專利名稱：在植物中產(chǎn)生細胞質雄性不育性的方法及其在雜種種子生產(chǎn)中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有農學和商業(yè)重要性的植物的改良，特別是涉及供生產(chǎn)細胞質雄性不育性植物的一種新的基于質體的轉基因系統(tǒng)，以及這種植物在生產(chǎn)雜種種子中的應用。發(fā)明背景將兩種近交植物系雜交產(chǎn)生產(chǎn)量增加的雜種的發(fā)現(xiàn)，在發(fā)展生產(chǎn)雜種種子的商業(yè)方法中引起了植物育種者極大的興趣。雜種通常趨向于更多產(chǎn)，在利用營養(yǎng)素，如肥料和水方法更有效。F1雜種還趨向于比親本雜交系對環(huán)境壓力表現(xiàn)更強的抗性性，還可表現(xiàn)希望的疾病抗性特性。通過產(chǎn)生兩種近交系的雜種，還有可能使以其它途徑很難或不可能結合的特性結合在一起。
雜種健壯在植物和動物中是常見現(xiàn)象，并且已在植物育種中被商業(yè)地利用了很多年。目前很多有商業(yè)重要性的作物物種能得到商購雜種，還在繼續(xù)努力以提供雜種能穩(wěn)定地和商業(yè)化的產(chǎn)生作物。
為產(chǎn)生兩種近交系的雜種后代，必須發(fā)生交叉授粉。這對于很多作物性植物的雜種產(chǎn)生是一種障礙，因為在這些植物中，自然地進行恢復系，經(jīng)常在同一朵花中產(chǎn)生花粉和卵兩者。為阻止自我受精，必須去除或破壞一種親本中的花粉產(chǎn)生器官。這可通過手工去雄實現(xiàn)，即，去除整個雄花，或從在同一朵花中具有有功能的雄性和雌性器官兩者的花中去除花藥。手工去雄是一種精細的工作，因而也是高花費的工藝。
用于雜種種子生產(chǎn)的雄性不育親本系也可通過使用阻止形成有活性花粉的化學物質(“殺配子劑”)來產(chǎn)生。這些化學物質也昂貴，并且由于在向植物施用化學物質中的限制而漢森漢不完全可靠。
還可使用種植于產(chǎn)花粉的雄性親本鄰近處的遺傳學地雄性不育植物作為雌性親本產(chǎn)生一致的交叉授粉。使用這種方法，所有從雌性親本的行收獲的種子均為交叉授粉產(chǎn)生的。
植物中花粉產(chǎn)生的缺乏(即，雄性不育)可歸因于核突變或細胞質遺傳因子。對于生產(chǎn)雜種種子，細胞質雄性不育性優(yōu)于核遺傳學雄性不育性，因為CMS特性不受孟德爾式分離的作用。漢森和西多，Int’l.Rev.Cytol.，94213-267(1985)。為闡明這一點核遺傳學雄性不育通常由單個隱性基因編碼，因而表達純合雄性不育表型需要。為繁殖核遺傳雄性不育植物，必需將純合的隱性雄性不育株與雄性不育基因雜合的同源雄性可育系雜交。這樣的雜交導致形成一定百分比的雄性可育性植物(在單基因系統(tǒng)中為50％)，必須在能識別它們的可育性后立即從田地中去除，以維持所希望的雄性不育群的有效性。類似于手工去雄，將雄性不育植物從田地中去除是精細而高花費的勞動。因此，核基因的分離極大地限制了核遺傳學雄性不育性在產(chǎn)生雜種種子方面的用途。
核遺傳學雄性不育性受到孟德爾式分離的障礙。與此相反，細胞質雄性不育性在CMS近交糸和雄性可育親本之間雜交的所有后代中表達。由于此原因，CMS特性是用于雜種種子生產(chǎn)的優(yōu)選方法。
自然發(fā)生的細胞質雄性不育性可歸因于線粒體基因組中的突變。這些線粒體突變和細胞質雄不育性的關系隨種屬不同而不同，并且尚未被很好地解釋。在玉米，最具特點的線粒體CMS系統(tǒng)中的一種中，細胞質雄不育性在Texas細胞質中(CMS-T)似乎與一種13-KD多肽的表達有關。漢森遺傳學年評，25461-486(1991)；萊文斯和西多植物分子生物學，19135-147(1992)。此種多肽顯示為一種跨膜蛋白，它增加細胞膜的通透性。該多肽在正常分裂的營養(yǎng)細胞中無明顯不利作用，但通過一種迄今未知的機制，引起絨氈層細胞膜的過度通透性并因而妨礙花粉形成。13KD多肽的產(chǎn)生已知與CMS-T玉米對植物病原菌如Bipolaris maydis和Phyllosticta maydis的易感性有關。
在可得到自然發(fā)生的CMS細胞質的植物育種計劃中，種子生產(chǎn)需要3種近交系(1)一種具有CMS細胞質的細胞質雄性不育系；(2)一種具有正常細胞質的可育近交系，它與CMS系對于核基因同源(“維持因子系”)；和(3)一種具有正常細胞質，攜帶可育性恢復基因的可育近交系(“恢復系”系，它不必與該CMS系同源)。此CMS系通過用維持因子系授粉繁殖。這種雜交得到的所有植物都將是雄性不育的，因為CMS細胞質是得自雌性親本。雜種種子通過用攜帶可育性恢復系(Rf)基因的第二種近交系授粉生產(chǎn)。如果得不到恢復系基因，不育雜種仍可用于不攜帶可育性恢復系基因的不同近交系授粉獲得。這種雜種可用于營養(yǎng)組織有用的作物(如煙草葉或矮牽牛屬植物花)。然而，在大多數(shù)作物中，種子是作物有價值的部分，因此在這些作物中雜種的可育性必須被恢復。
雖然細胞質雄性不育性可用于雜種生產(chǎn)，其用途常受與自然發(fā)生的細胞質雄性不育性相關的許多實際問題限制。這些問題包括不能鑒定區(qū)分CMS細胞質或核恢復系等位基因，以及混雜的不希望的特性如疾病敏感性(如上所述)，降低的可育能力等。這些困難的每一個都是因為對細胞質雄性不育性的線粒體機制和可育性恢復缺乏理解所致。顯然，如果開發(fā)出一種CMS系統(tǒng)，其組成被充分了解并表征，并能有信心地操縱而不利副作用的危險，則細胞質雄性不育性的價值將大大增加。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種基于質體基因組而不是線粒體基因組的新的CMS系統(tǒng)，并采用3種轉基因一種質體雄性不育性基因和兩種調節(jié)此質體雄性不育性基因表達的核基因。
按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于生產(chǎn)細胞質雄性不育性植物的一種方法。首先，選擇一種親本植物系。質體轉基因親本植物通過用雄性不育性基因pms在親本細胞系的細胞中穩(wěn)定地轉化質體，并再生一株植物而產(chǎn)生。pms基因可受核編碼的質體指導的調節(jié)物多肽的調節(jié)。當那種調節(jié)發(fā)生在花藥組織中時，有活性的花粉的形成被破壞。在一項實施方案中，在本文中稱為“花粉殺滅”方法，該pms基因是一種滅活基因，它包含編碼一種能滅活或殺滅質體，從而破壞活性花粉形成的物質的編碼區(qū)，該區(qū)可操作地連接于供激活基因表達的靶核苷酸序列。在另一項實施方案中，在本文中稱為“花粉饑餓”方法，該pms基因包含質體基因組必需基因，可操作地連接于靶核苷酸序列以阻止基因表達。此基因置換天然質體基因，并阻止引起質體損害或死亡，從而破壞有活性花粉的形成的基因的表達。包含pms基因的質體轉基因植物是可育的。下一步，親本植物系的不同細胞受到一種核雄性不育基因，nms的穩(wěn)定核轉化，該nms包含一種可操作地連接于一個編碼核苷酸序列的花藥特異性5’調節(jié)核苷酸序列，其中所述編碼核苷酸序列編碼能夠進入質體并通過與靶核苷酸序列相互作用調節(jié)pms基因的前述質體指導的“調節(jié)基因”多肽，可通過激活表達(“花粉殺滅”方法)或阻止表達(“花粉饑餓”方法)實現(xiàn)。從核轉化的親本作物細胞再生一株植物。這種植物也是可育的。細胞質雄性不育植物通過將質體轉基因親本植物與核轉基因親本植物雜交產(chǎn)生，從而提供供花藥特異性質體失活或死亡的完整系統(tǒng)，它破壞有活性花粉的形成。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于從兩種親本植物系產(chǎn)生雄性可育雜種種子的一種方法，其中一種親本植物系包含上述細胞質雄性不育性植物系。按照本方法，細胞質雄性不育性親本植物如上所述被生產(chǎn)。隨后選擇第二親本植物系。從此系，一種雄性不育性恢復親本植物通過將第二親本植物系的細胞用一種“恢復雄性可育性”(rmf)基因進行穩(wěn)定的核轉化而產(chǎn)生。該rmf基因包含編碼能干擾nms基因的一種“恢復系”基因產(chǎn)物的核苷酸序列，這種干擾可以是通過阻斷nms基因本身的表達，也可是通過阻斷一種可激活的毒性pms基因的表達。從該被穩(wěn)定地核轉化的細胞再生出一株植物。然后將細胞質雄性不育系與可育性恢復系雜交，于是，rmf基因的表達阻止了前述調節(jié)因子多肽對pms基因的調節(jié)，從而使雜種植物恢復雄性可育性。
按照本發(fā)明的其它方面，提供DNA構建物和轉基因植物供本發(fā)明的實踐。提供一種包含nms基因的核轉基因植物和一種包含pms基因的，同親本系的質體轉基因植物。還提供一種通過將核轉基因植物與質體轉基因植物雜交產(chǎn)生的細胞質雄性不育性植物。提供一種第二親本植物系的核轉基因植物，它包含rmf基因。還提供了雄性可育性雜種植物，它們是通過將細胞質雄性不育親本植物與含rmf基因的第二親本植物系雜交產(chǎn)生的。附圖簡述

圖1.采用T7 RNA聚合酶/Lac抑制物系統(tǒng)的質體雄性不育性(pms)的“花粉殺滅”方法優(yōu)選實施方案的圖示。(圖1A)不育植物的絨氈層細胞或小孢子中雄性不育基因的表達。在細胞漿核糖體上核nms基因(“Knms”)被轉錄，編碼的蛋白(T7 RNA聚合酶)被翻譯，并被引入質體。隨后的質體殺傷基因(“Kpms”)從T7lac啟動子轉錄引起細胞的死亡(“+”代表陽性調節(jié)子，T7 RNA聚合酶，該酶對T7啟動子是特異的) (圖1B)雄性不育基因在可育的雜種植物絨氈層細胞或小孢子中的表達。核可育性恢復系基因(Krmf)的產(chǎn)物lca抑制物結合于質體中的Kpms T7/lac啟動子，從而阻止毒性基因通過Knms基因產(chǎn)生轉錄。(黑圈中的白“X”代表lac抑制物結合于T7/lac，調節(jié)序列上的lac操縱基因)。
圖2.質體雄性不育性的“花粉饑餓”方法優(yōu)選實施方案的圖示，此種質體雄性不育性使用一種質體指導的lac抑制物和一種核指導的tet抑制物(圖2A)雄性不育性基因在可育植物的絨氈層細胞或小孢子中的表達。核nms基因(“Snms”)被轉錄并且編碼的lac阻遏物被引入質體中，在質體中它阻斷一種重要基因(Spms)的表達，該重要基因的啟動子含有一個lac阻遏物結合位點。該重要的Spms基因表達的缺乏引起細胞死亡(黑圈中的白“X”代表lac阻遏物對Spms基因的lac操縱基因序列的特異結合)。(圖2B)雄性不育性基因在可育雜種植物的絨氈層細胞中的表達。可育性恢復系基因(Srmf)編碼阻止核Snms基因轉錄的以核為靶的阻遏物，這種阻止是通過在Snms基因上操縱的阻遏物結合位點，從而使Spms基因不能表達(黑圈中的白“-”表示以核為靶的阻遏物與其在Snms基因上的阻遏物結合位點的特異結合)。
