專利名稱：由氧化葡糖桿菌t-100得到的新的l-山梨糖脫氫酶和新的l-山梨酮脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩者都由氧化葡糖桿菌(Gluconobacter Oxydans)T-100得到的一種新的L-山梨糖脫氫酶(在下文中稱為SDH)和一種新的L-山梨酮(sorbosone)脫氫酶(在下文中稱為SNDH)。更確切地，本發(fā)明涉及一種新的SDH、一種新的SNDH、一種將它們編碼的DNA、一種含所述DNA的表達(dá)載體、一種用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)染的)宿主細(xì)胞、以及通過培育宿主細(xì)胞制備SDH和SNDH。
本發(fā)明的SDH和SNDH為用于制備2-酮基-L-古洛糖酸的酶。
背景技術(shù)：
2-酮基-L-古洛糖酸(下文中稱為2KLGA)是一種在合成L-抗壞血酸中的關(guān)鍵中間體。為了工業(yè)生產(chǎn)，2KLGA是按照Reichstein′s法通過氧化反應(yīng)由L-山梨糖化學(xué)合成的。
另一方面，公知的是，許多微生物具有通過由SDH和SNDH兩步酶氧化將L-山梨糖轉(zhuǎn)化成2KLGA的能力。就是，SDH催化將L-山梨糖轉(zhuǎn)化成L-山梨酮的氧化作用，而SNDH催化將L-山梨酮轉(zhuǎn)化成2KLGA的氧化作用。然而，由于通過使用這些微生物達(dá)到的2KLGA生產(chǎn)率低，它們迄今尚末被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
因此需要提供有效而簡(jiǎn)單的制備2KLGA的方法。
本發(fā)明公開內(nèi)容在為完成上述目的的一種嘗試中，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了充分研究以發(fā)現(xiàn)一種具有較佳性能的SDH和SNDH，并成功地制得具有為制備2KLGA所需性能的一種新SDH和一種新的SNDH并開發(fā)了這些研究，導(dǎo)致完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及一種由氧化葡糖桿菌T-100(FERM BP-4188)得到的新的SDH，其特征在于(1)一種催化L-山梨糖轉(zhuǎn)化成L-山梨酮的能力，(2)分子量58000道爾頓(SDS-PAGE)，以及(3)N-末端氨基酸順序?yàn)門hr-Ser-Gly-Phe-Asp-Tyr-Ile-Val-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-此外，本發(fā)明涉及一種具有示于在下文中述及的順序目錄，順序No.1中的氨基酸順序的SDH。
本發(fā)明也涉及一種由氧化葡糖桿菌T-100得到的新的SNDH，其特征在于(1)催化L-山梨酮轉(zhuǎn)化成2KLGA的能力，(2)分子量為50000道爾頓(SDS-PAGE)，以及(3)N-末端氨基酸順序?yàn)锳sn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu(Xaa為未鑒別的氨基酸)。本發(fā)明另外還涉及一種具有示于順序目錄，順序No.2中氨基酸順序的SNDH。
本發(fā)明也涉及一種編碼上述SDH和/或SNDH的DNA，一種含有所述DNA的表達(dá)載體，由所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)染的)宿主細(xì)胞以及制備該SDH和/或SNDH的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)并從得到的培養(yǎng)物中回收SDH和/或SNDH。
在本發(fā)明中所用的氧化葡糖桿菌T-100是以常規(guī)方法通過N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)誘變由氧化葡糖桿菌G716(野生株)得到的2KLGA高產(chǎn)突變體。
氧化葡糖桿菌G716由柿中分離得到并具有如下的形態(tài)和生理性能。Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984)中所述的方法和Manual for Identification to MedicalBacteria(S.T.Cowan，2nd.Edition，1985)中所述的方法基本上被用于分類學(xué)研究。1.形態(tài)性能氧化葡糖桿菌G716是一種革蘭氏陰性，游動(dòng)的細(xì)菌。細(xì)胞形為桿狀，單獨(dú)或成對(duì)兩種形式存在，很少成鏈狀。氧化葡糖桿菌G716的形態(tài)特征革蘭氏染色劑 陰性菌落顏色 淡白色孢子 陰性細(xì)胞形狀 桿狀游動(dòng)性 陽性鞭毛 3-8極生鞭毛2.生理特征氧化葡糖桿菌G716的生理特征歸納在下表中。
氧化葡糖桿菌G716的生理特征條件 特征生長(zhǎng)在空氣中+在4℃ -在22℃ +在30℃ +在40℃ -過氧化氫酶 +氧化酶 -明膠液化-硝酸還原作用-七葉苷(aesuclin)水解-酸形成L-阿糖 +D-纖維素二糖+衛(wèi)矛醇 +D-半乳糖+D-葡萄糖+丙三醇 +D-甘露糖醇 +D-甘露糖+D-木糖 +
D-乳糖 -麥芽糖 -D-棉子糖-鼠李糖 -D-山梨醇-蔗糖-D-海藻糖-DNA mol％G＋C 60.0泛醌Q10該有機(jī)體是需氧的，在厭氧條件下不能生長(zhǎng)。最佳溫度為22-30℃，在40℃和4℃下不能生長(zhǎng)。生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基是SY培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由2.5％山梨酵和0.5％酵母浸膏(pH6.4)組成。由葡萄糖和丙三醇發(fā)生強(qiáng)烈的生酮作用。
本發(fā)明所用的氧化葡糖桿菌T-100具有與氧化葡糖桿菌G716相同的那些形態(tài)和生理特征。
本發(fā)明新的SDH和新的SNDH可通過重組體DNA技術(shù)、多肽合成等制得。
在應(yīng)用重組體DNA技術(shù)的場(chǎng)合下，新的SDH和/或新的SNDH可通過在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)用含有編碼新SDH和/或新SNDH氨基酸順序的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)染的)宿主細(xì)胞并從所得培養(yǎng)物中回收SDH和/或SNDH而制得。
以下詳盡地說明這一方法的特征。
宿主細(xì)胞包括，例如微生物，如細(xì)菌(例如，大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、氧化葡糖桿菌和枯草桿菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、動(dòng)物細(xì)胞系和培養(yǎng)的植物細(xì)胞。微生物的較佳實(shí)例包括細(xì)菌，特別是屬于大腸桿菌屬(例如，E.coli JM109 ATCC53323，E.coli NM538ATCC35638，E.coli HB101 ATCC33694，E.coli HB101-16FERMBP-1872和E.coli 294 ATCC31446)和桿菌屬(例如Bacillussubtilis ISW1214)的菌株、酵母，特別是屬于酵母屬(例如，Saccharomyces cerevisiae AH22)的菌株，以及動(dòng)物細(xì)胞系[例如，小鼠L929細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞]。
當(dāng)使用細(xì)菌，特別是E.coli或Bacillus subtilis作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體通常的組成至少為啟動(dòng)子、起始密碼子、編碼新SDH和/或新SNDH氨基酸順序的DNA、終止密碼子、終止區(qū)、以及可復(fù)制單元。
當(dāng)使用酵母或動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體較佳組成至少為啟動(dòng)子、起始密碼子、編碼信號(hào)肽和新SDH和/或新SNDH氨基酸順序的DNA、以及終止密碼子，并且可以還插入強(qiáng)化因子順序、新SDH的5′-和3′-末編碼區(qū)、新SNDH的5′-和3′-末編碼區(qū)、粘接點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)以及可復(fù)制單元。
在細(xì)菌中表達(dá)新SDH和/或新SNDH的啟動(dòng)子包括例如，啟動(dòng)子和Shine-Dalgarno(SD)順序(例如AAGG)。較佳的啟動(dòng)子包括例如，常規(guī)所用的啟動(dòng)子(例如，E.coli的PL-啟動(dòng)子和trp-啟動(dòng)子)和SNDH染色體基因的啟動(dòng)子。
