專利名稱：鑒定雌激素受體－β/α選擇性調(diào)節(jié)劑的生物試驗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及激素的受體，更具體地說，涉及鑒定選擇性激活雌激素受體(ER)α或β亞型的化合物的方法，還涉及該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
調(diào)節(jié)基因表達的蛋白質(zhì)對于細胞的功能至關(guān)重要?；蛘{(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中研究較多的一個家族是甾體類激素受體超家族。這類受體蛋白質(zhì)通過激活或抑制特定基因使細胞對各種激素產(chǎn)生應答。該家族的成員之一是ER。一般認為雌激素是性別發(fā)育和生殖功能中的一類重要激素。眾所周知，雌激素在靶組織中通過靶細胞的ER結(jié)合影響細胞繁殖和分化。雌激素替代療法是預防和/或緩解絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的一種成熟療法(Sagraves，1995；Lobo，1995)，因為，已經(jīng)證明，這些化合物可預防婦女骨質(zhì)流失和骨折。此外，雌激素替代療法還與心血管疾病死亡率下降相關(guān)。最后，目前的研究表明，雌激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能有益，可改善認知和降低早老性癡呆發(fā)病率。
傳統(tǒng)ER(現(xiàn)在又稱ER-α)的調(diào)變結(jié)構(gòu)中具有不同的結(jié)構(gòu)域，參與配體結(jié)合、受體二聚化、DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活(Green等，1986)。其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列在甾體類激素受體中是保守的。Kuiper等(1996)曾利用這一相似性嘗試鑒定該家族的其他成員。他們所發(fā)現(xiàn)的這一新成員被認為是ER，因為DNA結(jié)合區(qū)域的氨基酸與ER-α的幾乎相同，體外翻譯的蛋白質(zhì)以納摩爾親合力特異性地結(jié)合[3H]-雌二醇，并能夠調(diào)節(jié)一種單純雌激素應答性元件引起的轉(zhuǎn)錄。為區(qū)別于先前已知的形式(現(xiàn)在稱ER-α)，將該蛋白質(zhì)稱為ER-β。已經(jīng)克隆了人和小鼠的ER-β(Bhat等，1988；Mosselman，1996；Pettersson等，1997；Tremblay等，1997)。發(fā)現(xiàn)ER-β后，大多數(shù)工作集中在對繪制其mRNA在正常和瘤形成性組織內(nèi)的分布圖，測定它與各種各樣配體的結(jié)合親合力，以及評估它與ER-α的相互作用。
RT-PCR和原位雜交技術(shù)可在多種組織中檢測到ER-βmRNA。雖然其分布與ER-α有重疊，但有些組織只表達一種類型的受體。例如，子宮、卵巢和垂體中兩種受體都有，而前列腺、肺和膀胱中ER-β看來占優(yōu)勢(Kuiper等，1996)。用原位雜交進行檢測可進一步發(fā)現(xiàn)兩種受體分布之間的區(qū)別。ER-βmRNA在大鼠前列腺的上皮細胞內(nèi)表達；ER-α則見于基質(zhì)區(qū)室中(Kuiper等，1996)。在大鼠卵巢中，ER-β出現(xiàn)于粒細胞內(nèi)，ER-α則出現(xiàn)于基質(zhì)中(Shughrue等，1996；私人通訊)。在大鼠下丘腦中，室旁區(qū)表達ER-β而不表達ER-α的信使，視葉前區(qū)則兩種信使都有(Shughrue等，1996)。令人感興趣的是，某些器官內(nèi)ER-β與ER-α的相對水平可能存在著顯著的種間差異。例如，ER-β的mRNA在大鼠前列腺中高表達，而在人前列腺中則較低。大鼠前列腺中的ER-β多于ER-α，而它們在小鼠前列腺中的相對水平則較為相等(Couse等，1997)。
曾有多個研究組鑒定了ER在腫瘤樣品和癌細胞系中的表達。大多數(shù)工作是在乳房中進行的，一項研究報道稱，用RT-PCT在40份乳房活檢組織樣品的70％中檢測到ER-βmRNA(Dotzlaw等，1996)。沒有人提到過ER-α和ER-β表達之間的關(guān)系。另一項研究也報道了ER-α/βmRNA表達在乳腺腫瘤標本中的異質(zhì)性，有些腫瘤只表達ER-αmRNA，另一些則表達兩種受體亞型的mRNA(Enmark等，1997)。在乳腺癌細胞系中，MDA MB231只含ER-βmRNA，關(guān)于MCF-7細胞的ER狀態(tài)也有與之相抵觸的報道(Enmark，1997；Kuiper等，1997；Vladusic等，1998；R.Henderson，尚未發(fā)表)。
雖然人ER-α與ER-β的配體結(jié)合區(qū)在氨基酸水平上的相同性為59％(Enmark，1997)，與17β-雌二醇的結(jié)合親合力卻十分接近。有些化合物對ER-α或ER-β具有明顯的選擇性。三羥異黃酮是一種植物性雌激素，與ER-β的結(jié)合親合力高約10-25倍(Kuiper，1996，H.Harris，尚待發(fā)表)。另一方面，雷洛昔芬與ER-α的結(jié)合比與ER-β強約20倍(H.Harris，尚待發(fā)表)。
當ER-α與ER-β共表達時，可用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶下降和凝膠電泳漂移/超漂移試驗等幾種方法來測定它們的相互作用(Cowley等，1997；Pettersson等，1997；Ogawa等，1998)。由于這兩種受體能夠異二聚化，雌激素對含有兩種受體的組織的作用可由ER-α與ER-β之間復雜的相互作用所介導。
在測定ER-β功能方面，一種有價值的工具是雌激素受體α敲除的(ERKO)小鼠(Lubahn等，1993)。因為這些小鼠沒有功能性ER-α，所以它們可幫助確定ER-α和ER-β的生理學作用。一項研究在野生型和ERKO小鼠中人為誘導頸動脈血管損傷，而后比較了17-β雌二醇處理緩解損傷的效果(Lafrati等，1997)。在兩種小鼠中，藥學劑量的17-β雌二醇都抑制了運載體處理動物的血管中層的面積擴大和平滑肌細胞增殖。對內(nèi)皮剝落的這些反應據(jù)認為可造成血管腔狹窄，從而限制血液流量。因為17-β雌二醇在野生型和ERKO小鼠中效果相當，所以，一種解釋是ER-α不是這種反應所必須的。因為在這些血管中也表達ER-βmRNA，所以可能是它介導了17-β雌二醇的作用。但缺乏支持這一假設(shè)的直接證據(jù)。最近報道了ERKO小鼠應答17-β雌二醇替代的另一實例(Pan等，1997，私人通訊)。該研究稱，CEKO小鼠在被摘除卵巢后發(fā)生股骨礦物質(zhì)密度丟失和骨小梁體積減小，用17-β雌二醇處理，這些參數(shù)上升(但二氫睪酮無此效果)。同樣，根據(jù)間接證據(jù)提出ER-β具有生理學功能。
因此，雖然已知ER-β某些方面的特性，但現(xiàn)有技術(shù)沒能提供鑒定功能上對ER-α或ER-β具有選擇性的配體的方法。這樣的鑒定試驗對于制藥業(yè)發(fā)現(xiàn)ER亞型的可能性治療性用途將是十分有利的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種方法，用于在受體結(jié)合試驗中篩選與ER結(jié)合的待測化合物，該方法檢測ER-β多肽介導的轉(zhuǎn)錄，所述方法包括以下步驟(a)提供一種細胞，它含有至少一段受雌激素誘導的編碼金屬硫蛋白(MT-II)的DNA序列和至少一段編碼ER-β多肽的DNA序列，所述受體具有轉(zhuǎn)錄活性；(b)使所述細胞與結(jié)合ER的待測化合物或?qū)φ战佑|；和(c)檢測MT-II的表達，所述MT-II表達增強，高于對照，表明所述待測化合物具有雌激素激動劑活性。
本發(fā)明還提供了一種方法，用于在受體結(jié)合試驗中篩選與ER結(jié)合的待測化合物，該方法檢測ER-β多肽介導的轉(zhuǎn)錄的抑制的抑制，所述方法包括以下步驟(a)提供一種細胞，它含有至少一段受雌激素誘導的編碼金屬硫蛋白(MT-II)的DNA序列和至少一段編碼ER-β多肽的DNA序列，所述受體具有轉(zhuǎn)錄活性；(b)在已知能結(jié)合ER的待測化合物存在下，使所述細胞與一種或多種雌激素接觸；和(c)檢測MT-II的表達，所述MT-II表達降低，低于單用一種或?qū)φ沾萍に靥幚?，表明所述待測化合物具有雌激素拮抗劑活性。
