專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)γ-環(huán)糊精的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)EC2.4.1.19，以及涉及這些酶的制備方法及它們的用途。
通常，從淀粉或類(lèi)似淀粉的物質(zhì)制備環(huán)糊精。由環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶將淀粉酶促地轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精(CD)。不考慮該反應(yīng)中使用的CGT酶，由于熱力學(xué)原因，如果將反應(yīng)進(jìn)行達(dá)到熱力學(xué)平衡(最高CD產(chǎn)生量)，淀粉主要轉(zhuǎn)化為β-CD。但是，在起始階段，在淀粉轉(zhuǎn)化反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶不同，所得到的一級(jí)產(chǎn)物混合物中的組分也不同。就α-，β-或γ-CGT酶在起始階段形成的主要產(chǎn)物α-，β-或γ-CD而言，三種酶之間也有明顯的區(qū)別。
至今，只在細(xì)菌中檢測(cè)到適用于工業(yè)上生產(chǎn)CD的那些酶，并且已經(jīng)使用至今，僅在軟化芽孢桿菌(Bacillus macerans)(J.Bacteriol.(1986)，166，pp.1118-1122)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearochermophilus)(GB2169902)和催產(chǎn)克雷伯氏桿菌(Klebsiella oxytoca)(Gene(1986)47，pp.269-277)中鑒定到α-CGT酶。例如在環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1990)34，pp.229-230)，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)(US-A 3，812，011)，Bacillus ohbensis(JP74124285)，微球菌各個(gè)種(Micrococcus sp.)(EP0017242)以及在尚未按分類(lèi)學(xué)規(guī)則進(jìn)行確切分類(lèi)的嗜堿芽孢桿菌(alkalophilic bacilli)，如芽孢桿菌屬38-2菌株(Bacillus sp.38-2)(J.Gen.Microbiol.(1988)134，pp.97-105)，17-1菌株(關(guān)于環(huán)糊精的第4屆國(guó)際專(zhuān)題討論會(huì)的記錄匯編(1988)，pp.87-92)，1011菌株(Appl.Microbiol Biotechnol.(1987)26，pp.149-153)以及1-1菌桿(關(guān)于環(huán)糊精的第4屆國(guó)際專(zhuān)題討論會(huì)的記錄匯編(1988)，pp.71-76)中鑒別出了β-CGT酶。已有人描述在枯草芽孢桿菌313(Bacillus subtilis313)(Agric.Biol.Chem(1986)50，pp.2161-2162)，芽孢桿菌屬A1-6(Bacillus sp.A1-6)(J.Ferment Bioeng.(1990)70(3)，pp.150-154)以及芽孢桿菌屬290-3(Bacillus sp.290-3)(關(guān)于環(huán)糊精的第4屆國(guó)際專(zhuān)題討論會(huì)記錄匯編(1988)，pp.87-92)中存在有在起始階段能形成γ-CD的高活性酶。
X-射線結(jié)構(gòu)分析闡明了環(huán)狀芽孢桿菌的β-CGT酶的三維空間結(jié)構(gòu)(J.Mol.Biol.(1990)217，pp.737-750)。從該結(jié)構(gòu)可以推斷出能夠直接參與構(gòu)建底物結(jié)合位點(diǎn)以及構(gòu)建該CGT酶活性中心的氨基酸殘基，但是不能推導(dǎo)出決定該CGT酶底物特異性的氨基酸殘基(Biochemistry(1992)31，pp.8740-8746)。
