專利名稱：具有動員活性的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
近年來，大量研究用來探討增加哺乳動物(尤其是人類)外周血循環(huán)中干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的含量的可能性。實際上，干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的獲得在一些領(lǐng)域是非常重要的，這些領(lǐng)域諸如有循環(huán)造血祖細(xì)胞的自體移植、循環(huán)造血祖細(xì)胞的異體移植以及在循環(huán)造血細(xì)胞的基因治療的過程中。
盡管出生后，干細(xì)胞和祖細(xì)胞幾乎只存在于骨髓中，但它們?nèi)匀痪哂羞w移性質(zhì)；也就是說，在生理條件下它們可以通過骨髓腔進(jìn)入血液循環(huán)。該過程，即通常所說的“動員”，通過各種處理例如使用細(xì)胞因子特別是粒細(xì)胞集落生長因子(G-CSF)，可以在哺乳動物中擴(kuò)增。該過程的反過程(稱作“歸巢”)發(fā)生在例如造血細(xì)胞移植后接受放射治療的病人中；然而，動員和歸巢的機(jī)制仍然不明確(C.F.Craddock等人，“在靈長類和小鼠中VLA4整聯(lián)蛋白抗體動員長效種群恢復(fù)細(xì)胞和增大細(xì)胞因子誘導(dǎo)的遷移(Antibodies to VLA4 IntegrinMobilize Long-Term Repopulating Cells and Augment Cytokine-InducedMobilization in Primates and Mice)”，Blood，Vol.90，n.12，1997，pp.4779-4788；F.Prosper等，“外周血祖細(xì)胞的動員和歸巢與α4β1整聯(lián)蛋白的表達(dá)和功能的可逆減量調(diào)節(jié)有關(guān)(Mobilization and Homing of PeripheralBlood Progenitors is Related to Reversible Downregulation of α4β1Integrin Expression and Function)”，J.Clin.Invest.，Vol.101，n.11，1998，pp.2456-2467；M.Vermeulen等，“粘著分子在鼠造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的歸巢和動員中的作用(Role of Adhesion Molecules in the Homing andMobilization of Murine Hermatopoietic Stem and Progenitor Cells)”，Blood，Vol.92，n.3，1998，pp.894-900)。
G-CSF(CAS登記號為143011-2-7/Merck Index，1996，page 4558)是一種造血生長因子，其在粒系祖細(xì)胞的增殖和分化中是不可缺少的；該因子是一種分子量為18-22KDa、通常響應(yīng)各種細(xì)胞的特定刺激而產(chǎn)生的糖蛋白，其中這些細(xì)胞包括單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)語“去纖維蛋白多核苷酸”(CAS登記號83712-60-1)通常是指從動物和/或植物組織中提取的一種多脫氧核糖核苷酸(US3,770,720和US3,899,481)；該多脫氧核糖核苷酸一般是以堿金屬鹽(通常為鈉鹽)的形式存在。去纖維蛋白多核苷酸主要用作抗凝劑(US3,829,567)，但它還可用于其它用途，如用于治療急性腎功能不全(US4,694,134)和急性心肌缺血(US4,693,995)。美國專利US4,985,552和US5,223,609中描述了一種制備去纖維蛋白多核苷酸的工藝方法，通過此工藝制成的產(chǎn)品具有穩(wěn)定和確切的物理-化學(xué)特性，同時也無任何不良副作用。
根據(jù)本發(fā)明的目的，術(shù)語“去纖維蛋白多核苷酸”應(yīng)被理解為從動物和/或植物組織中特別是從哺乳動物的器官中提取出來的任一種寡核苷酸和/或多核苷酸。優(yōu)選地，去纖維蛋白多核苷酸是根據(jù)上述專利中所描述的方法生產(chǎn)出來的，因此這些方法本身也應(yīng)作為本說明書的一部分；更為優(yōu)選的是，去纖維蛋白多核苷酸是用美國專利US4,985,552和US5,223,609中所描述的方法生產(chǎn)的發(fā)明詳述人們業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過施用去纖維蛋白多核苷酸，并同時或依次施用一種具有動員造血祖細(xì)胞的能力的造血因子，可以增加干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的遷移。
從實施例中可以看出，通過施用去纖維蛋白多核苷酸，并同時或依次施用一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，所獲得的動員能力大大高于單獨服用造血因子所獲得的動員能力。