圖3.用于“花粉殺滅”方法，在質體中表達Kpms的盒。該DNA序列顯示為PTlac1(序列I.D.No.1)和PT7lac2(序列I.D.No.2)啟動子和TT7(序列I.D.No.3)和Trps16T7(序列I.D.No.4)轉錄終止子。RBS代表核糖結合位點，T7噬菌體基因10(φ10)啟動子，lac操縱子和相關的限制性位點下面劃線。包括在NcoI識別序列中的翻譯起始密碼子為粗體。
圖4.通過連接于壯觀霉素抗藥性(aadA)基因將Kpms基因整合入質體基因組的轉錄沉默區(qū)。質體pC8的質體尋靶作用區(qū)被顯示，同時還顯示野生型質體基因組(Nt-ptDNA)的同種區(qū)，和含整合的殺滅基因的區(qū)。aadA和過路基因的整合是通過長線間的兩次同源重組事件進行的。簡略語16SrDNA＝16SrRNA基因；V＝trnV基因；B＝ORF70B開放閱讀框；PT7＝PT7lacl啟動子；TT7＝TT7終止子。限制性位點E，EcoRI；B，BamHI；Bg，BglII；H，HindIII；RV，EcoRV。
圖5.Knms核雄性不育性基因(pZS233核苷酸序列為序列I.D.No.5，蛋白序列為序列I.D.No.6；pZS243核苷酸序列為序列I.D.No.7，蛋白序列為序列I.D.No.8)。顯示的Knms基因表達為組成基因，帶有一個花椰菜花葉病毒35S啟動子(P35S；蒂莫曼斯等，生物技術雜志14333-344，1990)，RuBisCO小亞單位運送肽(TP-SSU；卡那夫斯基和馬利格，美國國家科學院院報，911969-1973，1994)，T7 RNA聚合酶(T7-RNAP；斯圖迪等，酶學方法，18560-89，1990)和花椰菜花葉病毒轉錄終止子(T35S；蒂莫曼斯等，1990，上述)。還顯示了運送肽的蛋白序列(長線)和與T7RNA聚合酶N-末端融合。加工位點用實心三角標記。當從上面所示pZS233基因表達時前T7 RNAP的加工產(chǎn)生不帶附加氨基酸的T7 RNAP，并且當從下面所示的pZS243基因表達時留下融合在N-末端的成熟SSU的5個氨基酸。
圖6.雄性可育性基因的Srmf核恢復系(pZS253核苷酸序列是序列I.D.No.9，蛋白質序列是序列I.D.No.10；pZS263；核苷酸序列是序列I.D.No.11，蛋白質序列是序列I.D.No.12)。一種帶有花椰菜花葉病毒35S啟動子(P35S；Timmermans等，1960，上述)的組成型測試基因。TP-SSU，RuBisCO小亞單位運送肽(Kanevski和Maliga，1994，上述)；lacI，lac阻遏物編碼區(qū)(Farabaugh，Nature，274765-769，1978)；T35S，花椰菜花葉病毒轉錄終止子(Timmermans等，1990，上述)。還顯示了運送肽蛋白序列(長線)和與T7 RNA聚合酶的N-末端融合。加工位點以實心三角標記。當從上面描述的pZS253基因表達時前T7RNAP的加工產(chǎn)生不帶有附加氨基酸的T7RNAP，并且當從下面所示pZS263基因表達時留下在N末端融合的成熟SSU的5個氨基酸。
圖7.用于為“花粉饑餓”方法轉錄Spms基因的改變的啟動子序列。Prrnlac1(序列I.D.No.13)和Prrlac2(序列I.D.No.14)啟動子來自rRNA操縱子啟動子，PtrnVlac2(序列I.D.No.15)啟動子來自trnV基因。標出下劃線的-10和-35啟動子元件和lac操縱基因序列(粗體)。數(shù)字代表核苷酸在煙草質體基因組中位置(Shinozaki等，EMBO J.，52043-2049，1986)。
圖8.用于為“花粉饑餓”方法表達蛋白編碼Spms基因的改變的啟動子序列。所顯示的啟動子為rRNA操縱子啟動子的衍生物，并具有T7噬菌體基因10前導(PrrnlacL1；序列I.D.No.16)或質體rbcL基因前導(PrrnlacL2；序列I.D.No.17)的前導序列。標出下劃線的-10和-35啟動子元件和lac操縱序列(粗體)。數(shù)字代表核苷酸在煙草質體基因組中的位置(Shinozaki等，1986，上述)。發(fā)明詳述本發(fā)明的轉基因CMS系統(tǒng)所依據(jù)的原則是，在發(fā)育的花藥組織(特別是絨氈層或小孢子)中活性的有功能的葉綠體對于活性花粉的形成是至關重要的。三轉基因系統(tǒng)包含受兩種核基因調節(jié)的質體雄性不育性(pms)基因。兩種核調節(jié)基因之一是設計為只在花藥組織中表達的核雄性不育性(nms)基因。該nms基因編碼調節(jié)pms基因的質體指導多肽，此種調節(jié)是通過激活或滅活pms基因，這可引起被選擇的花藥組織的轉化質體失去活性或死亡，從而阻止有活性的花粉的形成。另一種核基因，雄性可育性恢復(rmf)基因，編碼一種阻止nms基因調節(jié)pms基因的基因產(chǎn)物。
在下面I-III部分中進行的詳述中，闡明了制造并使用本發(fā)明的DNA構建物和轉基因植物，以及實踐本發(fā)明方法的優(yōu)選方法。部分I闡明構建本發(fā)明的基于質體的CMS系統(tǒng)的一般方法(在時在本文中稱為“質體雄性不育性”或“pms”系統(tǒng))。部分II和III闡明了質體轉基因CMS系統(tǒng)的兩種優(yōu)選實施方案，即“花粉殺滅”方法和“花粉饑餓”方法，并描述了用于實施這兩種優(yōu)選實施方案的每一種有用的DNA構建物和其它組成。未特別描述的任何分子克隆或重組DNA技術按常規(guī)方法進行，按照通常所描述的，如，在薩姆布魯克等“DNA克隆，實驗室手冊”，冷泉港實驗室，1989中。
I.構建質體轉基因CMS系統(tǒng)和生產(chǎn)雜種種子的一般方法本發(fā)明的轉基因CMS系統(tǒng)根據(jù)為高等植物核和質體轉化，維持親本植物系和產(chǎn)生雜種種子闡述的一般方法制備和使用。
A.用pms基因穩(wěn)定轉化質體并再生質體轉基因植物的DNA構建物和方法供穩(wěn)定高效地轉化質體并在質體中表達重組蛋白的方法和DNA構建物在本領域中是公知的。在下列參考文獻中描述的方法和構建物為本發(fā)明實踐所優(yōu)選斯威伯等，美國國家科學院院報，878526- 30(1990)；斯威伯和馬利格，美國國家科學院院報，90913-17(1993)；凱若等分子基因遺傳學，24149-56(1993)；斯圖伯&莫利格，EMBO J.，12601-06(1993)；和美國專利申請序列號08/11398和08/189256；所有上述公開內容均描述了在穩(wěn)定，高效的質體轉化和重組基因在質體中表達方面本領域的狀態(tài)。
下列定義將使對關于本發(fā)明中使用的質體轉化方法的理解變得容易異質的指在單個質體內或植物細胞和組織中包含的一群質體中存在不同質體基因組的混合群。
同質的指在質體中或細胞和組織內純的質體基因組群。
質體轉化將轉化DNA穩(wěn)定地整合將被傳送入含轉化質體的植物種子后代的質體基因組。
前述供質體轉化的優(yōu)選方法和構建物依賴于使用一種非致死選擇方法，它給予含轉化質體的細胞一種可選擇表型。術語“選擇性標記”或“可選擇標記”指當編碼選擇性標記的基因或等位基因包含于用于轉化的外源DNA時，確定成功轉化的細胞器，細胞或組織的表型。通常使用的選擇性標記包括對抗生素，除莠劑或其它化合物的抗性性，當細胞，細胞器或組織不表達抗性性基因或等位基因時將是致死的。轉化體的選擇是通過將細胞或組織在選擇性壓力下，即在含抗生素，除莠劑或其它化合物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)而完成的。如果選擇性標記是“致死的”選擇性標記，則表達選擇性標記的細胞將存活，而缺乏選擇性標記的細胞將死亡。如果選擇性標記是“非致死的”，則轉化體(即表達選擇性標記的細胞)將通過一些方法與非轉化體鑒別，但轉化體和非轉化體兩者在選擇壓力存在下將都存活。
一種選擇性標記可以在細胞水平是非致死的，但在細胞器水平是選擇的；本文中優(yōu)選的用于質體轉化的選擇性標記即是這種情況。例如，抗生菌壯觀霉素抑制質體中的翻譯，但不抑制細胞質內的。對壯觀霉素敏感的質體不能產(chǎn)生包含光合作用裝置的蛋白質。在壯觀霉素存在下，含這種質體的細胞通過在光異養(yǎng)條件下(即，提供外源性的碳源)生長而保持存活，但其中的質體生長更緩慢，并且細胞或組織變白，而不是成為綠色。與此相反，表達壯觀霉素抗性性選擇性表型的質體繁殖速度快而且含有這種質體的細胞是綠色的。在含有轉化的和非轉化的質體的混合細胞群中，敏感的非轉化體將在數(shù)量上被超過并將在選擇壓力下在質體/細胞分離過程中被稀釋，并且基本上只有轉化的質體將組成質體群(同質細胞或組織，如上面所定義)。因此，非致死性選擇性標記指在細胞水平非致死，其中敏感細胞或組織可在選擇性培養(yǎng)基中生長，但抗性性組織易于從其中被鑒別。
質體轉化需要(1)傳送DNA通過雙層質體膜的方法；(2)整合異源DNA而不妨礙質體基因組的正常功能(通過在質體基因組中合適位點置換已存在的質體基因或插入附加的基因)；和(3)有效地選擇轉化的質體基因組，優(yōu)選通過使用顯性型非致死性選擇性標記，如上文中成斯伯和馬利格，1993，所述(描述了aadA基因作為可選擇標記基因用于高效轉化煙草葉綠體)。
可采用幾種方法將DNA導入開花植物的質體，包括，但不限于，土壤桿菌屬載體，聚乙二醇(PEG)處理原生質，用質體轉化DNA包被的微彈轟擊細胞或組織(有時在本文中稱為“biolistic DNA傳送”)和通過UV激光微光束切割的臨時孔。其它方法包括使用雙病毒載體，鈣磷酸鹽處理原生質，分離的原生質的電穿孔和用轉化DNA包被的微珠的細胞懸溶液的攪拌。如上述由斯威伯和馬利格，1993描述的biolistic方法優(yōu)選用于質體轉化，因為它可用于其中許多植物和組織，包括不經(jīng)細胞或原生質培養(yǎng)或再生處理的種或屬。在一項替代的實施方案中，在原生質可被獲得并再生入完整植物的植物系統(tǒng)中有用，可在轉化DNA存在下通過聚乙二醇(PEG)處理原生質獲得質體轉化。在PEG-處理的原生質中穩(wěn)定的質體轉化的方法由Gold等，Bio/Teehnology，1195-97(1993)在煙草中舉例說明。
