專利名稱：一種能特異性殺滅eb病毒相關(guān)腫瘤的重組病毒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能在Epstein-Barr病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖及表達(dá)晚期基因，而在Epstein-Barr病毒陰性正常細(xì)胞內(nèi)不增殖及不表達(dá)晚期基因的重組溶細(xì)胞性病毒，及其構(gòu)建和增殖的方法。
惡性腫瘤嚴(yán)重危及人類的生命健康。目前對惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手術(shù)及放、化療，這種常規(guī)治療對極大多數(shù)腫瘤的療效仍不十分理想，對于極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的方法對腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的方法主要依賴于腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，其療效也決定于該腫瘤標(biāo)記是否嚴(yán)格限制于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
人類腫瘤大約15％與病毒有關(guān)，數(shù)種與人腫瘤相關(guān)的病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)潛伏感染，而在正常細(xì)胞中則潛伏感染率非常低及病毒負(fù)荷很小。如Epstein-Barr病毒(按常規(guī)簡稱EB病毒，記為EBV，下同)在Barkitt’s淋巴瘤和未分化鼻咽癌所有細(xì)胞內(nèi)均可潛伏感染，其病毒基因EBNA-1在上述腫瘤細(xì)胞中均表達(dá)，而在正常細(xì)胞中則非常低，其外周血中單個核細(xì)胞中陽性率為10-5-10-6，在成人其它正常細(xì)胞中幾乎均呈陰性。又如HPV病毒在90％宮頸癌細(xì)胞均可潛伏感染，其宮頸癌細(xì)胞通常均表達(dá)HPV病毒的E6及E7基因，而這種基因在正常細(xì)胞中表達(dá)率極低或陰性。因此，在與這種病毒相關(guān)的腫瘤病人中，其病毒蛋白可作為非常好的腫瘤標(biāo)記。人們已將這些腫瘤細(xì)胞上的病毒蛋白作為免疫治療的特異性靶目標(biāo)，但由于在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中，為逃避免疫監(jiān)控，腫瘤細(xì)胞發(fā)生很多變化，如很多腫瘤細(xì)胞MHC1類基因表達(dá)及抗原提呈能力下調(diào)，缺乏免疫細(xì)胞刺激的第二信號，因而不能有效激活細(xì)胞毒T細(xì)胞來殺滅腫瘤細(xì)胞，因此在臨床上免疫治療療效并十分不理想。
基因治療是近年興起的一種新的治療惡性腫瘤方法。其基因轉(zhuǎn)染方法分病毒法及非病毒法兩種。病毒法通常采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒及痘苗病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有較高的轉(zhuǎn)染率，但病毒滴度偏低，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低，而且只能感染分裂期的細(xì)胞，同時具有整合至染色體，存在癌變的可能性的缺點(diǎn)。腺相關(guān)病毒具有轉(zhuǎn)染分裂及靜止細(xì)胞的能力，能持久的表達(dá)。非病毒法包括脂質(zhì)體及基因槍等方法，其轉(zhuǎn)染基因表達(dá)時間較短，轉(zhuǎn)染率較低。腺病毒是目前腫瘤基因治療中最常見病毒載體，已廣泛地應(yīng)用于人體基因治療方案中，具有容易生產(chǎn)及純化的特點(diǎn)，它在體內(nèi)及體外均能有效轉(zhuǎn)染分裂及靜止細(xì)胞，無致癌性。
目前腫瘤基因治療的主要障礙是不能有效地將目的基因特異性轉(zhuǎn)染所有的腫瘤細(xì)胞，而基因治療的療效與腫瘤細(xì)胞受基因轉(zhuǎn)染的數(shù)量密切相關(guān)，因此，研究與發(fā)展特異性轉(zhuǎn)染所有腫瘤細(xì)胞的病毒載體系統(tǒng)在腫瘤基因治療中至關(guān)重要。
近年來，國際上興起了腫瘤特異性增殖的病毒的研究，根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞某些生物學(xué)特性的差異，經(jīng)過改造的病毒只能特異性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、裂解腫瘤細(xì)胞，然后釋放出病毒顆粒，再次感染其它腫瘤細(xì)胞，再次增殖、裂解，如此產(chǎn)生放大效應(yīng)，由于病毒能夠彌散到全身各個組織及臟器，因而能感染所有腫瘤細(xì)胞，從而殺滅局部及轉(zhuǎn)移的腫瘤，而不影響正常細(xì)胞。
典型的例子有三個，第一個為E1B 55Kda蛋白失活的腺病毒ONYX-015，其主要機(jī)理為很多研究者發(fā)現(xiàn)P53在腫瘤癌變過程中起很大作用，P53突變或失活可使DNA損傷的細(xì)胞繼續(xù)分裂及復(fù)制，當(dāng)其它基因也產(chǎn)生突變時就可能發(fā)生癌變。P53也是宿主細(xì)胞抗病毒的主要蛋白，在正常細(xì)胞中病毒感染細(xì)胞后即可激活P53，如腺病毒增殖所必需的基因E1A區(qū)可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖并同時激活P53，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使病毒復(fù)制終止。然而在極大多數(shù)情況下，正常細(xì)胞感染腺病毒后并沒有出現(xiàn)立即凋亡，主要原因腺病毒尚存在著關(guān)閉激活P53功能的蛋白即E1B 19Kda和55Kda兩個蛋白，前者作用于P53下游，阻止細(xì)胞凋亡，后者與P53結(jié)合阻止P53激活，因此野生型腺病毒能在正常細(xì)胞內(nèi)生存并復(fù)制增殖。當(dāng)腺病毒缺乏E1B區(qū)55Kda的蛋白，在正常細(xì)胞內(nèi)由于P53具有正常功能，因此，很快被激活，從而使細(xì)胞凋亡，使腺病毒不能得到有效的復(fù)制及增殖，從而使感染終止，而在P53突變或失活的腫瘤細(xì)胞中，病毒感染后，P53不能被激活，因此缺乏E1B的腺病毒，仍能復(fù)制及增殖，使病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解死亡，并釋放新的病毒感染其它腫瘤細(xì)胞，這使所有腫瘤細(xì)胞均受感染并死亡。在體內(nèi)及體外ONYX-015對P53突變與功能異常的腫瘤均具有明顯療效，同時發(fā)現(xiàn)ONYX-015和化療藥物5-氟脲嘧啶(5-Fu)順鉑具有明顯的協(xié)同作用。1999年3月已結(jié)束II期臨床試驗(yàn)，對于30例常規(guī)治療后無效的頭頸部腫瘤病人，應(yīng)用該病毒聯(lián)合常規(guī)化療，結(jié)果表明19例腫瘤縮小一半以上(占63％)，其中8例腫瘤完全消退(占27％)，僅有17％病人無效，到目前已隨訪1-11月，無一例復(fù)發(fā)，且無明顯的毒性作用(1.Bischoff JR，Kirn DH，Williams A，et al.Anadenovirus mutant that replicaties selective in p53-deficientes humancells.Science 1996，274，373-376.2.Heise C，Sampson-Johannes A，Williams A，et al.Onyx-015，an E1b gene-attenuated adenovirus，causestumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmentedby standard chemotherapeutic agents.Nature Medicine，1997，3，639-645.3.McCormic k.Cytopathic for therapy and prophylaxis of neoplasia.1998，United States Patent 5,801,029.4.McCormick.Cytopathic for therapyand prophylaxis of neoplasia.1997，United States Patent 5,677,178.5.McCormick.Cytopathic for therapy and prophylaxis of neoplasia.1998，United States Patent 5,846,945.6.McCormick.Cytopathic fortherapy and prophylaxis of neoplasia.1999，United States Patent5,856,181)。
