專利名稱：隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物及其制備方法和其在藥物制備中的應(yīng)用。
很早以前，人們就已經(jīng)認識到機體接觸某些物質(zhì)后會產(chǎn)生異乎尋常的反應(yīng)，如水腫、皮癢、哮喘等癥狀，甚至導(dǎo)致死亡。1819年，John Bostock首先描述了枯草熱。1873年Charles Blokley認識到花粉是枯草熱的致病因子。1906年，奧地利醫(yī)生Clemens vo Pirquet發(fā)現(xiàn)少數(shù)病人接受血清治療后病情得不到好轉(zhuǎn)，反而出現(xiàn)高燒、全身性淋巴結(jié)腫大、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾腫大、腎功能衰竭等癥狀，據(jù)此提出了變態(tài)反應(yīng)“Allergy”一詞。1921年，Prausnitz和Kustner發(fā)現(xiàn)過敏性疾病體內(nèi)存在著一種可轉(zhuǎn)移至正常人組織使之過敏的致敏因子。1963年，P.C.H.Cell和R.R.A.Coombs將變態(tài)反應(yīng)病進行更合理的分型，將其分為四型。1966年，美籍日本人石坂夫婦(Kimishige Ishizaka和Teruko Ishizaka)首先發(fā)現(xiàn)了速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的抗體1gE。目前，變態(tài)反應(yīng)已成為一門獨立學(xué)科，慢性過敏性炎癥概念的提出使人們對I型變態(tài)反應(yīng)有了更深入的認識。
流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計表明，在各種變態(tài)反應(yīng)性疾患中，過敏性皮膚病發(fā)病率最高，約占44％，其中以蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫、異位性皮炎、接觸性皮炎、藥物疹最為多見。各種呼吸道過敏病約占人群11％，其中支氣管病人占4.6％，過敏性鼻炎占6.7％，各種藥物過敏占3.2％，胃腸道過敏約占1％-2％，其他各種各樣少見的過敏性疾患約占5％。近30年以來，隨著經(jīng)濟的發(fā)展以及生活水平的提高，過敏性疾病在世界范圍內(nèi)明顯增加。
過敏性疾病的發(fā)病主要涉及過敏原、抗體、細胞、受體和介質(zhì)5個環(huán)節(jié)。引起過敏的物質(zhì)很多，如花粉、屋塵、食物、真菌、藥物、人與動物皮屑、羽毛、昆蟲、寄生蟲及其他化學(xué)物質(zhì)等，它們通過吸入、食入、注射、或接觸使機體致敏，誘發(fā)B細胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE抗體與肥大細胞、嗜酸性粒細胞等靶細胞表面的受體結(jié)合。當(dāng)機體再次接觸相同的抗原，后者與結(jié)合在靶細胞上的IgE抗體發(fā)生特異反應(yīng)，當(dāng)特異性抗原與兩個以上的IgE分子結(jié)合就可能發(fā)生橋聯(lián)反應(yīng)，即雙價或多價抗原分子和兩個以上的IgE分子靠近而發(fā)生構(gòu)型改變，繼而導(dǎo)致IgE受體聚集，介導(dǎo)細胞脫顆粒。細胞脫顆粒后釋放血管活性物質(zhì)及某些酶類，可引起平滑肌收縮、黏液分泌、血壓降低及組織損傷等。另外，過敏原也可由親細胞性的IgE抗體介導(dǎo)激活嗜酸性粒細胞而釋放大量炎癥因子，如白三烯，前列腺素、血栓素A2，細胞因子等，從而導(dǎo)致皮膚、支氣管黏膜、鼻黏膜和胃腸黏膜產(chǎn)生炎癥。
在各種過敏性疾病中哮喘的發(fā)病機制在最近幾年取得了很大進展。哮喘是由肥大細胞、嗜酸性細胞、T淋巴細胞等多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥。這種炎癥使易感者對多種激發(fā)因子具有氣道高反應(yīng)，并可引起氣道狹窄，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和(或)清晨發(fā)作、加劇，常常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，多數(shù)患者可自行緩解或經(jīng)治療緩解。