用于用pms基因進行穩(wěn)定的質體轉化的DNA構建物(在本文中有時稱為“轉化DNA”或“插入載體”)包含下列元件(1)與被轉化的質體基因組的一個區(qū)同源的一段DNA序列(在本文中有時稱為“靶節(jié)段”或“靶片段”)，具有足夠的長度以確保為將轉化DNA整合質體基因組所需的同源重組事件能發(fā)生，(2)一種非致死性可選擇標記基因，如aadA基因，和(3)pms基因，兩種基因分別可操作地連接于5’和3’調節(jié)區(qū)以供在質體中表達。這種載體被方便地裝配為嵌合基因，其中每個編碼區(qū)(即，可選擇標記基因編碼區(qū)和pms基因編碼區(qū))側翼排列有適當?shù)?’和3’調節(jié)序列。選擇可選擇標記編碼節(jié)段的5’和3’調節(jié)節(jié)段以便可選擇標記基因被有效表達，從而傳遞非致死性可選擇表型。如上所述選擇pms基因5’和3’調節(jié)節(jié)段，以便基因能在核nms和rmf基因控制下被激活和滅活。這種嵌合基因在兩側帶有部分靶節(jié)段。
插入載體的靶節(jié)段應足夠大以保證在轉化DNA和質體基因組之間的同源重組。為實現(xiàn)這一點，靶節(jié)段應至少約50堿基對長，并優(yōu)選在將要插入質體基因組中的DNA的每一側為500～1500堿基。
選擇靶節(jié)段應使轉化DNA不破壞附近質體基因的表達。本領域技術人員可確定有用的靶節(jié)段，其原因是可得到數(shù)種質體基因組的大量基因圖譜信息和序列信息，以及由于質體基因組中具有高度保守性而可將這種信息用于其它質體基因組(帕爾默，遺傳學動向，6115-120，1990；蘇格里亞，植物分子生物學，19149-168，1992)。
對于本發(fā)明的“花粉-饑餓”方法，靶節(jié)段包含要置換的基因，并且完全置換該基因而不妨礙質體基因組上的臨近基因。置換的完成是通過連接可選擇標記基因于置換質體基因的下游，并選擇表現(xiàn)可選擇表型的轉化體(見馬利格等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B，342203-208(1993))。
對于“花粉殺滅”方法，選擇靶節(jié)段使轉化DNA在轉錄寂靜位點插入質體基因組，而不破壞質體基因。已知質體基因的3’區(qū)不能有效終止轉錄(格瑞珊和托金，植物學關鍵回顧，1219-55，1993)，在轉化DNA插入質體基因組的幾乎任何位點時，均可預期到一定程度的連讀轉錄。考慮到這一點，在trnV基因和rps12/7操縱子之間的反向重復區(qū)的插入位點特別有用，因為當取向于rps12/7操縱子時，轉化DNA被轉錄而不伴隨顯著的連讀轉錄。在trnV-rps12/7插入位點缺乏連讀轉錄可能是由于側翼質體基因或操縱子被逆向轉錄(即，從對面的鏈，以相反方向轉錄)。因此，指向其它逆向轉錄基因間位點的靶節(jié)段在本發(fā)明的實踐中可能也有用。這些包括，但不限于，在反向重復區(qū)trnL和ORF2280間的位點，在大單拷貝區(qū)trnS和ORF168和trnW和petG之間。另外，任何兩個tRNA基因間的插入位點也可能有用，因為tRNA基因是轉錄的相對有效的終止子(斯騰和格瑞珊，細胞，511145-57，1987)。在插入位點兩翼加入轉錄終止子也可獲得相同結果，這些轉錄終止子可被合成或從源基因切下并被克隆。
可選擇標記基因和pms基因可在供插入至靶節(jié)段的表達盒中提供。本文中使用的表達盒包含5’和3’調節(jié)基因節(jié)段，優(yōu)選應適合通過常規(guī)重組DNA技術方便地混合和配對。表達合用于為插入載體的裝配產(chǎn)生嵌合pms基因和可選擇標記基因。因此供用pms基因轉化質體的插入載體包含至少一種其它基因，它提供非致死性可選擇表型。
表達載體包含5’和3’調節(jié)節(jié)段以控制多種編碼片斷的表達。5’調節(jié)節(jié)段控制質體中表達的總量和特異性。3’調節(jié)節(jié)段提供mRNA穩(wěn)定性。優(yōu)選5’和3’調節(jié)節(jié)段得自內源性質體基因的5’和3’調節(jié)區(qū)，它可被進一步修飾。其它5’和3’調節(jié)區(qū)也可被使用，特別是得自大腸埃希桿菌、草藍藻細菌，光合細菌，噬菌體和植物病毒的這種調節(jié)區(qū)。
為獲得可選擇標記基因和主要pms基因在其它花藥質體中的高水平蛋白表達，經(jīng)修飾的非光合作用啟動子可用于5’調節(jié)節(jié)段中。這一類中的強啟動子是斯威伯和馬利格描述16S核糖體RNA操縱子啟動子，Prrn，1993年上文。
除了為指導轉錄而具有啟動子元件外，為調節(jié)翻譯5’調節(jié)節(jié)段可含附加的表達啟動元件，如在質體基因的5’非翻譯區(qū)(UTRs)中的核糖體結合位點，以及編碼質體基因的幾種N-末端氨基酸的序列。
被操縱用于表達壯觀霉素抗性性基因的一種rrn操縱子啟動子實例aadA由Svab和Maliga公開于1993年，上文。這種5’調節(jié)節(jié)段包含rrn操縱子5’-區(qū)的一個節(jié)段，包括- 10和-35啟動子元件，與包括GGGUGGG核糖體結合位點的高表達rbcL非翻譯區(qū)的18氨基酸融合。這種5’調節(jié)節(jié)段能夠指導uidA基因在轉化質體中的構建物表達。作為另一實例，Carrer等，1993年，上文，描述的同樣的啟動子能夠指導kan基因的表達。
還發(fā)現(xiàn)通過在5’調節(jié)節(jié)段中包括進相對于翻譯起始位點從-16至+18的整個rbcL前導序列，可提高表達。假設對于高水平蛋白表達而言mRNA前導序列(即，5’UTRs和N末端編碼區(qū))是重要的，其它有用的前導序列可得自其它高表達基因，特別是高表達病毒基因(如，煙草花葉病毒(TMV)包被蛋白的omega序列，苜?；ㄈ~病毒(AMV)RNA4或雀麥花葉病毒(BMV)RNA3的非翻譯前導，和噬菌體T7前導序列(見圖8和實施例4))。
適合本發(fā)明實踐的3’調節(jié)節(jié)段的一項實施例由Staub和Maliga，1993年，在上文公開，并也公開在實施例1中(圖3)。這些片段得自各種質體基因和T7噬菌體基因10的3’非翻譯區(qū)。
使用上文描述的構建物，可如下獲得包含pms；基因的穩(wěn)定質體轉化多細胞植物(1)在包含非致死性可選擇的標記基因和合適靶節(jié)段的插入載體中提供pms基因；(2)傳送轉化DNA進入質體(優(yōu)選通過biolistic方法)，從而能夠整合轉化DNA而不妨礙質體基因組的正常功能；(3)在合適的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)處理的細胞或組織并重復亞克隆直至獲得同質細胞；(4)通過可選擇表型的表達鑒定同質細胞或組織；并(5)使經(jīng)鑒定的轉化體生長為成熟植物并評價它們的后代保持可選擇表型和存在pms基因的情況。
B.獲得包含nms基因或rmf基因的核轉基因植物的方法植物核轉化可按照為質體轉化描述的同樣方法完成。這些包括，但不限于，土壤桿菌屬載體，原生質的PEG處理，biolistic DNA傳送，UV激光微光束，二價染色體病毒載體，原生質的磷酸鈣處理，分離的原生質的電穿孔，以轉化DNA包被的微珠細胞懸液的攪拌，直接DNA攝取，脂質體介導的DNA攝取，等等。這些方法已在本領域中公開，參見，植物分子生物學方法，威斯巴赫和威斯巴赫編，學術出版公司(1988)；植物分子生物學中的方法，舒勒和澤利斯基編，學術出版公司(1989)；植物分子生物學手冊，葛文施普勞特，沃瑪編，克魯夫學術出版社，道瑞茲(1993)和植物分子生物學方法-實驗室手冊，馬利格、克萊斯格、凱施莫、格瑞賽姆和沃納編，冷泉港出版社。
轉化的方法取決于被轉化的植物。biolistic DNA傳送方法已被描述用于轉化質粒并也可用于核轉化。在本發(fā)明的另一實施方案中，土壤桿菌屬載體被用于幫助植物核的有效轉化。
在一項優(yōu)選實施方案中，nms基因(及下述rmf基因)被導入土壤桿菌屬雙元載體中的植物核中。這種核包括，但不限于，BIN19(貝萬，核酸研究，128711-8721，1984)和其衍生物，pBI載體系列(杰弗遜等，EMBO.J.，63901-3907，1987)，和雙元載體pGA482和pGA492(安，植物生理，8186-91，1986)。本發(fā)明的實踐優(yōu)選一種新的土壤桿菌屬雙元載體系列，pPZP族。斯威伯等描述了此載體族在植物轉化中的應用，見植物分子生物學方法-實驗室手冊，馬利格、達萊斯格、凱施莫、格瑞賽姆和沃納編，冷泉港出版社(1994，在印刷中)。
使用土壤桿菌屬雙元載體系統(tǒng)用于轉化，nms或rmf基因被連接至一種核藥物抗性性標記，如卡那霉素或慶霉素抗性性。nms基因和rmf基因優(yōu)選連接至不同藥物抗性性標記，以便兩種基因能分別被獨立選擇。土壤桿菌屬介導的植物核轉化按照下列步驟完成(1)nms基因或rmf基因被插入被選擇的土壤桿菌屬雙元載體；(2)通過將植物組織(如葉盤)與重組土壤桿菌屬懸液共培養(yǎng)，隨后在不存在用作選擇性培養(yǎng)基的藥物情況下在培養(yǎng)基上培養(yǎng)(如2天)而完全轉化(見，赫賽等，科學2271229-1231，1985)；(3)然后將植物組織轉至選擇性培養(yǎng)基上以鑒定轉化的組織；并且(4)被確定的轉化體再生為完整植物。
應認識到表達量以及nms或rmf基因在轉化植物中表達的組織特異性可能根據(jù)它們插入核基因組的位置而不同。這種位置效應在本領域中是熟知的；見Weising等，Ann.Rev.Genet.，22421-477(1988)。為此原因，應再生數(shù)種核轉化體并與質體轉化AP系(或者一種其pms基因為報導基因如uidA，編碼β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的AP“檢測”系)雜交檢測以確定轉化體適當?shù)乇磉_了核轉基因。
C.親本系的制備和維持及雜種種子的生產(chǎn)按照上述方法，三種轉基因被導入如下選擇的植物系。一種親本系，親本A，被選擇。親本A植物的質體用pms基因穩(wěn)定地轉化，并再生質體轉基因植物(AP)。另一親本植物的核用nms基因穩(wěn)定地轉化并再生核轉基因植物(AN)。選擇第2種親本系，親本B。親本B系的核用rmf基因轉化，并再生核轉基因植物(BR)。
產(chǎn)生親本系AP，AN，和BR后，種子繁殖和雜種種子生產(chǎn)可容易地完成。所有核轉化親本系被近交為純合。質體轉化的AP系是同質的。所有親本系是雄性不育的并能無限維持。為獲得細胞質雄性不育子代，將AN(花粉親本)與AP(雄性親本)雜交，使用各種技術(如去除AP的雄性部分和使用AN作為雄性親本)以保證獲得雜交的而非自交的種子。這些子代由于具有pms基因和nms調節(jié)基因兩者而成為雄性不育，此兩種基因導致被選擇的花藥組織中質體或細胞無能力或死亡從而不能形成有活性的花粉。通過用AN重復回交獲得穩(wěn)定AS系它在AP細胞漿中產(chǎn)生AN純合子。
