專利名稱：多劑量紅細(xì)胞生成素制劑的制作方法
背景技術(shù)：
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及紅細(xì)胞生成素(下文簡(jiǎn)稱″EPO″)的多劑量制劑，其中含有一種或多種特別有益的防腐劑。本發(fā)明還涉及防腐劑如芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇單獨(dú)或聯(lián)用于多劑量EPO制劑的用途。本發(fā)明還涉及使用含有芐索氯銨、苯氧乙醇和/或苯乙醇的EPO組合物治療患者的方法。本發(fā)明還涉及藥物載體組合物；用于容納組合物的小瓶；和抑制溶液中微生物生長(zhǎng)的方法；其中所有組合物或溶液均含有EPO和一種或多種防腐劑如芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇。
II.發(fā)明背景無菌，是非腸道給藥產(chǎn)品的一個(gè)最重要特征。對(duì)于用于單劑量注射的無菌非腸道產(chǎn)品而言，無菌度的保持主要與滅菌方法和包裝系統(tǒng)的完整性有關(guān)。而對(duì)于用于多劑量注射的非腸道產(chǎn)品而言，則必須加入抗微生物劑以防止產(chǎn)品在貯藏和/或使用過程中被微生物污染。
穩(wěn)定的含蛋白質(zhì)多劑量藥用制劑由于其特別有益且極具商業(yè)價(jià)值而備受制藥工業(yè)的關(guān)注。多劑量制劑一般可裝于小瓶(多劑量容器)中，其中的制劑可多次取用部分量。采用這種類型的系統(tǒng)，可從單一容器取用多劑量，可抽取并給予任何部分量的制劑，因此可對(duì)藥用組合物的給藥實(shí)現(xiàn)更有效的控制。
多劑量制劑的使用特點(diǎn)也對(duì)制劑本身提出了特殊的要求。例如，在可能將微生物和其他污染物引入制劑的多種情況如何使組合物保持無菌，是制劑面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。反復(fù)將外源物如針頭引入多劑量容器，則有可能將微生物引入容器。另外，在填充容器的過程或凍干后和給藥前的重建過程也有可能引入微生物。如果貯存時(shí)間超過容器的貯藏期-尤其是在多次引入外源物，和/或可能已引入污染物后，則需要制劑含有專門的添加劑以確保內(nèi)容物的無菌。
為了使多劑量制劑保持最佳的無菌性質(zhì)，美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)和其他對(duì)此有管轄權(quán)(jurisdictions)的管理機(jī)構(gòu)均要求所有多劑量制劑應(yīng)含有防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)或殺死任何引入制劑的微生物。由于蛋白質(zhì)固有的不穩(wěn)定性并易與防腐劑化合物發(fā)生不利作用，因此含蛋白質(zhì)多劑量制劑的研制就特別困難。防腐劑與蛋白質(zhì)間可能的不利作用包括使蛋白質(zhì)降解，尤其是長(zhǎng)期貯藏時(shí)； 使蛋白質(zhì)失活；形成蛋白質(zhì)聚集；和其他使制劑滅活或使對(duì)人的給藥變得困難、痛苦或不利的相互作用，尤其是經(jīng)輸液、注射或其他非腸道給藥時(shí)。
另外，在經(jīng)非腸道給予人時(shí)，防腐劑本身也會(huì)引起急性副作用如過敏反應(yīng)。理想的防腐劑是在較低濃度即可有效地抵抗多劑量蛋白質(zhì)藥用組合物中的多種微生物，可溶于制劑中，無毒、可與蛋白質(zhì)配伍但不與其反應(yīng)，長(zhǎng)期保持活性，并且不與容器或密閉系統(tǒng)的成分發(fā)生反應(yīng)。
Sandeep Nema等描述了多種美國(guó)市售的用于可注射產(chǎn)品的賦形劑。該篇綜述中列舉的抗微生物性防腐劑如表1所示表TABLE 1抗微生物的防腐劑
EPO是一種可刺激骨髓中產(chǎn)生血紅蛋白和紅血球的糖蛋白。它產(chǎn)生于腎臟，并廣泛用于治療各種疾病如腎衰所致的貧血。EPO的氨基酸序列其及常規(guī)糖基化作用模型均屬已知。可參見如Miyaka等和US4,703,008。從人組織或分泌液中分離和純化EPO可參見Miyake等的描述。
可采用常規(guī)重組技術(shù)進(jìn)行核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)及該序列的分離和生產(chǎn)蛋白質(zhì)。例如可參見Lin的US4,703,008，其中描述了核苷酸序列編碼EPO；Sugimoto等的US4,337,513，描述了用原淋巴細(xì)胞(lymphoblastoid)生產(chǎn)EPO；和Sherwood等描述了用人腎癌細(xì)胞系生產(chǎn)的EPO。另外，采用基因激活或同源重組和已知的分離和純化技術(shù)，可分離和純化蛋白質(zhì)。
由于EPO特別不穩(wěn)定且易與常規(guī)的藥用成分作用，使得含EPO的多劑量制劑的研制非常困難。針對(duì)上述問題，US4,806,524提出為了提高EPO蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，可將多劑量EPO制劑保持低pH值或加入多種氨基酸組分，或采用其凍干制劑，其中的防腐劑在給藥前從凍干制劑中升華出來。Woog的US5,503,827(’827專利)。