哮喘發(fā)病機理的觀點是一種涉及到氣道壁的特定性的慢性炎癥過程，它可引起氣流受限和反應(yīng)性增高，從而對不同的刺激物反應(yīng)時氣道更加狹窄。氣道炎癥的典型特點是呼吸道黏膜及管腔中活性的嗜酸性粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞數(shù)目增多和基底膜網(wǎng)質(zhì)層增厚、上皮下纖維增生。研究表明反復(fù)出現(xiàn)哮喘癥狀和以哮喘肺功能異常為特點的可逆性氣流受限與炎癥反應(yīng)升高相關(guān)。引起哮喘發(fā)生的危險因素有傾向性因素有特應(yīng)性和性別，致病因素有室內(nèi)變應(yīng)原(室塵螨、動物變應(yīng)原、蟑螂變應(yīng)原、真菌)、室外變應(yīng)原(花粉、真菌)、阿司匹林、職業(yè)性致敏物質(zhì)，促成因素有呼吸道感染、低出生體重、膳食、空氣污染(室外污染物、室內(nèi)污染物)、吸煙(主動吸煙、被動吸煙)。
近20年以來，世界各國的哮喘患病率及哮喘死亡率有所上升，有資料提示全球現(xiàn)有1.5億哮喘患者，每年有10萬人不必要地死于哮喘病，哮喘不僅影響身體發(fā)育和健康，還會影響心理發(fā)展，包括自尊。哮喘這種長期的疾病會給個人和社會造成多方面的負擔(dān)，生活質(zhì)量降低或影響全身健康，進行性的能力喪失和早死，同時降低生產(chǎn)力和增加醫(yī)療費用。因此哮喘是一個主要的公共衛(wèi)生問題，值得引起政府和公共衛(wèi)生部門的關(guān)注。
哮喘是一種慢性的氣道炎癥性患疾，最有效的控制就是通過消除誘發(fā)因素來防止炎癥的發(fā)生。哮喘的藥物治療是用來逆轉(zhuǎn)及預(yù)防癥狀和氣流受限的，包括控制藥物和緩解藥物?？刂扑幬镉糜诔掷m(xù)性哮喘，包括抗炎藥和長效支氣管擴張劑?？寡姿幨悄壳白钣行У目刂扑幬?，主要有皮質(zhì)激素，它能在一方面或幾方面來控制哮喘，但有嚴重副作用。支氣管擴張劑通過松弛氣道平滑肌來擴張氣道。雖然支氣管擴張劑能逆轉(zhuǎn)或抑制支氣管的收縮，但是它不能逆轉(zhuǎn)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)。目前還開發(fā)一些和白三烯的作用有關(guān)的藥物，如白三烯拮抗劑，生物合成中的一種關(guān)鍵酶阻抗劑以及一種平滑肌細胞或其它細胞表面的脂類受體阻抗劑，阻止脂類物質(zhì)與平滑肌細胞結(jié)合，從而封閉白三烯的生物活性。
因此，如何利用隱孔菌具有的藥用功能，提供一種隱孔菌的發(fā)酵產(chǎn)物，用于制備預(yù)防和治療過敏性疾病如哮喘的藥物，將具有十分重要的意義。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是提供上述發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之三是公開上述發(fā)酵產(chǎn)物在制備預(yù)防和治療過敏性疾病如哮喘的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物為一種菌絲體和發(fā)酵上清液的混合物，該發(fā)酵混合物的干重為5～50g/1000ml，多糖含量3～10％，揮發(fā)性醚浸出物含量為0.05～0.15％，總生物堿含量為0.03～0.25％。多糖、揮發(fā)性醚浸出物和總生物堿的分析方法如下(1)總多糖取發(fā)酵混合物粉末10g，加入200ml蒸餾水，煮沸提取30min，過濾，濾渣中再加入100ml蒸餾水，如前操作。合并兩次提取的濾液，適當(dāng)濃縮后置于截留分子量為1萬的透析袋中透析3天，去除溶液中的小分子物質(zhì)，取出濃縮到10ml。
取濃縮液少量，加Molish試劑反應(yīng)，結(jié)果硫酸和水溶液界面有紫色或綜紅色圓環(huán)出現(xiàn)，表明本藥材中含有多糖成分。
取濃縮液少量，用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以希夫試劑染色，結(jié)果有連續(xù)的電泳條帶，表明有分子量不同的多糖存在。