通過將AS植物與核轉化的親本AN回交可繁殖雄性不育AS植物的種子。為繁殖AS種子，AS植物可在交替行中種植在AN植物邊上，并按行分別收獲種子。從AS行的種子生長的植物為雄性不育的。由于雄性不育是在質體水平通過轉基因質體產(chǎn)生的，因此雄性不育特性是一致地經(jīng)細胞質地遺傳，而不會由于核基因的分離產(chǎn)生不希望的雄性可育性。
第二親本系，親本B被用于產(chǎn)生雜種種子。如果雄性可育性雜種植物是不需要的，則進行簡單的AS×B雜交，并且ASB子代將遺傳CMS特性以產(chǎn)生也是雄性不育性的植物，因為子代將攜帶至少一份拷貝nms基因，但無rmf基因。如果，在另一方面，希望雜種種子生長為雄性可育性植物，則使用核轉基因親本BR。為產(chǎn)生雄性可育雜種種子，AS植物不具有可育花粉。由AS植物產(chǎn)生的所有種子都是用BR花粉受精的結果。由于rmf基因的表達阻斷nms基因產(chǎn)物對pms基因的調節(jié)活性，AS與BR的雜交導致形成將生長為雄性可育性植物的雜種種子。
II.“花粉殺滅”方法在本發(fā)明的一項實施方案(在本文中稱為“花粉殺滅”方法)中，pms基因是一種被改變的無活性基因，它能被選擇激活或失活。當被激活時，pms基因表達一種對質體毒性或致死性的基因產(chǎn)物。nms基因是編碼質體指導的激活物多肽的花藥特異性核基因，這種激活物多肽能夠進入質體和激活毒性pms基因，從而殺滅被選擇花藥組織的質體或使其失活。B親本的rmf基因編碼一種“恢復系”基因產(chǎn)物，此基因產(chǎn)物能妨礙激活物多肽的作用，從而阻止致死性pms基因產(chǎn)物的形成。在一項優(yōu)選實施方案中，rmf基因編碼一種質體指導的多肽，此多肽能進入質體并妨礙在那里的激活物多肽(例如，通過與pms基因的滅活位點相互作用，從而去除激活物多肽的作用)。在另一項實施方案中，rmf基因編碼一種細胞質基因產(chǎn)物，此基因產(chǎn)物在激活前體多肽進入質體前妨礙它(例如，以核為靶并抑制nms基因的表達)。
“花粉殺滅”方法通過下述系統(tǒng)舉例說明，該系統(tǒng)使用T7 RNA聚合酶作為激活物多肽，lac阻遏物作為恢復系多肽，以及可操作地連接于T7/lac啟動子的質體毒性“殺滅”基因。在此實施方案中，pms基因產(chǎn)物包含與質體轉送肽(如RuBisCo小亞單位)融合的高度特異性T7噬菌體RNA聚合酶以引導聚合酶進入質體基質區(qū)域。T7 RNA聚合酶是相對簡單的聚合酶，包含一種約100KD的單體酶，聚合物特異地結合于短(23bp)啟動子序列，具有特異性而阻止妨礙宿主基因的表達。質體指導的T7 RNA聚合酶的編碼區(qū)可操作地連接于絨氈層特異性啟動子，從而該基因只會在絨氈層細胞中被轉錄而誘導細胞死亡。T7聚合酶-T7/lac啟動子系統(tǒng)用于本發(fā)明特別有利，在于不論聚合酶的表達多高都不會引起對植物細胞的任何副作用(已發(fā)現(xiàn)高至總細胞蛋白的1％的水平的T7聚合酶表達不有害地影響酵母生長(陳等，細胞，501047-1055，1987))。
因此，本實施方案中，AN親本系表達T7 RNA聚合酶，AP親本系含有質體中的失活pms基因，并且AN×AP的子代由于T7聚合酶對T7/lac啟動子的作用從而激活pms基因而成為細胞質雄性不育的。這些雄性不育性子代，AS系，被用于雜種種子生產(chǎn)，如上所述，為生產(chǎn)雄性可育性雜種，將AS親本與BR親本雜交，它表達rmf基因產(chǎn)物，一種以質體為靶的lac阻遏物。lac阻遏物進入質體單元并結合于包括在T7/lac啟動子中的lac操縱序列，從而阻止pms；基因被T7 RNA聚合酶轉錄(見杜本德夫和斯圖迭，分子生物學雜志21945-49，1991)。因此，雜種ASBR子代將為雄性可育的，該可育性由rmf基因的表達所恢復。
本文描述的T7/lac系統(tǒng)在實施例1-3中更進一步地闡明并圖示于圖1。鑒于對T7/lac系統(tǒng)的上述描述，應認識到其它激活物和阻遏物系統(tǒng)也可被使用以獲得相同效果。例如，T7 RNA聚合酶/lac阻遏物系統(tǒng)的替代物是T3聚合酶/lac阻遏物系統(tǒng)，由Deuschle等描述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865400-5404(1989)。
對本發(fā)明的實踐有用的另一種系統(tǒng)是四環(huán)素阻遏物和操縱子系統(tǒng)，見下述，它為哺乳動物和植物系統(tǒng)兩者所采用(見高森等，生物技術學趨勢，1258-62，1994)。
A.“花粉殺滅”方法的質體雄性不育基因根據(jù)本發(fā)明的“花粉殺滅”方法，pms基因作為在靶序列的控制下失活基因的導入質體，此靶序列只在存在由CMS系其它親本組成部分的nms基因編碼的激活物多肽時使基因能夠表達。在此實施例中，pms基因編碼區(qū)編碼一種對質體有毒性的基因產(chǎn)物(RNA或蛋白)，它正是在這種質體中被產(chǎn)生的。由于質體是植物的很多重要的代謝和生化過程的位點，這些代謝和生化過程包括光合作用(在葉綠體中)，淀粉合成和積累(在葉綠體和造粉質體中)和氨基酸和脂質合成(一般在質體中)，在質體中有質體毒性基因產(chǎn)物作用的許多靶位點?？赡艿馁|體毒性系統(tǒng)的實例包括，但不限于特定質體基因產(chǎn)物的過度表達，針對編碼重要質體基因產(chǎn)物的mRNAs的反義RNA或核糖體的表達，活力蛋白的轉錄后修飾，如ADP核糖基化(尤達和海拉什，生物化學年評5473-100，1985)異源DNA酶，RNA酶，蛋白酶，和使質體膜可通透或破壞質體膜系統(tǒng)的孔形成蛋白。應指出毒性基因產(chǎn)物也可滲漏(或轉位)至細胞質，在那里發(fā)生毒性作用。有用的致死性多肽的具體實例包括，但不限于來自CMS-T玉米線粒體基因組的T-urf13。如在背景部分中所討論的，由urf13基因編碼的13KDa多肽增加生物膜的通透性，它導致了自然發(fā)生的系統(tǒng)中的CMS表型。見Hanson，Ann.Rev.Genet.，25461-86(1991)。其它有用的膜破壞蛋白包括得自酵母，細菌或哺乳動物的各種膜轉運蛋白(見科提茲等.，EMBO J.，113491-3499，1992；古蘭卡等.，F(xiàn)ASEBJ.，32583-2592，1989)。
得自蘇云金桿菌的CytA毒素基因，它編碼一種殺死蚊子的溶血蛋白。該基因在植物細胞中表達由于破壞細胞膜而引起細胞死亡(Mclean等.，J.Bacteriol.，1691017-1023，1987；Ellar等，美國專利第4918006號，1990)，這種生物活性也可應用于細胞器膜，如質體膜。
得自噬菌體P1和Cre-lox的系統(tǒng)的Cre重組酶，用于產(chǎn)生可導致喪失細胞活性的位點特異性重組和重排(范華仁和歐，Plant Mol.Biol.23525-533，1933)。
在本發(fā)明的實施方案中，pms基因的編碼區(qū)能夠編碼抑制重要質體功能從而引起質體失能或死亡的RNA。這些可包括反義分子或核糖基酶(ribozyme)，此酶的構建和使用在本領域是公知的。反義分子通常被設計以結合至基因或mRNA的重要區(qū)，從而阻止轉錄或翻譯或引起靶DNA的降解。ribozyme包含一個核苷酸序列與靶DNA的一部分互補的雜交區(qū)和一個在特定位點剪切靶DNA的催化區(qū)。
在“花粉殺滅”方法中，pms基因的可調節(jié)靶序列包含一個被nms基因的質體指導基因產(chǎn)物特異激活的非質體啟動子。在優(yōu)選實施方案中，pms基因的可調節(jié)靶序列包含一個位于相對于啟動子處的阻遏物結合位點，因而特異性阻遏物對阻遏物結合位點的結合阻止基因的轉錄，即使是在存在激活物多肽時(關于此啟動子和pms編碼區(qū)，稱為“控制位置”)。本發(fā)明的實踐優(yōu)選的是上文所述由Dubendorff和Studier在J.Mol.Biol.，21945-49(1991)中所述的T7/lac啟動子構建物。使用這種啟動子/阻遏物序列能夠通過質體指導的T7 RNA聚合酶激活pms基因，并用質體指導的lac阻遏物使該基因失活以恢復雄性可育性。
實踐本實施方案有用的另一種可調節(jié)靶序列是tet阻遏物結合位點(tet操縱基因)，也已在上面討論過并在下文與“花粉饑餓”方法有關。lac操縱基因或其它阻遏物結合位點類似地可用于采用由阻遏物結合區(qū)和異源激活區(qū)組成的嵌合激活物多肽的系統(tǒng)。
B.用于“花粉殺滅”方法的核雄性不育性基因本發(fā)明的核雄性不育性基因包含3種元件(1)編碼調節(jié)物多肽的編碼區(qū)，通過翻譯融合于(2)使調節(jié)物多肽能夠轉位入質體的質體送運肽，嵌合基因的轉錄在(3)花藥特異啟動子的控制下。
通過將nms基因的編碼區(qū)置于花藥特異性啟動子控制下而使花藥特異性被傳送至本發(fā)明的CMS系統(tǒng)?；ㄋ幪禺愋詥幼又笇嚓P編碼序列的轉錄從而使相應的信息RNA以至少約為在其它組織中觀察到的濃度的約100倍存在于花藥組織中。
花藥的代謝活性絨氈層對小孢子，即花粉的原始粒子，起到營養(yǎng)作用。已顯示節(jié)切除絨氈層細胞能導致核雄性不育。馬拉尼等，自然，347737-741(1990)；馬拉尼等，自然，357384-387(1992)。從而，在本發(fā)明的一項優(yōu)選實施方案中，使用絨氈層特異性啟動子。絨氈層特異性啟動子在本領域中是公知的，如上文所述，由馬拉尼等所舉例說明。在另一項實施方案中，使用小孢子特異性啟動子。這種啟動子在本領域中也是公知的(如，T52和T59，退爾等公開，Genes&Devel.，5496-507，1991)。
nms基因也可包含其它調節(jié)信號。例如，植物核翻譯共有序列也可包括在構建物物中，以及用于終止植物核基因轉染和翻譯的適當信號。
多數(shù)質體蛋白在核中被編碼，在細胞質中被翻譯并在翻譯后轉運至質體。這種核編碼蛋白作為含有被稱為運送肽的可剪切N-末端序列的高分子量前體被合成。這種運送肽對于運送前體多肽穿過質體外殼膜是必需和足夠的(并且，取決于多肽進入質體各種單元的最后位置)。運送肽能夠指導經(jīng)翻譯融合在那里的異源過客蛋白的攝取和內部定位。參見，塞格及斯格特，細胞生物學動向3186-190(1993)；亦見施耐爾和布洛凱，細胞生物學雜志，120103-115(1993)；開尼夫斯基等，美國國家科學院院報，911969-1973(1994)。
為本發(fā)明實踐，使用指導核編碼調節(jié)物多肽轉位于質體基質的運送肽，因為含pms基因的質體基因組位于基質中。在優(yōu)選實施方案中，編碼ribulose-1，5-二磷酸鹽羧酶/氧化酶(RuBisCo)小亞單位前體的送運肽被整合nms基因，以表達包含經(jīng)翻譯融合于前ss運送肽的調節(jié)物多肽的前體多肽。雖然在本文中例舉的是前-ss運送肽，本領域中技術人員可知道，任何指導基質定位的核編碼蛋白都可用于本發(fā)明的實踐。