由于在工業(yè)上制備環(huán)糊精使用CGT酶將淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精時(shí)總是產(chǎn)生由幾種環(huán)糊精組成的混合物，因而已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種用于分離純化環(huán)糊精(α，β或γ)的方法-采用，例如基于環(huán)糊精分子量不同，用色譜的方法可從產(chǎn)物混合物中分離出限定的CD(例如在US-A4808232中描述)。
-在用酶促方法將淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精時(shí)，加入復(fù)合物形成劑。該形成劑僅與一種限定的CD反應(yīng)，從而例如，形成一種能通過(guò)物理方法從反應(yīng)混合物中分離出來(lái)的一種不溶性復(fù)合物。隨后，溶解該復(fù)合物，并且分離出勻質(zhì)CD(例如由EP0291067描述)。
-通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入一種有機(jī)溶劑，例如乙醇，使用γ-CGT酶時(shí)產(chǎn)品組分向γ-CD轉(zhuǎn)變(J.Ferm.Bioeng.(1990)70(3)，pp.150-154)。
在每種方法中，在最適條件下使用CGT酶，這樣對(duì)于將要制備其純化形式的CD而言，這些酶具有形成盡可能高產(chǎn)量的起始產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)。
至今已知的α-和β-CGT酶的特異性適合于工業(yè)上制備相應(yīng)的環(huán)糊精。相反，沒(méi)有一種已知的γ-CGT酶具有允許產(chǎn)生相當(dāng)量的γ-CD的產(chǎn)物特異性。
因此，為了制備γ-CD，在JP-03 053892中建議通過(guò)加入γ-CD特異性復(fù)合物形成劑糖基甘草素，麥芽糖和一種CGT酶而將α-和/或β-環(huán)糊精酶促地轉(zhuǎn)化為γ-CD。
本發(fā)明目的是提供環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)，該酶在將淀粉或類(lèi)似淀粉的底物轉(zhuǎn)化為CD時(shí)能在更大程度上產(chǎn)生γ-CD。
本發(fā)明的另一目的是提供制備所述CGT酶的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供在所述CGT酶作用下制備γ-CD的方法。
利用下面所述CGT酶可達(dá)到本發(fā)明的目的。在該酶的蛋白質(zhì)序列第180位氨基酸和第240位氨基酸的區(qū)域內(nèi)含有氨基酸序列Asn Leu Xxx Asp，其中該蛋白質(zhì)序列的第1位是CGT酶信號(hào)肽的起始點(diǎn)，并且Xxx表示除Tyr外的天然氨基酸。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的CGT酶在其蛋白質(zhì)序列的第180位氨基酸和第240位氨基酸之間的區(qū)域內(nèi)含有氨基酸序列Asn Leu Trp Asp或Asn Leu Ser Asp，其中該蛋白質(zhì)序列的第1位是CGT酶的信號(hào)肽的起始點(diǎn)。
特別優(yōu)選的是，本發(fā)明的CGT酶在其蛋白質(zhì)序列的第180位氨基酸和第240位氨基酸之間區(qū)域內(nèi)含有Asn Leu Trp Asp序列基元，其中該蛋白質(zhì)序列的第一位是CGT酶的信號(hào)肽的起始點(diǎn)。
在轉(zhuǎn)化淀粉或類(lèi)似淀粉的物質(zhì)時(shí)，本發(fā)明的CGT酶按下列所述產(chǎn)物分布產(chǎn)生CD，即γ-CD和α-CD與β-CD總和的商值大于用相應(yīng)的未改變的起始酶轉(zhuǎn)化淀粉獲得的其產(chǎn)品的商值。
在本文中，起始酶是指用于制備本發(fā)明所述的CGT酶的CGT酶。因此，令人意想不到的是，本發(fā)明的CGT酶比用于制備該酶的起始酶具有更高的γ-CD特異性。
本發(fā)明的CGT酶的例子是由下表1所列的CGT酶通過(guò)用另一天然氨基酸取代每一例子中下面劃線的Tyr而獲得的CGT酶。用Trp或Ser替代Tyr的CGT酶是優(yōu)選的。用Trp替代Tyr的CGT酶是特別優(yōu)選的。