另一個成功的例子來自對單純瘡疹病毒的研究。單純瘡疹病毒具有明顯的嗜神經(jīng)細(xì)胞特性，在靜止細(xì)胞中其核糖核苷酸還原酶和胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(HSV-TK)為病毒DNA復(fù)制所必需的基因，這在快速生長的細(xì)胞中如腫瘤細(xì)胞病毒DNA復(fù)制則不需要上述兩個基因，這是因?yàn)樵诳焖偕L的細(xì)胞存在著足夠數(shù)量的核苷酸，因此，在缺乏HSV-TK的情況下也可以使病毒復(fù)制，由于正常中樞神經(jīng)細(xì)胞處于靜止期，顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞則處于生長期。因此，Martuza RL等人應(yīng)用缺失HSV-TK的單純性瘡疹病毒來治療膠質(zhì)瘤，其在體外也有效溶解生長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。在裸鼠體內(nèi)應(yīng)用該病毒直接注射膠質(zhì)瘤細(xì)胞或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤可使病毒明顯繁殖，并抑制腫瘤生長。這個實(shí)驗(yàn)隨后被其它研究組在免疫功能正常的大鼠9L膠質(zhì)癌模型中證實(shí)。1998年開始進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)(Mineta T，Rabkin SD，YazakiT，ea al.Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for thetreatment of malignant gliomas.Nature Med，1995，1，938-943)。第三個例子來自Rodriguez R等報告，應(yīng)用前列腺特性抗原(PSA)啟動子插入腺病毒5型增殖所必需基因(E1A)上游區(qū)，命名為CN706，該病毒的E1A基因表達(dá)受PSA起動子的嚴(yán)格控制，在分泌PSA的前列腺癌的細(xì)胞株LNCaP中，E1A基因表達(dá)下降99％，其腺病毒則增殖能力明顯減少，所產(chǎn)生的病毒滴度比分泌PSA的前列腺癌細(xì)胞株LNCaP低150倍，這表明腺病毒CN706能相當(dāng)特異性地在分泌PSA的細(xì)胞株中復(fù)制及增殖。用該病毒一次性注射給裸鼠體內(nèi)能有效殺死1×109個分泌PSA的LNCaP腫瘤細(xì)胞并使PSA分泌消失，而對不分泌PSA的DU145則無效，目前該研究已在美國進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。該研究應(yīng)用真核細(xì)胞某些組織特異性激活順式作用元件控制病毒早期基因的增殖腺病毒(1.Rodriguez R，Schuur ER，Lim HY，et al.Prostate attenuated replication competent adenovirus(ARCA)CN706Aselective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancercells.Cancer Res，1997，57，2559-2563.2.Henderson，et al.Tissue specificand tumor growth supperssion by adenovirus comprising prostate specificantigen.1999，United States Patent 5,871,726.3.Henderson，et al.Tissuespecific viral vectors.1997，United States Patent 5,698,443)。
但迄今為止，尚未見到應(yīng)用EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件控制病毒早期基因的增殖病毒的報告本發(fā)明的目的在于提供一類能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒及其構(gòu)建方法，即該病毒能選擇性地在EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及增殖，而在EB病毒陰性的正常細(xì)胞內(nèi)基本不復(fù)制及基本不增殖，從而特異性抑制或殺滅EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明提供的能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒，其修飾病毒基因組中非增殖必需區(qū)域插入有目的基因。該目的基因?yàn)?1)抑癌基因、(2)血管抑制基因、(3)細(xì)胞因子基因、(4)前藥轉(zhuǎn)換酶基因及(5)細(xì)胞凋亡基因之一種。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)?1)抑癌基因，抑癌基因能抑制腫瘤細(xì)胞生長，抑癌基因包含以下一個基因P53、Rb、NF1、VHL及APC。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)?2)血管抑制基因，血管抑制基因抑制腫瘤新生血管形成，可阻斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡，腫瘤明顯萎縮乃至完全消褪。同時抑制腫瘤新生血管的形成，也達(dá)到阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的通路的目的。血管抑制基因包含以下一個基因內(nèi)皮抑素基因，血管生成抑素基因，為血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu)、Kringle1-5結(jié)構(gòu)、Kringle1-3結(jié)構(gòu)及Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)、干擾素-α基因、干擾素-β基因、干擾素-γ基因、血小板反應(yīng)蛋白基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因、白細(xì)胞介素-12及纖維結(jié)合素基因。血管抑制基因中含有編碼分泌型信號肽。該分泌型信號肽可以是下述中的任何一種血管生成抑制因子自身信號肽，M-成瘤蛋白信號肽，免疫球蛋白K鏈信號肽。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)?3)細(xì)胞因子基因，細(xì)胞因子基因具有激活免疫細(xì)胞，增加造血功能等，細(xì)胞因子基因包含以下一個基因白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素12、粒-單集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、Light及Flt3配體。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)?4)前藥轉(zhuǎn)換酶基因，前藥轉(zhuǎn)換酶基因可使無毒性藥物轉(zhuǎn)變成毒性藥物，從而增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷。前藥轉(zhuǎn)換酶基因包含以下一個基因單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶及大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶。
本發(fā)明提供的上述重組病毒攜帶的目的基因?yàn)?5)細(xì)胞凋亡基因，細(xì)胞凋亡基因可導(dǎo)致真核細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡基因包含以下一個基因ICE、capase-3、capase-8、capase-9。
隨著病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，目的基因拷貝數(shù)增加，使腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)目的基因。
基因轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)受反式作用因子(如轉(zhuǎn)錄因子)與順式作用元件相互作用的影響。當(dāng)缺乏或出現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子時會影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)宿主細(xì)胞受病毒感染或潛伏感染后，病毒可使細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)生變化，從而有利于病毒的基因的表達(dá)、病毒的復(fù)制及增殖。本發(fā)明應(yīng)用病毒基因的某些順式作用元件控制目的基因，使該目的基因特異性在該病毒感染或潛伏感染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或低水平表達(dá)。應(yīng)用該病毒某些順式作用元件控制病毒增殖及復(fù)制的必需基因，從而使病毒增殖必需基因只能在上述病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致病毒只能在上述病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)增殖，而在上述病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)基本不增殖。這種修飾后的病毒載體可被用于在某些細(xì)胞混合物中殺滅被某種病毒感染或潛伏感染的特殊靶細(xì)胞，通過給予修飾后的病毒能選擇性地在該種靶細(xì)胞中增殖，從而使這種靶細(xì)胞被增殖的病毒選擇性的殺滅；在體外培養(yǎng)或在動物體內(nèi)通過將修飾后的病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，病毒只能在靶細(xì)胞增殖，也就是說除了靶細(xì)胞，其它細(xì)胞不能被這種病毒殺死。由于病毒在靶細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中的該靶細(xì)胞被殺滅，一旦靶細(xì)胞被破壞，病毒不再能夠再增殖。
本發(fā)明采用細(xì)胞專一的反應(yīng)元件是由EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活順式作用元件組成，其順式作用元件EB病毒Orip聯(lián)合Bam HI C-啟動子控制的報告基因，在EB病毒潛伏感染細(xì)胞(EBNA-1陽性)細(xì)胞的表達(dá)量比在EB病毒陰性(EBNA-1陰性)表達(dá)量高大約1000倍，同樣應(yīng)用順式作用元件EB病毒Orip聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子(mini-HSV-TK)或SV40基本啟動子(mini-SV40啟動子)控制的報告基因，在EB病毒潛伏感染細(xì)胞(EBNA-1陽性)細(xì)胞的表達(dá)量比在EB病毒陰性(EBNA-1陰性)表達(dá)量高100-1000倍。