在“花粉殺滅”方法中，nms基因編碼一種能夠通過可操作地連接于基因的靶核核苷酸序列激活毒性pms基因的質體指導的激活物多肽。本發(fā)明的激活物多肽包括，但不限于，聚合酶，DNA結合蛋白，自然產(chǎn)生的和合成的轉錄激活物，翻譯激活物，其它轉錄后激活物等。使用激活物多肽指導其它核苷酸序列的表達已如上所述以T7 RNA聚合酶為例予以說明。見雷姆等美國專利第5122457號，以及斯圖迭等美國專利4,952,496、及斯圖迭的綜述酶學方法，18560-89(1990)。
本發(fā)明的激活物多肽還可包含對于具體啟動子的轉錄激活所需要的其它DNA結合蛋白(如，噬菌體T3 RNA聚合酶)。另外，一種蛋白的結合區(qū)可融合于另一蛋白的轉錄激活區(qū)。這種嵌合蛋白的一個實例是tetR/Vp16轉錄激活物，在綜述中描述，高森等，生物技術動向，1258-62(1994)。其它嵌合轉錄激活物的實例包括lex A(結合區(qū))/Ga14轉錄激活物。布侖特和帕仲等人描述，Cell，43729- 736(1985)和Ga14/Vp16(蓋瑞等，分子生物學雜志209423-432，1989；克瑞斯等，科學，25187-90，1991；塞都斯基等.，自然，335563-564，1988)。
轉錄激活物也可用于本發(fā)明中。指導病毒基因高度表達的前導序列及其特定翻譯激活物特別有用。一個實例是花椰菜花葉病毒翻譯激活物(TAV)，福徹和洪描述，EMBO J.，103887-3896(1991)。在這種系統(tǒng)中，可構建編碼雙順反子信息的pms基因，其中，比如，第一個順反子可以是可選擇標記基因而第二個順反子可以是質體致死性基因，兩者在來自相同啟動子的相同mRNA中轉錄?？蛇x擇標記mRNA的翻譯在未加入其它成分下發(fā)生；然而，質體致死性mRNA只在TAV存在下才被翻譯。
C.用于“花粉殺滅”方法的雄性可育性基因恢復系rmf基因產(chǎn)物可阻止nms基因在數(shù)個位點任意之一作用，包括，但不限于(1)在質體中在pms基因處，例如通過阻礙質體毒性pms基因的轉錄或翻譯，或通過使被nms編碼的阻遏物滅活的重要pms基因去抑制；(2)在質體中，但不必在pms基因處，通過阻礙或破壞成熟調節(jié)物多肽；(3)在細胞質中，通過在前體調節(jié)物多肽轉位入葉綠體阻斷或破壞之；和(4)在細胞質或核中，通過阻礙nms基因的表達(例如，通過轉錄或翻譯阻遏物)。
本發(fā)明的rmf基因包含至少一種編碼恢復系基因產(chǎn)物的編碼區(qū)，可操作地連接至適當?shù)?’和3’調節(jié)序列，以便從核基因組表達。需要包括在rmf基因的調節(jié)序列取決于rmf基因產(chǎn)物被設計用來阻礙的調節(jié)物多肽作用點，如上所述。
rmf基因產(chǎn)物的花藥特異性對本發(fā)明的實際不是絕對必要的；rmf基因可在其它組織中表達，只要它也在表達nms基因的花藥組織中表達。然而，花藥特異性對本發(fā)明實踐來說是優(yōu)選的，因為rmf基因在整個植物中系統(tǒng)表達可產(chǎn)生毒性作用，這種毒性作用在涉及在宿主細胞中表達外來基因時經(jīng)?？捎^察到。而且，將強的花藥特異性啟動子包括在rmf中，優(yōu)選與用于nms基因者相同或類似的啟動子，將保證rmf基因的強表達并在nms基因也被表達的位點產(chǎn)生rmf基因產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的rmf基因包含可操作地連接于花藥特異性啟動子的恢復多肽編碼區(qū)，如上文描述的用于nms基因者。
rmf基因也可包含其它調節(jié)信號。例如，植物核翻譯共有序列也可包括在構建物中，以及用于終止植物核基因轉錄和翻譯的合適信號。
如果rmf基因產(chǎn)物是質體基質區(qū)域指定的恢復系多肽，則rmf基因的編碼區(qū)必須連接于編碼質體基質運送肽的DNA序列，如上文中關于nms基因描述的前-ss運送肽。編碼其它將蛋白轉位至質體基質的運送肽的DNA序列在本領域中也是公知的并可用于本發(fā)明這方面的實踐中。
在“花粉殺滅”方法的優(yōu)選實施方案中，rmf基因編碼一種質體指導的多肽，此多肽進入質體并通過對pms基因產(chǎn)生壓倒性的相反調節(jié)而阻礙nms編碼的調節(jié)物多肽的作用。此實施方案通過編碼質體指導的lac阻遏物多肽的rmf基因舉例說明。pms基因包含一個位于相對于可激活靶核核苷酸序列的lac阻遏物結合位點和pms編碼區(qū)，因而lac阻遏物的結合抑制pms基因的轉錄，而不管nms-編碼的激活物多肽的存在(如，T7 RNA聚合酶)。
如上所述，多種轉錄和翻譯抑制系統(tǒng)在本領域中是公知的。這些其它阻遏物蛋白也可被用作rmf編碼的恢復系多肽。另外，包含帶有得自另一種多肽的阻遏物區(qū)的得自一種多肽的DNA結合區(qū)嵌合蛋白也可以應用，如上面說明激活物多肽時所述。
在使用質體指導的恢復系多肽的其它實施方案中，恢復系多肽可為能夠特異地結合于調節(jié)因子多肽從而阻止其對pms基因的作用的蛋白，如質體指導的免疫球蛋白或其片段，或其它與本領域中公知的阻遏物激活物系統(tǒng)有關的特異性配基(如，產(chǎn)生結合于阻遏物并使之變?yōu)闊o活性的小分子誘導物的酶)。
在另一項實施方案中，可用于“花粉殺滅”或“花粉饑餓”方法，rmf基因編碼阻止nms編碼的調節(jié)物多肽前體進入質體的一種細胞質多肽?？捎糜诖藢嵤┓桨傅牡鞍装ǎ幌抻?，對前體調節(jié)物多肽特異性的免疫球蛋白或其片段，和能夠特異性地作用于前體調節(jié)物多肽并使之不能穿過質體膜的蛋白酶或其它蛋白修飾酶，或阻止nms編碼的mRNA翻譯的翻譯終止子。
在另一項實施方案中，rmf基因編碼一種以核為靶的多肽，如轉錄或翻譯阻遏物，能夠進入核并阻止nms基因的表達。為實踐本發(fā)明的該實施方案，nms基因應包含一個rmf編碼的阻遏物的阻遏物結合位點。關于此實施方案，應指出，包括植物細胞核在內的真核生物細胞核包含一系列蛋白，這些蛋白在細胞質中合成開通過包含在這些蛋白中的氨基酸信號序列的操作而轉位至核中。這種使靶蛋白進入核的定位信號在本領域中是公知的。見霍爾等，Cell，361057-1065(1984)(描述通過得自酵母MAT alpha 2基因的核定位序列使細胞β-半乳糖苷酶定位于酵母核)。
II. 花粉饑餓”方法在另一項在本文中稱為“花粉饑餓”的實施方案中，pms基因是對質體生存至關重要的天然質體基因的同源物，它是活性的但被改變?yōu)椴豢杉せ畹?即，可阻遏的)。天然質體基因通過同源重組被經(jīng)改變的pms基因置換，因而穩(wěn)定地質體轉化的植物只含基因的經(jīng)改變形式。本實施方案中的nms基因是編碼質體指導的滅活多肽的花藥特異性基因。此種滅活多肽能進入質體并阻斷重要pms基因的表達從而滅活或殺滅選擇的花藥組織的質體。B親本的rmf基因再次編碼一種能夠妨礙滅活多肽的作用從而使重要pms基因能保持活性的“恢復系”基因產(chǎn)物。在優(yōu)選實施方案中，rmf基因編碼能進入核并妨礙nms基因核指導多肽。在另一實施方案中，rmf基因編碼一種能妨礙編碼滅活多肽的mRNA翻譯或前體向質體中的轉位的細胞質基因產(chǎn)物。
“花粉饑餓”方法通過下述系統(tǒng)舉例說明，該系統(tǒng)使用以質體為靶的lac阻遏物作為滅活多肽，以核為靶的tet阻遏物作為rmf基因產(chǎn)物，和可操作地連接于為其在質體中的表達所需要的必不可少的5’和3’調節(jié)序列的重要質體基因，在至少一種lac阻遏物結合位點的控制下。
在此實施方案中，AN親本系表達一種從質體為靶的lac抑制多肽，AP親本系含有質體中活性改變的pms基因，并且由于lac阻遏物結合于lac結合位點阻止了重要pms基因的表達，因而ANXAP的子代是細胞質雄性不育的。為在此實施方案中產(chǎn)生雄性可育性雜種，AS親本與BR親本雜交。此BR親本表達rmf基因，一種以核為靶的tet阻遏物。
tet抑制系統(tǒng)在植物中應被證實是特別有效的，因為已顯示在轉基因煙草中四環(huán)素阻遏物可抑制從含有3個tet抑制結合位點緊鄰啟動子TATA盒的花椰菜花葉病毒的轉錄。此抑制作用被四環(huán)素逆轉成為數(shù)百倍的調節(jié)因子，(蓋茨等，Plant J.，2397-402，1992；蓋茨和Guail，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851394-1397，1988)。
上面描述的四環(huán)素阻遏物也可在本發(fā)明的“花粉饑餓”方法中用作nms基因產(chǎn)物。在此實施方案中，滅活多肽包含以質體為靶的tet阻遏物。pms基因位于相對于內在的5’和3’調節(jié)區(qū)的至少一種tet阻遏物結合位點，從而tet阻遏物的結合阻斷pms基因的表達。如上所述，通過用編碼另一種以核為靶的阻遏物，如lac阻遏物或一種不同的ret阻遏物的rmf基因轉化B親本系，雄性可育性在雜合子中被恢復。應指出以質體為靶的阻遏物和以核為靶的阻遏物可選自兩種不同的阻遏物族，如上文所述(以質體為靶的lac阻遏物和以核為靶的tet阻遏物，或反過來)。本方法還可使用通過翻譯融合于以質體為靶的序列或以核為靶的序列的相同阻遏物進行實踐。然而，使用兩種不同的阻遏物優(yōu)選用于本發(fā)明的實踐。
A.用于“花粉饑餓”方法的質體雄性不育性基因在本發(fā)明的“花粉饑餓”方法中，一種重要的質體基因被經(jīng)修飾變?yōu)椴豢杉せ畹耐椿蛑脫Q。經(jīng)修飾的基因通過同源重組穩(wěn)定地整合質體基因組中。用于本發(fā)明此項實施方案的重要質體基因包括核糖體RNA操縱子，rps16核糖體蛋白基因，trnV基因和rpo B基因。因為在此情況下pms基因以活性形式被導入質體，pms基因必須還包含對于pms基因在質體中表達所需要的天然質體啟動子和其它調節(jié)序列。
在優(yōu)選的實施方案中，pms基因包含上文描述的lac抑制結合位點。該抑制位點位于相對于控制pms基因轉錄的天然質體啟動子序列處，因而lac阻遏物的結合抑制重要基因的轉錄，從而導致質體失活或死亡。通過一種阻斷以質體為靶的滅活多肽在核或細胞質中的合成的機制可恢復可育性。在本發(fā)明的此項實施方案中有用的其它抑制結合位點包括，但不限于，tet阻遏物結合位點，Lex A結合位點(Brent&Ptashue，Cell，43729-736，1985)，和Gal 4結合位點。