本發(fā)明還提供一種篩選待測化合物以鑒定候選藥物的方法，該候選藥物模擬雌激素對ER-α或ER-β所介導轉(zhuǎn)錄的作用，所述方法包括以下步驟(a)使待測化合物與以下物質(zhì)接觸(i)第一類細胞，其含有至少一段編碼金屬硫蛋白(MT-II)的DNA序列，和至少一段編碼ER-β多肽的DNA序列，所述受體具有轉(zhuǎn)錄活性；和(ii)第二類細胞，其含有ERE報道基因構(gòu)建物，該細胞表達ER-α多肽；(b)鑒定如下化合物該化合物增強第一類細胞中的MT-II表達，高于對照，但對第二類細胞中所述報道基因表達的作用極小，故認為該化合物具有ER-β選擇性；或(c)鑒定如下化合物它增強第二類細胞中所述報道基因的表達高于對照，但對第一類細胞中MT-II表達的作用極小，故認為該化合物具有ER-α選擇性。
最后，本發(fā)明提供了一種篩選待測化合物以鑒定候選藥物的方法，該候選藥物抑制雌激素對ER-α或ER-β介導的轉(zhuǎn)錄的作用，所述方法包括以下步驟(a)在沒有或有一種或多種雌激素存在下，使待測化合物與以下物質(zhì)接觸(i)第一類細胞，其含有至少一段編碼金屬硫蛋白(MT-II)基因的內(nèi)源性DNA序列，和編碼ER-β多肽的DNA序列，所述受體具有轉(zhuǎn)錄活性；和(ii)第二類細胞，其含有ERE報道基因構(gòu)建物，該細胞表達ER-α多肽；(b)鑒定如下化合物該化合物降低第一類細胞中的MT-II表達，低于單用一種或多種雌激素處理；但對第二類細胞中所述報道基因表達的作用極小，故認為該化合物具有ER-β選擇性；或(c)鑒定如下化合物它降低第二類細胞中的報道基因的表達，低于與單用一種或多種雌激素處理，但對第一類細胞中MT-II表達的作用極小，故認為該化合物具有ER-α選擇性。
附圖簡述

圖1Saos-2和LNCaPLN3細胞的ER-β和ER-α的RT-PCR擴增。
圖2分離擴增所得cDNA和17-β雌二醇上調(diào)片段6a的測序凝膠。
圖3(A)受調(diào)節(jié)片段的核苷酸序列，以及其與人MT-II的排列對比；(B)從第一甲硫氨酸至終止密碼子(*)的片段序列的翻譯。
圖4兩種細胞系內(nèi)MT-II的調(diào)節(jié)。為了測定mRNA的變化倍數(shù)，將MT-II信號歸一化成GAPDH，以此與對照細胞比較。
圖5Saos-2細胞內(nèi)17-β雌二醇調(diào)節(jié)MT-II的劑量反應。所顯示的是4個不同實驗的結(jié)果，顯示了各實驗的EC50。
圖6Saos-2細胞內(nèi)17-β雌二醇調(diào)節(jié)MT-II的時間進程。用GAPDH進行數(shù)據(jù)歸一化，根據(jù)零時刻運載體對照的數(shù)據(jù)計算出變化倍數(shù)。
圖7Saos-2細胞內(nèi)MT-II調(diào)節(jié)的受體特異性。
圖8各種化合物對Saos-2細胞內(nèi)MT-II的調(diào)節(jié)。
圖9放線菌酮處理的Saos-2細胞內(nèi)MT-II的調(diào)節(jié)。(A)放線菌酮處理期間，蛋白質(zhì)合成的測定。(B)放線菌酮處理后8小時的全細胞ER結(jié)合試驗。(C、D)處理8小時和24小時后MT-II的調(diào)節(jié)。
圖10大鼠前列腺內(nèi)雌激素對MT的調(diào)節(jié)。
圖11在大鼠前列腺內(nèi)誘導MT-II需要至少兩天的給藥。
圖12選擇性激活ER-β和/或ER-α的配體的篩選策略。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了一種有效篩選大量選擇性激活ERα或β亞型的待測化合物的方法。這些化合物可能具有的理想特性可用于治療或預防各種由雌激素介導的疾病，例如但不限于癌癥(例如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌)，子宮內(nèi)膜異位，骨質(zhì)疏松和心血管病，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。定義在本說明書和權(quán)利要求中，下列術(shù)語的定義如下“hERβL”是實施例1所述的人ER-β(cDNA或其翻譯所得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)。
“雌激素”指各種具有雌激素激動劑作用的配體。
“雌激素激動劑”指在標準的雌激素活性試驗(例如Webb等(1992)所述的細胞試驗)中能基本上模擬17-β雌二醇左右的化合物。
“雌激素拮抗劑”指在標準的雌激素活性試驗(例如Webb等(1992)所述的細胞試驗)中實質(zhì)性抑制雌激素激動劑作用的化合物。
“功能性ER”指根據(jù)RNA、蛋白質(zhì)和/或下游生物學活動中的變化所測定，能在轉(zhuǎn)錄水平激活內(nèi)源或轉(zhuǎn)染基因的受體。
“非功能性ER”指根據(jù)RNA、蛋白質(zhì)和/或下游生物學活動中的變化所測定，不能在轉(zhuǎn)錄水平激活內(nèi)源或轉(zhuǎn)染基因的受體。“待測化合物”包括但不限于具有潛在生物學活性的小分子化合物、肽、多肽、自然產(chǎn)物和毒素。
“配體”包括能與受體的相互作用的物質(zhì)。
“轉(zhuǎn)染”指將外源基因引入培養(yǎng)細胞的任何方法。
“報道物”指易于測定及容易與其他細胞組分相區(qū)別的物質(zhì)。報道物可以是轉(zhuǎn)染的受體DNA，轉(zhuǎn)錄的受體mRNA，酶，結(jié)合性蛋白質(zhì)或抗原。
“細胞”在此指能夠通過特定受體對信號傳導作出反應的細胞。
“受體結(jié)合試驗”指測定特異性結(jié)合受體的配體量的試驗。配體可以是放射性配體(例如，與3H或125I偶聯(lián)的配體)，熒光化配體(與熒光團偶聯(lián)或自身具有熒光)或可被測知的其他標記。試驗的描述本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)MT-II的表達受體配體與ER-β相互作用的選擇性調(diào)節(jié)。
在本發(fā)明方法中，對MT-II活性的調(diào)節(jié)可用于提供一種篩選系統(tǒng)，以選擇性檢測某配體與ER-β相互作用后雌激素激動劑或拮抗劑的功能活性。
該方法通常包括培養(yǎng)表達人功能性ER-β，而不表達(或少量表達)ERα的細胞。此類細胞包括但不限于Saos-2(ATCC HTB-85)和LNCaPLN3。適合本發(fā)明目的的優(yōu)選細胞包括過度表達ER-β的細胞，例如后文所述經(jīng)重組而過度表達ER-β的細胞?？梢愿鞣N方式修飾ER-β受體，例如長度修飾；這些修飾可能提高ER-β選擇性和增加該試驗的靈敏度。
熟練技術(shù)人員可以明白，可將各種含ER-β的重組構(gòu)建物與各種無功能性ERα的細胞或細胞系聯(lián)用。
為了在大量化合物中篩選雌激素激動劑活性，使表達ER-β的細胞與待測化合物或?qū)φ杖芤?用來溶解待測化合物)接觸?？墒辜毎诙嗫着囵B(yǎng)皿分開的各孔中或半固體營養(yǎng)基質(zhì)中生長時進行接觸。經(jīng)合適的時間處理后，測定MT-II mRNA。雌激素激動劑將提高MT-II mRNA，高于單用對照溶液的處理。
為了在大量化合物中篩選雌激素拮抗劑活性，在待測化合物存在或缺乏下，使表達ER-β的細胞與一種或多種雌激素接觸接觸?？墒辜毎诙嗫着囵B(yǎng)皿分開的各孔中或半固體營養(yǎng)基質(zhì)中生長時進行接觸。經(jīng)合適的時間處理后，測定MT-IImRNA。雌激素拮抗劑將降低MT-II mRNA，低于單用雌激素溶液的處理。
用本發(fā)明試驗鑒定的雌激素性或抗雌激素性化合物可用于治療癌癥的標準藥物組合物中，用作口服避孕藥的成分，或用于需要調(diào)節(jié)雌激素活性的其他用途。該藥物組合物的制備和給藥可采用本領(lǐng)域熟知的方法進行。該藥物組合物一般適合于非腸胃道、表面、口服或局部給予，用于預防和/或治療。該藥物組合物可以多種單位劑型形式給予，這取決于給藥方法。例如，適合口服的單位劑型包括粉劑、片劑、丸劑和膠囊。適合本發(fā)明使用的藥物劑型可參見Remington藥物科學，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa，第17版(1985)?？梢灾苽涠喾N含有本發(fā)明化合物以及藥學上有效載體的藥物組合物。
用途本發(fā)明方法和組合物可用來鑒定與ER-β相互作用從而激活或抑制其轉(zhuǎn)錄活性的化合物。這類化合物包括但不限于具有激動劑或拮抗劑作用的激活劑輔蛋白，雌激素及其他甾體，甾體樣分子，或非甾體樣分子。