在酵母中表達(dá)新SDH和/或新SNDH的啟動(dòng)子包括例如，TRP1基因、ADHI或ADHII基因、以及S.cerevisiae的酸性磷酸酶(PHO5)基因的啟動(dòng)子。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)新SDH和/或新SNDH的啟動(dòng)子包括例如，SV40早期或晚期啟動(dòng)子、HTLV-LTR啟動(dòng)子、小鼠金屬硫因I(MMT)啟動(dòng)子和牛痘啟動(dòng)子。
較佳的起始密碼子包括例如，甲硫氨酸密碼子(ATG)。
信號(hào)肽包括例如，常規(guī)使用的其他酶的信號(hào)肽(例如，天然t-PA的信號(hào)肽和天然血纖維蛋白溶酶原的信號(hào)肽)。
編碼信號(hào)肽或新SDH和/或新SNDH的DNA可用常規(guī)方法制得，這些方法如像使用DNA合成器的部分或全部DNA合成和包括用常規(guī)方法，如在Molecular Cloning中(主要在11和14章中，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，USA)所述PCR操作或DNA探針操作由氧化葡糖桿菌基因組DNA制備的方法。
終止密碼子包括例如，常規(guī)所用的終止密碼子(例如，TAG和TGA)。
終止區(qū)包括例如，天然或合成終止區(qū)(例如，新SDH染色體基因終止區(qū)和合成fd噬菌體終止區(qū))。
可復(fù)制單元是能復(fù)制屬于宿主細(xì)胞中的整個(gè)DNA順序的DNA化合物，并可以包括天然質(zhì)粒、人工修飾的質(zhì)粒(例如，由天然質(zhì)粒制得的DNA片段)和合成質(zhì)粒。在本發(fā)明中，可復(fù)制單元可根據(jù)用作宿主細(xì)胞的微生物適當(dāng)?shù)剡x擇。質(zhì)粒的較佳實(shí)例包括E.coli的質(zhì)粒pBR322及其人工修飾的質(zhì)粒(由合適的限制性內(nèi)切酶處理pBR322得到的DNA片段)、酵母的酵母2μ質(zhì)粒和酵母染色體DNA、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)粒pRSVneoATCC37198、質(zhì)粒pSV2dhfr ATCC37145、質(zhì)粒pdBPV-MMTneoATCC37224和質(zhì)粒pSV2neo ATCC37149。
強(qiáng)化因子順序包括例如，SV40的強(qiáng)化因子順序(72b.p.)。
多腺苷酸化位點(diǎn)包括例如，SV40的多腺苷酸化位點(diǎn)。
粘接點(diǎn)包括例如，SV40的粘接點(diǎn)。
啟動(dòng)子、起始密碼子、編碼新SDH和/或新SNDH氨基酸順序的DNA、終止密碼子和終止區(qū)，如有必要可以常規(guī)方式使用合適的DNA片段(例如，用限制性內(nèi)切酶消化，使用T4 DNA連接酶連接)與一種合適的可復(fù)制單元(質(zhì)粒)連續(xù)和環(huán)形地連接，以得到本發(fā)明的表達(dá)載體。
當(dāng)使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，則可以用上述方法使強(qiáng)化因子順序、啟動(dòng)子、新SDH和/或新SNDH的cDNA的5′-末編碼區(qū)、起始密碼子、編碼信號(hào)肽的DNA、編碼新SDH和/或新SNDH氨基酸順序的DNA、終止密碼子、新SDH和/或新SNDH的cDNA的3′-末編碼區(qū)，粘接點(diǎn)和多腺苷酸化位點(diǎn)與一種合適的可復(fù)制單元連續(xù)和環(huán)形地連接，以得到一種表達(dá)載體。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可通過將上述得到的表達(dá)載體引種入宿主細(xì)胞而制得。將表達(dá)載體引種入宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化，在下文中也用來指轉(zhuǎn)染)可用常規(guī)方法進(jìn)行(例如，E.coli的Kushner法，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的磷酸鈣法和顯微注射)。
為通過本發(fā)明方法制備新SDH和/或新SNDH，將含有該表達(dá)載體的所得到的轉(zhuǎn)化體在水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
使用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基可含有碳源(例如，葡萄糖、甘油、甘露糖醇、果糖和乳糖)和無機(jī)或有機(jī)氮源(例如，硫酸銨、氯化銨、酪蛋白水解產(chǎn)物、酵母浸膏、多胨、細(xì)菌胰蛋白胨(Bactotrypton)和牛肉膏)。如有需要，可將其他營(yíng)養(yǎng)源，如無機(jī)鹽類(例如，磷酸二氫鈉或鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂、硫酸鎂和氯化鈣)、維生素(例如，維生素B1)以及抗生素(例如，氨芐青霉素、卡那霉素)加入培養(yǎng)基中。為培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，經(jīng)常使用的是補(bǔ)充有胎牛犢血清和抗生素的Dulbecco′s Modified Eagle′s Minimum Essential Medium(DMEM)。
轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)通常在pH5.5-8.5(較佳為pH7-7.5)以及18-40℃(較佳為20-30℃)下進(jìn)行5-50小時(shí)。
當(dāng)在培養(yǎng)溶液中存在所產(chǎn)生的新SDH和/或新SNDH時(shí)，通過將培養(yǎng)物過濾或離心得到培養(yǎng)物濾液(上清液)。通過通常用于提純和分離天然或合成蛋白質(zhì)的方法(例如，透析、凝膠過濾、使用抗SDH單克隆抗體或抗SNDH單克隆抗體的親和柱色譜法、在合適吸附劑上的柱色譜法和高性能液相色譜法)可由培養(yǎng)物濾液中提純新SDH和/或新SNDH。
當(dāng)在培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中存在所產(chǎn)生的新SDH和/或新SNDH時(shí)，則通過過濾和離心收集細(xì)胞，并通過例如，用超聲波和/或溶菌酶處理使其細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜破壞，以得到碎片。這些碎片可溶于合適的水溶液(例如，8M含水尿素和6M含水胍(guanidium)鹽)中。可用上述舉例說明的常規(guī)方法由該溶液中提純新SDH和/或新SNDH。
如果必需重新折疊通過本發(fā)明方法在E.coli中產(chǎn)生的新SDH和/或新SNDH，則重新折疊可用常規(guī)方法進(jìn)行。
當(dāng)在轉(zhuǎn)化體中存在SDH活性和/或新SNDH活性時(shí)，則以下可作為由處理培養(yǎng)物得到的物料例子(下文中該物料被稱作處理后的物料)。(1)原細(xì)胞用常規(guī)方法，如過濾和離心由培養(yǎng)物中分離的；(2)干細(xì)胞用常規(guī)方法，如冷凍干燥和真空干燥通過將以上(1)的所述原細(xì)胞干燥得到的(3)無細(xì)胞提取液用常規(guī)方法(例如，使用有機(jī)溶劑自溶細(xì)胞、用氧化鋁、海砂等研磨細(xì)胞，以及用超聲波處理細(xì)胞)通過將上述(1)的所述原細(xì)胞或上述(2)的干燥細(xì)胞破壞而得到的；(4)酶溶液用常規(guī)方法(例如，柱色譜法)通過將上述(3)的所述無細(xì)胞提取液提純或部分提純而得到的；以及(5)固定化細(xì)胞或酶用常規(guī)方法(例如，使用丙烯酰胺、玻璃珠、離子交換樹脂等的方法)通過將上述(1)的所述原細(xì)胞或上述(2)的干燥細(xì)胞或上述(4)的酶固定而制得的。
當(dāng)在轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物濾液中存在SDH活性和/或新SNDH活性時(shí)，則培養(yǎng)物濾液(上清液)、提純的酶溶液和固定酶可作為培養(yǎng)物處理后物料的例子。
通?？砂凑誘.SUGISAWA et al.(Agric.Biol.Chem.，55，363-370，1991)使用L-山梨糖作為基質(zhì)，并使用2，6-二氯靛酚(在下文中稱作DCIP)作為一種電子受體，在磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)中，在粗混合物，如聲處理的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或在每次提純步驟中得到的其處理后的物料中進(jìn)行新SDH活性的試驗(yàn)。將酶活性作為DCIP的還原率測(cè)量，該還原率由在600nm處吸光度的降低而測(cè)定。一個(gè)酶單位被規(guī)定為每分鐘催化還原1μmol DCIP的酶量。反應(yīng)混合物的較佳pH、L-山梨糖和DCIP的濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度可隨培養(yǎng)基或其所用的處理后物料變化。通常反應(yīng)在pH7-10，較佳為pH8-9，于5-50℃，較佳為20-45℃進(jìn)行0.5-24小時(shí)。