穩(wěn)定且無菌的含EPO多劑量藥用制劑較少。這其中包括’827專利公開的那些制劑?！?27專利公開并明確地要求以三氯叔丁醇(氯代丁醇，1，1，1-三氯-2-甲基-2-丙醇)、苯扎氯銨或苯甲醇為防腐劑。Woog明確地指出提供具有較低變態(tài)反應(yīng)發(fā)生率的多劑量EPO制劑特別困難，因此推介使用其要求保護(hù)的防腐劑。該專利還強(qiáng)調(diào)由于摻入防腐劑易使蛋白質(zhì)降解和滅活，必須盡量減少防腐劑與蛋白質(zhì)的接觸。’827專利還披露可加入幾種氨基酸組分和其他添加劑以穩(wěn)定溶液中的EPO。最后，’827專利在一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方案中披露可先將最初制劑中的防腐劑從凍干組合物中升華出來，然后在重建過程中加入附加的防腐劑如三氯叔丁醇、苯扎氯銨或苯甲醇，但是這種注射用重建溶液應(yīng)在30天內(nèi)使用。
US5,661,125(’125專利)公開了含EPO多劑量制劑的另一示例。該專利明確承認(rèn)并證實(shí)其他文獻(xiàn)對(duì)EPO的表述即“EPO，尤其是溶液形式的EPO是一種不穩(wěn)定物質(zhì)”，“與已知穩(wěn)定劑組合時(shí)，所得EPO的穩(wěn)定性是變化且不可預(yù)測(cè)的”。因此該專利要求保護(hù)苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸烷基酯和/或苯酚或上述組合用于含EPO溶液的防腐劑的用途。該專利進(jìn)一步證實(shí)了含EPO多劑量制劑中選用可配伍且有益的防腐劑的困難性，其中提到″...防腐劑與其他蛋白質(zhì)的應(yīng)用，并不能預(yù)見任何可用于紅細(xì)胞生成素的特定防腐制劑。可參見如Geigert，J.，“有關(guān)重組蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性和處理的綜述”，Journal ofParenteral Science & Technology，Vol.43(5)220-224(1989)″。
因此，有必要開發(fā)具有下述特征的含EPO的防腐多劑量藥用制劑(1)可在延長(zhǎng)的貯存期內(nèi)保持蛋白質(zhì)成分和組合物的穩(wěn)定性；(2)可保持制劑的無菌，并符合美國(guó)、歐洲和日本藥典有關(guān)防腐劑誘發(fā)試驗(yàn)(challenge testing)的標(biāo)準(zhǔn)；(3)所用濃度是安全的；和(4)可經(jīng)任何有效的非腸道或口服途徑給藥，并能使患者的痛苦和副作用如過敏反應(yīng)的發(fā)生幾率最小。
III.發(fā)明概述本發(fā)明提供新穎和特別有益的含紅細(xì)胞生成素和防腐劑的多劑量制劑，其中防腐劑可單獨(dú)或聯(lián)用芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇。
本發(fā)明制劑配制成各種濃度裝入不同給藥劑量的小瓶中。例如，本發(fā)明制劑可含有10,000、20,000、40,000，或甚至高達(dá)或高于100,000單位/ml的EPO。也可含有上述示例濃度范圍內(nèi)的任何濃度，例如5,000、15000、25,000單位/ml等。另外，也可配成適于1/2、1或2ml小瓶、或調(diào)劑師優(yōu)選的任何其他容積的小瓶或容器的劑量。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，劑量與小瓶的任何組合取決于調(diào)劑師需要。例如，可將本發(fā)明制劑配成10,000單位/1/2ml裝于1ml小瓶中，或配成40,000單位/ml劑量裝于2ml小瓶中，或采用任意EPO濃度與任何容積小瓶組合。組合物可制成水性溶液、混懸液或凍干制劑。
本發(fā)明的另一技術(shù)方案提供了用作EPO載體的可藥用載體，其中包括防腐劑如芐索氯銨、苯氧乙醇或苯乙醇，所述EPO載體組合物中的防腐劑可單用或聯(lián)用。本發(fā)明提供了用于容納多劑量EPO的小瓶，該小瓶中包括EPO和有效量的單用或聯(lián)用的下列防腐劑芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制含EPO溶液中微生物生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向EPO溶液中加入一種或多種下列防腐劑芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇。
本發(fā)明EPO多劑量制劑中的附加成分包括表面活性劑、緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和抗吸收劑。特別有益的添加劑包括聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、磷酸鈉、氯化鈉和genapol。