取濃縮液少量，做苯胺蘭沉淀試驗反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有醇不溶性的藍色沉淀，表明有β-1，3葡聚糖存在。
取濃縮液1ml，稀釋200倍，用硫酸—苯酚法測定糖含量，結(jié)果每毫升濃縮液中含有多糖30～100mg，即發(fā)酵混合物中含有多糖3～10％。
(2)揮發(fā)性醚浸出物植物中提取的揮發(fā)油已經(jīng)在臨床上作為祛痰、發(fā)汗、鎮(zhèn)咳或利尿的藥物應(yīng)用，并具有殺菌或抑菌的功效。從隱孔菌中得到的揮發(fā)油中棕櫚酸的相對含量較高，而棕櫚酸有抗炎、抑菌的作用和較強的鎮(zhèn)痛活性。揮發(fā)油中的倍半萜化合物有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、平喘等作用。說明隱孔菌揮發(fā)油中存在多種與臨床療效相關(guān)的有效成分。
具體的方法如下取發(fā)酵物粉末3g，精密稱定，置50ml三角瓶中，加入20ml乙醚振搖12小時，靜置分取乙醚層，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，重復(fù)加入乙醚，至乙醚提取液無色，放置揮去乙醚，置硫酸干燥器中干燥18小時，精密稱定，緩緩加熱至105℃，并干燥至恒重。其減失的重量即為揮發(fā)性醚浸出物的重量，計算即得結(jié)果(見表1)。
表1，揮發(fā)性醚浸出物含量測定

(010302Y、010306Y、010307Y為制備的三批樣品)(3)總生物堿生物堿類化合物大多具有生理活性，往往是許多中草藥及藥用植物的有效成分，具有鎮(zhèn)痛、止咳、平喘、抗菌消炎、松弛平滑肌等作用。本發(fā)明將發(fā)酵上清用氨水調(diào)pH＞9，用氯仿多次萃取，水浴蒸餾除去氯仿得到總生物堿，并對所提取的生物堿進行定性和定量檢測三種沉淀試劑的反應(yīng)與碘化鉍鉀試液反應(yīng)，有橘黃色沉淀；與磷鉬酸試液反應(yīng)，有黃綠色沉淀，反應(yīng)迅速；與硅鎢酸(5％)反應(yīng)，有白色沉淀，反應(yīng)迅速。
進行薄層層析TLC分析進行TLC試驗所用薄層板是硅膠GF254板(200mm×50mm)，用甲苯-丙酮-乙醇-濃氨水試液(20∶20∶3∶1)為展開劑，在紫外燈下進行檢視，可以看到分離較好的斑點，斑點的重現(xiàn)性好。
對總生物堿進行定量檢測的方法是酸性染料比色法。對照品溶液制備精密稱取嗎啡對照品1mg，精密加入甲醇1ml，搖勻，即得(每1ml中含有嗎啡1mg)。
供試品溶液制備精密稱取發(fā)酵物粉末5g，用1％H2SO440ml提取24小時，加濃氨試液調(diào)節(jié)pH至9，用乙醚提取2次(40ml，40ml)，用氯仿提取2次(20ml，20ml)，合并有機溶劑，置溫水浴上回收有機溶劑至近干，精密加入20ml酸水溶液(pH＝3)，揮盡有機溶劑，即得。繪制標準曲線精密吸取對照品溶液，20，40，60，80，100，120ul分別置于20ml分液漏斗中，精密加入pH3.0的酸水溶液，至1ml，精密加入氯仿5ml和溴甲酚綠試液(取溴甲酚綠50mg與鄰苯二甲酸氫鉀1.021g，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液6.0ml使溶解，再加水稀釋至100ml，搖勻)1ml，強力振搖2min，靜置，分取氯仿層，用分光光度法，在420nm處測定吸收度，繪制標準曲線。樣品測定精密量取供試品溶液400ul和pH3.0的酸水溶液600ul，置20ml分液漏斗中，精密加入氯仿5ml和溴甲酚綠試液1ml，強力振搖2min，靜置，分取氯仿層，用分光光度法，在420nm處測定吸收度，計算即得結(jié)果(見表2)。
表2，樣品總生物堿含量

(010302Y、010306Y、010307Y為三批隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物)該發(fā)酵產(chǎn)物是這樣制備的(1)菌種的活化將4℃條件下保存的隱孔菌菌種，通過無菌操作移植到以下培養(yǎng)基中，在真菌常規(guī)培養(yǎng)溫度下無菌培養(yǎng)3-10天，培養(yǎng)基組分和重量百分含量為(％)葡萄糖 0.5-0.9麥芽糖 0.5-2蛋白胨 0.1-0.2酵母粉 0.5-1KH2PO40.2-0.4MgSO4·7H2O 0.2-0.5維生素B1.05-0.1