也可使用具有熒光檢測(cè)(Ex.315nm；Em.405nm)的后柱高性能液相色譜法(HPLC)通過測(cè)定用鹽酸芐脒標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物，L-山梨酮的量測(cè)定新SDH酶的活性。
也可通過SUGISAWA等人(Agric.Biol.Chem.，55，363-370，1991)的一般方法測(cè)定在粗混合物，如超聲波處理的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和在分別提純步驟中得到的處理過的物質(zhì)中存在的新SNDH活性。在該場(chǎng)合下，通過在磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)中使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(在下文中稱作NAD)作為一種電子受體并用L-山梨酮作為基質(zhì)測(cè)量所產(chǎn)生的NADH量(該測(cè)量由在340nm處的吸光度所測(cè)定)來測(cè)定SNDH活性。一個(gè)酶單位被規(guī)定為每分鐘產(chǎn)生1μmol NADH的酶量。反應(yīng)混合物的較佳pH、所用L-山梨酮和NAD的濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度可隨所用的培養(yǎng)基和處理后的物料變化。通常反應(yīng)是在pH7-10，較佳為pH8-9，于5-50℃，較佳為20-45℃進(jìn)行0.5-24小時(shí)。
本發(fā)明的新SDH和新SNDH是用于制備2KLGA，從而制備L-抗壞血酸的具有較佳性能的酶。按照本發(fā)明，可通過遺傳工程大量生產(chǎn)具有這些較佳性能的新SDH和新SNDH。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1是pUC18SD180的限制性內(nèi)切酶圖。
圖2是含有編碼本發(fā)明新SDH的DNA和編碼本發(fā)明新SNDH的DNA的質(zhì)粒pUC19SD5的限制性內(nèi)切酶圖。
圖3示出了質(zhì)粒pUC19SD5的結(jié)構(gòu)。
以下將更詳細(xì)地說明本發(fā)明。在以下實(shí)施例中，質(zhì)粒、酶如限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、以及其他物料均得自商業(yè)來源并按供應(yīng)商的指示使用。用于克隆DNA、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體、由所得培養(yǎng)物中回收新SDH和/或新SNDH等的操作在現(xiàn)有技術(shù)中為公知的或可采用文獻(xiàn)方法。
不用說，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1由氧化葡糖桿菌T-100提純SDH(1)微生物通過亞硝基胍誘變選擇氧化葡糖桿菌T-100作為由氧化葡糖桿菌G716(野生株)得到的2KLGA-高產(chǎn)突變體。(2)培養(yǎng)氧化葡糖桿菌T-100將氧化葡糖桿菌T-100單菌落轉(zhuǎn)移入在500ml錐形燒瓶中的6份獨(dú)立由2.5％葡萄糖、1.0％多胨、0.5％酵母浸膏(Difco Labs.，USA)和2.0％CaCO3組成的培養(yǎng)基(各為100ml)中。在旋轉(zhuǎn)振蕩器(250rpm)上于30℃進(jìn)行培養(yǎng)18小時(shí)。在30升罐中將培養(yǎng)后的培養(yǎng)基(總共600ml)接種到20升含有5％D-山梨醇、0.5％甘油、0.5％酵母浸膏和1.0％CaCO3的發(fā)酵培養(yǎng)基中。在以20升/分鐘的通氣和以300rpm攪動(dòng)下于30℃進(jìn)行培養(yǎng)42小時(shí)。在4℃下以6000rpm將培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基(20L)離心分離10分鐘。用冷鹽水洗滌細(xì)胞一次并在相同條件下再次離心分離。將細(xì)胞貯存在-20℃下直至使用。(3)制備膜部分將(2)中所得的細(xì)胞(17.7g，濕重)懸浮在50ml 10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，通過聲波處理破裂，并在4℃下以8000rpm離心分離10分鐘，得到上清液。另一方面，將得到的沉淀懸浮在40ml 10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，聲波處理使破裂并在上述相同條件下離心分離。將上清液匯集并在4℃下以32000rpm進(jìn)行超離心分離1小時(shí)。用磷酸鹽緩沖液(50ml)將得到的沉淀洗滌一次并在上述相同條件下使其經(jīng)受超離心分離，得到粗膜蛋白質(zhì)(膜部分)。(4)由膜部分溶解SDH將(3)中所得的膜部分懸浮在50ml 10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。向該懸浮液加入0.75ml 20％Triton X-100(Nacalai Tesque，Japan)和1.8g L-山梨糖，并將該混合物在冰上攪拌3.5小時(shí)。在4℃下以32000rpm將得到的懸浮液進(jìn)行超離心分離1小時(shí)，得到上清液(約48ml)，被稱作溶解的SDH部分。(5)離子交換色譜法將(4)中所得的溶解部分(16ml)在用含有0.3％TritonX-100和200mM L-山梨糖的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡的TSKgel DEAE-5PW柱(7.5mm內(nèi)徑×75mm，Toso Co.Ltd.，Japan)上經(jīng)受離子交換色譜分離。在一種平衡緩沖劑中以氯化鈉線性梯度0-0.5M洗脫該柱。按照T.SUGISAWA等人的方法(Agric.Biol.Chem.，Vol.55，363-370，1991)，使用L-山梨糖作為基質(zhì)并使用0.1mM2，6-二氯靛酚(DCIP)作為電子受體，在0.28M磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)中測(cè)定活性。一個(gè)酶單位被規(guī)定為每分鐘催化1μmole DCIP還原反應(yīng)的酶量。通過用分光光度計(jì)(Model UV-160，Shimadzu，Japan)在600nm處吸光度的減少測(cè)定DCIP的還原率。將活性部分匯集，用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋3倍，并施加到用10mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)平衡的DEAE-TOYOPEARL650M柱(7.0mm內(nèi)徑×17mm，Toso Co.Ltd.，Japan)上。用0.2M在平衡緩沖液中的氯化鈉洗脫該柱。將得到的洗脫液用于進(jìn)一步提純步驟。(6)凝膠-過濾色譜法將一部分(300μl)濃縮的活性部分在用含有0.3％Triton X-100，200mM L-山梨糖和0.2M氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)平衡的Superose 12 HR10/30柱(10mm內(nèi)徑×30cm，Pharmacia，Sweden)上經(jīng)受凝膠-過濾色譜分離。使用相同的緩沖劑進(jìn)行洗脫。通過在有十二烷基硫酸鈉存在時(shí)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE 12.5％凝膠)并通過實(shí)施例1(5)所述的酶測(cè)定法分析各個(gè)餾分(0.4ml)。由SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，SDH活性相應(yīng)于58kd蛋白質(zhì)，可以認(rèn)為該58kd蛋白質(zhì)就是所希望的SDH分子。實(shí)施例2SDH的氨基酸順序分析將濃縮的活性部分(15μl)經(jīng)受SDS-PAGE(125％凝膠)并在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析。切開含有被ponceauS所染色的58kd蛋白質(zhì)的膜并用蒸餾水洗滌。直接用自動(dòng)蛋白質(zhì)定序機(jī)Model 470A(Applied Biosystems Inc..USA)將膜片定序以進(jìn)行N-末端氨基酸順序分析。