本發(fā)明制劑可以是固體、半固體、液體或流體形式，例如為片劑、水性溶液或混懸液，或?yàn)榻o藥前重建的凍干制劑形式。所述制劑可經(jīng)任何非腸道途徑給藥，這包括靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或經(jīng)肺部吸入給藥。也可經(jīng)口服給藥。IV.發(fā)明詳述本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有技術(shù)作了重要的改進(jìn)，提供了新穎的含有防腐劑的EPO多劑量藥用制劑，所述制劑可用于制備易于給藥的穩(wěn)定且無菌的組合物。另外，出人意料地是，聯(lián)用于本發(fā)明EPO多劑量藥用組合物中的苯氧乙醇和芐索氯銨顯示了積極的協(xié)同作用，這使得該組合物特別有益。具體地說，這種防腐劑的組合具有以下特征(1)協(xié)同抗微生物作用，使防腐劑的用量降低；(2)EPO在變化的貯藏條件下長(zhǎng)期貯藏仍具有良好的穩(wěn)定性；和(3)苯氧乙醇潛在的局麻作用使組合物特別適于皮下給藥。
在此所用的術(shù)語具有以下含義紅細(xì)胞生成素-是一種生物活性和糖基化形式的糖蛋白，它可誘發(fā)骨髓中血紅蛋白和紅血球的生成。采用常規(guī)重組技術(shù)或基因激活，可從人組織或分泌液中分離出來。
非腸道-指不同于胃腸道的方式，這包括經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)和髓內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和肺部吸入。
可藥用(或藥理學(xué)接受的)-指經(jīng)適當(dāng)方法給于動(dòng)物或人后，不產(chǎn)生副作用、過敏或其他不利反應(yīng)的分子實(shí)體或組合物。
可藥用載體-包括可用作藥用物質(zhì)介質(zhì)的任一溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。
單位-指通過exhypoxic polyeythemic小鼠生物測(cè)定測(cè)得的生物學(xué)活性單位，相當(dāng)于世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)。
在此所述的任何數(shù)值，包括增量為1個(gè)單位的較低值與較高值之間的所有數(shù)值，其中所述任何較低值與任何較高值之間至少相差2個(gè)單位。例如，如果組分濃度或過程變量如滲透壓、溫度、壓力、時(shí)間等表述為1-90、優(yōu)選為20-80和更優(yōu)選為30-70，則表明說明書中也清楚地列舉了例如15-85、22-68、43-51、30-32等的數(shù)值。對(duì)于那些低于1的數(shù)值，一個(gè)單位相當(dāng)于0.0001、0.001、0.01或0.1。那些具有特定含義的示例值及所列舉的最低值與最高值之間的所有可能數(shù)值，均以同樣方式清楚地列于說明書中。
A.防腐劑苯氧乙醇和芐索氯銨本發(fā)明的防腐劑優(yōu)選采用芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇，或這些防腐劑的變體及其結(jié)構(gòu)類似物。任一上述防腐劑均可單獨(dú)、或有益地相互組合用于本發(fā)明制劑。本發(fā)明制劑優(yōu)選采用苯氧乙醇與芐索氯銨的組合。
本發(fā)明制劑可采用任一有效量的芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇。防腐劑的總濃度優(yōu)選約占制劑總量的0.001％-4.0％。防腐劑的總濃度應(yīng)盡可能地低，但仍保持其抗微生物效力，這樣就降低了副作用的發(fā)生機(jī)率。盡管芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇均可單獨(dú)用作防腐劑，但是其單用所需的濃度藥高于聯(lián)用時(shí)的濃度。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，可聯(lián)用芐索氯銨和苯氧乙醇。出人意料地是，這些防腐劑的聯(lián)用產(chǎn)生了協(xié)同作用。為了達(dá)到與聯(lián)用時(shí)相同的抗微生物效力，單用時(shí)芐索氯銨或苯氧乙醇的用量要高于它們聯(lián)用時(shí)的總量，通常至少是聯(lián)用時(shí)的兩倍量。例如，如果單用芐索氯銨或苯氧乙醇，要達(dá)到與聯(lián)用時(shí)用量相同抗微生物效力，則至少要求兩倍的芐索氯銨或苯氧乙醇。實(shí)際上，含有高濃度芐索氯銨和苯氧乙醇的單一防腐劑制劑并不符合美國(guó)、歐洲或日本有關(guān)抗微生物管理標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)選制劑含優(yōu)約0.001-0.1％的芐索氯銨和約0.01-1.0％的苯氧乙醇。更優(yōu)選制劑含有約0.01％-0.02％的芐索氯銨和約0.25％-0.5％的苯氧乙醇。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括芐索氯銨聯(lián)用苯乙醇。優(yōu)選制劑包括約0.001-0.1％的芐索氯銨與約0.01-1.0％的苯乙醇聯(lián)用。更優(yōu)選制劑含有約0.15-0.25％的芐索氯銨和約0.2-0.5％的苯乙醇。最優(yōu)選制劑聯(lián)用芐索氯銨和苯乙醇，其中包括約0.02％的芐索氯銨和約0.25％的苯乙醇。
