一種利用鮮果渣液體深層發(fā)酵制備高蛋白果渣的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蘋果渣廢物利用和生物飼料領(lǐng)域，具體涉及一種利用鮮果渣液體深層 發(fā)酵制備高蛋白果渣的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國水果產(chǎn)量和種植面積均居世界前列，每年產(chǎn)生蘋果渣近千萬噸。蘋果渣中所 含水分較高，可溶性營養(yǎng)物的含量較高，容易造成微生物的滋生，如若不及時處理，就會腐 敗變質(zhì)，不僅造成了資源的嚴重浪費，更會對環(huán)境造成危害。目前，蘋果渣的利用主要分為 非發(fā)酵利用和發(fā)酵利用兩個方面。
[0003] 非發(fā)酵利用的方法有：鮮食、干制飼料、分離提取有效成分等。鮮蘋果渣由于其適 口性差、易霉變、蛋白質(zhì)含量低等原因不能直接作飼料，所以需與其他飼料進行配比；干制 后雖解決了易霉變等問題，但在飼料中復(fù)配時仍然存在蛋白含量低等缺點；分離提取又會 產(chǎn)生大量二次殘渣。
[0004] 發(fā)酵利用的方法分為自然發(fā)酵和接種發(fā)酵。自然發(fā)酵適口性較差、易滋生有害 菌。接種發(fā)酵又分為兩個大的方面：1.利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酒精、沼氣、檸檬酸、蘋果醋等； 2.接種益生菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料。其中，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酒精、沼氣、檸檬酸、蘋果醋等， 又會伴隨著大量二次殘渣的出現(xiàn)，形成對環(huán)境的二次污染。而接種益生菌生產(chǎn)蛋白飼料是 一種能夠?qū)⑻O果渣達到完全的利用、無環(huán)境二次污染、成本較低且具有高附加值的利用方 法，現(xiàn)就這一方面進行以下概述：
[0005] 目前，利用接種益生菌生產(chǎn)蛋白飼料對蘋果渣進行開發(fā)利用的研宄成果來看，發(fā) 酵方式大多為固態(tài)發(fā)酵，淺盤液體發(fā)酵也有報道。武運，李煥榮等人利用固態(tài)發(fā)酵法對蘋果 渣生產(chǎn)菌體飼料蛋白進行了研宄。高衛(wèi)衛(wèi)利用產(chǎn)朊假絲酵母，對蘋果渣進行固體發(fā)酵。而 固態(tài)發(fā)酵也有其局限性，不利于工業(yè)化生產(chǎn)：1.菌種限于耐低水活性的微生物，菌種選擇 性少。2.發(fā)酵速度慢，周期較長。3.占地面積過大，規(guī)模受限。4.工藝參數(shù)難測準和控制。 5.批量產(chǎn)出的產(chǎn)品少，工藝操作消耗勞力多，強度大。6.由于自動化程度差，過程中大多環(huán) 節(jié)需要認為操作，易污染雜菌。張宗舟，鞏曉芳等發(fā)表的專利中利用蘋果渣液體培養(yǎng)基進行 淺盤培養(yǎng)，發(fā)酵2-7天，取菌膜烘干供飼料添加所用。淺盤液體發(fā)酵的局限性在于：1.發(fā)酵 占地面積大，規(guī)模受限。2.由于發(fā)酵過程中需要翻盤，人力消耗大。3.批量產(chǎn)出產(chǎn)品少。 4.需要露天培養(yǎng)，更易污染雜菌。5.僅靠觀察菌膜厚度判斷發(fā)酵效果，工藝參數(shù)難測準和 控制。徐抗震，宋紀蓉等利用液固態(tài)進行發(fā)酵，即菌種一次活化之后，將多菌種混合小規(guī)模 液態(tài)發(fā)酵，再接入到固態(tài)培養(yǎng)基中進行固態(tài)發(fā)酵，此方法利用的液體發(fā)酵僅限于菌種二次 活化以利于多菌種相互適應(yīng)，在后期仍需固態(tài)發(fā)酵。另外，田杏芳，王連民則著手于利用蘋 果渣等配成的混合培養(yǎng)基生產(chǎn)發(fā)酵飼料，在發(fā)酵過程中不添加外源含氮物，在于利用培養(yǎng) 基增菌，即將培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換為菌體，著重益生菌發(fā)酵飼料的保健作用，不涉及蛋白 質(zhì)含量的大量增加。寧瑛的研宄成果原理與之類似。這些研宄所用的發(fā)酵方法也是固態(tài)發(fā) 酵，或添加少量水成半固態(tài)，在發(fā)酵過程中的弊端與以上類似。