為測(cè)定內(nèi)氨基酸順序，在該膜表面進(jìn)行用無色桿菌屬蛋白酶I(Wako Chemical，Japan)的碎裂。用50mM含有8％乙腈的Tris-HCl(pH9.0)洗脫所得到的片段，并通過使用Cosmosil 5C4-300(4.6mm內(nèi)徑×50mm，Nacalai Tesque，Japan)在0.05％三氟乙酸中以8-83％的乙腈線性梯度洗脫(75分鐘)的反相色譜分離。分離出兩種肽(肽1和肽2)，并用自動(dòng)蛋白質(zhì)定序機(jī)Model470A定序以進(jìn)行氨基酸順序鑒別。得到的數(shù)據(jù)示于表1。
表1

實(shí)施例3制備DNA探針(1)合成DNA低聚物通過使用DNA合成器型號(hào)392(Applied Biosystems Inc.，USA)的二氧磷基酰氨脒(amidite)法合成以下表2中列出的各個(gè)低核苷酸。合成的低核苷酸由含28％氨水的CPG聚合物載體(CPG受控的多孔玻璃)釋放出，隨后在60℃下加熱9小時(shí)以除去所有保護(hù)基團(tuán)。在真空中蒸發(fā)反應(yīng)混合物，并將殘?jiān)苡?00μl TE[10mMTris-HCl(pH7.4)-1mM EDTA]中。用醚將得到的溶液洗滌一次并用乙醇沉淀。將得到的低核苷酸不經(jīng)進(jìn)一步提純用作聚合酶鏈反應(yīng)的引物。
表2

2)制備染色體DNA將氧化葡糖桿菌T-100的單菌落在由2％葡萄糖、1％多胨和0.5％酵母浸膏組成的培養(yǎng)基(100ml)中于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。通過離心(4600rpm，10分鐘)收集細(xì)胞并懸浮在TE緩沖劑(2.5ml)中。用20ml STE緩沖劑[20％蔗糖-50mM Tris-HCl(pH8)-1mM EDTA]稀釋一部分(2.0ml)懸浮液，與5ml溶菌酶溶液(5mg/ml)混合，并在37℃下培育30分鐘。加入肌氨酸(Sarcosil)溶液[1％月桂酰肌氨酸酯(Sarcosilate)-100mMEDTA(pH9.0)](50ml)和蛋白酶K(40mg)，并將該混合物在50℃下培育1.5小時(shí)。將氯化銫(93.8g)和6ml溴化乙錠(5mg/ml)溶于75ml所述混合物中，將該氯化銫溶液在20℃下以50000rpm超離心分離14小時(shí)。分離含有染色體DNA的部分，用生理鹽水飽和的異丙醇洗滌二次，并對(duì)TE緩沖液(2L)透析4小時(shí)。用酚(20ml)萃取透析液，并對(duì)TE緩沖液(2L)透析二次，得到所需的染色體DNA溶液(14ml，91.5μg/ml)。(3)聚合酶鏈反應(yīng)利用Hybaid熱反應(yīng)器Model HB-TR1(Hybaid Limited，UK)用180ng氧化葡糖桿菌T-100染色體DNA和2.5pmol表2的各個(gè)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。將該反應(yīng)混合物[在PCR緩沖劑(PerkinElmer-Cetus，USA)中各為200μM dNTPs和2.5單位Taq DNA聚合酶]經(jīng)受50次PCR循環(huán)，每次由在95℃下變性0.5分鐘，在42℃下退火1分鐘以及在72℃下聚合2分鐘組成。由PCR得到單個(gè)片段。通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離大概編碼一部分SDH基因的DNA片段(180bp)并充填DNA聚合酶Klenow片段(Takara Shuzo，Japan)，得到鈍圓-端接的DNA。在有T4 DNA連接酶(Takara Shuzo，Japan)存在下將得到的DNA和事先用SmaI(Nippon Gene，Japan)消化的pUC18綁扎。按照SHIGESADA等人的方法(Saibo-kogaku2，616-626，1983)將該綁扎的混合物用于轉(zhuǎn)化E.coli JM109(Nippon Gene，Japan)。由一種該轉(zhuǎn)化體得到所希望的質(zhì)粒pUC18SD180(見圖1)并由限制性圖所表征。(4)制備32P-標(biāo)記的探針通過用BamHI和EcoRI(Nippon Gene，Japan)消化pUC18SD180分離插入物DNA(約200bp)。通過0.5％瓊脂糖凝膠電泳提純?cè)摷s200bpDNA。按照所附的程序用切口轉(zhuǎn)譯器Kit(Takara Shuzo，Japan)將提純的DNA32P-標(biāo)記。用32P標(biāo)記的DNA的比活性約為3.7×107cpm/μg。實(shí)施例4由氧化葡糖桿菌T-100DNA庫(kù)分離SDH基因(1)制備染色體DNA庫(kù)用MboI(Nippon Gene，Japan)部分消化實(shí)施例3(2)中所得的染色體組DNA并在蔗糖梯度上分離片段，在克隆入λ噬菌體載體EMBL-3(Clonetech)的BamHI位點(diǎn)之前產(chǎn)生尺寸范圍為8-22kbp的片段。將該λ噬菌體載體引種入E.coli NM538(Clonetech)以構(gòu)成葡糖桿菌T-100染色體DNA庫(kù)。(2)噬菌斑雜交按照Molecular Cloning vol.1，Chapter 2，page 108，1989，USA中所述的程序，進(jìn)行制備具有E.coli NM 538(Clonetech)為平板細(xì)菌的λ噬菌體噬菌斑和制動(dòng)硝化纖維素濾器上的噬菌斑。在雜交緩沖劑(50％甲酰胺-1％牛血清清蛋白-0.1％聚乙烯吡咯烷酮-0.1％ ficoll-5×SSPE(見Molecular Cloning)-0.1％SDS-100μg/ml鮭精液DNA)中于42℃將含有λDNA的濾器培育4小時(shí)，在相同緩沖劑中，但含有32P-標(biāo)記的探針(約200bp，約1×107cpm/ml)于42℃培育18小時(shí)并在含有0.05％SDS的2×SSC(見Molecular Cloning)中于42℃陸續(xù)除去過量探針。將濾器在-80℃下暴露于X射線膠片HR-H(Fuji Film，Japan)達(dá)18小時(shí)。首次篩選λ噬菌體庫(kù)的結(jié)果，由72000噬菌斑得到約30陽性噬菌體。(3)Southern印跡用EcoRI和SalI(Nippon Gene，Japan)消化一種陽性噬菌體DNA并使其經(jīng)受0.8％瓊脂糖凝膠電泳。通過電印跡將在凝膠上分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾器上。被鑒定出約6kbp DNA片段使32P-標(biāo)記的探針雜交。將其克隆入pUC19(Nippon Gene，Japan)的EcoRI位點(diǎn)和SalI位點(diǎn)之間，得到pUC19SD5(圖2)。實(shí)施例5SDH基因的DNA順序分析(1)供DNA定序的質(zhì)粒構(gòu)成質(zhì)粒pSD5RRV的構(gòu)成用EcoRV(Toyobo，Japan)消化pUC19SD5。由通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離的三條帶中分離出使32P-標(biāo)記的探針雜交的1.1kbpDNA并將其克隆入pUC18的SmaI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pSD5RRV。(2)質(zhì)粒pSD5RVS的構(gòu)成用EcoRV和Ec047III(Toyobo，Japan)消化pUC19SD5。分離大的DNA(約5700bp)并與T4 DNA連接酶(Takara Shuzo，Japan)自身連接，得到質(zhì)粒pSD5RVS。(3)DNA順序分析按照所附程序通過用370A DNA定序器的二脫氧終止法(AppliedBiosystems，USA)進(jìn)行模板DNA(pSD5RRV和pSD5RVS)的DNA順序分析。將M13定序引物，一般和反向引物(New England Biolabs，USA)用于首次定序。根據(jù)首次順序分析所測(cè)得的DNA順序，合成如下的引物并用于進(jìn)一步DNA順序分析。所用的合成引物如下引物1(12mer)5′＞CTG TGT TCT CGC＜3′引物2(15mer)5′＞TCG GTT TCG CGA AGA＜3′引物3(16mer)5′＞CGT CTT CAA CGG AAC G＜3′引物4(16mer)5′＞GGA GTG ACG TCC GTT C＜3′引物5(16mer)5′＞GAG ATG TTC TCC CAG C＜3′由分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由1596堿基對(duì)組成的開放閱讀框(ORF)。被由ORF起始密碼子(ATG)開始的核苷酸順序編碼的氨基酸順序與實(shí)施例2中所得的SDH的氨基酸順序相符，而被ORF編碼的蛋白，58kd的理論分子量與被SDS-PAGE編碼的SDH，58kd的表觀分子量完全相符。從而，測(cè)得ORF就是SDH基因。