本發(fā)明提出的能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒，它至少有一個病毒增殖所必需的基因的表達(dá)受EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件控制。它由在病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件而構(gòu)成。該順式作用元件特異性在EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)激活，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而在EB病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。該順式作元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(記為FR)、EB病毒Bam HI C-啟動子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒Bam HI C-啟動子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子(mini-HSV-TK)或SV40基本啟動子(mini-SV40啟動子)以及在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。上述病毒增殖所必需的為病毒早期表達(dá)基因，如單純皰疹病毒早早期表達(dá)基因ICE4。
本發(fā)明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一個腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
本發(fā)明提出的特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒與化學(xué)治療藥物(如順鉑、5-氟脲嘧啶、絲裂霉素C、碳鉑、環(huán)磷酰胺等)、生物毒素(如蛇毒素)、單克隆抗體(如抗鼻咽癌細(xì)胞抗體等)一起可以組成復(fù)合物，其作為抗腫瘤藥物效果更好。
本發(fā)明提出的特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組腺病毒構(gòu)建方法如下，將兩個分別含有腺病毒左臂及右臂的載體共轉(zhuǎn)染給會產(chǎn)生重組腺病毒的細(xì)胞，這兩個腺病毒載體中至少有一個載體中腺病毒增殖非必需區(qū)插入目的基因，同時這兩個腺病毒載體中至少有一個載體中腺病毒早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2及E4區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件，該順式作用元件特異性在EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)激活，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而在EB病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。該順式作元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒Bam HI C-啟動子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒Bam HI C-啟動子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子(記為mini-HSV-TK)或SV40基本啟動子(記為mini-SV40啟動子)、以及在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。
將EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件插入腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域可以通過以下方法完成通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域做一個酶切位點(diǎn)，通過酶切，將上述順式作用元件插入該位點(diǎn)，從而使腺病毒早期基因受控于EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件。
人類腺病毒有6個不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對宿主細(xì)胞的親嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本發(fā)明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證對本發(fā)明加以進(jìn)一步具體說明，但不限于該例證。腺病毒基因分為兩類，早期基因與晚期基因，早期基因包括E1A、E1B、E2、和E4。E1a基因在病毒感染后即表達(dá)(0-2小時)，是最早表達(dá)腺病毒蛋白，它作為反式激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是其它病毒早期基因蛋白表達(dá)所必需的，同時它反式激活其它病毒啟動子。因此，缺乏E1A基因的表達(dá)，腺病毒DNA復(fù)制的必需基因產(chǎn)物不能產(chǎn)生，腺病毒不能有效復(fù)制及增殖。
E1b基因的轉(zhuǎn)錄受E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期病毒基因mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿中所必需的，E1B基因表達(dá)缺失可導(dǎo)致病毒后期基因表達(dá)不佳及不能關(guān)閉宿主細(xì)胞蛋白的合成。
E4基因位于病毒基因組的右未端，其開放閱讀框3(ORF3)和ORF6能提高腺病毒主要晚期基因mRNA的水平。缺乏ORF3及ORF6蛋白功能，其病毒滴度比野生滴度低106倍。
腺病毒系統(tǒng)是由兩個載體組成，一個載體提供腺病毒的左臂部分，另一個載體提供右臂，這兩個載體至少有500nt的同源重組區(qū)，然而其轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生重組腺病毒，載體系統(tǒng)質(zhì)粒pXC1(Mckinnon，Gene 1982，1939-42)，含有野生型Ad5左臂。pBHG10提供缺乏E3區(qū)Ad5右臂或pBHGE3提供Ad5右臂(含E3區(qū))。
Ad5 E1A的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)分別位于病毒基因組約560nt及610nt，在這個區(qū)域插入某種病毒順式作用元件，如EB病毒的Orip聯(lián)合BamH I C啟動子。首先，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在這區(qū)域構(gòu)建一個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，PCR引物將被限制于Ad5基因組或攜帶Ad5部分基因組的質(zhì)粒中，如有pBR322為背景的引物。應(yīng)用含有EcoR I位點(diǎn)pBR322序列及含有Xba I位點(diǎn)Ad5序列，通過二次疊加PCR方法，在該區(qū)域創(chuàng)建一個新的唯一個酶切位點(diǎn)，該確切位點(diǎn)將用于插入病毒順式作用元件。
相似的方案也被用于插入病毒順式作用元件，來調(diào)節(jié)E1b Ad5的E1B啟動子，由一個對Sp1單一高親和為識別物和一個TATAbox組成這區(qū)域位于1636到Sub-1701nt。通過插入病毒順式作用元件在這個區(qū)域，將提供給E1B在細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明還提出前述增殖型重組病毒增殖方法，即將重組病毒(如重組腺病毒)感染EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞，從而使重組病毒特異性地在EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞中增殖。
使用只能在EB病毒感染或潛伏感染的特殊靶細(xì)胞內(nèi)增殖的腺病毒，在靶細(xì)胞允許腺病毒增殖并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在體外培養(yǎng)或在動物體內(nèi)通過將修飾后的腺病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，腺病毒只能在EB毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)增殖，也就是說除了EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞外，其他細(xì)胞不能被這種腺病毒殺死，由于腺病毒在EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中的該EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞被殺滅，一旦該EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞被破壞，腺病毒不再能夠再增殖。