B.紅細(xì)胞生成素EPO的核苷酸序列、氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)和典型的糖基化模式均屬已知。從各種來源分離和純化EPO亦屬已知。因此，通過常規(guī)的重組技術(shù)或基因激活方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可制得本發(fā)明所用的EPO。所有上述方法明確地包含于本發(fā)明范疇內(nèi)。另外，本發(fā)明也可采用任何其它來源的EPO。
C.其他活性組分根據(jù)制劑的預(yù)期貯藏時(shí)間、預(yù)期的貯藏和使用條件和適用的特定患者群等因素，可對(duì)本發(fā)明最佳的制劑加以變化。按照調(diào)劑師的需要，可對(duì)制劑組分的種類及其用量加以調(diào)節(jié)，但不對(duì)上述防腐劑芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇及EPO加以調(diào)節(jié)。本發(fā)明EPO多劑量制劑中的附加成分還可包括水、緩沖劑、表面活性劑或抗吸收劑、潤(rùn)濕劑和滲透壓調(diào)節(jié)劑。該制劑的特征在于可加以調(diào)節(jié)，例如調(diào)節(jié)pH值和滲透壓，可制得與人血液和組織具有相同pH值和滲透壓的制劑。
本發(fā)明所用的緩沖劑可用來調(diào)節(jié)藥用制劑的總pH值。許多本領(lǐng)域已知的緩沖劑可用于本發(fā)明制劑，例如各種有機(jī)或無機(jī)酸、堿或氨基酸鹽，包括各種形式的檸檬酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、丁二酸鹽、己二酸鹽、馬來酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽、碳酸氫鹽或碳酸鹽離子。特別適用于本發(fā)明的緩沖劑包括鈉或鉀緩沖劑，尤其是磷酸鈉。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所用磷酸鈉的濃度約為20mM。一種特別有效的磷酸鈉緩沖劑系統(tǒng)包括磷酸二氫鈉一水合物和磷酸氫二鈉七水合物。當(dāng)二者組合使用時(shí)，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的有益濃度分別約為0.5-1.5mg/ml和2.0-4.0mg/ml，優(yōu)選分別約為0.9mg/ml和3.4mg/ml。制劑的pH值隨緩沖劑的用量而變化。優(yōu)選制劑的pH值為5.0-8.0、更優(yōu)選約為6.0-7.5和最優(yōu)選約為7.0。
本發(fā)明制劑中應(yīng)用表面活性劑是有益的。本發(fā)明所用的表面活性劑或抗吸收劑包括聚氧乙烯脫水山梨醇，聚氧乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯，聚山梨酯-20例如Tween20TM和聚山梨酯-80，氧化纖維素和genapol。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，采用了聚山梨酯-20。本發(fā)明所用表面活性劑的有益濃度約為0.01-0.5mg/ml。在一特別有益的優(yōu)選實(shí)施方案中，所用聚山梨酯20的濃度約0.1mg/ml。
根據(jù)特定的需求和本發(fā)明預(yù)期的用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定所需的其他添加劑。一種特別有益的添加物是氯化鈉，它可將制劑的滲透壓調(diào)節(jié)到所需水平。特別優(yōu)選滲透壓約為270-330mOsm/kg。本發(fā)明制劑的最佳滲透壓約為300mOsm/kg。加入約6.5-7.5mg/ml的氯化鈉即可達(dá)到這一滲透壓，采用約7.0mg/ml的氯化鈉則特別有效?；蛘咚勇然c的量可將滲透壓調(diào)節(jié)到約270-330mOsm/kg、優(yōu)選為300mOsm/kg。其它有益的滲透壓調(diào)節(jié)劑包括甘露醇和山梨醇。
D.制備組合物在水中與適宜的表面活性劑如羥丙纖維素或聚氧乙烯脫水山梨醇混合，可制得本發(fā)明EPO制劑。在許多情況下，優(yōu)選還包括等滲劑例如上述糖或氯化鈉。組合物中加入延緩吸收劑，可使注射組合物的吸收時(shí)間延長(zhǎng)，此類物質(zhì)如單硬脂酸鋁或明膠。其他有用的試劑包括但不限于卵磷脂、尿素、環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、羥丙基纖維素、甲基纖維素或聚乙二醇。
在此描述的水性組合物(注射物(inocula))中包括溶解或分散于可藥用水性介質(zhì)的有效量的EPO。該組合物也指注射物。適于藥用活性物質(zhì)的藥用載體介質(zhì)和試劑在本領(lǐng)域是已知的。只要不與活性組分有配合禁忌，任何常規(guī)介質(zhì)和試劑均可加到治療組合物中。附加活性成分也可摻入上述組合物中。