可用無細胞或基于細胞的試驗來進行ER-β反應性化合物的鑒定。在一組實施例中，使純化的ER-β與一標記的配體(例如17-β雌二醇)接觸，在待測化合物存在下產(chǎn)生測試反應，在沒有待測化合物存在下產(chǎn)生對照反應。標記分子可以是放射性標記(例如3H或125I)或熒光分子。為了形成特異性結(jié)合，可在適宜條件下培育足夠長的時間，然后(通過檢測放射性、熒光或熒光極化作用)測定標記的配體與ER-β的結(jié)合。在實施例之一中，將大腸桿菌產(chǎn)生的ER-β的配體結(jié)合區(qū)吸附于微滴板的孔內(nèi)，在待測化合物缺乏或存在下與[3H]-17-β雌二醇共培育。也可以在沒有或有待測化合物存在下，將可溶性受體與標記的配體共培育，通過玻璃纖維濾膜過濾或用葡聚糖包裹的活性炭處理將結(jié)合的配體與游離配體相分離。
也可采用全細胞結(jié)合試驗，其中通過洗滌將結(jié)合的受體與游離受體相分離。用于此類試驗的細胞可以含有內(nèi)源性受體，或可在穩(wěn)定或臨時轉(zhuǎn)染或感染ER-βcDNA后過度表達該受體。合適的細胞包括但不限于COS細胞、HeLa細胞、CHO細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞和酵母。一旦某化合物因其結(jié)合活性而被鑒定為ER-β反應性化合物，則進一步通過體內(nèi)或體外試驗確定其活性的性能和程度，即，是激動劑還是拮抗劑(參見后文)。
也可以細胞試驗來鑒定ER-β反應性化合物，此類試驗測定內(nèi)源性或轉(zhuǎn)染的雌激素反應答性基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制。例如，激動劑(如17-β雌二醇)，可在表達ER-β的原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞中阻抑白介素-1β誘導產(chǎn)生內(nèi)源性E-選擇蛋白。拮抗劑(如ICI-182780)則阻抑17-β雌二醇的激動活性性。其他適宜的內(nèi)源性雌激素反應性啟動子元件包括但不限于調(diào)節(jié)內(nèi)皮肽-1(ET-1)的那些；HDL受體(II型清除受體)；和參與凝血和血纖蛋白溶解的酶(例如，血纖蛋白溶酶原活化劑的抑制劑-1和補體C3)。能對雌激素志反應的啟動子元件也可用作相應的靶，這包括NFkB結(jié)合位點，或載脂蛋白A1基因的增強子序列。
在一組實施例中，用一種編碼ER-β的表達載體轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞，在有或沒有待測化合物存在下，使轉(zhuǎn)染細胞不與或與一種或多種雌激素一起培育。通過測定轉(zhuǎn)錄活性來評價ER-β活性。這可以通過檢測mRNA(采用，例如Northern印跡分析，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應，RNase保護試驗)和/或蛋白質(zhì)(采用，例如免疫試驗或功能性試驗)來進行。如果靶序列的活化引發(fā)一種生物級聯(lián)反應，則也可以測定下游生物活動來定量測定ER-β活性。所鑒定的ER-β反應性化合物是對靶序列的活化具有積極或消極影響的那些化合物。
在另一組實施例中，用編碼ER-β的表達載體和一種報道質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞)，該報道質(zhì)粒含有位于一個或多個ERE下游的報道基因。在有或沒有待測化合物存在下，將轉(zhuǎn)染細胞不與或與一種或多種雌激素一起培育，然后通過測定該報道基因的表達來確定ER-β活性。在一優(yōu)選實施例中，通過目測來監(jiān)測ER-β活性。適宜的報道基因包括但不限于螢光素酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)和綠熒光蛋白。
較好的是，本發(fā)明方法適用于高產(chǎn)量的篩選，從而可在一次試驗中測試大量化合物。候選的雌激素和雌激素樣化合物包括但不限于二乙基己烯雌酚、三羥異黃酮和雌酮。其他ER-β反應性化合物可能存在于天然產(chǎn)物庫，發(fā)酵庫(包括植物和微生物)，組合庫，化合物檔案和合成化合物庫中。例如，合成化合物庫可購自Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)，Comgenex(Princeton，NJ)，BrandonAssociates(Merrimack，NH)和Microsource(New Milford，CT)。稀有化合物庫可購自AldrichChemical Company，Inc.(Milwaukee，WI)。細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物庫則可購自，例如，Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)，也不難制備。此外，用常規(guī)化學、物理和生物化學方法對天然及合成庫及化合物進行修飾(Blondelle等，1996)。本發(fā)明ER-β結(jié)合試驗的優(yōu)點在于可兼容多種不同類型的溶劑，因而可以測試多種來源的化合物。
可對用本發(fā)明方法鑒定為ER-β激動劑或拮抗劑的化合物進行修飾，以增強其在治療等應用中的強度、效力、吸收率、穩(wěn)定性和適宜性?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的方法進行這些修飾和測試。
實施例以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例通過參照具體實施方案僅用來說明本發(fā)明。這些例舉可以說明本發(fā)明的某些具體內(nèi)容，但不限定本發(fā)明的范圍。實施例1ER-β重組腺病毒的構(gòu)建按照待批的美國專利08/906,365(“新的人雌激素受體β”，1997年8月5日申請)和Bhat等(1998)所述得到人ER-β的編碼序列。主要包括將人睪丸聚A+RNA(1μg，Clontech，Palo Alto CA)與0.5μg寡dT引物(GIBCO-BRL，Gaithersburg MD)混合，總體積為10μl。該混合物在70℃加熱10分鐘，冰上冷卻后，在其中加入脫氧核苷三磷酸各500μM，1×cDNA合成緩沖液和10mM DTT，最終體積為20μl。該混合物在42℃孵育2.5分鐘，然后加入1-2單位逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO-BRL，GaithersburgMD)，然后在45℃孵育30分鐘，50℃孵育5分鐘。取1/10含有cDNA模板的此混合物進行ER-β的PCR擴增，正向和反向引物參見后文。
用申請08/906,365(同上)中設(shè)計的PCR引物擴增ER-β序列，反應物中包含以下組分2μl上述cDNA模板，1×PCR緩沖液，200μM各脫氧核苷三磷酸，2單位Hot Tub DNA聚合酶(Amersham，Arlington Heights IL)和正向和反向引物各1μg。反應混合物在95℃加熱2分鐘，52℃退火1分鐘，然后擴增36輪，接著72℃孵育1.5分鐘。
由此產(chǎn)生一段長約1500bp的片段。用HindIII和XbaI(分別在正向和反向引物內(nèi)的位點切斷，但在所擴增cDNA序列的主體內(nèi)沒有切點)消化該片段，克隆到pcDNA3表達載體(Invitrogen，Carlsbad CA)內(nèi)的相應位點。這一不對稱克隆策略使得ER-βcDNA的5′端位于pcDNA3內(nèi)病毒CMV啟動子的調(diào)控下。該克隆稱為“截短的hERβ”或hERβT。
為了驗證人ER-β的氨基末端和上游序列，可分別采用以下兩種方法。
(1)將10μl人卵巢5′-延伸段cDNA庫(Clontech，Palo Alto CA)與50μl 1×K溶液(1×PCR緩沖液(GIBCO-BRL，Gaithersburg MD)，2.5mM MgCl2，0.5％Tween-20，100μg/ml蛋白酶K)混合，該反應混合物在56℃加熱2小時，然后在99℃加熱10分鐘。取5μl反應混合物作為模板進行嵌套PCR，使用專利申請08/906,365(同上)中設(shè)計的PCR引物。該反應物包含1×Klentaq PCR反應緩沖液(40mM Tricine-KOH，15mMKOAc，3.5mM Mg(OAc)2，75μg/ml牛血清白蛋白)，dTNP各0.2μM，上述引物各0.2μM，和1單位Klentaq聚合酶混合物(Clontech，Palo Alto CA)。觸地PCR(Touchdown PCR)的條件如下94℃ 2秒，72℃ 4分鐘，5輪，然后94℃ 2秒，67℃ 3分鐘，30輪。