表1CGT酶類(lèi)型 來(lái)源的菌種 位置 氨基的序列β 環(huán)狀芽孢桿菌 225 (1)β 芽孢桿菌1-1 213 (2)β B.ohbensis 213 (3)β 枯草芽孢桿菌 218 (4)γ 芽孢桿菌290-3 207 (5)(1)Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(2)Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(3)Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(4)Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp(5)Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala ser對(duì)列舉的這些CGT酶，表1示出了在β-和γ-CGT酶中普遍存在的氨基酶序列區(qū)域以及該序列區(qū)域內(nèi)的Tyr，該序列區(qū)域與改變產(chǎn)品的特異性有關(guān)。在表1中，將在各種例子中重復(fù)產(chǎn)生的氨基酸序列的第一個(gè)氨基酸的編號(hào)規(guī)定為相關(guān)的CGT酶的信號(hào)肽的第一個(gè)氨基酸的位置，編為第1位點(diǎn)。采用常規(guī)公知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以發(fā)現(xiàn)，在所有β-和γ-CGT酶中存在該一致序列區(qū)。利用同樣已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在本發(fā)明列舉的那些方法，通過(guò)用本發(fā)明所述的方法在這些CGT酶中誘變Tyr可以從β-或γ-CGT酶制備本發(fā)明的酶。
采用下列方法可達(dá)到本發(fā)明的另一目的，即采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的誘變方法使編碼β-或γ-CGT酶的基因的DNA序列突變，從而用另一天然氨基酸替代該突變CGT酶中的Tyr，該Tyr定位于使用的β-或γ-CGT酶的第180位氨基酸到第240位氨基酸之間的區(qū)域內(nèi)的序列單位Asn Leu Tyr Asp中。
所有的β-和γ-CGT酶都適合于制備本發(fā)明的CGT酶。采用已知方法分離編碼CGT酶的基因，并且采用“體內(nèi)”或“體外”誘變方法將本發(fā)明所述突變引入到CGT酶基因中。
“體內(nèi)誘變方法”特定地指那些用誘變劑，例如紫外線，亞硝基胍或甲基磺酸乙酯將微生物進(jìn)行非特異性誘變的方法，其中的微生物在染色體上和/或附加體上攜帶有編碼CGT酶的基因。例如由Miller J.H.在Experiments in Molecular Genetics(172);Cold Spiring Harbor Laboratory;Cold Spring Marbor，N.Y.中描述了這樣一種方法。
隨后，用已知方法，例如采用Sanger等人在PNAS74(1977)5463-5467中描述的鏈終止方法分析序列的方法識(shí)別突變體，該突變體中至少是編碼與環(huán)狀芽孢桿菌的CGT酶的Tyr 229同源的酪氨酸的CGT酶基因的密碼子由編碼另一天然氨基酸殘基，優(yōu)選的是一個(gè)絲氨酸或一個(gè)色氨酸殘基，特別優(yōu)選的是一個(gè)色氨酸殘基的一個(gè)密碼子替代。
在本發(fā)明的含意內(nèi)，與環(huán)狀芽孢桿菌的CGT酶的Tyr 229同源的密碼子是指其他CGT酶基因的為T(mén)yr編碼的密碼子，該密碼子為表1中提供的氨基酸序列基元中底下劃線的Tyr編碼。
在本發(fā)明含意內(nèi)，“體外”誘變方法是指下述方法，即以本領(lǐng)域內(nèi)已知的一種方式和途徑修飾一個(gè)離體的CGT酶基因，或一個(gè)CGT酶基因的片段，從而制備一個(gè)編碼一種CGT酶的基因，在該酶中至少是與環(huán)狀芽孢桿菌CGT酶的Tyr 229同源的氨基酸殘基由另一個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選的是色氨基殘基或絲氨酸殘基，特別優(yōu)選的是色氨酸殘基所取代。