B.用于“花粉饑餓”方法的核雄性不育性基因在“花粉饑餓”方法中，nms基因編碼阻止重要pms基因在質體中表達的以質體為靶的“滅活”多肽。滅活多肽可包含轉錄或翻譯阻遏物，其眾多實例在本領域中是公知的。在優(yōu)選實施方案中，lac阻遏物蛋白由nms基因編碼。該蛋白進入葉綠體并結合于lac阻遏物結合位點，以如此方式連接于pms基因，使抑制蛋白對結合位點的結合抑制pms基因的轉錄，從而引起質體死亡。
其它可用于本發(fā)明實踐的轉錄阻遏物蛋白包括，但不限于，上文描述的tet阻遏物。也可使用包含來自一種多肽的DNA結合區(qū)和來自另一種多肽的阻物區(qū)的嵌合蛋白，如上文為激活物多肽所述。
C.用于“花粉饑餓”方法的雄性可育性基因恢復系如上所述，rmf基因產(chǎn)物可阻止在nms基因表達和nms編碼的多肽對pms基因的作用之間數(shù)點的任何一點上nms基因的作用。本發(fā)明的雄性可育性基因恢復系包含至少一種編碼恢復系基因產(chǎn)物的編碼區(qū)，可操作地連接于適當?shù)?’和3’調節(jié)序列以供從核基因組的表達。需要包括在rmf基因中的調節(jié)序列取決于調節(jié)物多肽的作用位點，rmf基因被設計為在此位點進行阻斷，如上所述。
如前所述，rmf基因產(chǎn)物的花藥特異性不是絕對必須的，但在本發(fā)明實踐中是優(yōu)選的。相應地，rmf基因包含可操作地連接于花藥特異性啟動子的恢復多肽編碼區(qū)，如上文為nms基因所描述的那些。
rmf基因也可包含其它調節(jié)信號。例如，植物核轉錄共有序列也可包括在構建物中，以及終止植物核基因轉錄和翻譯的合適信號。
在“花粉饑餓”方法特別優(yōu)選的實施方案中，rmf基因編碼一種以核為靶的多肽，如一種轉錄阻遏物，它能夠進入核并阻止nms基因表達。為實施本發(fā)明的此實施方案，nms基因應包含rmf編碼的阻遏物的阻遏物結合位點。與此實施方案有關，應指出真核細胞核，包括植物細胞核，包括一套蛋白，這些蛋白在細胞質中合成開通過包含在那些蛋白中的信號序列的操縱轉位至細胞核。這種使蛋白定位在核的定位信號在本領域中是公知的，見，如Hall等，Cell，361057-1065(1984)(描述通過得自酵母MAT alpha 2基因的核定位序列使細菌β-半乳糖苷酶定位至酵母核)。
在另一實施方案中，rmf基因編碼阻止nms編碼的調節(jié)物多肽前體進入質體的一種細胞質多肽?？捎糜诖藢嵤┓桨傅牡鞍装?，但不限于，對前體調節(jié)物多肽特異的免疫球蛋白或其片段，和能夠特異地作用于前體調節(jié)物多肽并使之不能穿過質體膜的蛋白酶或其它蛋白修飾酶，或阻止nms編碼的mRNA翻譯的翻譯終止子。
在妨礙nms基因表達的實施方案中，本領域技術人員會懂得rmf基因可編碼一種能阻止nms基因或mRNA轉錄或翻譯的RNA分子。這種mRNA可為能特異性地結合于nms基因或mRNA的關鍵區(qū)的反義寡核苷酸。另外，RNA分子可為能結合至nms編碼的mRNA上的選定區(qū)從而剪切mRNA分子并阻止其翻譯的核糖酶。
本發(fā)明的轉基因CMS種子生產(chǎn)系統(tǒng)在構建物上類似于自然發(fā)生的和常規(guī)的基于CMS的系統(tǒng)。但是本發(fā)明的系統(tǒng)比那些系統(tǒng)具有顯著的優(yōu)越性，在于它們用在DNA序列水平完全確定的元件裝配和使用質體而不是線粒體作為細胞質雄性不育性的基礎。與線粒體和線粒體基因組相反，質體基因組已被很好地確定性質，而且質體的遺傳學操縱方法比線粒體者發(fā)展得好很多。因而，本發(fā)明的基于質體的CMS系統(tǒng)基本沒有與基于線粒體的CMS系統(tǒng)相聯(lián)系的不可預測的有害特性，并可應用于任何可接受核或質體轉化技術的作物。當這種轉化技術繼續(xù)擴展而包括新作物種類時，本發(fā)明的新CMS方法可應用于那些作物。因此，本發(fā)明的系統(tǒng)將使雜種種子生產(chǎn)更降低成本并能在作物中產(chǎn)生那些迄今尚無切實可行的雜種種子生產(chǎn)方法的雜種。這些作用包括美國的主要農藝學作物，包括小麥和棉花。
下述實施例為更詳細地描述本發(fā)明而提供。這些實施例意在闡明而不限制本發(fā)明。
實施例1質體雄性不育性的花粉殺滅方法Kpms質體雄性不育性基因本發(fā)明的“花粉殺滅”方法用圖顯于圖1。在“花粉殺滅”方法的優(yōu)選實施方案中，質體“殺滅”基因(Kpms)從含有T7噬菌體基因10啟動子和lac I操縱基因的被調節(jié)的T7/lac啟動子表達，從而轉錄可被lac阻遏物阻斷(Studier等，1990，上文；Dubendorf&Studier，1991，上文)。顯示于圖3的啟動子序列從pET21d表達質體(Novagen)修飾而來。關于圖3，PT7lac1具有未翻譯的基因10前導序列，包括核糖體結合位點(RBS)。PT7lac2具有質體rbc L基因的前導序列和RBS。兩種啟動子以可比的效率被轉錄。但是具有基因10前導序列的mRNAs比含有rbc L前導序列的mRNAs的翻譯效率高200倍。在“花粉殺滅”方法中低水平翻譯是優(yōu)選的，以阻止得自來自外來啟動子的任何低水平轉錄的毒性基因產(chǎn)物的致死性積累。這種罕見轉錄本，如果被有效地翻譯，將對非靶組織具有不利效應。
為穩(wěn)定mRNA，將Kpms基因編碼區(qū)連接至經(jīng)修飾的T7基因10終止子(TT7)，或至終止子Trps 16 T7，它包含前后排列的質體rps16核糖體蛋白基因3’尾隨序列和T7基因10終止子。
適合阻斷質體功能的毒性基因在上面列于詳細詳述中。為在盒中方便的表達，Kpms基因應具有(i)一個NcoI限制性位點，包括翻譯起始密碼子(ATG)和(ii)緊接在編碼區(qū)下游的Xba I位點。然而，本領域中公知其它克隆策略也可應用。
為盡量減小來自外來啟動子的新來的轉錄本的可能性，應將Kpms基因整合質體基因組的轉錄沉默區(qū)。最適位置在trnV和ORF 70B基因之間，指導殺滅基因向rps12/7操縱子方向的轉錄，如圖4中標為“PC8”的插入載體所圖示。質體轉化體的轉化和選擇用常規(guī)方法進行(Svab和Maliga，1993，上文)。
實施例2質體雄性不育性的花粉殺滅方法Knms核雄性不育性基因質體雄性不育性的“花粉殺滅”方法依賴于Kpms質體基因在絨氈層細胞中的轉錄。該策略的成功取決于(1)編碼T7 RNA聚合酶的Knms基因表達的發(fā)育定時和組織特異性和(ii)被編碼的多肽以質體為靶。
Knms基因的發(fā)育定時通過使用絨氈層特異性或微孢子特異性啟動子獲得。適合此目的的是TA29啟動子，它在早期花藥發(fā)育中被短暫地轉錄。TA29啟動子已被用于通過表達嵌合核糖核酸酶獲得絨氈層特異性基因表達和隨后的雄性不育性(Mariani等，1990，上文)。其它適合表達核nms基因的已進行特征描述的花藥特異性啟動子可得自數(shù)種來源(見Goldberg等綜述.，植物細胞，51217-1229，1993)。
關于圖5，Knms基因中的T7 RNA聚合酶編碼區(qū)經(jīng)翻譯與核編碼的葉綠體蛋白的運送肽即RuBisCo的小亞單位(SSU)融合。當Knms基因在核中表達時，運送肽使蛋白以質體為靶。在進入質體前，運送肽從T7前蛋白(pre T7 RNAP)上被剪切以產(chǎn)生無任何附加氨基酸的T7RNA聚合酶(T7 RNAP)。編碼SSU運送肽和T7蛋白融合結合部的DNA序列也顯示于圖5(上文)。在第2基因中的pre T7aRNAP(圖5，下面的序列)在質體中被加工為T7aRNAP。T7aRNAP含有成熟SSU的5個氨基酸。在這兩種基因中編碼的蛋白就它們被送運進入的特性而言可以不同，并可用于獲得以不同水平積累T7 RNA聚合酶的轉基因植物。
表達T7 RNA聚合酶的植物不具有與眾不同的表型。為易化攜帶Knms的植物的鑒定，將該基因連接至土壤桿菌屬雙元載體(例如pBI121載體質體(lonetech)中的可選擇性卡那霉素抗性基因。替代地，將攜帶Knms基因的質體與攜帶可選擇卡那霉素抗性基因的質體混合如，質體pLGCneo 1103(Czernylowski等，DNA，5101-103，1986)或質體pFF 19K(Timmermans等，1990，上文)。用混合的DNA進行Biolistic轉化，隨后進行卡那霉素抗性性選擇，被用于在同一遺傳學座位獲得兩種基因的同時整合?？敲顾乜剐孕院蚑7聚合酶基因的共分離證實兩種基因在相同遺傳學座位被整合。
實施例3質體雄性不育性的花粉殺滅方法雄性可育性的Krmf核恢復系質體雄性不育性是攜帶質體Kpms和核Knms基因兩者的植物的表型。雄性可育性的恢復取決于第二種核基因Krmf的存在，該可育性恢復系優(yōu)選用于“花粉殺滅”型質體雄性不育。Krmf通過阻斷質體Kpms基因的表達施加其影響(圖1)。這種調節(jié)通過Kpms基因啟動子區(qū)介導。
圖3中顯示的PT7lac1和PT7lac2啟動子可被調節(jié)(i)正性地，通過以質體為靶的T7 RNA聚合酶(見上文)和(ii)負性地，通過lac阻遏物。雄性可育性的恢復取決于質體中存在的lac阻遏物濃度足以阻斷Knms基因產(chǎn)物的表達。
Krmf基因在核雄性不育性基因Knms的表達之前或表達過程中表達對雄性不育的完全恢復是重要的。達到這一點最簡單有效的方法是通過表達來自組成型的啟動子的編碼的lac阻遏物蛋白，如在構建物物PTS24中的花藥盒包含的花椰菜花葉病毒35S啟動子(Van der Meer等，Plant Cell，4253-262，1992)。另外，轉錄可受在Knms基因表達前被激活的花藥特異性基因的啟動子指導。適合驅動核恢復系基因表達的已被描述特征的花藥特異性啟動子可從數(shù)種來源獲得，如上文Goldberg等，1993，綜述。另外，使用相同(TA29)啟動子表達不育性誘導和可育性恢復兩種轉基因恢復核雄性不育也容易(瑪拉尼等，1992)。
為使lac阻遏物以質體為靶，將它融合至RuBisCo小亞單位運送肽。基因設計，關鍵運送肽和lacI編碼區(qū)融合的DNA和蛋白序列顯示于圖6，并且如上文關于Knms基因所討論的。應指出圖6的圖解顯示從一個組成型的組織非特異性啟動子，P35S的表達(蒂莫曼等，1990，上文)。然而，對于花藥特異性表達，應使用花藥盒包含衍生物(如，PTS24，Van den Meer等，1992，上文)。
當被導入核基因組時，Krmf基因被連接在嵌合aacC1基因中編碼的可選擇性慶大霉素抗性標記(Carrer等，Plant Mol.Biol.17301-303，1991)。轉化的方法與Knms基因轉化方法一致。連接于Krmf基因的慶大霉素抗性基因易于與連接于Knms的卡那霉素抗性基因區(qū)分，也易于與連接于質體Kpms基因的壯觀霉素抗性基因區(qū)分。