[0006] 綜上所述，現(xiàn)有的發(fā)酵方法弊端較多，受諸多不確定因素影響，發(fā)酵時間長，消耗 大，最大的問題的是難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種利用鮮果渣液體 深層發(fā)酵制備高蛋白果渣的方法，該方法發(fā)酵速度快、周期短，過程易控制，產(chǎn)量高，利于工 業(yè)化生產(chǎn)。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0009] 一種利用鮮果渣液體深層發(fā)酵制備高蛋白果渣的方法，包括以下步驟：
[0010] 1)菌種一級活化
[0011] 向Yro培養(yǎng)基中接入0. 5%~1 %的釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母，滅菌后，培養(yǎng)活化 至活菌數(shù)大于IO8CfuAiL ;
[0012] 2)菌種二級活化
[0013] 按1000 :(2. 5~4) :(0.7~L 5)的質(zhì)量比，取蘋果渣漿料、CO(NH2)2和甘蔗糖蜜， 或按1000 : (5~7) : (0. 7~1. 5)的質(zhì)量比，取蘋果渣漿料、（NH4)2 ? SO4和甘蔗糖蜜；
[0014] 混勻、滅菌后，按3%~5%的接種量接入經(jīng)一級活化的釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵 母，然后發(fā)酵培養(yǎng)至活菌數(shù)大于IO 8CfuAiL ;
[0015] 3)菌種三級活化
[0016] 按1000 :(2. 5~4) :(0.7~L 5)的質(zhì)量比，取蘋果渣漿料、CO(NH2)2和甘蔗糖蜜， 或按1000 : (5~7) : (0. 7~1. 5)的質(zhì)量比，取蘋果渣漿料、（NH4)2 ? SO4和甘蔗糖蜜；
[0017] 混勻后經(jīng)超高溫瞬時滅菌后，按5%~10%的接種量接入經(jīng)二級活化的釀酒酵母 或產(chǎn)朊假絲酵母，然后發(fā)酵培養(yǎng)至活菌數(shù)大于IO 8CfuAiL ;
[0018] 4)液體深層發(fā)酵
[0019] 按1000 : (2. 5~7) : (0. 7~1. 5)的質(zhì)量比，取蘋果渣漿料、CO(NH2)2和甘蔗糖蜜， 或按1000 : (5~7) : (0. 7~1. 5)的質(zhì)量比，取蘋果渣漿料、（NH4)2 ? SO4和甘蔗糖蜜；
[0020] 混勻后經(jīng)超高溫瞬時滅菌后，按5%~10%的接種量接入經(jīng)三級級活化的釀酒酵 母或產(chǎn)朊假絲酵母，然后發(fā)酵培養(yǎng)18~24h后活菌數(shù)達4. 0 X IO8~5. 0 X 10 8cfU/mL，制得 高蛋白果渣。
[0021] 步驟1)所述的菌種一級活化，是將Yro培養(yǎng)基裝入0. 05~IL的發(fā)酵容器中，裝 料量為20 %~30 %，在121 °C下滅菌15-20min，然后接入釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母后，在 25~30°C下培養(yǎng)12~24h。
[0022] YPD培養(yǎng)基的成分為：IOg酵母浸粉、IOg蛋白胨、20g葡萄糖及IL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 值至5~6。
[0023] 步驟2)菌種二級活化采用5~50L的發(fā)酵罐，裝料量為70 %~80% ;滅菌是在 115~121°C下，處理20~30min ;且接入釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母后，發(fā)酵罐的通氣量為 0? 5~0? 7V/V ? min，攪拌轉(zhuǎn)速為200~300rpm，在25~28°C下，發(fā)酵培養(yǎng)20~48h，發(fā)酵 過程中pH值控制在5~6。
[0024] 步驟3)菌種三級活化采用50~100L的發(fā)酵罐，裝料量為60%~70%;超高溫瞬 時滅菌是在135~140°C下處理4~8s ;且接入釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母后，發(fā)酵罐的通氣 量為0. 6~0. 9V/V .min,攪拌轉(zhuǎn)速為200~300rpm，在25~28°C下，發(fā)酵培養(yǎng)24~48h， 發(fā)酵過程中pH值控制在5~6。