目前已知的“體外”誘變方法的舉例是利用“PCR”技術(shù)的特異(Biotechniques(1992)13(3)pp.342-346)或非特異(Technique(1989)1(1)，pp.11-15)誘變方法。下述方法也是已知的在合成的寡聚核苷酸幫助下按特定的方式將突變導(dǎo)入靶基因中。利用所謂的“單鏈方法”(Ausubel F.Met al.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates)或使用“雙鏈方法”(Promega 1992-1993 Catalog，150)或使用其他方法，例如在Ann.Eev Genet.(1985)19，pp.423-462中描述的方法，可以完成上述過(guò)程。
用于從淀粉中分離γ-CD是本發(fā)明所述的具有提高了的形成γ-CD活性的CGT酶的主要應(yīng)用領(lǐng)域。采用現(xiàn)有的制備方法可將本發(fā)明的CGT酶用于該目的。下面例舉描述的是制備γ-CD的現(xiàn)行制備方法，其中，該方法中使用的CGT酶可用本發(fā)明的CGT酶替代。
-Journal of Fermentation and Bioengineering(1990)70(3)，pp.190-192在能增加γ-CD產(chǎn)量的乙醇存在下，用來(lái)自芽孢桿菌AL-6并能生成β-和γ-CD的CGT酶制備γ-CD。
-JP87 25，976用芽孢桿菌313的γ-CGT酶制備γ-CD。
-EP 291，067用軟化芽孢桿菌的CGT酶制備γ-CD。通過(guò)加入復(fù)合物形成劑，例如環(huán)十六烷-8-烯-1-酮，達(dá)到γ-CD產(chǎn)物特異性。
-DE 4009822用芽孢桿菌290-3的γ-CGT酶制備γ-CD。
通過(guò)與α-CD和β-CD兩者相比較，γ-CD有特定優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)該優(yōu)點(diǎn)鑒別出該γ-CD是唯一一種可能的CD，或者是一種最適合于系列應(yīng)用的CD。
與由六個(gè)葡萄糖單元構(gòu)成的α-CD相比，由八個(gè)葡萄糖單元構(gòu)成的γ-CD具有更高程度的疏水空化作用，該作用使其還可以結(jié)合由于空間原因而不能被α-CD結(jié)合的那些外源分子。
與β-CD(室溫下在水中溶解性約18.5克/升)相比，γ-CD具有顯著的更高的溶解性(室溫下約為232.0克/升)，因此比β-CD更適合于涉及從水溶液形成復(fù)合物的反應(yīng)。γ-CD的低毒性是其與β-CD及改性的β-CD衍生物相比所具有的另一優(yōu)點(diǎn)。在動(dòng)物模型中，不論是口服或靜脈給藥，α-CD衍生物和β-CD衍生物比γ-CD更具毒性。
下列實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1 芽孢桿菌290-3(DSM 5850)的γ-CGT酶的誘變處理以本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的途徑和方式，用另一個(gè)編碼任意一種氨基酸殘基，而優(yōu)選的是色氨酸殘基的堿基三聯(lián)體，取代編碼211酪氨酸的CGT酶結(jié)構(gòu)基因的堿基三聯(lián)體而實(shí)現(xiàn)了用另一個(gè)任意的氨基酸，尤其是用色氨酸或絲氨酸殘基取代在芽孢桿菌290-3(保存于在Braunschweig的德國(guó)微生物收集中心，DSM 5850)的γ-CGT酶的第211位上的酪氨酸殘基。
為了進(jìn)行誘變，首先將芽孢桿菌290-3的γ-CGT酶基因克隆到可通過(guò)商品途徑購(gòu)買(mǎi)的大腸桿菌載體pUC19(Boehringer，Mannheim)。為了完成該步驟，從芽孢桿菌290-3中分離染色體DNA(關(guān)于環(huán)糊精的第4屆國(guó)際專(zhuān)題討論會(huì)會(huì)議記錄匯編)，并且用限制性核酸內(nèi)切酶Sau 3AI(Bochringer，Mannheim)部分切割，所用方法如Ausubel F.M.，Current protocols in molecwlar biology，vol.l;Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience，N.Y.描述。分離出2和5kb大小范圍內(nèi)的片段，然后將它們與用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI(Boechringer，Mannheim)線性化的pUC19-DNA和T4 DNA連接酶一起，在16℃保溫12小時(shí)。