實施例4質體雄性不育性花粉饑餓方法Spms質體雄性不育基因由于需要完整細胞器以維持氨基酸和脂質生物合成，因此在質體中去除蛋白合成導致細胞死亡。因此，阻斷質體維持所需的基因表達也可用于去除絨氈層細胞或小孢子。
“花粉饑餓”方法的質體雄性不育性基因(Spms)是從帶有參入的lac阻遏物結合位點的嵌合質體啟動子表達的內源性質體基因。這些在體細胞中的啟動子通過質體RNA聚合酶轉錄。但是，質體基因在絨氈層細胞中的表達被lac阻遏物所阻止，此lac阻遏物被工程化為只在絨氈層，小孢子或其它花藥細胞中表達。rRNA操縱子是“花粉饑餓”方法中優(yōu)選的用于阻遏的靶。帶有l(wèi)ac操縱序列的經(jīng)修飾的rRNA操縱子啟動子和trnV基因啟動子顯示于圖7。這些啟動子被用于通過同源重組置換同源的內源性基因啟動子。為蛋白表達修飾的rRNA操縱子啟動子衍生物顯示于圖8。兩種啟動子前導序列(核糖體結合位點)不同。兩種啟動子中，mRNAs帶有基因10前導序列者更易于更有效地被翻譯。
內源性基因啟動子通過連接于可選擇壯觀霉素抗性(aadA)基因用Spms啟動子置換(Maliga等，1993)。Spms基因在除絨氈層細胞外所有組織中被質體RNA聚合酶轉錄，在絨氈層細胞中從Snms基因產(chǎn)生以質體為靶的lac阻遏物。以質體為靶的lac阻遏物阻斷從Spms啟動子的轉錄，從而引起細胞死亡。
實施例5質體雄性不育的花粉饑餓方法Snms核雄性不育基因如實施例4中所述，“花粉饑餓”方法中花粉雄性不育通過阻斷內源性質體基因的轉錄而獲得。缺乏轉錄是因為lac阻遏物在質體中積累，以及l(fā)ac阻遏物結合于Spms基因的嵌合啟動子中的lac操縱序列。lac阻遏物的組織特異性表達是通過使用花藥特異性啟動子獲得的，如關于Knms基因所述(實施例2)。然而Snms啟動子對四環(huán)素(tet)阻遏物敏感，因而Snms基因的表達可被編碼以核為靶的tet阻遏物的Srmf基因抑制(見實施例6)。Snms基因被遺傳學地連接于卡那霉素抗性標記，如關于Knms基因所述(實施例2)。
實施例6質體雄性不育性的花粉饑餓方法Srmf核雄性不育基因雄性可育性的恢復需要恢復絨氈層細胞質體中Spms基因的正常活性。這一點可通過阻斷核Snms基因的表達而最佳地獲得。Snms基因從花粉特異性啟動子表達，它也含有數(shù)拷貝的19bp pallindromic tet操縱基因。該系統(tǒng)的可育性恢復系基因，Srmf，編碼以核為靶的tet阻遏物，下調Snms基因的表達500倍。此系統(tǒng)已由Gatz等描述，Plant，J.，2397-404(1992)。Srmf基因連接于慶大霉素抗性基因從而它很容易區(qū)別于攜帶Spms基因(連接于壯觀霉素抗性性)和Snms基因(連接于卡那霉素抗性性)的植物。
權利要求
1.一種產(chǎn)生細胞質雄性不育性植物的方法，所述方法包括a)提供一種親本植物系；b)通過用質體雄性不育性基因穩(wěn)定轉化所述親本植物系細胞中的質體并從其再生質體轉基因植物，從所述親本植物系產(chǎn)生質體轉基因親本植物，所述質體雄性不育基因能被一種核編碼的質體指導的調節(jié)物多肽調節(jié)，在花藥組織中的所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞；c)通過用核雄性不育性基因穩(wěn)定轉化所述親本植物系細胞中的核并從其再生核轉基因植物，從所述親本植物系產(chǎn)生核轉基因親本植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地連接于編碼所述質體指導的調節(jié)物多肽的編碼核苷酸序列的花藥特異性5’調節(jié)核苷酸序列，該質體指導的調節(jié)物多肽能進入質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因；和d)用所述核轉基因植物與所述質體轉基因植物雜交以產(chǎn)生一種植物，在此植物中所述質體指導的調節(jié)物多肽是花藥特異地產(chǎn)生的，該多肽進入所述花藥細胞的經(jīng)轉化質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因，所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞，從而產(chǎn)生所述細胞質雄性不育性植物。
2.按照權利要求1的方法，其中所述花藥特異性5’調節(jié)核苷酸序列選自含絨氈層特異性啟動子和小孢子特異性啟動子。
3.按照權利要求1的方法，其中a)所述質體雄性不育性基因包含用于激活基因表達的靶核苷酸序列，可操作地與編碼當其在花藥細胞質體中表達時能破壞所述活性花粉形成的基因產(chǎn)物的編碼核苷酸序列連接；和b)所述核雄性不育性基因編碼質體指導的激活物多肽，它進入質體并與所述靶核苷酸序列特異性地相互作用，所述相互作用引起所述質體雄性不育性基因的表達。
4.按照權利要求3的方法，其中所述質體雄性不育性基因編碼RNA。
5.按照權利要求4的方法，其中所述RNA選自反義RNA和核糖酶。
6.按照權利要求3的方法，其中所述質體雄性不育性基因編碼一種多肽。
7.按照權利要求6的方法，其中所述多肽選自DNA酶，RNA酶，蛋白水解酶重組酶和跨膜孔形成多肽。
8.按照權利要求3的方法，其中所述質體指導的激活物多肽包含轉錄激活物并且所述靶核苷酸序列包含所述轉錄激活物與之結合的調節(jié)區(qū)。
9.按照權利要求8的方法，其中所述轉錄激活物是一種聚合酶。
10.按照權利要求9的方法，其中所述聚合酶是T7RNA聚合酶并且所述靶核苷酸序列包含T7啟動子。
11.按照權利要求8的方法，其中所述轉錄激活物是包含一個DNA結合域和一個激活物域的一種嵌合蛋白。
12.按照權利要求3的方法，其中所述質體指導的激活物多肽包含翻譯激活物并且所述靶核苷酸序列包含所述翻譯激活物與之結合的調節(jié)區(qū)。
13.按照權利要求1的方法，其中a)所述質體雄性不育性基因包含阻止基因表達的靶核苷酸序列，它可操作地連接于必需質體基因，所述質體雄性不育性是以質體基因組為靶的基因，從而在轉化質體中必需質體植物基因的天然形式被所述質體雄性不育性基因置換，阻止在花藥細胞質體中能破壞所述活性花粉形成的所述質體雄性不育性基因的表達；和b)核雄性不育性基因編碼質體指導的滅活多肽，該滅活多肽可進入質體并與所述靶核苷酸序列特異性地相互作用以阻止基因表達，所述相互作用阻止所述質體雄性不育性基因的表達。
14.按照權利要求13的方法，其中所述必需質體基因選自核糖體RNA操縱子，16S核糖體蛋白基因，trnV基因和rpoB基因。
15.按照權利要求13的方法，其中所述質體指導的失活物多肽包含轉錄阻遏物并且所述靶核苷酸序列包含所述轉錄阻遏物與之結合的調節(jié)區(qū)。
16.按照權利要求15的方法，其中所述轉錄阻遏物是lac阻遏物并且所述靶核苷酸序列包含至少一種lac阻遏物結合位點。
17.按照權利要求1 3的方法，其中所述滅活多肽是包含DNA結合域和阻遏物域的嵌合蛋白。
18.按照權利要求13的方法，其中所述質體指導的滅活多肽包含翻譯阻遏物并且所述靶核苷酸序列包含所述翻譯阻遏物與之結合的調節(jié)區(qū)。
19.從兩種親本植物系產(chǎn)生雄性可育性雜種種子的方法，其中一種包含細胞質雄性不育性植物，所述方法包含a)從第一親本植物系產(chǎn)生細胞質雄性不育性植物，通過i)通過用質體雄性不育性基因穩(wěn)定轉化在所述親本植物系細胞中的質體并從其再生質體轉基因植物，從所述親本植物系產(chǎn)生質體轉基因親本植物，所述質體雄性不育性基因能被核編碼的質體指導的調節(jié)物多肽調節(jié)，在花藥組織中的所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞；ii)通過用核雄性不育性基因穩(wěn)定地轉化所述親本植物系細胞中的核并從其再生核轉基因植物，從所述親本植物系產(chǎn)生核轉基因親本植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地連接于編碼所述質體指導的調節(jié)物多肽的編碼核苷酸序列的花藥特異性5’調節(jié)核苷酸序列，所述調節(jié)物多肽能進入質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因；和iii)用所述質體轉基因植物與所述核轉基因植物雜交以產(chǎn)生一株植物，在此植物中所述質體指導的調節(jié)物多肽是花藥特異性地產(chǎn)生的，進入花藥細胞的所述轉化質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因，所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞，從而產(chǎn)生所述細胞質雄性不育性植物；b)通過用雄性可育性基因的恢復系穩(wěn)定轉化所述第二親本植物細胞中的核并從其再生一株植物而生產(chǎn)第二親本植物系的雄性可育性恢復系植物，所述雄性可育性基因的恢復系編碼一種恢復系基因產(chǎn)物，該產(chǎn)物能夠阻止所述質體雄性不育性基因受所述以質體為靶的調節(jié)物多肽的調節(jié)，從而使活性花粉能夠形成；和c)用所述細胞質雄性不育性植物與所述雄性可育性恢復系植物雜交以從所述兩種親本植物系產(chǎn)生雄性可育性雜種種子。
20.按照權利要求19的方法，其中a)所述質體雄性不育性基因包含具有供激活基因表達的位點和供阻止基因表達的位點的靶核苷酸序列，所述供阻止基因表達的位點處于相關于所述供激活基因表達的位點的控制位置，所述靶核苷酸序列可操作地連接于一種編碼核苷酸序列，此編碼核苷酸序列編碼一種當在花藥細胞質體中表達時能破壞所述活性花粉形成的基因產(chǎn)物；b)所述核雄性不育性基因編碼一種進入質體并特異性地與供激活基因表達的所述位點相互作用的質體指導的激活物多肽，所述相互作用引起所述質體雄性不育性基因的表達；和c)所述雄性可育性基因的恢復系編碼一種進入質體并特異性地與供阻止基因表達的所述位點相互作用的質體指導的恢復系多肽，所述相互作用阻止所述質體雄性不育性基因的表達。
21.按照權利要求20的方法，其中所述質體指導的激活物多肽包含一種轉錄激活物并且所述供基因表達的激活的位點包含一種所述轉錄激活物與之結合的調節(jié)區(qū)。
22.按照權利要求21的方法，其中所述轉錄激活物是T7 RNA聚合酶并且所述供激活基因表達的位點包含T7啟動子。
23.按照權利要求20的方法，其中所述質體指導的恢復系多肽包含轉錄阻遏物并且所述供阻止基因表達的位點包含轉錄阻遏物所與之結合的調節(jié)區(qū)。