蛋白多糖如EPO可以中性或鹽的形式加入組合物中。藥用鹽包括酸加成鹽(用蛋白質(zhì)的游離氨基形成)和用無機(jī)酸如鹽酸、磷酸形成的鹽，或用有機(jī)酸如醋酸、草酸、酒石酸和苦杏仁酸形成的鹽等。用游離羧基形成的鹽也可衍生于無機(jī)堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，和有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。
以液體或混懸液的注射組合物方式給予本發(fā)明治療組合物是有益的；適于以固體或混懸液給藥的固體制劑，可在注射前配成液體。一種用于此目的典型組合物包括可藥用載體。例如，組合物可含有10mg、25mg、50mg或高至約100mg人血清白蛋白/ml磷酸鹽緩沖的生理鹽水。
在此描述的制劑可裝于小瓶、瓶、 管、注射管或其他適于單或多次給藥的容器。此類容器可用玻璃或高分子材料如聚丙烯、聚乙烯或聚二氯乙烯。優(yōu)選容器配有密封或其他封閉系統(tǒng)例如橡膠塞，它允許針頭刺入抽出單劑量并在拔出針頭后再密封上。本領(lǐng)域已知的可用于容納注射液、凍干制劑、重建凍干制劑或重建粉末的所有此類容器均可用于本發(fā)明組合物和方法。
V.實(shí)施例以下實(shí)施例旨在示例說明，對(duì)本發(fā)明范疇沒有限制。
A.實(shí)施例1防腐劑的選擇和穩(wěn)定性試驗(yàn)材料和方法磷酸二氫鈉一水合物，USP(美國(guó)藥典)標(biāo)準(zhǔn)；磷酸氫二鈉七水合物磷酸鈉，USP標(biāo)準(zhǔn)；氯化鈉USP/EP(歐洲藥店)標(biāo)準(zhǔn)；和聚山梨酯20，USP/NF(美國(guó)國(guó)家處方集)標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自Mallinckrodt Baker公司的子公司J.T.Baker公司，Phillipsburg，NH 08865。
苯扎氯銨，USP/NF標(biāo)準(zhǔn)；2-苯氧乙醇，BP(英國(guó)藥典)標(biāo)準(zhǔn)；苯乙醇，USP/NF標(biāo)準(zhǔn)；硫汞撒，USP/NF標(biāo)準(zhǔn)；苯酚結(jié)晶，USP標(biāo)準(zhǔn)；芐索氯銨，USP/NF標(biāo)準(zhǔn)；間甲酚，USP標(biāo)準(zhǔn)；硝酸苯汞，USP/NF標(biāo)準(zhǔn)；苯甲醇，USP標(biāo)準(zhǔn)；三氯叔丁醇，USP標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)羥基苯甲酸甲酯，USP/NF標(biāo)準(zhǔn)；和對(duì)羥基苯甲酸丙酯，USP/NF標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自Spectrum Quality products公司，Gardena，CA 90248。
肉豆蔻基γ-picolinium chloride購(gòu)自Pharmacia & Upjohn公司，Kalamazoo，Michigan 49001。
用注射用水，將含EPO的多劑量溶液配成濃度為10,000單位和20,000單位的無菌且無熱源的無色水性溶液。所得溶液含有20mM磷酸鹽緩沖劑(磷酸二氫鈉一水合物和磷酸氫二鈉七水合物)、0.01％w/v聚山梨酯20抗吸收劑、0.45-0.8％w/v氯化鈉(視防腐系統(tǒng)的不同，氯化鈉的用量應(yīng)確保將滲透壓調(diào)節(jié)到約為300mOsm/kg)，和防腐系統(tǒng)。制得的溶液的pH值約為7.0、滲透壓約為300mOsm/kg。
溶液經(jīng)0.22微米的微孔濾器滅菌后，裝入2ml無菌的無色USP1型玻璃小瓶中，并于5℃和25℃下貯藏供化學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)，裝于250-500mlHDPP(高密度聚乙烯)無菌瓶中的溶液用于微生物試驗(yàn)。
待試防腐劑包括苯甲醇1.0％w/v，苯扎氯銨0.01％w/v，2-苯氧乙醇0.5％w/v，苯乙醇0.5w/v，硫汞撒0.005％和0.01％w/v，苯酚結(jié)晶0.4％w/v，芐索氯銨0.01％和0.02％w/v，間甲酚0.4％w/v，硝酸苯汞0.002％w/v，對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.1和0.18％w/v，和對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.03％和0.035％w/v，和肉豆蔻基-γ-picolinium chloride 0.02％w/v。同時(shí)，還對(duì)下述組合進(jìn)行了研究(1)芐索氯銨0.005％w/v與苯氧乙醇0.25％w/v組合；(2)芐索氯銨0.005％與苯氧乙醇0.5％w/v組合；(3)芐索氯銨0.01％w/v與苯氧乙醇0.5％w/v組合；和(4)苯乙醇0.25％w/v與芐索氯銨0.02％w/v組合。討論當(dāng)將對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、間甲酚或苯酚加到EPO制劑(經(jīng)緩沖的溶液)中時(shí)，溶液變混濁。這被認(rèn)為是吸附劑聚山梨酯20與上述每一防腐劑均不配伍所致(藥用賦形劑手冊(cè)，1994年)。