采用已知方法將該連接混合物用于轉(zhuǎn)化已變?yōu)橛心芰ξ誅NA的大腸桿菌k12細(xì)胞(Maniatis，Molecular Cloning，Alaboratory Manaal;Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，N.Y.)。從大腸桿菌細(xì)胞中分離出攜帶了為芽孢桿菌290-3的γ-CGT酶編碼的基因的重組質(zhì)粒，所述的大腸桿菌細(xì)胞在轉(zhuǎn)化后在含有淀粉的指示平板上形成淀粉降解圈(Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，N.Y.pp.86-92)。
使用由Amersham(Braunsohweig)作為商品銷(xiāo)售的“寡聚核苷酸特異性體外誘變系統(tǒng)，變體2.1”完成該基因的誘變，并且誘變是基于Eckstein(Nacl，Acids.Res.(1986)14，pp.9676-9698以及Nacl.Acids.Res.(1988)16，pp.791-802)研制的方法進(jìn)行的。精確地講誘變是按照所說(shuō)的Amersham誘變系統(tǒng)所附的方案完成的。該方法概括于下文。從所說(shuō)誘變系統(tǒng)的方案可以獲得詳細(xì)方法。
利用可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)的酶，例如限制性核酸內(nèi)切酶和T4DNA連接酶(Bochringer，Mannheim)，將為芽孢桿菌290-3的γ-CGT酶編碼的克隆于pUC19中的基因部分克隆到商業(yè)上可得到的M13載體(New English Biolabs)，其中的基因部分含有為CGT酶的第211位上的酪氨酸殘基編碼的堿基三聯(lián)體。這樣一種片段的例子是0.6kb大小的PstI/EcoRI片段。將該片段克隆到已用限制性核酸內(nèi)切酶PstI和EcoRI切割的M13載體中。
根據(jù)Amersham提供的試驗(yàn)方案以及上面提到的誘變系統(tǒng)，從吸收了重組M13載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞中分離出單鏈重組M13 DNA(模板DNA)。
合成適用于實(shí)際誘變的在每一種情況下都具有所需序列的用化學(xué)方法制備的誘變寡核苷酸。該寡核苷酸可通過(guò)商業(yè)途徑，例如從MWG(Ebersberg)獲得。選擇這樣的誘變寡核苷酸序列，即該誘變寡核苷酸的堿基順序與模板DNA的核苷酸序列部分反向互補(bǔ)，所述模板DNA在每種例子中其上游和下游有15個(gè)堿基，并且含有原在于模板DNA中的為芽孢桿菌290-3的γ-CGT酶的第211位的酪氨酸殘基編碼的堿基三聯(lián)體。但是誘變的寡核苷酸不含有為酪氨酸編碼的堿基三聯(lián)體，而是含有在完成誘變后導(dǎo)致產(chǎn)生γ-CGT酶衍生物的核苷酸，在該酶衍生物中由另一氨基酸殘基代替酪氨酸殘基定位于第211位。
本發(fā)明使用的兩個(gè)誘變寡核苷酸的序列描述于表2。
表25' -ATT TAT CGA AAT CTT TGG GAT TTA GCTAGT CTA -3'5' -ATT TAT CGA AAT CTT NNN GAT TTA GCTAGT CTA -3'使用表2中描繪的上面一個(gè)誘變寡核苷酸導(dǎo)致產(chǎn)生γ-CGT酶衍生物，該衍生物中第211位酪氨酸殘基已由色氨酸殘基取代。
如果使用表2中描繪的下面一個(gè)誘變寡核苷酸即所謂的簡(jiǎn)并或“混合”寡核苷酸，編碼211位酪氨酸的堿基三聯(lián)體由除編碼Tyr的三聯(lián)體以外的64種可能的堿基三聯(lián)體中任一種所替代。因此該寡核苷酸適合于生產(chǎn)這樣的γ-CGT酶衍生物，即該衍生物中的第211位氨基酸殘基酪氨酸由任何一種其他天然氨基酸替代。
用T4聚核苷酸激酶和ATP(Maersham)在誘變寡核苷酸的5'末端磷酸化。將磷酸化的誘變寡核苷酸結(jié)合到模板DNA的同源區(qū)域。為了該目的，將5微克單鏈模板DNA與約4皮摩爾(pmol)的磷酸化誘變寡核苷酸一起在70℃保溫3分鐘，然后在37℃保溫30分鐘。隨后，以結(jié)合至模板DNA上的誘變寡核苷酸作為合成起始點(diǎn)并且以模板DNA作為突變DNA鏈從頭開(kāi)始合成的模板，從而合成一條DNA鏈，該鏈除誘變位點(diǎn)外其余部分與模板DNA互補(bǔ)。在加入DNA多聚酶klenow片段(Amersham)，T4 DNA連接酶以及含有核苷酸dATP，dGTP，dTTP，以用于代替dCTP的硫代核苷酸dCTPαs(Amersham)后，在16℃合成反應(yīng)進(jìn)行15小時(shí)。