SDH基因的核苷酸順序示于后面將述及的順序目錄，順序No.3中，而由該核苷酸順序推導(dǎo)出的氨基酸順序示于順序No.1。實(shí)施例6在E.coli中表達(dá)SDH基因(1)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)染的)E.coli在500ml燒瓶中將用pUC19SD5轉(zhuǎn)化的E.coli JM109單菌落(E.coliJN109-pUC19SD5)接種入100ml含有1％Bactotrypton(Difco Labs.，USA)，0.5％酵母浸膏、0.5％氯化鈉和0.1％葡萄糖(pH7.2)的培養(yǎng)基中并在30℃下培養(yǎng)18小時(shí)。在500ml錐瓶中將一部分培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基(各為3ml)轉(zhuǎn)移入兩份含有1％ Bactotrypton、0.5％酵母浸膏、0.5％氯化鈉、1％甘油、0.3％KH2PO4、0.8％Na2PO4·12H2O(pH6.8)、1％L-山梨糖和100μg/ml氨芐青霉素中的培養(yǎng)基中。將得到的混合物在25℃下培養(yǎng)3天。通過在4℃下以6000rpm離心10分鐘采集回收培養(yǎng)過的液體培養(yǎng)基(總量200ml)，用鹽水將細(xì)胞洗滌兩次，懸浮在5ml鹽水中，并在冰冷下通過在2分鐘總聲波處理時(shí)間中以30秒間隔進(jìn)行聲波處理而使細(xì)胞破裂。將所得的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物在-20℃貯存直至用于酶測(cè)定。(2)測(cè)定SDH活性通過使用高性能液相色譜法(HPLC)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物，L-山梨酮的量試驗(yàn)SDH表達(dá)活性。將由1％L-山梨糖，1mM甲基硫酸(methosulfate)吩嗪、0.1M磷酸鹽緩沖劑(pH8.0)和聲波處理的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物組成的反應(yīng)混合物于30℃在振蕩下培育5小時(shí)。通過用6N硫酸將pH調(diào)節(jié)到2使反應(yīng)停止。將該反應(yīng)混合物在4℃下以6000rpm離心10分鐘并通過具有#3011N柱(4.6mm內(nèi)徑×300mm，Hitachi，Japan)的HPLC直接分析一部分上清液。流動(dòng)相是以每分鐘0.8ml流速的，含有用于后柱(post column)標(biāo)記法的0.02M鹽酸芐脒和0.25M硫酸鉀的1M硼酸鹽緩沖液(pH9.5)。該后柱標(biāo)記反應(yīng)是于80℃在Tefron管(0.5mm內(nèi)徑×10m)中進(jìn)行的。通過監(jiān)控?zé)晒?Ex.315nm，Em.405nm)進(jìn)行標(biāo)記化合物的檢測(cè)。如下表3中所示，聲波處理的含有質(zhì)粒pUC19SD5的細(xì)胞具有一種將L-山梨糖轉(zhuǎn)化成L-山梨酮的能力。然而，在100℃下處理的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或在沒有質(zhì)粒的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)任何活性。這些結(jié)果表明，重組體質(zhì)粒pUC19SD5含有在Ecoli JM109中表達(dá)的編碼L-山梨糖脫氫酶的基因。
表3

實(shí)施例7由氧化葡糖桿菌T-100提純SNDH(1)制備粗酶溶液在冰冷卻下將實(shí)施例1(2)中所得的細(xì)胞(約10g，濕重)懸浮在40ml 10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，通過聲波處理破裂，并在4℃下以8000rpm離心分離10分鐘。將上清液在4℃下以32000rpm超離心分離1小時(shí)。將得到的上清液作為SNDH粗酶溶液用于進(jìn)一步測(cè)定。(2)離子交換色譜法使SNDH粗酶溶液(45ml)通過事先用10mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)平衡的QAE-TOYOPEARL 550C柱(1.6cm內(nèi)徑×30cm，Toso Co.Ltd.，Japan)。用相同緩沖劑洗滌該柱并在相同緩沖劑中以0-0.4M的氯化鈉線性梯度洗脫。用SUGISAWA等人的方法(Agric.Biol.Chem.，55，665-670，1991)，通過測(cè)量由在340nm處的吸光度所測(cè)定的，在50mM磷酸鹽緩沖液中有13.7μML-山梨酮和0.73μM NAD存在時(shí)反應(yīng)所產(chǎn)生的NADH量，進(jìn)行酶活性測(cè)定。將活性部分(約15ml)匯集并用磷酸鹽緩沖劑稀釋5倍以用于隨后的提純步驟。(3)Blue Sepharose色譜法使(2)中所得的酶溶液(約75ml)通過事先用磷酸鹽緩沖劑平衡的Blue Sepharose柱(1.0cm內(nèi)徑×7cm，Pharmacia Sweden)。用相同緩沖劑洗滌該柱并在相同緩沖劑中以0-0.6M的氯化鈉線性梯度洗脫。通過在有十二烷基硫酸鈉存在時(shí)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并通過實(shí)施例7(2)的酶測(cè)定分析各個(gè)餾分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有由SDS-PAGE得到的50kd分子量的蛋白質(zhì)與酶活性一致，認(rèn)為所述的50kd蛋白質(zhì)就是所希望的SNDH分子。實(shí)施例8SNDH氨基酸順序分析使實(shí)施例7(3)中所得的活性餾分(75μl)經(jīng)受SDS-PAGE并將分離的蛋白質(zhì)在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上進(jìn)行印跡分析。切開被Coomassie Brilliant Blue染色的含50kd蛋白質(zhì)的膜并用蒸餾水洗滌。用自動(dòng)蛋白質(zhì)定位器Model 470A(Applied BiosystemsInc.，USA)將膜片定序以進(jìn)行N-末端氨基酸順序分析。結(jié)果示于下面，其中Xaa為一種未鑒別的氨基酸。N-末端氨基酸順序Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu-實(shí)施例9SNDH基因的DNA順序分析(1)供DNA順序分析的質(zhì)粒構(gòu)成用SalI(Nippon Gene，Japan)和EcoRV(Toyobo，Japan)消化實(shí)施例4(3)中所得的質(zhì)粒pUC19SD5(圖2)并使其經(jīng)受0.8％瓊脂糖凝膠電泳。由凝膠中分離出分離的DNA片段中的約600bp和4300bp的片段。將前者插入pUC18的SmaI位點(diǎn)，構(gòu)成pSD6RRV。將后者充填DNA聚合物Klenow片段(Takara Shuzo，Japan)，得到鈍圓封端的SalI分裂位點(diǎn)，隨后自身綁扎，構(gòu)成環(huán)狀質(zhì)粒pSD5RIRV。用EcoRI和MluI消化該質(zhì)粒pSD5RIRV，并分離約3400bp片段。用上述相同方法鈍化和圓化，得到pSD5MRV。(2)DNA順序分析通過用370A DNA定位器的二脫氧終止法(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行模板DNA(用于SDH核苷酸順序分析的pSD5MRV、pSD6RRV和pSD5RRV)的DNA順序分析。將M13定序引物，普通和反向引物(NewEngland Biolab，USA)用于首次定序。根據(jù)由首次定序測(cè)得的DNA順序，合成如下引物并用于進(jìn)一步DNA順序分析。所用的合成引物如下引物1(15mer)；5′＞TGATGGAGAATGGCG＜3′引物2(15mer)；5′＞GTAATCAGACCGACG＜3′引物3(15mer)；5′＞TTCATTCTCGCATCC＜3′引物4(15mer)；5′＞GATCTCACCTTTCGC＜3′引物5(15mer)；5′＞CACGGATGTGAAGCC＜3′引物6(15mer)；5′＞GATCCTGTGTGAGCG＜3′引物7(15mer)；5′＞GCGATGTCATCACGG＜3′上述分析的結(jié)果，在SDH基因5′一側(cè)上游發(fā)現(xiàn)一個(gè)由1497bp組成的開放閱讀框(ORF)。被由ORF的起始密碼子(ATG)開始的核苷酸順序編碼的氨基酸順序與在實(shí)施例8中所得的SNDH的N-末端氨基酸順序一致，而被ORF編碼的，52kd蛋白質(zhì)的理論分子量與由SDS-PAGE得到的SNDH，50kd的分子量完全一致。從而，ORF被認(rèn)為就是SNDH基因。SNDH的核苷酸順序示于后面將述及的順序目錄，順序No.4中，由核苷酸順序推導(dǎo)出的氨基酸順序示于順序No.2。