盡管三氯叔丁醇用于制劑中可形成澄明溶液，但是仍中止了試驗(yàn)，這是由于其在pH值＞3下不穩(wěn)定，其pH值7.5時(shí)的半衰期僅約為3個(gè)月(藥用賦形劑手冊(cè)，1994年)。
含有硝酸苯汞可使溶液混濁，這是由于硝酸苯汞與等滲劑氯化鈉不配伍所致(藥用賦形劑手冊(cè)，1994年)。
硫汞撒用于EPO制劑時(shí)也可形成澄明溶液，并顯示有良好的防腐劑效力。另外，含有硫汞撒的EPO制劑具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。但是，由于其中含有汞而可能不被歐洲、日本和美國(guó)的管理機(jī)構(gòu)所接受。
含有苯甲醇、芐索氯銨、苯氧乙醇、苯乙醇、苯扎氯銨和肉豆蔻基-γ-picolinium chloride的制劑可形成澄明的溶液?；诜栏瘎┑淖钚∫志鷿舛?、安全性和使用頻率方面的考慮，選擇了以下防腐劑供進(jìn)一步化學(xué)評(píng)估研究它們對(duì)EPO制劑的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和抗微生物效力苯甲醇、芐索氯銨、苯氧乙醇、苯乙醇、及芐索氯銨與苯氧乙醇的幾種組合。
B.實(shí)施例2待試蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性材料和方法采用上述選定的防腐劑制備試樣，并置于5℃和25℃供穩(wěn)定性試驗(yàn)。試樣用反相HPLC法測(cè)定。含防腐劑的EPO制劑的分析結(jié)果(％標(biāo)識(shí)量(label claim))見表2。
采用反相HPLC測(cè)定標(biāo)識(shí)量，所用柱為Waters Delta-Pak C18柱，梯度洗脫液為含有0.05％ TFA和濃度由23％增加到86％的乙腈的水性溶液。于210nm處檢測(cè)EPO蛋白質(zhì)。
表2濃度分析結(jié)果(％標(biāo)識(shí)量)防腐劑 月數(shù) 濃度 化學(xué)分析(％LC)15℃25℃苯甲醇 7月 10,000U/ml 98.6 90.0苯甲醇 7月 20,000U/ml 99.7 93.7苯乙銨 4月 10,000U/ml 99.9 88.9苯乙銨 4月 20,000 U/ml 101.5 94.4苯氧乙醇4月 10,000 U/ml 100.5 96.9苯氧乙醇4月 20,000 U/ml 102.6 97.5苯乙銨和苯氧乙醇3月 20,000 U/ml 98.3 97.0(0.005％和0.5％)1為反相HPLC測(cè)定。
如表2中的反相HPLC數(shù)據(jù)所示，所有處方在5℃下貯存3-7月后未見有EPO損失。然而，單獨(dú)含有苯甲醇或芐索氯銨的處方25℃下貯存3-7月后，EPO卻有高達(dá)10％的損失。含有苯氧乙醇或苯氧乙醇與芐索氯銨組合的處方25℃下貯存3-4月后未見有EPO損失。這些結(jié)果表明，苯氧乙醇、苯氧乙醇與芐索氯銨聯(lián)用對(duì)EPO具有穩(wěn)定化作用，這種效果非常有益而且是出人意料的。
C.實(shí)施例3防腐劑誘發(fā)(challenge)試驗(yàn)防腐劑效力試驗(yàn)采用Compendial-guided分析法，測(cè)定了多劑量藥用制劑中防腐系統(tǒng)的效力。在該試驗(yàn)中，用含有需氧菌和霉菌指示菌的標(biāo)準(zhǔn)懸浮液攻擊待試制劑，并在28天內(nèi)監(jiān)測(cè)微生物的存活狀況。
表3為USP和EP防腐劑誘發(fā)試驗(yàn)結(jié)果。所有待試處方均符合USP的防腐劑誘發(fā)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。含有0.01％w/v芐索氯銨、0.5％w/v苯氧乙醇或0.5％w/v苯乙醇的處方在EP標(biāo)準(zhǔn)的防腐劑誘發(fā)試驗(yàn)中失敗。含有芐索氯銨與苯氧乙醇不同組合、或芐索氯銨與苯乙醇不同組合的處方均符合USP和EP的防腐劑誘發(fā)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。如表3數(shù)據(jù)所示，加入的苯氧乙醇以一種協(xié)同作用的方式，出人意料地提高了芐索氯銨的抗微生物效力。
表3防腐劑誘發(fā)試驗(yàn)防腐劑 濃度 防腐劑誘發(fā)USPEP苯甲醇(1.0％) 20,000 U/ml 合格 未試驗(yàn)苯乙銨20,000 U/ml(0.01％) 合格 失敗(0.02％) 合格 合格苯氧乙醇(0.5％)20,000 U/ml 合格 失敗苯乙銨和苯氧乙醇 20,000 U/ml 合格 合格(0.005和0.25％)(0.005和0.5％)(0.01和0.5％)苯乙醇(0.5％) 20,000 U/ml 合格 失敗苯乙銨和苯乙醇 20,000 U/ml 合格 合格(0.02知0.25％)參考Sugimoto等的US 4,377,573；Lin的US 4,703,008；Kawagachi等的US 4,806,524；Woog等的US 5,503,827；Stricklan等的US 5,661,125；藥用賦形劑手冊(cè)，第2版，1994年；L.A.Trissel，″注射藥物手冊(cè)″第8版，American Society of HospitalPharmacists公司，1994年；Miyaka等，″紅細(xì)胞生成素的提純，″J.Biol.Chem.