本發(fā)明提出上述重組病毒實(shí)際應(yīng)用。例如將該重組病毒(如重組腺病毒)用于體外感染EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。將重組病毒(例如重組腺病毒)用于抑制EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞生長。將重組病毒(例如重組腺病毒)用于體內(nèi)選擇性殺滅EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明提供一類治療EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒，動物實(shí)驗(yàn)證明，這種重組病毒可用于治療EB病毒相關(guān)腫瘤，包括鼻咽癌、何杰金氏淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、胃癌等。
2.本發(fā)明提供一類治療EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒的構(gòu)建方法。該方法簡便易行可用于構(gòu)建多種治療EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒。
3.本發(fā)明提供一種在體內(nèi)及體外殺滅EB病毒潛伏感染或感染腫瘤細(xì)胞、而不影響EB病毒陰性的正常細(xì)胞的方法。
例1含有EB病毒順式作用元件的載體的構(gòu)建以pCAT-Basic為基礎(chǔ)載體，在其多克隆位點(diǎn)中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)聯(lián)合SV40基本啟動子(mini-SV40)，pCAT-Basic購自Promega公司。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40啟動子。前者的模板EB病毒DNA從淋巴瘤細(xì)胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法參見QIAGEN公司QIAamp Blood試劑盒的操作說明。后者的模板為pCAT-Control(購于Promega公司)。EB病毒Orip中的FR的引物為prime15’-引物(含有Hind III及AgeI酶切位點(diǎn))GGG AAG CTTACC GGT GCA TGC AGG AAA AGG ACA AGCprimer23’-引物(含有部分mini-SV40啟動子序列)GAG ATGCAG ATC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-SV40啟動子的引物為primer35’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GTG CCA TTG ATCTGC ATC TCA ATT AGT CAGprimer43’-引物(含有Sal I及Age I酶切位點(diǎn))GCT AAA GTCGAC ACC GGT AAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG應(yīng)用兩次疊加PCR技術(shù)(方法參見PCR Protools Current Methodsand Applications，White BA主編，Humana Press Inc.1993年出版—文獻(xiàn)1)將EB病毒Orip中的FR序列和mini-SV40啟動子產(chǎn)生融合啟動子，將其融合啟動子PCR片段應(yīng)用Hind III及Sal I雙酶切插入pCAT-Basic載體Hind III及Sal I位點(diǎn)中(方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版-文獻(xiàn)2)。將該片段進(jìn)行DNA測序，其融合啟動子序列完全正確，記為CHEB-FRSV40。
以pbluescript II KS(+)為基礎(chǔ)載體(購于美國ATCC公司)，在其多克隆位點(diǎn)中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)聯(lián)合HSV-TK基本啟動子(mini-TK)，pbluescript II購自Promega公司。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40啟動子。前者的模板EB病毒DNA從淋巴瘤細(xì)胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法參見QIAGEN公司QIAamp Blood試劑盒的操作說明。后者的模板為pTAL-Luc(購于Clontech公司)。
EB病毒Orip中的FR的引物為Primer 55’-引物(含有XhoI酶切位點(diǎn))GGG CAT CTC GAG GCATGC AGG AAA AGG ACA AGCPrimer 63’-引物(含有部分mini-HSV-TK啟動子序列)AGT CGGGGC GGC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-HSV-TK啟動子的引物為Primer 75’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GGT GCC ATT GCCGCC CCG ACT GCA TCT GCPrimer83’-引物(含有Xba I酶切位點(diǎn))TTT TCT AGA CTT CTG CTTCAT CCC CGT G應(yīng)用兩次疊加PCR技術(shù)(方法同前)將EB病毒Orip中的FR序列和mini-TK啟動子產(chǎn)生融合啟動子，將其融合啟動子PCR片段應(yīng)用Xho I及Xba I雙酶切插入pbluescript II KS(+)載體(購于美國ATCC公司)Xho I及Xba I位點(diǎn)中(方法參見文獻(xiàn)2)。將該片段進(jìn)行DNA測序，其融合啟動子序列完全正確，記為CHEB-FRTK。
例2攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒載體的構(gòu)建。
pXC.1載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中552bp處創(chuàng)立一個新的、唯一的Age I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1A起始密碼前12bp，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見前述文獻(xiàn)1)。其引物分別為primer95’-引物(含有EcoR I酶切位點(diǎn))TTC AAG AAT TCT CATGTT TGprimer103’-引物(插入一個A，從而產(chǎn)生一個Age I酶切位點(diǎn))CAG TCA CCG GTG TCG GAG Cprimer115’-引物(插入一個T，從而產(chǎn)生一個Age I酶切位點(diǎn))GCT CCG ACA CCG GTG ACT GAprimer123’-引物(含有Xba I酶切位點(diǎn))TTC TCT AGA CAC AGGTGA TG采用定位突變雙次PCR技術(shù)，PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T-easy載體中(方法參見Promega公司操作說明書)，命名為pGEM-T-E1a。將該片段進(jìn)行DNA測序，其測序結(jié)果顯示在pXC.1質(zhì)粒bp552位點(diǎn)中插入T，從而產(chǎn)生一個新的Age I酶切位點(diǎn)，其它序列與pXC.1相同。應(yīng)用EcoR I與Xba I雙酶切pGEM-T-E1A及pXC.1質(zhì)粒，將pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1質(zhì)粒中EcoR I及BamH I位點(diǎn)中，使pXC.1中552插入一個T，從而產(chǎn)生一個Age I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1A起始密碼前12bp，將該質(zhì)粒命名為pXC.1-Age I。
CHEB分別用Age I酶切，其酶切片段分別插入pXC-Age I質(zhì)粒中Age I酶切位點(diǎn)中，分別應(yīng)用引物24及19進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)出2050bp，這表明EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-SV40啟動子已正向插入pXC-Age I質(zhì)粒Age I位點(diǎn)，即腺病毒5型E1A起始密碼子上游區(qū)12bp處，命名為pXC-FRSVE1A。為進(jìn)一步證實(shí)EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-SV40啟動子已正向插入pXC-Age I質(zhì)粒Age I位點(diǎn)，本發(fā)明將pXC-FRSVE1A載體應(yīng)用EcoR I加Xba I作雙酶切，回收2823bp片段，插入pBluescript II SK載體EcoR I及Xba I酶切位點(diǎn)進(jìn)行測序，結(jié)果證實(shí)EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-SV40啟動子已正向插入pXC-Age I質(zhì)粒Age I位點(diǎn)。