從該合成試樣中去除剩余單鏈模板DNA分子。為完成這一步，向樣品中加入NaCl，然后通過(guò)能特異性地固定單鏈DNA的硝化纖維素濾膜(Amersham)過(guò)濾。濃縮遺留在濾液中的雙鏈雜交DNA，并用乙醇沉淀脫鹽。隨后在含有NciI(Amersham)的合適保溫緩沖液(Amersham)中，將該雜交DNA在37℃保溫90分鐘。其N(xiāo)ciI是一種識(shí)別核苷酸序列CC(G/C)GG，但僅切割天然DNA鏈并不切割哪些含有dCTPαs核苷酸類(lèi)似物的鏈的限制性核酸內(nèi)切酶。這種處理僅導(dǎo)致非突變鏈(模板DNA)產(chǎn)生斷裂。
然后在37℃用核酸外切酶Ⅲ(Amersham)，一種從游離末端開(kāi)始降解DNA鏈的酶，處理30分鐘以除去模板DNA。在將核酸外切酶熱失活(70℃加熱15分鐘)后，將留下的單鏈并且突變的DNA鏈與DNA多聚酶Ⅰ(Amersham)，T4 DNA連接酶以及核苷酸dATP，dTTP，dCTP和dGTP一起在16℃保溫3小時(shí)。這一步驟導(dǎo)致突變的單鏈DNA鏈轉(zhuǎn)化為雙鏈。進(jìn)一步用乙醇沉淀而進(jìn)行純化后，將突變DNA轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌K12細(xì)胞中。
通過(guò)分析轉(zhuǎn)化后獲得的五個(gè)克隆中重組DNA相關(guān)區(qū)域的序列而檢驗(yàn)誘變步驟是否成功。如果使用的是簡(jiǎn)并性誘變寡核苷酸(表2，底部)，則通過(guò)測(cè)序測(cè)定得到的突變。使用合適的限制性酶，從那些已證實(shí)發(fā)生了突變的載體中切除起始時(shí)為了誘變而克隆到M13中的DNA片段。
對(duì)于本實(shí)施例中使用的0.6kb片段，用PstI和CcoRI進(jìn)行切除。
隨后，從表達(dá)芽孢桿菌290-3的γ-CGT酶的基于pUC19的表達(dá)質(zhì)粒中切除相應(yīng)的、未突變的Pst I/EcoRI片段，并用T4 DNA連接酶將突變的片段連接上去而替代該未突變片段。
實(shí)施例2 來(lái)自芽孢桿菌1-1菌株的β-CGT酶的誘變類(lèi)似于實(shí)施例1中描述的方法，用編碼色氨酸殘基的三聯(lián)體替代為相應(yīng)的CGT酶的第217位酪氨酸殘基編碼的芽孢桿菌1-1的β-CGT酶基因的密碼子。
表3顯示用于進(jìn)行這種誘變的寡核苷酸。
表35' -ATT TAC AGA AAC TTA TGG GAT CTG GCA GAC TAT -3'實(shí)施例3 來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌的β-CGT酶的誘變類(lèi)似于實(shí)施例1中描述方法，用編碼一個(gè)色氨酸殘基(表4，上)或編碼一個(gè)絲氨酸的殘基(表4，下)的三聯(lián)體替代為相應(yīng)CGT酶的第229位酪氨酸殘基編碼的來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌的β-CGT酶基因的密碼子。
表4顯示用于這些誘變過(guò)程的寡核苷酸。
表45' -ATC TAC AAA AAC CTG TGG GAC CTG GCC GAC TTC-3'5' -ATC TAC AAA AAC CTG TC T GAC CTG GCC GAC TTC -3'實(shí)施例4 在大腸桿菌中生產(chǎn)本發(fā)明所述的芽孢桿菌290-3 γ-CGT酶及其衍生物為了生產(chǎn)實(shí)施例1中制備的芽孢桿菌290-3γ-CGT酶及其衍生物，將實(shí)施例1中描述的基于pUC19的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的二級(jí)菌株中。大腸桿菌WCM105用作為大腸桿菌的二級(jí)菌株。按EP338401描述從大腸桿菌DS410制備該菌株。