，252(15)5558-5564頁，1997年；醫(yī)師桌面參考，第48版，1994年；醫(yī)師桌面參考，第50版，1996年；Sandeep Nema，R.J.Washkuhn，和R.J.Brendel，″賦形劑及其在可注射產(chǎn)品中的應(yīng)用″，PDA Journal of pharmaceutical Sciences &Technology，51(4)，7-8月，1997年；Shewood等，″用人腎癌培養(yǎng)物生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素″，Endocrinology，99(2)504-510頁，1976年；Sherwood等，“培養(yǎng)可生產(chǎn)人紅細(xì)胞生成素的腎癌細(xì)胞系”，ClinicalResearch，31323A，1983年。
權(quán)利要求
1.一種藥用組合物，其中含有紅細(xì)胞生成素和抑制組合物中微生物生長(zhǎng)有效量的芐索氯銨。
2.如權(quán)利要求1的組合物，其中還包括苯氧乙醇。
3.如權(quán)利要求1的組合物，其中還包括苯乙醇。
4.如權(quán)利要求1的組合物，其中芐索氯銨的有效濃度約為0.001-1.0％。
5.如權(quán)利要求1的組合物，其中芐索氯銨的有效濃度約為0.01-0.1％。
6.如權(quán)利要求1的組合物，其中芐索氯銨的有效濃度為0.005％。
7.如權(quán)利要求1的組合物，其中芐索氯銨的有效濃度為0.01％。
8.如權(quán)利要求1的組合物，其中芐索氯銨的有效濃度為0.02％。
9.如權(quán)利要求2的組合物，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.001-1.0％和0.01-1.0％。
10.如權(quán)利要求2的組合物，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.01-0.1％和0.1-0.75％。
11.如權(quán)利要求2的組合物，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.25％。
12.如權(quán)利要求2的組合物，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.5％。
13.如權(quán)利要求2的組合物，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.01％和0.5％。
14.如權(quán)利要求3的組合物，其中芐索氯銨和苯乙醇的濃度分別月為0.02％和0.25％.。
15.如權(quán)利要求3的組合物，其中還包括0.02％的芐索氯銨和0.25％的苯乙醇。
16.如權(quán)利要求1的組合物，其中包括鹽。
17.如權(quán)利要求16的組合物，所述鹽為氯化鈉。
18.如權(quán)利要求1的組合物，其中包括緩沖劑。
19.如權(quán)利要求18的組合物，所述緩沖劑為磷酸鈉。
20.一種可用作紅細(xì)胞生成素載體的藥用載體組合物，其中所述載體含有抑制組合物中微生物生長(zhǎng)有效量的芐索氯銨。
21.如權(quán)利要求20的組藥用載體，還包括苯氧乙醇。
22.如權(quán)利要求20的組藥用載體，還包括苯乙醇。
23.如權(quán)利要求20的組藥用載體，其中芐索氯銨的有效濃度約為0.001-1.0％。
24.如權(quán)利要求20的組藥用載體，其中芐索氯銨的有效濃度約為0.01-0.1％。
25.如權(quán)利要求20的組藥用載體，其中芐索氯銨的有效濃度為0.005％。
26.如權(quán)利要求20的組藥用載體，其中芐索氯銨的有效濃度為0.01％。
27.如權(quán)利要求20的組藥用載體，其中芐索氯銨的有效濃度為0.02％。
28.如權(quán)利要求21的組藥用載體，芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.001-1.0％和0.01-1.0％。
29.如權(quán)利要求21的組藥用載體，芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.01-0.1％和0.1-0.75％。
30.如權(quán)利要求21的組藥用載體，芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.25％。
31.如權(quán)利要求21的組藥用載體，芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.5％。
32.如權(quán)利要求21的組藥用載體，芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.01％和0.5％。
33.如權(quán)利要求22的組藥用載體，芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.02％和0.25％。
34.如權(quán)利要求20的組藥用載體，還包括選自緩沖劑、鹽類、抗吸收劑和表面活性劑的一種或多種添加劑。