pXC.1載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中1686bp處創(chuàng)立多個酶切位點(diǎn)，包括Bgl II、BamH I、Xho I及Xba I，該酶切位點(diǎn)位于E1B轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)與起始密碼之間，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見上述文獻(xiàn)1)。其引物分別為primer135’-引物(含有Hind III及Hpa I酶切位點(diǎn))TTT TGCAAG CTT GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGAprimer143’-引物(產(chǎn)生四個酶切位點(diǎn))CTC GAG GGA TCC AGATCT GCG CAT TAT ATA CCC TTT AAGprimer155’-引物(產(chǎn)生四個酶切位點(diǎn))AGA TCT GGA TCC CTC GAGTGA TCT AGA GGG CTA ATC TTG GTT ACA TCprimer163’-引物(含有Kpa I酶切位點(diǎn))CCA GAA AAT CCA GCAGGT AAC采用定位突變雙次PCR技術(shù)，PCR產(chǎn)物片段經(jīng)Hind III和Kpn I酶切，插入pUC19載體中Hind III和Kpn I酶切點(diǎn)，pUC19購于美國ATCC公司，命名為pUC-E1B。將該片段進(jìn)行DNA測序，其測序結(jié)果顯示在E1b轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)中插入Bgl II、BamH I、Xho I及Xba I酶切位點(diǎn)，其它序列與pXC.1相同。
將CHEB-FRTK用Xho I和Xba I雙酶切，其片段插入pUC-E1B中XhoI和Xba I酶切位點(diǎn)，即在E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)中正向插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-TK啟動子，命名pUC-E1B-FRTK，應(yīng)用引物28及23進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)出1159bp，這表明EB病毒Orip中的FR聯(lián)合mini-TK啟動子已正向插入pUC質(zhì)粒Xho I和Xba I位點(diǎn)。
例3.攜帶人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建pCA13載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1區(qū)342至3523bp片段，在E1缺失區(qū)插入了人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299-+72)及SV40 poly A加尾信號。應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機(jī)引物作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在擴(kuò)增人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因，并用兩次多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(方法參見文獻(xiàn)1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信號肽及信號肽前、基因結(jié)尾引入EcoRI和XbaI兩個酶切位點(diǎn)。
Primer17GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG AGGACG CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTCPrimer18CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA AGCATG GCG AGC CAC CGC GAC TTC CAGPrimer19GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG CTGTTC TCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TGPrimer18與primer19進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，回收615bp片段，再用primer17與primer19對615bp片段進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，回收647bp片段，應(yīng)用EcoR I+Xba I對酶切，將該基因插入pbluescriptIIKS(+)載體(購于美國ATCC公司)中進(jìn)行測序，其測序結(jié)果見下GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG將其EcoR I+Xba I切下，定向插入pCA13載體EcoR I+Xba I中，命名pCA13-human endostatin。
例4、攜帶血管生成抑素(angiostatin)基因的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)血管生成抑素(angiostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機(jī)引物作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行第一輪PCR，并用兩次多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(方法參見文獻(xiàn)1)在基因結(jié)尾引入EcoR I和Xho I兩個酶切位點(diǎn)，primer205’-AGCGAATTCCAAAATGGAACATAAGG-3’EcoR I血漿纖維蛋白溶酶原49-67Primer215’-ACACTTTTCCTTGACCTGATTTCAG-3’血漿纖維蛋白溶酶原348-343+111-94primer225’-CTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGC-3’血漿纖維蛋白溶酶原94-111+343-363primer235’-AGCCTCGAGCTATTACGCTTCTGTTCCTGAG-3’Xho I(2 Stop)血漿纖維蛋白溶酶原1431-1416Primer20與primer21、primer22與primer23分別進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，將其反應(yīng)產(chǎn)物混合，用prime20與primer23進(jìn)行再次PCR反應(yīng)，回收1168bp片段。應(yīng)用EcoR I+Xho I對酶切，將該基因插入pbluescript IIKS(+)載體(購于美國ATCC公司)中進(jìn)行測序，其測序結(jié)果見下GAATTCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGTAATAGCTCGAG
將其EcoR I+Xho I切下，定向插入pCA13載體EcoR I+Xho I中，命名pCA13-human angiostatin。
例5攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的腺病毒載體的構(gòu)建應(yīng)用Bgl II分別酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分別回收1237bp(含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40poly A加尾信號)及1758bp(人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信號)，將其插入pUC-E1B-FRTK中Bgl II酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR技術(shù)分別驗(yàn)證其插入的正反方向其Bgl II上游引物primer24GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA分別與人內(nèi)皮抑素5’及3’-primer進(jìn)行擴(kuò)增primer25人內(nèi)皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信號肽及人內(nèi)皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA Gprimer26人內(nèi)皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信號肽及人內(nèi)皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C分別與人血管生成抑素5’及3’-primer進(jìn)行擴(kuò)增primer27人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT Cprimer28人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC
其primer24與primer26能擴(kuò)增到1122bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-E1B-FRTK-endostatin1。其primer24與primer25能擴(kuò)增到818bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40poly A加尾信號反向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)。命名為pUC-E1B-FRTK-endostatin2。
其primer24與primer28能擴(kuò)增到1364bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-E1B-FRTK-angiostatin1。其primer24與primer27能擴(kuò)增到1440bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號反向插入pUC-E1B-FRTKBgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-E1B-FRTK-angiostatin2。