[0025] 步驟4)液體深層發(fā)酵采用500~1000L的發(fā)酵罐，裝料量為60%~70%;超高溫 瞬時滅菌是在135~140°C下處理6~IOs ;且接入釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母后，發(fā)酵罐的 通氣量為〇. 8~I. 0V/V ? min，攪拌轉(zhuǎn)速為200~300rpm，在26~28°C下，發(fā)酵培養(yǎng)18~ 24h，發(fā)酵過程中pH值控制在5~6。
[0026] 所述蘋果渣漿料是按鮮蘋果渣：水=120~150kg :1000L的料液比，將鮮蘋果渣 和水混合后進行破碎打漿后制得。
[0027] 破碎打漿的粒度為20~60目。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0029] 本發(fā)明方法利用新鮮果渣為原料，將釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母菌種經(jīng)三級活化后 再進行液體深層發(fā)酵，制得高蛋白果渣。本發(fā)明方法中三級活化菌種的培養(yǎng)基與液體深層 發(fā)酵的培養(yǎng)基成分相同，省去了活化菌種時配制專用培養(yǎng)基的成本，同時能夠最大限度地 對蘋果渣進行綜合利用；活化好的菌體能夠更好地適應(yīng)生長環(huán)境，而且由于發(fā)酵罐能夠控 制溶氧，所以菌種在接入發(fā)酵罐后能在短時間內(nèi)達到生長的高峰，同時真蛋白含量也達到 最高峰，活菌數(shù)與真蛋白含量兼顧，有效縮短了發(fā)酵周期。本發(fā)明方法在制備過程中，由于 減少了發(fā)酵過程中的人為操作，不易污染雜菌，且發(fā)酵過程中可以隨時監(jiān)測各項指標，易于 控制。
【附圖說明】
[0030] 圖1為培養(yǎng)過程中活菌數(shù)的細胞生長動力學變化曲線；
[0031] 圖2為培養(yǎng)過程中真蛋白增長動力學變化曲線。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0033] 本發(fā)明中公開的內(nèi)容中：
[0034] 1.文中所述通氣量范圍為0. 5-1 (V/V ?min)，即指每分鐘通入的無菌空氣的體積： 培養(yǎng)液的體積=〇. 5-1。例如，設(shè)置通氣量為0. 5 (V/V min)時，內(nèi)裝Im3培養(yǎng)液的發(fā)酵罐， 每分鐘通入0. 5m3的無菌空氣。
[0035] 2.文中所述真蛋白為干物質(zhì)含量。真蛋白含量測定原理為：蛋白質(zhì)在堿性條件 下，與重金屬鹽類發(fā)生作用，沉淀析出，析出的沉淀不溶于熱水，而非蛋白氮易溶于水，用熱 水洗滌沉淀，洗去非蛋白氮，剩下的沉淀物再用凱氏定氮法測定，即得真蛋白含量。
[0036] 真蛋白增長量（g/kg)=發(fā)酵后真蛋白含量（g/kg)_未發(fā)酵果渣中真蛋白含量（g/ kg) 〇
[0037] 3.通過文中所述方法進行發(fā)酵，可獲得活菌數(shù)為4-5X108cfu/mL，真蛋白含量為 175-205g/kg的發(fā)酵液，發(fā)酵液可不經(jīng)干燥直接飼喂，也可用通過流化床干燥機烘干、噴霧 干燥等，即得干燥飼料。
[0038] 4、本發(fā)明所用的釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母購自微生物研宄院
[0039] 實施例1
[0040] 一種利用鮮果渣液體深層發(fā)酵制備高蛋白果渣的方法，包括以下步驟：
[0041] 1.菌種的一級活化：將Yro培養(yǎng)基（酵母浸粉10g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、pH5-6， 蒸餾水1L)分裝入500mL的三角瓶中，裝料量30%，在121°C下滅菌15min，接入0. 5%的釀 酒酵母，25°C培養(yǎng)18h。
[0042] 2.菌種的二級活化：將1000kg蘋果渣漿料（按鮮蘋果渣120kg :水1000L的比例， 在打漿機中進行破碎打漿，破碎粒度為60目）、3kg CO(NH2)2和0.7kg甘蔗糖蜜混勻后裝入 5L的發(fā)酵罐中，裝料量70 %，在115°C下滅菌20min，接入3 %的釀酒酵母，通氣量為0. 5 (V/ V ? min)，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，25°C培養(yǎng)20h，發(fā)酵過程中pH控制在5-6。
[0043] 3.菌種的三級活化：將1000 kg蘋果渣漿料（按鮮蘋果渣120kg :水1000L的比例， 在