶法合成順，順-己二烯二酸的新工藝，其特征在于所說酶的制備在使用保存的菌種時，將菌種在洋菜斜面上活化，溫箱中培養(yǎng)，再將斜面上的菌種接在種子瓶中，得到種子液，然后向搖瓶中加入30%體積發(fā)酵培養(yǎng)基，再加入種子液，在30℃的搖床上培養(yǎng)72小時，得到鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶液，所說的發(fā)酵液培養(yǎng)基各組成的百分配比為苯甲酸鈉0.15，琥珀酸鈉0.27，KH2PO40.2，Na2HPO40.1，(NH4)2SO40.1，Mg2+，Ca2+，F(xiàn)e2+和Mn2+用量各為微量;
3.如權利要求1所述的酶法合成順，順-己二烯二酸的新工藝方法，其特征在于所說的固定化酶的制備，將鄰苯二酚1，2-雙加氧酶酶液調(diào)至PH6-8，加入活化的固定化載體(有機或無機)，在室溫下攪拌1-2小時，使酶掛在載體上得到固定化酶，酶的活化收率為85-90%;
4.如權利要求1所述的酶法合成順，順-己二烯二酸的新工藝，其特征在于所說的順，順-己二烯二酸的酶催化合成反應系統(tǒng)是通過循環(huán)泵將酶反應柱與底物溶液槽相連，底物溶液中含有鄰苯二酚和緩沖液，PH為中性，將固定化酶裝在反應柱中，在室溫常壓下，用泵驅動底物溶液通過固定化酶柱，反復循環(huán)，使底物溶液中鄰苯二酚在固定化酶催化下轉化成所需產(chǎn)品順，順-己二烯二酸。
全文摘要
一種酶法合成順，順-己二烯二酸新工藝，特征在于首先制得產(chǎn)胞外鄰苯二酚1，2-雙加氧酶菌株，在發(fā)酵過程中該酶被自動分泌到細胞外的發(fā)酵液中，這樣可以方便地獲得此酶，用此酶催化鄰苯二酚一步得到順，順-己二烯二酸。經(jīng)簡單提取工藝即可得到順，順-己二烯二酸粉末或結晶，生產(chǎn)工藝簡單，成本低且產(chǎn)品純度高。
文檔編號C12N9/02GK1086851SQ93108610
公開日1994年5月18日 申請日期1993年7月9日 優(yōu)先權日1993年7月9日
發(fā)明者李欽, 李麗, 湯捷, 張樹政, 寇秀芬 申請人:中國科學院微生物研究所