通過Wizard PCR柱(Promega，Madison WI)純化去除第一次PCR反應后的過量核苷酸和引物。然后用2μl純化的第一次反應混合物，用專利申請08/906,365(同上)中設(shè)計的PCR引物進行第二次PCR反應。PCR反應和循環(huán)條件與第一次相同。將產(chǎn)物克隆到pCR2.1(Invitrgen，Carlsbad CA)中，對所得的3個克隆進行測序。這3個克隆(L1、L2和L3)含有不同長度的ER-β插入片段，它們均與ER-β同源，而且彼此同源。
(2)將用于cDNA末端5′快速擴增(RACE)的Marathon Ready胸腺cDNA試劑盒(Clontech，Palo Alto CA)用于分離ER-β5′克隆。用5μl人胸腺Marathon-ReadycDNA(Clontech，Palo Alto CA)作為模板，用專利申請08/906,365(同上)中設(shè)計的引物進行第一次嵌套PCR反應。PCR反應及循環(huán)條件與(1)相同。
通過Wizard PCR柱(Promega，Madison WI)純化去除第一次PCR反應后的過量核苷酸和引物。然后用2μl純化的第一次反應混合物，用專利申請08/906,365(同上)中設(shè)計的PCR引物進行第二次PCR反應。PCR反應和循環(huán)條件與第一輪相同。將產(chǎn)物克隆到pCR2.1(Invitrgen，Carlsbad CA)中，對所得的2個克隆進行測序。這2個克隆含有不同長度的插入片段，它們與ER-β同源，彼此同源，而且與上述從人卵巢cDNA庫中分離得到的序列同源。
方法(1)和(2)分離得到的ERβ序列都含有對應于hERβT序列的110個核苷酸以及5′端另外228個核苷酸。將hERβT與5′端序列連接，并將得的cDNA克隆到pCDNA3(Invitrogen，Carlsbad CA)中，在巨細胞病毒IE啟動子調(diào)控下，該表達載體稱為“長hERβ”或hERβL。全長hERβL的cDNA序列編碼一種含有530個氨基酸殘基的多肽，參見SEQ ID NO.1。
hERβL序列含有最適翻譯啟動序列CCACC，緊告于啟動密碼子上游，而且，該序列在巨細胞病毒IE啟動子調(diào)控下。然后將hERβL的編碼序列轉(zhuǎn)移到Ad5ΔE1a載體質(zhì)粒中，該質(zhì)粒含有圖譜單位0-17的腺病毒序列，在圖譜單位1.4-1.9之間缺失了E1a區(qū)(Davis AR等，1985，Gluzman，Y等，1982)。Ad5ΔE1a質(zhì)粒內(nèi)的hERβL轉(zhuǎn)錄單元包括巨細胞病毒1E啟動子，Ad5三聯(lián)前導序列，hERβL的編碼序列和SV40晚期聚腺苷酸信號序列。然后用BstEII酶將Ad5ΔE1a質(zhì)粒內(nèi)的hERβL線性化，與缺失了E3區(qū)的Ad5病毒C1alA片段一起轉(zhuǎn)染到293細胞(轉(zhuǎn)化的原代人胎腎細胞，ATCC CRL1573)中。分離同源重組產(chǎn)生的病毒空斑，擴增，并在A549細胞(人肺癌細胞，ATCC CCL185)中用限制性DNA分析和細胞裂解進行特性分析。驗證試驗表明，該重組的Ad5hERβL病毒含有預定的DNA片段，而且是復制缺陷型。然后通過重復空斑法進一步純化該病毒。擴增分離的空斑，檢驗，并用作種子儲備物在293細胞內(nèi)產(chǎn)生大量病毒。用空斑試驗在293細胞內(nèi)進行病毒滴定，該儲備物含有1.28×109PFU/ml。實施例2Saos-2和LNCaPLN3細胞內(nèi)內(nèi)源性ER mRNA水平的測評若非另作說明，細胞培養(yǎng)試劑都獲自Gibco BRL(Gaithersburg MD)。將LNCaPLN3細胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基(內(nèi)含10％FBS，2mM GlutaMAX-1，100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸鏈霉素)中。用McCoy 5A培養(yǎng)基(內(nèi)含10％FBS，2mM GlutaMAX-1，100U/ml青霉素G和100μg/ml硫酸鏈霉素)維持Saos-2細胞(ATCC，Manassas VA)單層。RT-PCR用TRIzol(Gibco BRL，Gaithersburg MD)，按照廠商說明，分離得到LNCaPLN3和Saos-2細胞的總RNA。然后用1單位/μg無RNase的DNasel(Gibco BRL，GaithersburgMD)處理該樣品，37℃，30分鐘。用RNeasy柱(Qiagen，Hilden Germany)純化反應物中的RNA，用UV分光光度法估測回收量。
用0.5μg RNA，20μl反應物進行逆轉(zhuǎn)錄反應。ERα的反應物包含1×PCR緩沖液(Gibco BRL，Gaithersburg MD)，5mM MgCl2，1.25μM ERα特異性反向引物(5′-CCAGCAGCATGTCGAAGATC-3′)，0.5μM GAPDH特異性反向引物(5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′)，dNTP各0.5mM，20單位RNasin(Promega，Madison WI)和200單位Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL，Gaithersburg MD)。ERβ反應所含組分與ERα的區(qū)別僅在于2.5mM MgCl2和1.25μM ERβ特異性反向引物(5′-GCAGAAGTGAGCATCCCTCTTTG-3′)。每份樣品進行一式二份反應，其他試劑都相同，只是不含Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶，以此作為陰性對照，以確保RNA樣品中沒有DNA污染。反應在42℃15分鐘，然后在99℃進行5分鐘，冰上5分鐘后再進行擴增。
在20μl的逆轉(zhuǎn)錄酶反應物中直接加入80μl主混合物(含ERα特異性正向引物(5′-GGAGACATGAGAGCTGCCAAC-3′)或ERβ特異性正向引物(5′-CAGCATTCCCAGCAATGTCAC-3′)和GAPDH特異性正向引物(5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′))引發(fā)PCR反應。ERα100μl PCR反應中各試劑的最終濃度如下ER特異性引物各0.25μM，GAPDH引物各0.1μM，1×PCR緩沖液(Gibco BRL，Gaithersburg MD)，dTNP各0.2mM，2mM MgCl2和.0.5單位Taq DNA聚合酶(Gibco BRL，Gaithersburg MD)。ERβ反應物中各試劑的量相同，區(qū)別在于1mMMgCl2。在PE9600中進行兩步PCR，如下循環(huán)25輪95℃ 30秒，64℃ 1.5分鐘。擴增后，樣品在64℃孵育10分鐘。
用1.5％瓊脂糖凝膠分離各樣品20μl，在0.4N NaOH，0.6M NaCl中進行毛細管堿性Southern印跡，后轉(zhuǎn)移到Hybond-N+(Amersham Pharmacia，Piscataway NJ)上。印跡在Rapid-Hyb緩沖液(Amersham Pharmacia，Piscataway NJ)中42℃預雜交30分鐘。用聚核苷酸激酶(Gibco BRL，Gaithersburg MD)，以32P-γATP末端標記以下各片段的特異性寡核苷酸探針ERα(5′-TGAACCAGCTCCCTGTCTGCCAGGTTGGT-3′)，ERβ(5′-CCGCATACAGATGTGATAACTGGCGATGGA-3′)和GAPDH(5′-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAACCTGGT-3′)。按3.0×106CPM/ml將探針加到印跡上，42℃孵育1小時。ER雜交與GAPDH雜交各自單獨進行。印跡在2×SSC，0.1％SDS中室溫下洗滌一次15分鐘，0.2×SSC，0.1％SDS中42℃洗滌15分鐘，2次。然后曝光膠片。
以PCR評估時(圖1)，Saos-2細胞表達內(nèi)源性ERβmRNA，但不表達ERαmRNA。作為陽性對照，在這些反應中同時擴增了GAPDH mRNA。雖然兩細胞系都含有GAPDH mRNA，但只有Saos-2細胞含有ERβ。對LNCaPLN3細胞也獲得了相似的結(jié)果(未給出數(shù)據(jù))。實施例3發(fā)現(xiàn)ERβ在Saos-2和LNCaPLN3細胞內(nèi)上調(diào)MT-II細胞的培養(yǎng)與感染因為ERβ信使的水平很低，所以在差異展示前，通過重組腺病毒(參見實施例1)瞬時感染對Saos-2細胞和LNCaPLN3細胞進行基因工程改造使之過度表達hERβL。