瓊脂2.2-3.0pH 4.5-5.0其余成分為水(2)搖瓶培養(yǎng)將上述活化的隱孔菌菌絲移入內(nèi)裝150-200ml下述培養(yǎng)液的500ml三角燒瓶中、在振蕩頻率為100-200rpm、溫度為20℃-30℃條件下在搖床中振蕩培養(yǎng)6天；如需加大種量可再將菌絲液移入內(nèi)裝750ml下述培養(yǎng)液的3000ml三角燒瓶中、在振蕩頻率為100-200rpm、溫度為20℃-30℃條件下在搖床機中振蕩培養(yǎng)1-2天。
培養(yǎng)液組分和含量為葡萄糖把0.5-0.9麥芽糖 0.5-2蛋白胨 0.1-0.2酵母粉 0.5-1KH2PO40.2-0.4MgSO4·7H2O 0.2-0.5維生素B10.05-0.1pH 4.5-5.0其余成分為水(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)在各種容量規(guī)格的發(fā)酵罐中裝入等于或小于70％罐容量的下述培養(yǎng)液，用壓差法移接相當(dāng)于罐容量3-5％搖瓶培養(yǎng)的隱孔菌菌絲液，在通風(fēng)量為1∶0.1-1.0(v/v/分鐘)、葉輪攪拌速度為100-200rpm、罐壓大于0.05kg/cm2，溫度20-30℃條件下發(fā)酵1-10天。
培養(yǎng)液組分和重量百分含量為(％)葡萄糖 2.5-3.5麥芽糖 0.5-2玉米粉 0.3蛋白胨 0.5
酵母粉 0.5-1KH2PO40.2-0.4MgSO4·7H2O 0.2-0.5維生素B10.05-0.1pH 4.5-5.0其余成分為水(4)將上述發(fā)酵罐內(nèi)的隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物采用常規(guī)過濾方法過濾得到菌絲體和發(fā)酵液上清。隱孔菌菌絲體濾餅在80-90℃條件下烘干，粉碎，過篩，得到顆粒小于60目的隱孔菌菌粉。發(fā)酵上清液70-80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至密度為1.2-1.5克/毫升。
3、臨床應(yīng)用及劑型本發(fā)明獲得的隱孔菌菌粉和發(fā)酵上清濃縮液可分別單獨制成各種類型的藥品和保健品或混合加工成各種藥品和保健品。
如可將發(fā)酵上清濃縮液加熱濃縮至稠膏狀，加入菌粉并拌以5％-50％的淀粉、微晶纖維素等輔料，攪拌均勻，烘干、粉碎，過60目篩，即得混合發(fā)酵產(chǎn)物。
本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物可以制備用于預(yù)防和治療抗變態(tài)反應(yīng)藥物，包括I、II、III、IV型變態(tài)反應(yīng)，尤其是發(fā)生在呼吸道、皮膚、胃腸道和眼的I型變態(tài)反應(yīng)，如支氣管哮喘炎、過敏性鼻炎、過敏性皮膚炎、藥物過敏癥、食物過敏癥等，也可制備用于抗過敏的藥物，如對花粉、塵螨、霉菌等過敏的疾病。
為了便于應(yīng)用，可以將上述的發(fā)酵產(chǎn)物采用公知的方法，制成各種劑型，如片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、錠劑、膏劑、貼劑、糖漿劑、合劑或氣霧劑。
圖2為樣品對致敏大鼠抗原攻擊引起的肺灌洗液中白細胞總數(shù)的影響。
圖3為樣品對致敏大鼠抗原攻擊引起的肺灌洗液中嗜酸性粒細胞的影響。
(1)對致敏豚鼠抗原攻擊后肺機械功能的影響采用卵白蛋白10mg后腿部肌內(nèi)注射致敏豚鼠，3-4周后予以抗原攻擊(1％卵白蛋白)引起肺阻力(RL)的變化來觀察樣品藥效。結(jié)果表明中華隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物Ts0001p1樣品5.0g/kg×10d對抗原攻擊引起的RL增高有一定的抑制作用，在抗原攻擊后2min、3min和5min時有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。陽性對照藥β2激動藥沙丁胺醇7mg/kg×1d，在抗原攻擊后氣道阻力反應(yīng)最為嚴重的10min內(nèi)，各時相均有明顯的抑制作用(P＜0.05～0.01)，結(jié)果見