實(shí)施例10在E.coli中表達(dá)SNDH基因(1)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的的E.coli以實(shí)施例6中的相同方式得到E.coliJM109-pUC19SD5的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物并在-20℃下貯存直至用于酶測(cè)定。(2)SNDH活性測(cè)定通過使用HPLC測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物，2KLGA的量進(jìn)行SNDH表達(dá)活性試驗(yàn)。將由1％L-山梨酮、0.5mM NAD、0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8.0)和聲波處理的細(xì)脆溶胞產(chǎn)物組成的反應(yīng)混合物于30℃在振蕩下培育5小時(shí)。通過用6N硫酸將pH調(diào)節(jié)到2使該反應(yīng)停止。在4℃以6000rpm將該反應(yīng)混合物離心10分鐘并通過HPLC(柱Capeellpak NHz；4.6mm內(nèi)徑×250mm，Shiseido，Japan)分析一部分上清液。流動(dòng)相為以每分鐘1.2ml流速的20mM含有30％乙腈的磷酸鈉緩沖劑(pH3.0)。通過測(cè)量在210nm處的紫外吸收進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果，含有用質(zhì)粒pUC19SD5轉(zhuǎn)化的E.coli JM109-pUC19SD5的聲波處理細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的混合物產(chǎn)生顯示出將L-山梨酮轉(zhuǎn)化成2KLGA能力的5690μg/ml 2KLGA。盡管轉(zhuǎn)化體宿主，E.coli JM109本身具有將同樣化合物轉(zhuǎn)化成2KLGA的能力，但其能力為轉(zhuǎn)化體所具有能力的約1/2(2170μg/ml)，因此認(rèn)為明顯的增強(qiáng)了轉(zhuǎn)化體將同樣化合物轉(zhuǎn)化成2KLGA的能力，這就是SNDH活性。由此使得明顯的是，重組體質(zhì)粒pUC19SD5具有編碼SNDH的基因，而由在實(shí)施例9中發(fā)現(xiàn)的SDH基因的5′一側(cè)上游處1497bp組成的ORF是一種SNDH基因。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的SDH和SNDH是在制備2-酮基-L-古洛糖酸，以及L-抗壞血酸中具有較佳性能的有用的酶。按照本發(fā)明的制備方法，可通過遺傳工程大量生產(chǎn)具有這些優(yōu)良性能的SDH和SNDH。微生物的保藏本發(fā)明所用的細(xì)胞株，氧化葡糖桿菌T-100，自1993年2月15日起已保藏在National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Japan(保藏號(hào)FERM BP-4188)。
順序目錄順序No1順序長(zhǎng)度530順序類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線形順序種類肽起源微生物氧化葡糖桿菌菌株 T-100順序特征測(cè)定特征的方法E順序Thr Ser Gly Phe Asp Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly1 5 10 15Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Clu Asn Pro Ser Val Arg Val20 25 30Cys Leu Ile Glu Ala Gly Arg Arg Asp Thr His Pro Leu Ile His35 40 45Met Pro Val Gly Phe Ala Lys Met Thr Thr Gly Pro His Thr Trp50 55 60Asp Leu Leu Thr Glu Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Gln Ile65 70 75Pro Tyr Val Gln Gly Arg Ile Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn80 85 90Ala Glu Val Phe Thr Arg Gly His Pro Ser Asp Phe Asp Arg Trp95 100 105Ala Ala Glu Gly Ala Asp Gly Trp Ser Phe Arg Asp Val Gln Lys110 115 120Tyr Phe Ile Arg Ser Glu Gly Asn Ala Val Phe Ser Gly Thr Trp125 130 135His Gly Thr Asn Gly Pro Leu Gly Val Ser Asn Leu Ala Glu Pro140 145 150Asn Pro Thr Ser Arg Ala Phe Val Gln Ser Cys Gln Glu Met Gly155 160 165Leu Pro Tyr Asn Pro Asp Phe Asn Gly Ala Ser Gln Glu Gly Ala170 175 180Gly Ile Tyr Gln Met Thr Ile Arg Asn Asn Arg Arg Cys Ser Thr185 190 195Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Gly Arg Lys Asn Leu Thr200 205 210Val Val Thr Arg Ala Leu Val Leu Lys Ile Val Phe Asn Gly Thr215 220 225Arg Ala Thr Gly Val Gln Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Leu Asn Thr230 235 240Ala Glu Ala Ser Gln Glu Ile Val Val Thr Ala Gly Ala Ile Gly245 250 255Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala His260 265 270Leu Arg Glu Asn Gly Ile Pro Val Val Gln Asp Leu Pro Gly Val275 280 285Gly Glu Asn Leu Gln Asp His Phe Gly Val Asp Ile Val Ala Glu290 295 300Leu Lys Thr Asp Glu Ser Phe Asp Lys Tyr Arg Lys Leu His Trp305 310 315Met Leu Trp Ala Gly Leu Glu Tyr Thr Met Phe Arg Ser Gly Pro320 325 330Val Ala Ser Asn Val Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Ser Asp335 340 345Pro Ser Ser Gly Val Pro Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Glu350 355 360Ala Gly Ala Glu Ala Gly Val Thr Ser Val Pro Lys Gly Ala Ser365 370 375Gly Ile Thr Leu Asn Ser Tyr Val Leu Arg Pro Lys Ser Arg Gly380 385 390Thr Val Arg Leu Arg Ser Ala Asp Pro Arg Val Asn Pro Met Val395 400 405Asp Pro Asn Phe Leu Gly Asp Pro Ala Asp Leu Glu Thr Ser Ala410 415 420Glu Gly Val Arg Leu Ser Tyr Glu Met Phe Ser Gln Pro Ser Leu425 430 435Glu Lys Eis Ile Arg Lys Thr Cys Phe Phe Ser Gly Lys Gln Pro440 445 450Thr Met Gln Met Tyr Arg Asp Tyr Ala Arg Glu His Gly Arg Thr455 460 465Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg Asp Asp Met470 475 480Ser Val Val Asp Pro Arg Leu Lys Val His Gly Leu Glu Gly Ile485 490 495Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Leu Gly Ser Asn500 505 510Thr Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Ser Glu Arg