因此，為了制備芽孢桿菌290-3γ-CGT酶或其衍生物，在一個(gè)振蕩水浴(旋轉(zhuǎn)速率為250rpm)中將含有合適CGT酶表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌WCM105細(xì)胞在含有10克/升乳糖和0.1克/升氨芐西林的LB培養(yǎng)基(Manitis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory(1982)，No.Y.)中30℃保溫72小時(shí)。然后通過(guò)5000×g離心而分離出細(xì)胞。無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中含有γ-CGT酶或其衍生物。
實(shí)施例5 在大腸桿菌中生產(chǎn)本發(fā)明所述的芽孢桿菌1-1β-CGT酶以及其衍生物以類(lèi)似于實(shí)施例4中的描述，使用實(shí)施例2中描述的表達(dá)質(zhì)粒完成制備過(guò)程。
實(shí)施例6 在大腸桿菌中生產(chǎn)本發(fā)明所述的環(huán)狀帶孢桿菌β-CGT酶及其衍生物以類(lèi)似于實(shí)施例4中的描述，使用實(shí)施例3中描述的表達(dá)質(zhì)粒完成制備過(guò)程。
實(shí)施例7 淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精按照Eur.J.Biochem.(1990)191，pp.177-185描述的方法測(cè)定CGT酶的活性。
在每種情況下，將待測(cè)試的10單位CGT酶/每克淀粉與5%可溶性淀粉溶液(Merck，Darmstadt)一起在含有20mM Tris/HCl，pH7.2，以及5mM CaCl2的緩沖液中45℃保溫一段規(guī)定時(shí)間。在規(guī)定時(shí)間后，通過(guò)加入1.5倍體積的甲醇而終止該反應(yīng)。通過(guò)在4℃保溫1小時(shí)而沉淀未發(fā)生反應(yīng)的殘留的淀粉，離心(10分鐘，12，000×g)分離。在Nukleosil 10-NH2柱(Macherey & Nagel，Diiren)進(jìn)行HPLC，以規(guī)定的環(huán)糊精或線性麥芽低聚糖(Singma，Munich)作為標(biāo)準(zhǔn)物，測(cè)定得到的產(chǎn)品。
實(shí)施例8 使用非突變的芽孢桿菌290-3的γ-CGT酶及實(shí)施例4制備的衍生物轉(zhuǎn)化淀粉按實(shí)施例7中描述進(jìn)行反應(yīng)。合計(jì)出現(xiàn)的線性麥芽低聚糖(G1-G7)的量。獲得下列所述結(jié)果表5反應(yīng)時(shí)間 淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精和G1-G7(%)(分鐘) 非突變CGT酶 突變CGT酶β-CD γ-CD G1-G7 β-CD γ-CD G1-G75 7.0 8.6 0.0 0.0 7.8 0.010 11.0 13.0 0.0 0.0 12.8 0.015 12.6 14.4 0.0 0.0 16.2 0.030 21.4 18.2 1.2 2.0 22.8 2.2實(shí)施例9 使用非突變的環(huán)狀芽孢桿菌β-CGT酶以及實(shí)施例6中制備的衍生物轉(zhuǎn)化淀粉，在該衍生物中第229位的酪氨酸由色氨酸替代按實(shí)施例7描述進(jìn)行反應(yīng)，得到下列結(jié)果。
表6
反應(yīng)時(shí)間 淀粉轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精(%)(分鐘) 非突變CGT酶 突變CGT酶α-CD β-CD γ-CD α-CD β-CD γ-CD1 0.0 6.4 1.2 0.0 1.0 4.42 0.0 10.6 2.0 0.0 2.0 8.03 1.6 13.5 2.6 0.0 2.8 14.64 2.6 16.4 5.2 0.0 4.8 17.25 3.2 18.2 7.0 0.0 5.8 16.46 2.6 20.0 6.6 0.0 6.2 16.07 3.4 22.2 7.6 1.0 7.4 16.48 3.8 23.0 6.4 1.2 8.4 19.89 4.4 24.6 7.0 1.8 9.6 22.010 4.6 26.2 6.0 1.8 8.2 20.8實(shí)施例10 利用非突變的環(huán)狀芽孢桿菌β-CGT酶以及實(shí)施例6制備的衍生物，在γ-CD復(fù)合物形成劑存在下轉(zhuǎn)化淀粉，所述衍生物中第229位的酪氨酸殘基由色氨酸殘基替代轉(zhuǎn)化是按實(shí)施例7中描述進(jìn)行的，但作了如下所述修改-用土豆淀粉替代可溶性淀粉-每10克淀粉中加入1.25克CHD(環(huán)十六碳烯酮)獲得下列結(jié)果