圖1。
(2)致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞變化采用卵白蛋白2％凝膠溶液致敏，每只大鼠兩后足掌、腹股溝、腰、背、頸、腋窩共十點，每點0.05ml，皮下注射，同時腹腔注射0.5ml。從致敏第10天開始給藥。受試物A2、B2、C2或生理鹽水溶液0.5ml/kg，或地塞米松(DXM)0.5ml/kg，分別腹腔注射。A1、B1 5g/kg，C1、2.5g/kg，分別給予灌胃。以上受試藥物均給藥10天。A1發(fā)酵菌絲體粉末，B1發(fā)酵上清濃縮液，C1子實體粉末，A2發(fā)酵菌絲體水提液，B2發(fā)酵濃縮液，C2子實體粉末水提液，地塞米松磷酸鈉。哮喘這種慢性氣道炎癥疾病，以支氣管肺嗜酸性粒細胞顯著升高為標志。嗜酸性粒細胞可釋放幾十種炎癥物質(zhì)，如細胞因子，白三烯、前列腺素等。這些物質(zhì)作用于氣道產(chǎn)生炎癥、水腫、損傷和增厚，使氣道狹窄導(dǎo)致通氣困難。因此，目前認為嗜酸性粒細胞是一個篩選平喘藥物的靶點，能抑制氣道嗜酸性粒細胞炎癥的藥物，就有可能成為預(yù)防和治療哮喘的藥物。本實驗中B物質(zhì)(即發(fā)酵濃縮液)能較好的抑制致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺部嗜酸性粒細胞的作用(見表3)。
表3致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞變化

(與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)(3)不同劑量的隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌洗液中白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞的影響。
SD大鼠75只共分8組，采用卵白蛋白2％凝膠溶液致敏，每只大鼠四足掌皮下注射，每點0.1ml，10天后再重復(fù)致敏一次。從致敏第14天開始給藥。受試物隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物T提取物或生理鹽水溶液1ml/100g灌胃，或地塞米松0.5mg/kg腹腔注射，或酮替芬5mg/kg灌胃，受試藥物均給藥7天。從致敏第14天，給藥后1小時抗原攻擊，每日一次，共7次，其中設(shè)計一組致敏不攻擊抗原對照組，以生理鹽水替代。攻擊結(jié)束后收集支氣管肺灌洗液，計數(shù)白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)。結(jié)果模型組抗原攻擊后，與致敏不攻擊的大鼠比較，白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞明顯增多，表明致敏大鼠抗原攻擊有非常明顯的過敏炎癥反應(yīng)過程。中華隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物呈劑量依賴性地抑制致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞升高，抑制嗜酸性粒細胞ID50(95％可信限)＝0.15(0.11～0.21)g/kg，抑制白細胞總數(shù)ID50(95％可信限)＝1.11(0.73～1.70)g/kg，結(jié)果見圖2、3。。
(4)對大鼠多形核粒細胞釋放白三烯的影響藥物采用肌肉注射，每天注射2次，每次0.5ml/kg，連續(xù)5天。收集大鼠腹腔中的多形核粒細胞，以Calcium ionopHore A23187誘導(dǎo)多形核粒細胞釋放白三烯，用Leukotriene C4 EIA Kit測定白三烯LTC4的含量。A發(fā)酵上清濃縮液經(jīng)90％乙醇沉淀后的上清液，B發(fā)酵上清濃縮液90％乙醇的沉淀物，C發(fā)酵上清濃縮液。結(jié)果三組藥物均能明顯抑制LTC4釋放，與生理鹽水對照組比較有顯著性差異(P<0.01>，表明該組藥物能較好地抑制氣道炎性介質(zhì)的釋放(見表4)。