如上所述培養(yǎng)Saos-2細胞和LNCaPLN3細胞。感染前16小時，將細胞接種在無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10％經(jīng)活性炭葡聚糖處理(“脫色”)的FBS(HyClone，Logan UT)，2mM GlutaMAX-1，100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸鏈霉素)上。該實驗其余步驟都使用此培養(yǎng)基。
用含有抗生素和GlutaMAX-1的2％脫色FBS無酚紅培養(yǎng)基，以1/20稀釋的Ad5hERβL病毒(實施例1)感染細胞，37℃，2小時。抽干含病毒的培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液洗滌細胞。加入新鮮培養(yǎng)液，讓細胞在37℃恢復過夜。
次日，用10nM 17β-雌二醇或運載體處理細胞24小時，用TRIzol試劑(GibcoBRL，Gaithersburg MD)制備總RNA，用于差異展示。為了去除殘留的DNA，用1單位/μg無RNase的DNase I(Gibco BRL，Gaithersburg MD)處理樣品，37℃，30分鐘。用RNeasy柱(Qiagen，Hilden Germany)純化RNA，通過UV分光光度法估測回收量。差異表達快速分析(RADE)逆轉(zhuǎn)錄(RT)DNase I處理后，取6μg總RNA與1×RT緩沖液(25mM Tris-Cl，pH8.3，37.6mMKCl，3mM MgCl2和5mM DTT，購自Genhunter，Nashville TN)，20μM dTNP(dA、C、G和TTP2′-脫氧核苷5′三磷酸(Gibco BRL，Gaithersburg MD)，0.2μM HT11C(寡核苷酸AAGCTTTTTTTTTTTTC)一起孵育，最終體積為600μl。該反應混合物在65℃培育5分鐘，引起二級結(jié)構(gòu)變性，然后37℃溫育10分鐘。此時，加入30μl Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(2000U/μl，Gibco BRL，Gaithersburg MD)，37℃孵育1小時。57℃加熱5分鐘，將酶滅活。然后，取該反應物一個等份通過PCR合成第二鏈。聚合酶鏈反應(PCR)在2μl RT反應產(chǎn)物中加入1×PCR緩沖液(10mM Tris-Cl，pH8.4，100mM KCl，1.5mM MgCl2和0.001％明膠)，2μM dNTP，15nM33P dATP(NEN，Boston MA)，1單位AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Norwalk CT)和1μM隨機引物(5′-AAGCTTGCCATGG-3′)，總反應體積為20μl。然后用如下參數(shù)對該反應混合物進行熱循環(huán)92℃ 2分鐘，1輪；92℃ 15秒，40℃ 2分鐘，72℃ 30秒，40輪；72℃ 5分鐘。凝膠電泳對相同的兩份PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳分離，在6％變性聚丙烯酰胺凝膠(5.7％丙烯酰胺，0.3％二丙烯酰胺，42％脲和51％水)上，1×TBE緩沖液(0.1M Tris，0.09M硼酸，1mM EDTA)中，2000伏下進行3小時。然后將凝膠轉(zhuǎn)移到濾紙(Schleicher& Schuell，Keene NH)上，80℃真空干燥1小時，然后曝光X光膠片24小時。
在Saos-2和LNCaPLN3細胞中，17β-雌二醇明顯上調(diào)稱為6a的一個條帶(圖2)。將顯影后的膠片重疊在干的凝膠上，用22號注射針標出各條帶的四個角。用剃須刀片切下邊界內(nèi)凝膠條，浸在100μl H2O中。將該樣品水浴煮沸15分鐘，離心2分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中。在該樣品中加入5μl 10mg/ml糖原，10μl 3M乙酸鈉和450μl 100％乙醇?；旌蠘悠?，在-20℃沉淀過夜，10,000g離心10分鐘。去除上清液，沉淀以200μl 85％乙醇洗滌，干燥，重懸在10μl H2O中。取3μl等份用于PCR再擴增，反應物含1×PCR緩沖液，20μM dNTP，0.2μM隨機引物和0.2μM寡核苷酸HT11C和2單位AmpliTaq聚合酶，循環(huán)參數(shù)與前一PCR反應相同。然后，用所得產(chǎn)物為探針進行Northern雜交試驗以驗證調(diào)節(jié)作用，并克隆到細菌質(zhì)粒中進行測序分析。片段的克隆用TA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad CA)克隆了條帶6a。細胞裂解后，用PCR篩選克隆，以尋找大小正確的插入片段。在20mM Tris-HCl，pH8.5，50mM KCl，2.5mMMgCl2，0.5％Tween 20和100μg/ml蛋白酶K中，56℃培育10分鐘以裂解克隆，然后在99℃ 10分鐘滅活蛋白酶K。用2μl該反應產(chǎn)物進行如下PCR反應20mM Tris-HCl，pH8，50mM KCl，2.5mM MgCl2，75μM dNTP，375nM M-13正向引物和反向引物和2.5UTaq聚合酶(Gibco BRL，Gaithersburg MD)。反應循環(huán)如下95℃ 30秒；64℃ 30秒；72℃ 45秒；30輪。挑選出一個克隆命名為，6a.2，進行測序。片段的測序用Applied Biosystems(Foster City CA)的ABI PRISMTM染料終止劑循環(huán)測序簡便反應試劑盒(含AmpliTaq DNA聚合酶)及其推薦的程度進行克隆6a.2的測序。在循環(huán)測序后，用旋轉(zhuǎn)柱(Spin column，AGTC)去除未摻入的染料標記核苷酸。用ABI 373DNA測序儀，對所有DNA測序樣品進行自動化DNA測序級4.75％聚丙烯酰胺凝膠電泳。測序數(shù)據(jù)用Sequence Navigator編輯，用DNAStar(DNAStar，Madison WI)進行拼接。修剪RADE引物的序列，用Millennium軟件(Boston MA)進行BLAST檢索。對克隆6a.2序列的核苷酸同源性檢索發(fā)現(xiàn)，它與人MT-II的相同性為98％。然而，在編碼序列上，沒有氨基酸錯配(圖3)。用Northern印跡法和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)驗證調(diào)節(jié)作用為了驗證用細胞mRNA作PCR擴增所得的結(jié)果，用Northern印跡和qRT-PCR來評價17-β雌二醇或其他化合物對信使水平的作用。除非另作說明，所有實驗均使用前述對腺病毒感染反應中瞬時過度表達hERβL的細胞，并用化合物處理24小時。有些情況中，用瞬時過度表達ERα的細胞進行比較。腺病毒介導ERα過度表達的方法與檢測ER-β所述的相同。Northern印跡用Oligotex mRNA分離試劑盒(Qiagen，Hilden Germany)，根據(jù)廠商說明書從總RNA中分離出聚A+RNA。6μg mRNA或10μg總RNA在凝膠(1.5％瓊脂糖，0.22M甲酰胺，10mM HEPES，1mM EDTA)上分離。通過20×SSC(Gibco BRL，Gaithersburg MD)中的毛細作用，經(jīng)一晝夜，將RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N(Amersham Pharmacia，PiscatawayNJ)上。轉(zhuǎn)移后，對薄膜進行UV交聯(lián)，并在80℃干燥10分鐘。Northern印跡在RapidHyb溶液(Amersham Pharmacia，Piscataway NJ)中預雜交30分鐘。
如上述克隆篩選那樣用PCR從質(zhì)粒中分離出克隆6a.2的插入片段。用WizardPreps(Promega，Madison WI)從瓊脂糖凝膠上純化PCR產(chǎn)物。條帶6a的再擴增RADE片段或克隆6a.2的片段用Redi-prime試劑盒(Amersham Pharmacia，Piscataway NJ)，按照廠商說明，進行隨機引物標記。用Nap-5柱(Amersham Pharmacia，Piscataway NJ)去除未摻入的核苷酸，用液體閃爍計數(shù)法測定[32P]-dCTP的摻入。