24.按照權利要求23的方法，其中所述轉錄阻遏物是lac阻遏物并且所述供阻止基因表達的位點包含至少一種lac阻遏物結合位點。
25.按照權利要求19的方法，其中a)所述質體雄性不育性基因包含供阻止基因表達的第一靶核苷酸序列，可操作地連接于必需質體基因，所述質體雄性不育性基因以質體基因組為靶，從而轉化質體中所述必需質體基因的天然形式被所述質體雄性不育性基因置換，阻止所述質體雄性不育性基因在花藥細胞質體中的表達能夠破壞所述活性花粉的形成；b)所述核雄性不育性基因包含供阻止基因表達的第二靶核苷酸序列，可操作地連接于編碼進入質體并與所述供阻止基因表達的第一靶核苷酸序列相互作用的質體指導的失活物多肽編碼核苷酸序列，所述相互作用阻止所述質體雄性不育性基因的表達；和c)所述雄性可育性基因恢復系編碼一種進入核并與所述供阻止基因表達的第二靶核苷酸序列特異性地相互作用的核指導的恢復系多肽，所述相互作用阻止所述核雄性不育性基因的表達。
26.按照權利要求25的方法，其中所述質體指導的失活物多肽包含轉錄阻遏物并且所述第一靶核苷酸序列包含所述轉錄阻遏物結合的調節(jié)區(qū)。
27.按照權利要求26的方法，其中所述質體指導的轉錄阻遏物是lac阻遏物并且所述第一靶核苷酸序列包含至少一種lac阻遏物結合位點。
28.按照權利要求26的方法，其中所述質體指導的轉錄阻遏物是tet阻遏物并且所述第一靶核苷酸序列包含至少一種tet阻遏物結合位點。
29.按照權利要求25的方法，其中所述核指導的恢復系多肽包含轉錄阻遏物并且所述第二靶核苷酸序列包含所述轉錄阻遏物結合的調節(jié)區(qū)。
30.按照權利要求29的方法，其中所述轉錄阻遏物是tet阻遏物并且所述第二靶核苷酸序列包含至少一種tet阻遏物結合位點。
31.按照權利要求29的方法，其中所述轉錄阻遏物是lac阻遏物并且所述第二靶核苷酸序列包含至少一種lac阻遏物結合位點。
32.一種具有包括穩(wěn)定整合的質體雄性不育性基因的質體基因組的植物，這種質體雄性不育性基因能受核編碼的質體指導的調節(jié)物多肽調節(jié)，在花藥組織中的所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞。
33.按照權利要求32中要求的植物，其中所述質體雄性不育性基因包含具有供激活基因表達的位點和供阻止基因表達的位點的靶核苷酸序列，所述供阻止基因表達的位點位于相關于所述供激活基因表達的位點的控制位置，所述靶核苷酸序列可操作地連接于編碼一種基因產(chǎn)物的編碼核苷酸序列，該基因產(chǎn)物在花藥細胞質體中表達時能破壞活性花粉的形成。
34.按照權利要求33中要求的植物，其中所述靶核苷酸序列包含供激活基因表達的T7啟動子和至少一種供阻止基因表達的lac阻遏物。
35.按照權利要求32中要求的植物，其中所述雄性不育性基因包含供阻止基因表達的靶核苷酸序列，可操作地連接于必需質體基因，所述質體雄性不育性基因以質體基因組為靶，從而使所述轉化質體中所述必需質體基因的天然形式被所述質體雄性不育性基因置換，阻止在花藥細胞質體中所述質體植物雄性不育性基因的表達能破壞所述活性花粉的形成。
36.按照權利要求35中要求的植物，其中所述靶核苷酸序列包含至少一種lac阻遏物結合位點。
37.一種具有包括穩(wěn)定整合的核雄性不育性基因的核基因組的植物，該核雄性不育性基因包含具有可操作地連接于一種編碼能夠進入質體并調節(jié)質體雄性不育性基因的質體指導的調節(jié)因子多肽的，核苷酸序列的花藥特異性5’調節(jié)區(qū)的核苷酸序列，所述調節(jié)導致活性花粉形成的破壞。
38.按照權利要求37中要求的植物，其中所述核雄性不育性基因編碼進入質體并與包含供激活基因表達的靶核苷酸序列的質體雄性不育性基因特異性地相互作用的質體指導的激活物多肽，所述相互作用引起所述質體雄性不育性基因的表達，所述表達導致活性花粉形成的破壞。
39.按照權利要求38中要求的植物，其中所述激活物多肽是T7RNA聚合酶。
40.按照權利要求37中要求的植物，其中所述核雄性不育性基因進一步包含供阻止基因表達的靶核苷酸序列，可操作地連接于編碼質體指導的失活物多肽的核苷酸序列，該失活物多肽進入質體并特異性地與包含供阻止基因表達的另一靶核苷酸序列的質體雄性不育性基因相互作用，所述相互作用阻止所述質體雄性不育性基因的表達，所述表達的阻止導致活性花粉形成的破壞。
41.按照權利要求40中要求的植物，其中所述失活物多肽是lac阻遏物。
42.一種具有包含穩(wěn)定整合的雄性可育性基因恢復系的核基因組的植物，該雄性可育性基因編碼一種恢復系基因產(chǎn)物，該產(chǎn)物能夠阻止可調節(jié)質體雄性不育性基因受核編碼的質體指導的調節(jié)因子多肽的調節(jié)。
43.按照權利要求42中要求的植物，其中所述雄性可育性基因的恢復系編碼進入質體并與阻止基因表達的位點特異性相互作用的質體指導的恢復系多肽，可操作地置于質體雄性不育性基因中，所述相互作用阻止所述質體雄性不育性基因的表達。
44.按照權利要求43中要求的植物，其中所述恢復系多肽選自lac阻遏物和tet阻遏物。
45.按照權利要求42中要求的植物，其中所述雄性可育性基因恢復系編碼一種進入核并與供阻止基因表達的靶核苷酸序列特異性地相互作用的核指導的恢復系多肽，可操作地置于核雄性不育性基因中，所述相互作用阻止所述核雄性不育性基因的表達。
46.按照權利要求45中要求的植物，其中所述恢復系多肽選自tet阻遏物和lac阻遏物。
47.一種具有包含穩(wěn)定整合的質體雄性不育性基因的質體基因組的細胞質雄性不育性植物，該質體雄性不育性基因能被核編碼的質體指導的調節(jié)因子多肽調節(jié)，并具有包含穩(wěn)定整合的核雄性不育性基因的核基因組，該基因組包含具有與編碼質體指導調節(jié)物多肽的核苷酸序列可操作地相連的花藥特異性5’調節(jié)區(qū)的核苷酸序列，所述調節(jié)物多肽能夠進入質體，且調節(jié)多肽雄性不育性基因，所述調節(jié)導致活性花粉形成的破壞。
48.一種細胞質雄性不育性植物，通過下列方法產(chǎn)生，它包含a)提供一種親本植物系；b)通過用質體雄性不育性基因穩(wěn)定轉化所述親本植物系細胞中的質體并從其再生一株質體轉基因植物，從所述親本植物系生產(chǎn)質體轉基因親本植物，所述質體雄性不育性基因能被核編碼的質體指導的調節(jié)因子多肽調節(jié)，在花藥組織中的所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞；c)通過用核雄性不育性基因穩(wěn)定轉化所述親本植物系細胞中的核并從其再生一株核轉基因植物，從所述親本植物系生產(chǎn)核轉基因親本植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地連接于編碼所述質體指導的調節(jié)因子多肽的編碼核苷酸序列的花藥特異性5’調節(jié)核苷酸序列，該質體指導的調節(jié)因子多肽能進入質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因；和d)用所述核轉基因植物與所述質體轉基因植物雜交以產(chǎn)生一株植物，在該植物中所述質體指導的調節(jié)物多肽被花藥特異性地產(chǎn)生，進入花藥細胞的所述轉化質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因，所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞。
49.從兩種親本植物系產(chǎn)生的雄性可育性雜種種子，其中一種包含細胞質雄性不育性植物，使用的方法中包含a)從第一親本植物系產(chǎn)生細胞質雄性不育性植物，通過i)通過用質體雄性不育性基因穩(wěn)定轉化所述親本植物系細胞中的質體并從其再生質體轉基因植物，而從所述親本植物系產(chǎn)生質體轉基因親本植物，所述質體雄性不育性基因能被核編碼的質體指導的調節(jié)因子多肽調節(jié)，在花藥組織中的所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞；ii)通過用核雄性不育性基因穩(wěn)定轉化所述親本植物系細胞中的核并從其再生核轉基因植物而從所述親本植物系生產(chǎn)核轉基因植物，所述核雄性不育性基因包含可操作地連接于編碼所述質體指導的調節(jié)因子多肽的編碼核苷酸序列的花藥特異性5’調節(jié)核苷酸序列，該調節(jié)因子多肽能進入質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因，和iii)用所述核轉基因植物與所述質體轉基因植物雜交以產(chǎn)生一株植物，在該植物中所述質體指導的調節(jié)因子多肽被花藥特異性地產(chǎn)生，進入花藥細胞的所述轉化質體并調節(jié)所述質體雄性不育性基因，所述調節(jié)引起活性花粉形成的破壞，從而產(chǎn)生所述細胞質雄性不育性植物；b)通過用雄性可育性基因的恢復系穩(wěn)定轉化所述第二親本植物系細胞中的核產(chǎn)生第二親本植物系的雄性可育性恢復系植物，其中所述雄性可育性基因編碼一種能阻止所述質體雄性不育性基因被所述以質體為靶的調節(jié)物多肽調節(jié)的恢復系基因產(chǎn)物，從而使活性花粉不能形成，并從所述穩(wěn)定核轉化細胞再生一株植物；和c)用所述雄性可育性恢復系植物與所述細胞質雄性不育性植物雜交以從所述兩種親本植物系產(chǎn)生雄性可育性雜種種子。
全文摘要
本發(fā)明為植物提供一種細胞質雄性不育性(CMS)系統(tǒng)，它是基于對質體基因組的修飾。該CMS系統(tǒng)包含3種轉基因一種“質體雄性不育性”(pms)基因，受一種“核雄性不育性”(nms)基因調節(jié)和一種“雄性可育性恢復系”(rmf)基因。pms基因是一種編碼毒性基因產(chǎn)物的滅活基因或一種編碼必需基因產(chǎn)物的活性表達基因。nms基因受花藥特異性啟動子控制，并編碼調節(jié)pms基因的質體指導的多肽，這種調節(jié)是通過激活滅活的毒性pms基因的表達或通過抑制重要pms基因的表達，它引起花藥組織中質體和細胞失去能力或死亡，從而阻止活花粉的形成。rmf基因編碼阻止nms基因被pms基因調節(jié)的一種基因產(chǎn)物。細胞質雄性不育性植物通過用含pms基因的親本系與含nms基因的親本系雜交獲得。雄性不育性雜種種子從細胞質雄性不育性植物和含rmf基團的第二親本系間的雜交獲得。
文檔編號C12N5/00GK1148869SQ95193218
公開日1997年4月30日 申請日期1995年3月23日 優(yōu)先權日1994年3月24日
發(fā)明者P·馬力加 申請人:拉杰斯大學