表4對大鼠多形核粒細胞釋放白三烯的影響

(與生理鹽水組比較**P＜0.01)(5)初步分離物對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞的影響采用卵白蛋白2％凝膠溶液致敏，藥物從致敏第10天給藥，受試藥物或生理鹽水10ml/kg灌胃，或地塞米松(DMX)0.5mg/kg腹腔注射。受試藥物均給藥10天。A發(fā)酵產(chǎn)物提取的總多糖，B發(fā)酵產(chǎn)物提取的總生物堿，C發(fā)酵產(chǎn)物提取的揮發(fā)油，D發(fā)酵產(chǎn)物提取的有機酸，E發(fā)酵產(chǎn)物提取的水提液，陽性對照物地塞米松。結(jié)果受試藥物A即發(fā)酵產(chǎn)物中提取的總多糖能較好的抑制致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺部嗜酸性粒細胞炎癥的作用，受試藥物C即發(fā)酵產(chǎn)物中提取的揮發(fā)油的作用也很強(見表5)。
表5對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞的影響

(與生理鹽水組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)(6)發(fā)酵產(chǎn)物小鼠急性毒性試驗昆明種小鼠115只，中華隱孔菌提取物以45g/kg的劑量灌胃給藥，給藥前禁食12小時，連續(xù)給藥8天，結(jié)果動物死亡率為0，未見其它毒性反應(yīng)，小鼠的最大耐受量(MTD)為45g/kg。
由上述公開的內(nèi)容可見，本發(fā)明的隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物對炎癥細胞和哮喘具有十分顯著的抑制和治療作用，且無毒副作用，制備方法十分簡單，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，解決了隱孔菌這一藥用資源從自然界獲取受到限制的問題。以下將通過實施例對本發(fā)明的具體實施方式
進行進一步的說明。
實施例1斜面隱孔菌菌種的培養(yǎng)方法為將4℃條件下保存的隱孔菌菌種，通過無菌操作移植到以下培養(yǎng)基中，在真菌常規(guī)培養(yǎng)溫度下無菌培養(yǎng)2-10天，培養(yǎng)基組分和重量百分含量為(％)葡萄糖 1.5麥芽糖 0.6蛋白胨 0.2酵母粉 1.4KH2PO40.3
MgSO4·7H2O0.1維生素B10.03瓊脂 2.2其余成分為水pH5.0菌體生長情況菌絲濃密，白色，放射性生長，生長速度快。
實施例2斜面隱孔菌菌種的培養(yǎng)方法為將4℃條件下保存的隱孔菌菌種，通過無菌操作移植到以下培養(yǎng)基中，在真菌常規(guī)培養(yǎng)溫度下無菌培養(yǎng)8-10天，培養(yǎng)基組分和重量百分含量為(％)葡萄糖 1.5麥芽糖 0.6蛋白胨 0.04酵母粉 0.3KH2PO40.3MgSO4·7H2O 0.1維生素B10.03瓊脂2.2其余成分為水pH 5.0菌體生長情況菌絲稀疏，纖細，白色，放射生長，生長速度較快。
實施例3將活化隱孔菌菌種的菌絲移入內(nèi)裝150ml下述液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，用旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)速度為100rpm，在28℃下培養(yǎng)6天。
基本液體培養(yǎng)基配方葡萄糖20g
蛋白胨10g酵母粉3g磷酸二氫鉀1g硫酸鎂0.5g水1000ml上述培養(yǎng)基的pH為5.5。
菌體生長狀況培養(yǎng)液澄清，菌體生長旺盛，菌絲球數(shù)大小均一充滿整個培養(yǎng)基。