Ala Ala Asp Phe515 520 525Ile Gln Gly Asn Ala530順序No2順序長(zhǎng)度497順序類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線形順序種類肽起源微生物氧化葡糖桿菌菌株 T-100順序特征測(cè)定特征的方法E順序Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu1 5 10 15Phe Gly Phe Phe Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe20 25 30Phe Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile35 40 45Pro Arg Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala50 55 60Arg Arg Ala Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala65 70 75Asp Arg Ala Ala Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu80 85 90Arg Arg Asp Asp Ile Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys95 100 105Pro Ile Ser Gln Ala Lys Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cya110 115 120Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr125 130 135Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu Phe Gly Met Val Leu Arg Glu140 145 150Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr Pro Trp Asn Phe Pro Phe155 160 165Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile Leu Ala Ser Gly Cys170 175 180Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser Ala Thr Thr Leu185 190 195Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro Lys Gly Val200 205 210Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln Ala Met215 220 225Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser Thr230 235 240Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu245 250 255Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val260 265 270Phe Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe275 280 285Gly Ile Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg290 295 300Leu Ile Val Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val305 310 315Val Pro Lys Met Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro320 325 330Glu Thr Gln Ile Gly Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr335 340 345Ile Leu Asp Tyr Ile Ala Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu350 355 360Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile365 370 375Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala380 385 390Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu Ala Ser Phe His Phe Asp395 400 405Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn Asp Thr Val Tyr Gly410 415 420Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp Lys Ala Leu Ala425 430 435Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val Asn Thr Ile440 445 450Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys Gln Ser455 460 465Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr Thr470 475 480Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp485 490 495Ile Ser順序No3順序長(zhǎng)度1596順序類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線形順序種類基因組DNA起源微生物氧化葡糖桿菌菌株T-100順序特征表示特征的符號(hào)CDS位置4..1593測(cè)定特征的方法E順序ATGACGAGCG GTTTTGATTA CATCGTTGTC GGTGGCGGTT CGGCTGGCTG TGTTCTCGCA 60GCCCGCCTTT CCGAAAATCC TTCCGTCCGT GTCTGTCTCA TCGAGGCGGG CCGGCGGGAC120ACGCATCCCC TGATCCACAT GCCGGTCGGT TTCGCGAAGA TGACCACGGG GCCGCATACC180TGGGATCTTC TGACGGAGCC GCAGAAACAT GCGAACAACC GCCAGATCCC CTATGTGCAG240GGCCGGATTC TGGGCGGCGG ATCGTCCATC AACGCGGAAG TCTTCACGCG GGGACACCCT300TCCGACTTCG ACCGCTGGGC GGCGGAAGGT GCGGATGGCT GGAGCTTCCG GGATGTCCAG360AAGTACTTCA TCCGTTCCGA AGGCAATGCC GTGTTTTCGG GCACCTGGCA TGGCACGAAC420GGGCCGCTCG GGGTGTCCAA CCTCGCGGAG CCGAACCCGA CCAGCCGTGC CTTCGTGCAG480AGCTGTCAGG AAATGGGGCT GCCCTACAAC CCTGAGTTCA ACGGCGCATC GCAGGAAGGC540GCAGGCATCT ATCAGATGAC GATCCGCAAC AACCGGCGCT GCTCGACGGC TGTGGGGTAT600CTGCGTCCGG CTCTGGGGCG GAAGAACCTG ACGGTTGTGA CGCGGGCGCT GGTCCTGAAG660ATCGTCTTCA ACGGAACGCG GGCGACGGGC GTGCAGTATA TCGCCAACGG CACCCTGAAT720ACCGCCGAAG CGAGCCAGGA AATCGTTGTG ACGGCCGGAG CGATCGGAAC GCCGAAGCTG780ATGATGCTGT CGGGCGTCGG GCCTGCCGCG CATCTTCGCG AAAATGGTAT CCCGGTCGTG840CAGGATCTGC CGGGCGTGGG CGAGAACCTT CAGGATCATT TCGGTGTGGA TATCGTAGCC900GAGCTCAAGA CGGATGAGAG CTTCGACAAG TACCGGAAAC TGCACTGGAT GCTGTGGGCA960GGTCTTGAAT ATACCATGTT CAGATCCGGT CCCGTTGCAT CCAACGTGGT TGAGGGCGGC 1020GCGTTCTGGT ACTCGGACCC GTCATCGGGT GTTCCTGATC TCCAGTTCCA TTTTCTTGCG 1080GAGGCTGGGG CTGAGGCTGG AGTGACGTCC