以上探針在100℃變性10分鐘，在薄膜上加1.5×106CPM/ml Rapid-Hyb雜交溶液。印跡在65℃雜交5小時，然后如下洗滌2×SSC，0.1％SDS中65℃ 15分鐘，1次；0.2×SSC，0.1％SDS中65℃ 15-30分鐘，2次。印跡曝光膠片，并在Phosphorlmager屏(Molecular Dynamics，Sunnyvale CA)上曝光。在用6a的RADE片段或6a.2克隆片段探測后，如上用與GAPDH同源的cDNA探測印跡。將Phosphorlmager屏(Molecular Dynamics，Sunnyvale CA)上6a.2片段的雜交信號歸一化成GAPDH信號，以測定誘導倍數(shù)。QRT-PCR將與克隆6a.2的差別僅在含有一段63bp缺失的MT-II片段亞克隆到pcDNA.3(Invitrogen，Carlsbad CA)中。用T7啟動子大規(guī)模轉(zhuǎn)錄試劑盒(Novagen，MadisonWI)轉(zhuǎn)錄生成RNA。經(jīng)酚-氯仿抽提和乙醇沉淀后，定量測定合成的RNA，并用UV分光光度法和凝膠電泳進行分析。
用200ng和300ng經(jīng)DNase處理過的Saos-2細胞總RNA，加上已知量的MT-II標準RNA進行總體積20μl的逆轉(zhuǎn)錄反應。反應物含1×PCR緩沖液(GibcoBRL，Gaithersburg MD)，3.75mM MgCl2，1.25μM MT-II特異性反向引物(5′-GGAATATAGCAAACGGTCAGGGTC-3′)，0.5mM dTNP，1mM DTT，20單位RNase(Promega)和200單位Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL，Gaithersburg MD)。反應物42℃培育15分鐘，然后在99℃ 5分鐘，冰上5分鐘，然后擴增。
在20μl的逆轉(zhuǎn)錄酶反應物中直接加入含MT-II特異性正向引物(5′-GGCTCCTGCAAATGCAAAGAG-3′)的80μl主混合物引發(fā)PCR反應。100μl PCR反應物中諸試劑的最終濃度如下MT-II特異性引物各0.25μM，1×PCR緩沖液(Gibco BRL，Gaithersburg MD)，dTNP各0.1mM，1.5mM MgCl2和.0.5單位Taq DNA聚合酶(GibcoBRL，Gaithersburg MD)。在PE9600(Perkin-Elmer，Norwalk CT)中進行兩步PCR，如下循環(huán)40輪95℃ 30秒，64℃ 1.5分鐘。擴增后，樣品在64℃孵育10分鐘。
在反向離子對高壓液相層析DNASeq柱(Sarasep，San Jose CA)上進行PCR產(chǎn)物的分離和分析。洗脫系統(tǒng)是乙腈以0.1乙酸三乙基銨(Fluka，Ronkonkoma NY)配成的梯度溶液，流速為0.7ml/min。乙腈梯度在5分鐘內(nèi)從14.6％升至16.6％。通過測定254nm UV吸光度來測定標準和原初RNA的產(chǎn)物量，并用一在線積分儀分析信號。根據(jù)層析圖，用各峰下的面積之比來確定MT-II標準RNA輸入量與Saos-2RNA內(nèi)原初MT-II信使量之比。
在LNCaPLN3細胞內(nèi)，17-β雌二醇對MT-II的誘導強度是大約6倍(圖4)。在Saos-2細胞內(nèi)，10nM 17-β雌二醇將MT-II mRNA上調(diào)了14倍(圖4)。Saos-2細胞內(nèi)的這一上調(diào)作用至少在20個實驗內(nèi)重復再現(xiàn)，誘導倍數(shù)為3.5-14。根據(jù)qRT-PCR測定，這一調(diào)節(jié)作用的EC50為4.6+2.7nM(圖5)。如果用10nM 17-β雌二醇處理Saos-2細胞，并在處理后的不同時刻制備RNA，則MT-II信使可見的增加最早發(fā)生在處理后8小時，24小時達到反應峰值(圖6)。
因為制備用于差異展示的樣品過度表達了hERβL，所以在天然Saos-2細胞和過度表達ERα的細胞內(nèi)評價了MT-II的調(diào)節(jié)作用。如圖7所示，內(nèi)源性ERβ水平或過度表達的ERα水平對17-β雌二醇調(diào)節(jié)MT-II沒有作用。
測定了其他化合物在Saos-2細胞內(nèi)上調(diào)MT-II的能力。10nM己烯雌酚(Sigma，St.Louis MO)和0.1μM三羥異黃酮(RBI，Natick MK)都可增加MT-II mRNA。1μM抗雌激素，ICI-182780(Zeneca，Wilmington DE)，完全阻抑了17-β雌二醇和三羥異黃酮的誘導作用，單獨給予則沒有效果(圖8)。共用1μM抗孕酮/抗糖皮質(zhì)素RU486(LigandPharmaceuticals，La Jolla CA)處理不阻抑17-β雌二醇的調(diào)節(jié)作用(未給出數(shù)據(jù))。實施例4用放線菌酮處理Saos-2細胞為了確定MT-II mRNA的增加是否需要新蛋白質(zhì)的合成，在hERβL過度表達后17-β雌二醇處理前用放線菌酮阻止翻譯。驗證放線菌酮對蛋白質(zhì)合成的影響如前所述接種細胞并用hERβL病毒感染，然后用10μg/ml放線菌酮或運載體37℃預處理1小時。如此預培育后，加入含有10μg/ml放線菌酮，10mM 17-β雌二醇和50μCi/ml35S-甲硫氨酸(NEN，Boston MA)的無甲硫氨酸培養(yǎng)基，37℃培育8或24小時。細胞用冷PBS洗滌3次，然后從板上刮下，加至500μl PBS中。沉淀細胞，然后重懸在200μl RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.5％DOC，0.1％SDS，和50mM Tris，pH8.0)中。通過TCA沉淀測定甲硫氨酸的摻入。將5和10μl各樣品點在各張Whatman濾紙上。濾紙在10％三氯乙酸中煮沸10分鐘，然后以去離子水洗滌3次，每次10分鐘，在95％乙醇中洗滌3次，每次10分鐘，在丙酮中洗滌一次10分鐘。將濾紙干燥后放在閃爍液中，進行1分鐘的計數(shù)。用17-β雌二醇處理細胞如前所述接種細胞并用hERβL病毒感染，用10μg/ml放線菌酮或運載體37℃預處理1小時。如此預培育后，加入10mM 17-β雌二醇或運載體，37℃繼續(xù)培養(yǎng)8或24小時。如前所述從細胞中分離出RNA，如實施例3所述用Northern印跡分析或qRT-PCR評價基因表達。放線菌酮處理后功能性ERβ蛋白的確認制備了兩份相同的樣品，如前段所述進行處理。培養(yǎng)8小時后，細胞以DMEM洗滌4次，去除17-β雌二醇。在所有樣品中加入放線菌酮(10μg/ml)和1nM[3H]-雌二醇。對部分細胞0.3μM己烯雌酚共同處理以評價非特異性結(jié)合。37℃培養(yǎng)2.5小時后，細胞用DMED洗滌，并用0.1％十二烷基硫酸鈉裂解。通過液體閃爍計數(shù)測定DPM。
MT啟動子包含糖皮質(zhì)素和金屬應答性元件，但不知道ERE的情況。17-β雌二醇對MT-II mRNA表達的作用可能是間接的。Saos-2細胞過度表達ERβ后，用放線菌酮處理嚴重限制新蛋白質(zhì)的合成(圖9)。雖然，用或不用放線菌酮處理，根據(jù)全細胞結(jié)合試驗測定，受體蛋白的表達量相當(圖9B)，但沒有發(fā)生MT-II誘導(圖9C，D)。實施例517-β雌二醇處理大鼠因為17-β雌二醇在前列腺癌細胞系LNCaPLN3細胞中上調(diào)MT-II，我們在大鼠前列腺中尋找是否也有類似的應答。
按照公認的科研指南用批準的程度處理所有動物。成年(15-19周齡，約375g)閹割過的Sprague-Dawley大鼠購自Taconic Farms(Germantown NY)。閹割后第10天，給大鼠皮下注射運載體，16μg 17-β雌二醇，16μg己烯雌酚(Sigma，St.Louis MO)，或16μg 17-β雌二醇加1.6mg雷洛昔芬(自合成)，每日1次，共3天。最后一次注射后24小時，用CO2將大鼠窒息致死，切取前列腺。如前所述制備總RNA和分析MT-IImRNA。在另一實驗中，用16μg 17-β雌二醇注射大鼠1、2或3天，然后收集前列腺組織。
17-β雌二醇處理后，金屬硫蛋白-II mRNA增加了5倍。用己烯雌酚處理大鼠時也出現(xiàn)類似的反應，但這種上調(diào)受到聯(lián)用過量100倍的雌激素拮抗劑鹽酸雷洛昔芬所阻抑圖(10)。雖然最初的實驗采用接受3天注射的大鼠的組織，但大鼠前列腺內(nèi)MT-II上調(diào)最早見于17-β雌二醇處理后的第二天(圖11)。實施例6用MCF-7細胞進行的ERE-螢光素酶報道試驗因為Saos-2細胞內(nèi)MT-I的調(diào)節(jié)ERβ介導而不受ERα介導，所以需要另外進行試驗比較細胞試驗中化合物對這兩種受體的選擇性。MCF-7是一種雌激素反應性乳腺癌細胞系，在我們手中如RT-PCR測定，只表達ERα(數(shù)據(jù)未給出)。用ERE-報道基因構(gòu)建物瞬時感染MCF-7細胞并用17-β雌二醇處理時，可測定報道基因活性。