應(yīng)用Hpa I和Kpn I雙酶切pUC-E1B-FRTK-endostatin1、pUC-E1B-FRTK-endostatin2、pUC-E1B-FRTK-angiostatin1及pUC-E1B-FRTK-angiostatin2，回收片段，分別插入pXC-FRSVE1A中Hpa I和Kpn I酶切位點(diǎn)，分別命名為pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angio-statin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2。
例6攜帶內(nèi)皮抑素或血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的重組。
293細(xì)胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B- angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHG10通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見GIBCO BRL公司的操作說明。PBHG10購于加拿大Microbix BiosystemsInc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，即得E1A及E1B受EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子控制的腺病毒，并攜帶人內(nèi)皮抑素或血管生成抑素，分別命名為EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1、EBVFRSVEIA-FRTKE1B-endostatin2、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin1及FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin2，分別記為CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2。
由上述方法構(gòu)建的重組病毒的列表如下病毒 名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒 含Ad5右臂質(zhì)粒EBV FRSVEIA-FRTKCNHKEBV- pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-endostatin1 endostatin1endostatin1EBV FRSVEIA-FRTKCNHKEBV- pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-endostatin2 endostatin2endostatin2EBV FRSVEIA-FRTKCNHKEBV- PXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-angiostatin1angiostatin1 angiostatin1EBV FRSVEIA-FRTKCNHKEBV- PXC-FRSVE1A-FRTKE1B-PBHG10E1B-angiostatin2angiostatin2 angiostatin2腺病毒在293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見前述文獻(xiàn)2出版)。EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1(CNHKEBV-endostatin1)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子上游區(qū)之間新建一個Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-endostatin2(CNHKEBV-endostatin2)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子上游區(qū)之間新建一個Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內(nèi)皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin1(CNHKEBV-angiostatin1)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及OripFR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子上游區(qū)之間新建一個Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin2(CNHKEBV-angiostatin2)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子上游區(qū)之間新建一個Bgl II酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
例7攜帶人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的體外在EB感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞增殖、復(fù)制及高效表達(dá)人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素因子并特異性殺滅腫瘤細(xì)胞。
將CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2分別感染EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye、293及正常人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1、CNHKEBV-angiostatin2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時后應(yīng)用293細(xì)胞株測定其病毒滴度，具體方法參見前述文獻(xiàn)2，結(jié)果為正常成纖維細(xì)293 Jijoye胞野生型5型腺病毒1×1057×1045×104CNHKEBV-1×1054×1053×10endostatin1CNHKEBV-1×1054×1054×10endostatin2CNHKEBV-1×1052.5×1052×10angiostatin1CNHKEBV-1×1052.5×1052×102angiostatin1將感染EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2，MOI為1，37℃孵育1小時，感染后7天收集細(xì)胞，應(yīng)用QIAamp DNA Bloodmini kit(德國QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見QIAGEN公司操作說明。應(yīng)用Nhe I和Xho I雙酶切，用0.8％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P標(biāo)記人5型腺病毒1178bp BstXI加Xho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，進(jìn)行souther blot雜交，以pXC.1作為病毒拷貝數(shù)對照(方法參見文獻(xiàn)2)，CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為5×104、5×104、4×104、4×104及0、0、0、0。將上述CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人內(nèi)皮抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA13-humanendostatin，回收637bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-human endostatin作為病毒拷貝數(shù)對照(方法參見文獻(xiàn)2)，CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為5×104、5×104及＜10、＜10。
將上述CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人血管生成抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-human angiostatin作為病毒拷貝數(shù)對照(方法參見文獻(xiàn)2)，CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為4×104、4×104及＜10、＜10。
例8攜帶人內(nèi)皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的在SCID小鼠體內(nèi)治療EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞移植瘤將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye細(xì)胞5×107，兩周后給予5×108pfu增殖型重組腺病毒CNHK101治療或用相同劑量的對照腺病毒Ad5-LacZ，其未治療組及對照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加3倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小，部分腫瘤完全消失。