實施例4取發(fā)酵菌絲體粉末20g，加入400ml蒸餾水，煮沸提取30min，過濾，濾渣中再加入200ml蒸餾水，如前操作。合并兩次提取的濾液，再加入100ml發(fā)酵濃縮液上請，置于截留分子量為1萬的透析袋中對10mM pH6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液2000ml透析3天，每天更換一次外透液，去除溶液中的小分子物質(zhì)，取出濃縮到100ml。動物實驗分析該多糖組分對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞變化(結(jié)果見表。采用卵白蛋白2％凝膠溶液致敏，每只大鼠兩后足掌、腹股溝、腰、背、頸、腋窩共十點，每點0.05ml，皮下注射，同時腹腔注射0.5ml。從致敏第10天開始給藥。結(jié)果表明能較好的抑制致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺部嗜酸性粒細胞的作用。
表6對致敏大鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細胞的影響

(DXM為地塞米松，與生理鹽水組比較**P＜0.01，***P＜0.001)
實施例5膠囊的制備方法將發(fā)酵產(chǎn)物上清加熱沸騰狀態(tài)下濃縮至半固體狀，加入菌絲體及20％微晶纖維素在高速混合制粒機中混合，40目制粒。大顆粒可干燥后二次制粒。將顆粒置于烘箱小于80℃烘干，定時翻料，至顆粒水分在4％以下。30目整粒，加3％滑石粉總混后灌裝膠囊，裝量300mg/粒。拋光后包裝。鈷60照射滅菌。
實施例6片劑的制備方法將發(fā)酵產(chǎn)物上清加熱沸騰狀態(tài)下濃縮至半固體狀，加入菌絲體及34％微晶纖維素、17％預(yù)膠化淀粉在高速混合制粒機中混合，10目制粒。大顆?？筛稍锖蠖沃屏！㈩w粒置于烘箱，80℃烘干，定時翻料，至顆粒水分在1％-3％。12目整粒，加3％滑石粉總混后壓片，裝量500mg/片。包薄膜彩衣。包裝后鈷60照射滅菌。
權(quán)利要求
1.一種隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，先培養(yǎng)隱孔菌，然后進行發(fā)酵，獲得發(fā)酵產(chǎn)物，該產(chǎn)物為一種菌絲體和發(fā)酵上清液的混合物，干重為5～50g/1000ml，多糖含量3～10％，揮發(fā)性醚浸出物含量為0.05～0.15％，總生物堿含量為0.03～0.25％。
2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述隱孔菌包括中華隱孔菌(Cryptoporus sinensis Sheng H.Wu & M.Zang)、(Cryptoporus volvatus(Peck)Schear)和其它隱孔菌的種。
3.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述發(fā)酵包括液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物包括隱孔菌液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體和發(fā)酵上清液及其從其中提取的各種成分。
4.如權(quán)利要求3所述的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于，所述的成分包括多糖、揮發(fā)性醚浸出物含和生物堿。
5.如權(quán)利要求1或3所述的發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，先用無菌斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)隱孔菌，然后進行液體或固體發(fā)酵，獲得發(fā)酵產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求1或3所述的發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，該方法包括菌種的活化、搖瓶培養(yǎng)和液體或固體發(fā)酵培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求6所述的發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，菌種的活化是這樣進行的將隱孔菌菌種移植到含有濃度大于0.05％的葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、維生素B1、瓊脂，pH3-7的培養(yǎng)基上，在真菌常規(guī)培養(yǎng)溫度下無菌培養(yǎng)3-10天。