MCF-7 HTB22(ATCC Manassas VA)細胞用生長培養(yǎng)基(D-MEM/F-12，含有10％(v/v)熱滅活的胎牛血清，100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸鏈霉素，2mM GlutaMAX-1)每周傳代2次。將細胞37℃維持在一透氣培養(yǎng)瓶中，置于5％CO2/95％潮濕空氣的培養(yǎng)箱中。處理前1天，用生長培養(yǎng)基接種細胞，按25,000/孔接種在96孔培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。
用腺病毒5-ERE-TK-螢光素酶(Bodine等，1997)在實驗培養(yǎng)基[無酚紅DMEM/F-12培養(yǎng)基，含有10％(v/v)熱滅活活性炭脫色胎牛血清，100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸鏈霉素，2mM GlutaMAX-1，1mM丙酮酸鈉]中的1∶10稀釋液感染細胞，50μl/孔，37℃ 2小時。然后用150μl實驗培養(yǎng)基洗滌諸孔一次。最后，用運載體(150μl/孔，≤0.1％v/v DMSO)或化合物(以實驗培養(yǎng)基稀釋1000倍以上)處理細胞37℃ 24小時，一式8孔。
處理后，在振蕩儀上，用25μl/孔1×細胞培養(yǎng)物裂解劑(Promega，Madison WI)裂解細胞15分鐘。將細胞裂解液(20μl)轉(zhuǎn)移到96孔發(fā)光測試板上，加入100μl/孔螢光素酶底物(Promega，Madison WI)，用MicroLumat LB96 P發(fā)光光度計(EG & GBerthold，Bad Wildbad Germany)測定螢光素酶活性。在注入底物前，每孔作1秒鐘背景熒光測定。注入底物后，等1秒種，然后進行10秒的螢光素酶活性測定?？鄢尘盁晒?，計算平均值和標準差。
這樣，在Saos-2細胞中誘導MT-II但在MCF-7細胞內(nèi)不激發(fā)報道基因活性的化合物就是ERβ選擇性的。此外，這兩個實驗的結(jié)果還可以用來選擇對ERα具有選擇性的化合物，參見圖12。
討論采用差異展示，出人意料的發(fā)現(xiàn)，ERβ在17-β雌二醇處理的兩種細胞系中提高了MT-II mRNA。據(jù)我們所知，這是第一個被發(fā)現(xiàn)受這種ER新形式調(diào)節(jié)的基因。我們在人骨肉瘤細胞系Saos-2細胞中對這一反應的特征進行了廣泛的研究。多種雌激素可上調(diào)MT-II，而且，這一反應可被雌激素拮抗劑ICI-182780共處理所阻抑。17-β雌二醇的EC50約5nM，17-β雌二醇通過與某些未知蛋白質(zhì)作用而介導這一反應。
ERβ對MT-II的作用并非普遍現(xiàn)象，因為對除Saos-2和LNCaPLN3細胞外十余種細胞系的研究都沒有發(fā)現(xiàn)這種誘導作用。然而，17-β雌二醇能在大鼠前列腺中上調(diào)MT-II的事實增強了這樣的可能性，即，這是一種生理學相關(guān)性反應而非在癌細胞系內(nèi)過度表達受體的人為結(jié)果。我們相信，這一前列腺反應由ER介導有二點理由非甾體類雌激素(己烯雌酚)上調(diào)MT-II，而雌激素激動劑/拮抗劑雷洛昔芬阻抑17-β雌二醇的作用。然而，至今還不清楚這種誘導是否反映ERβ和/或ERα的活性。雖然ERβ在大鼠前列腺中是ER的主要形式，但也存在著ERα。目前的研究是要確定引起這一體內(nèi)應答的受體類型。
金屬硫蛋白是一類低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，結(jié)合諸如鈣、銅和鋅等金屬。雖然早在40多年前就發(fā)現(xiàn)了第一種金屬硫蛋白(Vallee，1957)，但對它們的功能至今仍有爭議。曾提出了幾種假設(shè)，其中包括抗金屬毒性的保護作用，調(diào)節(jié)鋅和銅的動態(tài)平衡，抗氧化應力。還曾提出它們可調(diào)節(jié)能量平衡，因為，在性發(fā)育成熟后，敲除了MT(-I和-II)的小鼠變得肥胖(Beattie等，1998)。
最近有研究詳細描述了MT如何調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鋅動態(tài)平衡。最近出版的兩篇論文用純化的鋅依賴性酶(例如大腸桿菌堿性磷酸酯酶，牛羧基肽酶A和羊山梨醇脫氫酶)證明了細胞內(nèi)環(huán)境物質(zhì)如何促進鋅與MT以復合物和(無金屬)脫輔酶之間的交換(Jacob等，1998；Jiang等，1998)。檸檬酸和谷胱甘肽可影響鋅轉(zhuǎn)移的反向，從而根據(jù)細胞的氧還狀態(tài)調(diào)節(jié)酶活性。ER雖然不是酶但也需要鋅來獲得活性，而且，MCF-7細胞的ER可以在體外與純化MT可逆地交換鋅(Cano-Gauci等，1996)。
許多物質(zhì)可調(diào)節(jié)MT水平，包括糖皮質(zhì)類激素和鎘等金屬(參見Hamer，1986)。雌激素不是典型的MT調(diào)節(jié)劑，但文獻中有兩篇相關(guān)文獻值得注意。第一篇，17-β雌二醇處理雌性大鼠2周上調(diào)了小腸粘膜內(nèi)的一種銅結(jié)合蛋白，從而減少吸收入血漿的銅。由于該蛋白質(zhì)的分子量約10K，作者認為它是MT(Cohen等，1979)。最近，在一次注射17α乙炔基雌二醇后進行的受調(diào)節(jié)子宮mRNA的扣除雜交篩選中鑒定到了MT(Rivera-Gonzalez等，1998)。雖然沒有鑒定到其異構(gòu)體，但在17α乙炔基雌二醇激發(fā)后4-8小時之間，一種MT轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加了3倍。此外，也不知道是哪種受體型引發(fā)了這一調(diào)節(jié)作用，因為子宮中最豐富的ER是ERα而非ERβ(Kuiper等，1996；Course等，1997)。
因為對MT功能的闡明只是剛剛開始，而對于ERβ則一無所知，因此，了解它們之間相互關(guān)系的意義在目前是不可能的。然而，即便不清楚這兩種蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系，仍可以利用所觀察的調(diào)節(jié)作用來幫助設(shè)計ERβ或ERα特異性的配體。三羥異黃酮也上調(diào)Saos-2細胞內(nèi)的MT-II，或者比17-β雌二醇的作用更強，這表明ERβ選擇性化合物可有效地引導轉(zhuǎn)錄。此外，幾種結(jié)合ERβ的結(jié)構(gòu)不同的化合物也上調(diào)Saos-2細胞內(nèi)的MT-II信使。將能夠上調(diào)Saos-2細胞內(nèi)MT-II的化合物的資料與其如何調(diào)節(jié)MCF-7細胞內(nèi)報道基因活性的信息相結(jié)合，就可評價其ERβ和ERα選擇性。因此，這兩種試驗當同時使用時，可作為設(shè)計兩種ER型選擇性化合物的工具。最后，如果能證明前列腺內(nèi)的調(diào)節(jié)也是由ERβ介導的，則可評價這些化合物的體內(nèi)活性，為藥物開發(fā)提供又一種有價值的工具。
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權(quán)利要求
1.一種在受體結(jié)合試驗中篩選ER結(jié)合性化合物的方法，該方法檢測ER-β多肽介導的轉(zhuǎn)錄，該方法包括以下步驟(a)提供一種細胞，其含有至少一段受雌激素調(diào)節(jié)的編碼MT-II的DNA序列和至少一段編碼ER-β多肽的DNA序列，該受體具有轉(zhuǎn)錄活性；(b)使所述細胞與可結(jié)合ER的待測化合物或?qū)φ战佑|；和(c)檢測MT-II的表達，所述MT-II表達增強，高于對照，表示待測化合物具有雌激素激動劑活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中編碼ER-β多肽的DNA序列摻入在一種腺病毒中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的腺病毒是復制缺陷型Ad5病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細胞內(nèi)源性表達ER-βmRNA的速度高于ER-αmRNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中的細胞經(jīng)重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒含有與合適啟動子相連的編碼人ER-β的聚核苷酸，轉(zhuǎn)化細胞表達人ER-β的水平高于非轉(zhuǎn)化細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細胞是Saos-2或LNCaPLN3細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中的細胞不含有功能性ER-α。