例9攜帶白細(xì)胞介素-12融合基因的E1區(qū)缺失的腺載體的構(gòu)建pCA14載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA14含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1區(qū)342至3523bp片段，在E1缺失區(qū)插入了人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信號。
應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增白細(xì)胞介素-12融合基因，自新鮮的正常人T細(xì)胞中抽提總RNA，以隨機(jī)引物作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行第一輪PCR，并用兩次多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(方法參見1)在基因結(jié)尾引入Sal I酶切位點(diǎn)，
primer29TTT GTC GAC CAT GGG TCA CCA GCA GTT GGT CATPrimer30AGA TCC GCC GCC ACC GCC ACC ACT GCA GGG CAC AGATGC CCAPrimer31GGT GGC GGT GGC GGC GGA TCT AGA AAC CTC CCC GTGGCC ACTPrimer32TAT AAA GTC GAC TCA TTA GGA AGC ATT CAG ATA GCTCGPrimer29與primer30、primer31與primer32分別進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，將其反應(yīng)產(chǎn)物混合，用prime29與primer32進(jìn)行再次PCR反應(yīng)，回收1610bp片段。應(yīng)用Sal I酶切，將該基因插入pbluescriptIIKS(+)載體(購于美國ATCC公司)中進(jìn)行測序，其測序結(jié)果正確。
將其Sal I切下，插入pCA14載體Sal I中，應(yīng)用BamH I酶切來鑒定基因插入正反方向，其BamH I酶切可見1422bp與6919bp，這表明hIL-12融合基因正向插入pCA14載體中，命名pCA14-humanIL-12。
例10攜帶人白細(xì)胞介素12的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的腺病毒載體的構(gòu)建應(yīng)用Bgl II部分酶切pCA14-human IL-12，分別回收2191bp(含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人IL-12融合基因及SV40 poly A加尾信號)，將其插入pUC-E1B-FRTK中Bgl II酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR技術(shù)分別驗(yàn)證其插入的正反方向其Bgl II上游引物
primer24GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA分別與人白細(xì)胞介素12的primer29及primer32進(jìn)行擴(kuò)增其primer24與primer32能擴(kuò)增到2122bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有人IL12融合基因及SV40poly A加尾信號正向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)，命名為pUC-E1B-FRTK1-IL12。其primer24與primer29能擴(kuò)增到2122bp，表明含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有人IL12融合基因及SV40 poly A加尾信號反向插入pUC-E1B-FRTK Bgl II酶切位點(diǎn)。命名為pUC-E1B-FRTK2-IL12。
應(yīng)用Hpa I和Kpn I雙酶切pUC-E1B-FRTK1-IL12及pUC-E1B-FRTK2-IL12，回收片段，分別插入pXC-FRSVE1A中HpaI和Kpn I酶切位點(diǎn)，分別命名為pXC-FRSVE1A-FRTKE1B1-IL12、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B2-IL12。
例11攜帶白細(xì)胞介素-12融合基因的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的重組。
293細(xì)胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-FRSVE1A-FRTKE1B1-IL12及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B2-IL12與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHG10通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見GIBCO BRL公司的操作說明。PBHG10購于加拿大MicrobixBiosystems Inc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，即得E1A及E1B受EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及OripFR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子控制的腺病毒，并攜帶人白細(xì)胞介素12融合基因，分別命名為EBV FRSVEIA-FRTKE1B1-IL12及FRSVEIA-FRTKE1B2-IL12，分別記為CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12。
由上述方法構(gòu)建的重組病毒的列表如下含Ad5右病毒 名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒臂質(zhì)粒EBV FRSVEIA-FRTK pXC-FRSVE1A-CNHKEBV1-IL12 PBHG10E1B1-IL12FRTKE1B1-IL12EBV FRSVEIA-FRTK pXC-FRSVE1A-CNHKEBV2-IL12 PBHG10E1B2-IL12FRTKE1B2-IL12腺病毒在293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(方法參見文獻(xiàn)2)。EBV FRSVEIA-FRTK E1B1-IL12(CNHKEBV1-IL12)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子上游區(qū)之間新建一個BglII酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中正向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有人白細(xì)胞介素12融合基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B2-IL12(CNHKEBV2-IL12)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯(lián)合mini-SV40啟動子及Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯(lián)合mini-HSV-TK啟動子上游區(qū)之間新建一個BglII酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)中反向插入含有人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有人白細(xì)胞介素12融合基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區(qū)部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
例12攜帶人白細(xì)胞介素12融合基因的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的體外在EB感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞增殖、復(fù)制及高效表達(dá)人白細(xì)胞介素12并特異性殺滅腫瘤細(xì)胞。
將CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12分別感染EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye、293及正常人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHKEBV1-IL12、CNHKEBV2-IL12及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時后應(yīng)用293細(xì)胞株測定其病毒滴度，具體方法參見前述文獻(xiàn)2，結(jié)果為正常成纖維細(xì)293 Jijoye胞野生型5型腺病毒1×1057×1045×104CNHKEBV1-IL12 1×1053×1052×10CNHKEBV2-IL-12 1×1052×1053×10將感染EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞分別感染重組腺病毒CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12，MOI為1，37℃孵育1小時，感染后7天收集細(xì)胞，應(yīng)用QIAamp DNA Blood minikit(德國QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見QIAGEN公司操作說明。應(yīng)用Nhe I和Xho I雙酶切，用0.8％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P標(biāo)記人5型腺病毒1178bp BstXI加Xho I片段(位于腺病毒nt4611-5789)，進(jìn)行souther blot雜交，以pXC.1作為病毒拷貝數(shù)對照(方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為5×104、5×104、及＜10、＜10。將上述CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12提取的DNA分別應(yīng)用Bgl II酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉(zhuǎn)至尼龍膜，用32P分別標(biāo)記人內(nèi)皮抑素cDNA片段(EcoR I與Xba I雙酶切pCA14-human IL12，回收637bp)作為探針，進(jìn)行souther blot雜交，以pCA13-human endostatin作為病毒拷貝數(shù)對照(方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)，CNHKEBV1-IL12及CNHKEBV2-IL12在Jijoye及正常人成纖維細(xì)胞的每個細(xì)胞病毒拷貝數(shù)分別為5×104、5×104及＜10、＜10。
權(quán)利要求
1.一種能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒，其特征在于其修飾病毒基因組中非增殖必需區(qū)域插入有目的基因，該目的基因?yàn)橐职┗?、血管抑制基因、?xì)胞因子基因、前藥轉(zhuǎn)換酶基因及細(xì)胞凋亡基因之一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述的抑癌基因包含以下一個基因P53、P21、Rb、NF1、VHL及APC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述的血管抑制基因包含以下一個基因內(nèi)皮抑素基因，血管生成抑素基因，為血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu)、Kringle1-5結(jié)構(gòu)、Kringle1-3結(jié)構(gòu)及Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)、干擾素-α基因、干擾素-β基因、干擾素-γ基因、血小板反應(yīng)蛋白基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因、白細(xì)胞介素-12及纖維結(jié)合素基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組病毒，其特征在于所述的血管抑制基因血管抑制基因中含有編碼分泌型信號肽。該分泌型信號肽可以是下述中的任何一種血管生成抑制因子自身信號肽，M-成瘤蛋白信號肽，免疫球蛋白K鏈信號肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述的細(xì)胞因子基因包含以下一個基因白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素12、粒-單集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、Light及Flt3配體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述的前藥轉(zhuǎn)換酶基因包含以下一個基因單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶、水痘-帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶及大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述的細(xì)胞凋亡基因包含以下一個基因ICE、capase-3、capase-8、capase-9。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于由病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入有某種順式作用元件，該順式作用元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-啟動子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子或SV40基本啟動子、在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件，病毒增殖必需基因?yàn)椴《驹缙诨颉?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于所述該增殖型重組病毒為腺病毒，該腺病毒增殖必需基因至少含有以下一個腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
10.一種能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒的構(gòu)建方法，其特征在于將兩個分別含有腺病毒左臂及右臂的載體共轉(zhuǎn)染給會產(chǎn)生重組腺病毒的細(xì)胞，這兩個腺病毒載體中至少有一個載體中腺病毒非增殖必需區(qū)插入某個目的基因，同時這兩個腺病毒載體中至少有一個載體中腺病毒早期基因E1A、E1B、E2、E4區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間表達(dá)區(qū)域插入某種順式作用元件，該順式作元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒Bam HIC-啟動子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒Bam HI C-啟動子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子或SV40基本啟動子、以及在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種重組病毒的構(gòu)建方法，其特征在于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域做一個酶切位點(diǎn)，通過酶切，將上述順式作用元件插入該位點(diǎn)，使腺病毒早期基因受控于EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件。
12.一種能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒的增殖方法，其特征在于將重組病毒感染EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞，使重組病毒特異性地在EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞中增殖。
13.一種如權(quán)利要求1所述的能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。
14.一種如權(quán)利要求1所述的能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于抑制EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞的生長。
15.一種如權(quán)利要求1所述的能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體內(nèi)選擇性地殺滅EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞。
16.一種抗腫瘤藥物，其特征在于該藥物由如權(quán)利要1所述的能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒與化療藥物、生物毒素、單克隆抗體組成的復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所說的化學(xué)治療藥物為順鉑、5-氟脲嘧啶、絲裂霉素C、碳鉑、環(huán)磷酰胺之一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所說的生物毒素為蛇毒素、白喉毒素之一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所說的單克隆抗體為鼻咽癌細(xì)胞抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一類能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒及其構(gòu)建方法。通過在病毒早期基因上游區(qū)插入某種順式作用元件，使該重組病毒能在而且僅在EB病毒潛伏感染或感染細(xì)胞內(nèi)增殖，同時將目的基因插入腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖的病毒基因組中非增殖必需區(qū)域，使目的基因在腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)，從而特異性殺滅EB病毒潛伏感染或感染的腫瘤細(xì)胞。這種重組病毒可用于治療EB病毒相關(guān)腫瘤，如鼻咽癌、何杰金氏淋巴瘤、胃癌等。
文檔編號A61K48/00GK1405312SQ0110524
公開日2003年3月26日 申請日期2001年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月18日
發(fā)明者錢其軍, 車小燕, 岑信棠, 吳孟超 申請人:中山衛(wèi)健生物科技有限公司