GTTCCCAAGG GAGCGTCCGG GATTACGCTG 1140AACAGCTATG TGCTGCGTCC GAAGTCTCGT GGAACTGTCC GGCTGCGTTC GGCAGATCCA 1200AGGGTCAATC CGATGGTCGA TCCCAATTTC CTTGGAGACC CGGCCGACCT TGAGACGTCT 1260GCGGAAGGTG TGCGCCTGAG CTACGAGATG TTCTCCCAGC CGTCTTTGGA GAAGCACATC 1320CGGAAAACCT GTTTCTTTAG CGGTAAACAG CCGACGATGC AGATGTATCG GGACTATGCG 1380CGGGAACATG GCCGGACGTC CTATCATCCG ACATGCACCT GCAAGATGGG TCGTGATGAC 1440ATGTCCGTCG TCGATCCGCG TCTGAAGGTT CATGGCCTTG AGGGCATCAG GATCTGTGAC 1500AGTTCGGTTA TGCCCTCGCT GCTCGGTTCC AACACCAATG CTGCGACGAT CATGATCAGT 1560GAGCGGGCAG CGGATTTCAT TCAGGGGAAC GCCTGA 1596順序No4順序長(zhǎng)度1497順序類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線形順序種類基因組DNA起源微生物氧化葡糖桿菌菌株T-100順序特征表示特征的符號(hào)CDS位置4..1494測(cè)定特征的方法E順序ATGAATGTTG TCTCAAAGAC TGTATCTTTA CCGTTAAAGC CGCGTGAGTT CGGATTGTTT60ATTGATGGAG AATGGCGCGC AGGTAAGGAT TTCTTCGATC GTTCCTCGCC GGCTCATGAT 120GTTCCCGTCA CCCGTATTCC ACGCTGCACC CGTGAAGACC TTGATGAGGC AGTCGCTGCT 180GCACGTCGTG CTTTCGAGAA CGGAAGCTGG GCGGGTCTGG CAGCCGCGGA TCGTGCGGCG 240GTTCTTCTGA AAGCCGCGGG CCTTCTGCGC GAGCGCCGTG ATGACATCGC TTACTGGGAA 300GTTCTCGAAA ACGGGAAGCC CATCAGCCAG GCGAAAGGTG AGATCGATCA CTGTATCGCC 360TGTTTCGAGA TGGCGGCCGG CGCTGCGCGG ATGCTGCATG GTGATACGTT CAACAATCTG 420GGCGAGGGGC TGTTTGGCAT GGTCCTGCGG GAGCCCATCG GTGTCGTCGG TCTGATTACG 480CCGTGGAACT TCCCGTTCAT GATCCTGTGT GAGCGGGCGC CTTTCATTCT CGCATCCGGC 540TGCACGCTGG TCGTCAAGCC TGCCGAAGTC ACGAGTGCCA CGACCCTTGT TCTGGCAGAA 600ATCCTTGCCG ATGCCGGGCT GCCGAAGGGT GTCTTCAATG TCGTGACAGG CACGGGGCGC660ACGGTCGGTC AGGCCATGAC CGAGCATCAG GATATCGACA TGCTGTCCTT CACGGGCTCC720ACGGGCGTCG GCAAGTCCTG TATCCACGCG GCGGCTGACA GCAACCTGAA GAAACTTGGC780CTCGAACTGG GCGGCAAGAA CCCGATTGTC GTGTTCGCTG ACAGCAACCT TGAGGATGCG840GCCGACGCGG TAGCCTTCGG GATCAGCTTT AATACCGGGC AGTGCTGTGT GTCGTCGAGC900CGCGTGATCG TAGAGCGGTC CGTGGCGGAG AAGTTCGAGC GCGTCGTCGT GCCAAAAATG960GAGAAGATCC GCGTTGGTGA TCCGTTTGAT CCCGAAACGC AGATTGGCGC CATCACGACG 1020GAAGCGCAGA ACAAGACCAT TCTGGACTAT ATCGCGAAAG GCAAGGCCGA GGGCGCCAAG 1080CTGCTCTGTG GTGGCGGGAT CGTCGATTTC GGCAAGGGAC AGTATATCCA GCCCACGCTT 1140TTCACGGATG TGAAGCCCTC GATGGGCATC GCGCGTGACG AGATTTTTGG GCCGGTTCTG 1200GCGTCCTTCC ACTTCGATAC CGTCGATGAG GCGATCGCGA TTGCCAATGA CACGGTTTAC 1260GGCTTGGCCG CATCGGTCTG GAGCAAGGAT ATCGACAAGG CGCTTGCCGT GACCCGTCGT 1320GTTCGTGCCG GCCGCTTCTG GGTGAACACC ATCATGAGCG GTGGTCCCGA GACGCCGCTG 1380GGTGGTTTCA AGCAGTCGGG CTGGGGCCGT GAGGCCGGTC TGTACGGCGT TGAGGAATAT 1440ACGCAGATCA AATCTGTCCA TATCGAAACT GGCAAACGTT CGCACTGGAT TTCGTAA 149權(quán)利要求
1.一種由氧化葡糖桿菌T-100得到的L-山梨糖脫氫酶，其特征在于(1)一種催化L-山梨糖轉(zhuǎn)化成L-山梨酮的能力，(2)分子量58000道爾頓(SDS-PAGE)，以及(3)N-末端氨基酸順序?yàn)門hr-Ser-Gly-Phe-Asp-Tyr-Ile-Val-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-
2.一種L-山梨糖脫氫酶，其所具有的氨基酸順序示于說明書中順序目錄，順序No.1。
3.一種編碼權(quán)利要求1或權(quán)利要求2L-山梨糖脫氫酶的DNA。
4.權(quán)利要求3的DNA，其所具有的核苷酸順序示于說明書中順序目錄，順序No.3。
5.一種由氧化葡糖桿菌T-100得到的L-山梨酮脫氫酶，其特征在于(1)一種催化L-山梨酮轉(zhuǎn)化成2-酮基-L-古洛糖酸的能力，(2)分子量為50000道爾頓(SDS-PAGE)，以及(3)N-末端氨基酸順序?yàn)锳sn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu(Xaa是一種未鑒別的氨基酸)。
6.一種L-山梨酮脫氫酶，其所具有的氨基酸順序示于說明書中順序目錄，順序No.2。
7.一種編碼權(quán)利要求5或權(quán)利要求6L-山梨酮脫氫酶的DNA。
8.權(quán)利要求7的DNA，其所具有的核苷酸順序示于說明書中順序目錄，順序No.4。
9.一種含有至少一種選自權(quán)利要求3、權(quán)利要求4、權(quán)利要求7和權(quán)利要求8的DNA的表達(dá)載體。
10.一種由權(quán)利要求9表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)染的)宿主細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞為大腸桿菌。
12.一種制備權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的L-山梨糖脫氫酶和/或權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的L-山梨酮脫氫酶的方法，該方法包括在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞并從得到的培養(yǎng)物中回收L-山梨糖脫氫酶和/或L-山梨酮脫氫酶。
全文摘要
兩者均由氧化葡糖桿菌T-100得到的一種新的L-山梨糖脫氫酶(SDH)和一種新的L-山梨酮脫氫酶，一種編碼SDH和/或SNDH的DNA，一種含有該DNA的表達(dá)載體，一種由該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及一種制備SDH和/或SNDH的方法，該方法包括在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞并由得到的培養(yǎng)物中回收SDH和/或SNDH。本發(fā)明的SDH和SNDH是具有較佳性能用于制備2-酮基-L-古洛糖酸，以及L-抗壞血酸的酶。按照本發(fā)明的制備方法，可通過遺傳工程大量生產(chǎn)具有這些優(yōu)良性能的SDH和SNDH。
文檔編號(hào)C12N9/04GK1120350SQ94191626
公開日1996年4月10日 申請(qǐng)日期1994年3月8日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月8日
發(fā)明者丹羽峰雄, 齊藤善正, 石井芳則, 吉田勝, 鈴木寬美 申請(qǐng)人:藤澤藥品工業(yè)株式會(huì)社 被以下專利引用 (1),