8.一種在受體結(jié)合試驗中篩選ER結(jié)合性化合物的方法，該方法檢測ER-β多肽介導的轉(zhuǎn)錄抑制，該方法包括以下步驟(a)提供一種細胞，含有至少一段編碼MT-II的雌激素DNA序列和至少一段編碼ER-β多肽的DNA序列，該受體具有轉(zhuǎn)錄活性；(b)在已知可結(jié)合ER的待測化合物存在下使所述細胞與一種或多種雌激素接觸；(c)檢測MT-II的表達，所述MT-II的表達降低，低于單用一種或多種雌激素處理，表示待測化合物具有雌激素激拮抗劑活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中編碼ER-β多肽的DNA序列摻入在一種腺病毒中。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中的腺病毒是復制缺陷型Ad5病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中的細胞內(nèi)源性表達ER-βmRNA的速度高于ER-αmRNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中的細胞經(jīng)重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒含有與合適啟動子相連的編碼人ER-β的聚核苷酸，轉(zhuǎn)化細胞表達人ER-β的水平高于非轉(zhuǎn)化細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中的細胞是Saos-2或LNCaPLN3細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的細胞不含有功能性ER-α。
15.一種篩選化合物以鑒定候選藥物的方法，所述藥物模擬雌激素對ER-β或ER-α所介導轉(zhuǎn)錄的作用，該方法包括以下步驟(a)使待測化合物與以下物質(zhì)接觸(i)第一類細胞，含有至少一段編碼MT-II的內(nèi)源性DNA和至少一段編碼ER-β多肽的DNA序列，該受體具有轉(zhuǎn)錄活性；和(ii)第二類細胞，含有ERE報道基因構(gòu)建物，該細胞表達ER-α多肽；(b)鑒定如下化合物能提高第一類細胞的MT-II表達，高于對照，但對第二類細胞中所述報道基因的表達作用極小，由此認定該化合物具有ER-β選擇性；或(c)鑒定如下化合物能增強第二類細胞中該報道基因的表達，高于對照，但對第一類細胞內(nèi)MT-II表達的作用極小，由此認定該化合物具有ER-α選擇性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中第一類細胞內(nèi)編碼ER-β多肽的DNA摻入在一種腺病毒中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中的腺病毒是復制缺陷型Ad5病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中第一類細胞內(nèi)源性表達ER-βmRNA的速度高于ER-αmRNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中第一類細胞經(jīng)重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒含有與合適啟動子操作性相連的編碼人ER-β的聚核苷酸，該轉(zhuǎn)化的第一類細胞表達人ER-β的水平高于所述的第二類細胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中的第一類細胞是Saos-2或LNCaPLN3細胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中第一類細胞不含有功能性ER-α，第二類細胞不含有功能性ER-β。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中第二類細胞經(jīng)一種DNA聚核苷酸轉(zhuǎn)化，該聚核苷酸含有與一種報道基因操作性相連的ERE。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的報道基因是螢光素酶基因。
24.一種篩選待測化合物以鑒定候選藥物的方法，所述藥物模擬雌激素對ER-β或ER-α所介導轉(zhuǎn)錄的作用，該方法包括以下步驟(a)在沒有或存在一種或多種雌激素的情況下，使待測化合物與以下物質(zhì)接觸(i)第一類細胞，含有至少一段編碼金屬硫蛋白(MT-II)的內(nèi)源性DNA序列和至少一段編碼ER-β多肽的DNA序列，該受體具有轉(zhuǎn)錄活性；和(ii)第二類細胞，含有ERE-報道基因構(gòu)建物，該細胞表達ER-α多肽；(b)鑒定如下化合物能降低第一類細胞內(nèi)MT-II的表達，使之低于一種或多種雌激素處理，但對第二類細胞中對所述報道基因表達的作用極小，由此認定該化合物具有ER-β選擇性；或(c)鑒定如下化合物能降低第二類細胞內(nèi)報道基因的表達，使之低于一種或多種雌激素處理，但對第一類細胞內(nèi)MT-II的表達作用極小，由此認定該化合物具有ER-α選擇性。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中第一類細胞內(nèi)編碼ER-β多肽的DNA摻入在一種腺病毒中。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中的腺病毒是復制缺陷型Ad5病毒。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中第一類細胞內(nèi)源性表達ER-βmRNA的速度高于ER-αmRNA。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中第一類細胞經(jīng)重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒含有與合適啟動子操作性相連的編碼人ER-β的聚核苷酸，該轉(zhuǎn)化的第一類細胞表達人ER-β的水平高于所述的第二類細胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中的第一類細胞是Saos-2或LNCaPLN3細胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中第一類細胞不含有功能性ER-α，第二類細胞不含有功能性ER-β。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中第二類細胞經(jīng)一種DNA聚核苷酸轉(zhuǎn)化，該聚核苷酸含有與一種報道基因操作性相連的ERE。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中的報道基因是螢光素酶基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的試驗方法,用于鑒定選擇性激活雌激素受體(ER)α或的β亞型的化合物。具體地說,即對分別測定ER－β活性和ER－α活性的兩個試驗的結(jié)果進行解釋。測定ER－β活性的試驗所用的細胞含有內(nèi)源性金屬硫蛋白－II和含人ER－β編碼聚核苷酸的DNA質(zhì)粒。該試驗監(jiān)測所述細胞內(nèi)金屬硫蛋白－II－mRNA的表達,金屬硫蛋白－II的表達水平受潛在配體與ER－β結(jié)合的調(diào)節(jié)。測定ER－α活性的試驗所用的細胞含有ER－α和含有一種報道基因的DNA質(zhì)粒,其中該報道基因與一個雌激素應答性元件相連。該試驗監(jiān)測該報道基因的表達,該報道基因的表達水平受潛在配體與ER－α結(jié)合的調(diào)節(jié)。將在一個試驗中有調(diào)節(jié)活性而在另一試驗中幾乎沒有活性的化合物確定具有對雌激素受體該亞型的選擇性。
文檔編號C12Q1/02GK1352699SQ99814685
公開日2002年6月5日 申請日期1999年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月18日
發(fā)明者H·哈里斯, R·A·巴蒂 申請人:美國家庭用品有限公司 被以下專利引用 (1),