35.一種用于容納多劑量紅細(xì)胞生成素的小瓶，所述小瓶中含有包括紅細(xì)胞生成素和抑制組合物中微生物生長(zhǎng)有效量的芐索氯銨的溶液。
36.如權(quán)利要求35的小瓶，其中所述溶液還包括苯氧乙醇。
37.如權(quán)利要求35的小瓶，其中所述溶液還包括苯乙醇。
38.如權(quán)利要求35的小瓶，其中芐索氯銨的有效濃度約為0.001-1.0％。
39.如權(quán)利要求35的小瓶，其中芐索氯銨的有效濃度約為0.01-0.1％。
40.如權(quán)利要求35的小瓶，其中芐索氯銨的有效濃度為0.005％。
41.如權(quán)利要求35的小瓶，其中芐索氯銨的有效濃度為0.01％。
42.如權(quán)利要求35的小瓶，其中芐索氯銨的有效濃度為0.02％。
43.如權(quán)利要求36的小瓶，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.001-1.0％和0.01-1.0％。
44.如權(quán)利要求36的小瓶，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.01-0.1％和0.1-0.75％。
45.如權(quán)利要求36的小瓶，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.25％。
46.如權(quán)利要求36的小瓶，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.5％。
47.如權(quán)利要求36的小瓶，其中芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別約為0.01％和0.5％。
48.如權(quán)利要求37的小瓶，其中芐索氯銨和苯乙醇的濃度分別為0.02％和0.25％。
49.如權(quán)利要求37的小瓶，和包括約0.02％的芐索氯銨和約0.25％的苯乙醇。
50.如權(quán)利要求1的小瓶，其中所述溶液還包括鹽類。
51.如權(quán)利要求50的小瓶，其中所述鹽為氯化鈉。
52.如權(quán)利要求35的小瓶，其中所述溶液還包括緩沖劑。
53.如權(quán)利要求52的小瓶，其中所述緩沖劑為磷酸鈉。
54.一種抑制含紅細(xì)胞生成素溶液中微生物生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向溶液中加入芐索氯銨。
55.如權(quán)利要求54的方法，其中所述方法還包括向溶液中加入苯氧乙醇。
56.如權(quán)利要求54的方法，其中所述方法還包括向溶液中加入苯乙醇。
57.如權(quán)利要求54的方法，其中所加芐索氯銨的濃度約為0.001-1.0％。
58.如權(quán)利要求54的方法，其中所加芐索氯銨的濃度約為0.01-0.1％。
59.如權(quán)利要求54的方法，其中所加芐索氯銨的濃度為0.005％。
60.如權(quán)利要求54的方法，其中所加芐索氯銨的濃度為0.01％。
61.如權(quán)利要求54的方法，其中所加芐索氯銨的濃度為0.02％。
62.如權(quán)利要求55的方法，其中所加芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.001-1.0％和0.01-1.0％。
63.如權(quán)利要求55的方法，其中所加芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.01-0.1％和0.1-0.75％。
64.如權(quán)利要求55的方法，其中所加芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.25％。
65.如權(quán)利要求55的方法，其中所加芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.005％和0.5％。
66.如權(quán)利要求55的方法，其中所加芐索氯銨和苯氧乙醇的濃度分別為0.01％和0.5％。
67.如權(quán)利要求55的方法，其中所加芐索氯銨和苯乙醇的濃度分別為0.02％和0.25％。
68.如權(quán)利要求56的方法，其中所加芐索氯銨和苯乙醇的濃度分別約為0.02％和0.25％。
69.如權(quán)利要求54的方法，還包括向溶液中加入鹽類。
70.如權(quán)利要求69的方法，其中所述鹽類為氯化鈉。
71.如權(quán)利要求54的方法，還包括向溶液中加入緩沖劑。
72.如權(quán)利要求71的方法，其中所述緩沖劑為磷酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于非腸道給藥的多劑量紅細(xì)胞生成素制劑。該制劑含有一種或多種防腐劑如芐索氯銨、苯氧乙醇和苯乙醇。
文檔編號(hào)A61K47/02GK1371284SQ00812138
公開日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2000年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月22日
發(fā)明者A·加耶德 申請(qǐng)人:阿溫蒂斯藥物公司