表7反應(yīng)時(shí)間 淀粉轉(zhuǎn)化的環(huán)糊精(%)(分鐘) 非突變CGT酶 突變CGT酶α-CD β-CD γ-CD α-CD β-CD γ-CD1 2.3 18.0 5.4 1.4 10.5 13.72 3.2 20.0 7.2 2.2 13.8 22.23 4.4 21.8 9.5 3.4 15.8 23.74 n.d. n.d. n.d. 3.5 11.2 25.55 5.4 20.9 12.8 3.5 11.5 29.06 5.8 21.1 14.6 n.d. n.d. n.d.
7 6.4 20.6 17.0 4.7 11.0 32.0實(shí)施例11用非突變的環(huán)狀芽孢桿菌的β-CGT酶以及本發(fā)明實(shí)施例6所述的衍生物轉(zhuǎn)化淀粉，其中衍生物的第229位酪氨酸由絲氨酸替代按實(shí)施例7所述進(jìn)行反應(yīng)。在20分鐘保溫后獲得下列結(jié)果表8反應(yīng)時(shí)間 從淀粉轉(zhuǎn)化的環(huán)糊精(%)(分鐘) 非突變CGT酶 突變的CGT酶α-CD β-CD γ-CD α-CD β-CD γ-CD20 4.3 20.1 6.6 1 13 1權(quán)利要求
1.一種環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)，該酶在將淀粉或類(lèi)似淀粉物質(zhì)轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精(CD)時(shí)使γ-CD的含量提高，并且在該酶蛋白質(zhì)序列的第180位氨基酸至240位氨基酸之間的區(qū)域內(nèi)含有Asn Leu Xxx Asp氨基酸序列，其中該蛋白質(zhì)序列的第1位是CGT酶信號(hào)肽的起始點(diǎn)，Xxx是指除Tyr外的任何天然氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述CGT酶;其中Xxx代表Try或Ser。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述CGT酶，其中Xxx是指Trp。
4.制備CGT酶的方法，其中采用本領(lǐng)域已知的誘變方法將編碼β-或γ-CGT酶的基因的DNA序列進(jìn)行突變，從而在突變的CGT酶中由另一天然氨基酸代替位于所使用的β-或γ-CGT酶中位于180位-240位氨基酸之間區(qū)域內(nèi)的序列基元Asn Leu Tyr Asp中的Tyr。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其中在突變CGT酶中用Trp或Ser代替位于所使用的β-或γ-CGT酶中第180位-240位氨基酸之間區(qū)域內(nèi)序列基元Asn Leu Tyr Asp中的Tyr。
6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的CGT酶用于制備γ-環(huán)糊精。
全文摘要
本發(fā)明涉及環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶在將該粉或類(lèi)似淀粉的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為CD過(guò)程中使γ-CD含量提高，并且在第180位到第240位的氨基酸之間區(qū)域內(nèi)該蛋白質(zhì)序列含有氨基酸序列Asn Leu Xxx Asp，其中蛋白質(zhì)序列的第1位是CGT酶的信號(hào)肽的起始點(diǎn)，并且Xxx表示天然氨基酸。
文檔編號(hào)C12P19/18GK1103429SQ94107818
公開(kāi)日1995年6月7日 申請(qǐng)日期1994年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月24日
發(fā)明者格奧爾格·E·舒爾茨, 安東·坎杜西奧 申請(qǐng)人:電化學(xué)工業(yè)有限公司(國(guó)際)