8.如權(quán)利要求6所述的發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，搖瓶培養(yǎng)包括如下步驟將上述活化的隱孔菌菌絲移入含有濃度大于0.05％的葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、維生素B1，pH3-7的培養(yǎng)基中，在振蕩頻率為50-200rpm、溫度為20℃-30℃條件下在搖床中振蕩培養(yǎng)2-10天。
9.如權(quán)利要求6所述的發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，液體發(fā)酵培養(yǎng)包括如下步驟在發(fā)酵罐中裝入含濃度大于0.05％的葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O，pH3-7的培養(yǎng)基，滅菌后移接搖瓶培養(yǎng)的隱孔菌菌絲液，在通風(fēng)量為1∶0.1-1.0(v/v/分鐘)、葉輪攪拌速度小于300rpm、罐壓大于0.05kg/cm2，溫度20℃-30℃條件下發(fā)酵1-10天，其間用上述培養(yǎng)基補料。
10.如權(quán)利要求1或3所述的發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，可制備用于預(yù)防和治療抗變態(tài)反應(yīng)病藥物。
11.如權(quán)利要求10所述的發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗變態(tài)反應(yīng)病包括抗I、II、III、IV型變態(tài)反應(yīng)病。
12.如權(quán)利要求11所述的發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗變態(tài)反應(yīng)病包括發(fā)生在呼吸道、皮膚、胃腸道、眼的I型變態(tài)反應(yīng)病。
13.如權(quán)利要求12所述的發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗變態(tài)反應(yīng)病包括支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎、藥物過敏癥、食物過敏癥、胃腸炎、結(jié)膜炎或角膜炎。
14.如權(quán)利要求1或3所述的發(fā)酵產(chǎn)物在制備預(yù)防和治療用抗過敏疾病藥物中的應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其特征在于，過敏疾病包括花粉、塵螨、霉菌或粉塵過敏。
16.如權(quán)利要求1或3所述的發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，制成片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、錠劑、膏劑、貼劑、糖漿劑、合劑或氣霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法及其在臨床上的各種應(yīng)用，隱孔菌在含有葡萄糖、麥芽糖、酵母粉、蛋白胨、無機鹽及維生素的培養(yǎng)基上進行液體或固體發(fā)酵，獲得隱孔菌菌絲體、發(fā)酵上清液和各種代謝產(chǎn)物。該發(fā)酵產(chǎn)物可制備成各種劑型，用于預(yù)防和治療由于花粉、塵螨、霉菌、粉塵等引起的過敏性疾病，如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性胃腸病和眼病等變態(tài)反應(yīng)病。
文檔編號A61K9/20GK1405314SQ01126498
公開日2003年3月26日 申請日期2001年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月17日
發(fā)明者劉國安, 郭新軍, 王英明, 朱曉慧, 趙航, 柯傳奎 申請人:杭州泰士生物科技有限公司