因此，本發(fā)明的主題為一種制劑，其包括作為“活性成分”的去纖維蛋白多核苷酸和至少一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，優(yōu)選為G-CSF。在優(yōu)選實施方案中，該制劑由一種可注射的水溶液組成。另外，該制劑也可以由兩種不同的溶液構(gòu)成，其中一種含有去纖維蛋白多核苷酸，另一種含有具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。因此本發(fā)明的制劑可以是一種可以同時、單獨或依次使用上文所述活性成分的復(fù)合制劑，以增加哺乳動物外周血循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明的第二個主題是，去纖維蛋白多核苷酸聯(lián)合至少一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子在制備制劑中的應(yīng)用。該制劑能夠增加哺乳動物、優(yōu)選為人類外周血循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明的另一個主題是，一種增加哺乳動物外周血循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞數(shù)量的方法，其特征在于，給哺乳動物施用去纖維蛋白多核苷酸，并同時或依次服用至少一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。本發(fā)明實驗中所用的造血因子為G-CSF；然而，本發(fā)明并不排除通過使用G-CSF之外的、具有動員造血祖細(xì)胞能力的其它造血因子也可以得到類似的結(jié)果，這些造血因子諸如有粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落生長因子(GM-CSF)、Flt3配體(FL)、干細(xì)胞生長因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素8(IL-8)以及其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的造血因子。
在實驗的第一階段與G-CSF聯(lián)合使用的去纖維蛋白多核苷酸是Crinos Spa提供的ProciclideTM，該產(chǎn)品按照美國專利US4,985,552和US5,223,609中所描述的方法生產(chǎn)。
至于施用上述兩種活性成分的方法并不受到本發(fā)明目的的限制。也就是說，可以按照本領(lǐng)域公知的方法和劑量給予哺乳動物(特別是人類)去纖維蛋白多核苷酸和具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子；通常可以通過口服、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或靜脈內(nèi)注射給藥。其中靜脈注射為優(yōu)選的給藥途徑。
上述兩種活性成分也可以同時或依次施用。也就是說，第一種情況是，通過使用單一制劑給予上述兩種活性成分，該單一抑制劑包括上述兩種活性成分，并可以任選地在其中加入本領(lǐng)域公知的賦型劑和/或輔助劑；另一種情況是，上述兩種活性成分可以依次給予，也就是說，使用兩個不同的制劑，其中一個含有具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子、優(yōu)選為G-CSF，而另一個含有去纖維蛋白多核苷酸。
通常，皮下注射G-CSF，其劑量為5-24ug/kg，而DEF可以通過連續(xù)的靜脈輸注給予，劑量為5-15mg/kg/hr，連續(xù)輸注2-7天。
從本申請的實施例中可以看出(但本發(fā)明并不局限于這些實施例)，給鼠(最常見的實驗用哺乳動物模型)和猴聯(lián)合施用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸，所獲得的動員能力比單獨施用G-CSF所獲得的動員能力高得多。這一點對于那些希望獲得高水平動員能力的治療領(lǐng)域來說是非常有利的。
實施例1本試驗用于評價施用G-CSF和/或去纖維蛋白多核苷酸(DEF)對鼠科動物血液中存在的白細(xì)胞(WBC)數(shù)量的影響。對年齡在6-8周、體重為20-25克的BALB/c鼠腹膜內(nèi)注射給予G-CSF(5ug/鼠/天)，DEF(1mg/鼠/天)，或聯(lián)合使用G-CSF(5ug/鼠/天)和增加劑量的DEF(1，10，15mg/鼠/天)。對未給予G-CSF和/或DEF的對照組的小鼠腹膜內(nèi)注射稀釋至0.1％的鼠血清白蛋白的鹽溶液(PBS/MSA)。對小鼠進(jìn)行上述治療5天，在經(jīng)上述治療的3天或5天后、或停止上述治療的3天后將小鼠處死。本試驗的結(jié)果見

圖1。下列標(biāo)記代表各組小鼠G-CSF(■)(n＝24)，DEF1(○)(n＝3)，G-CSF+DEF1(◆)(n＝13)，G-CSF+DEF10(▲)(n＝6)，G-CSF+DEF15(●)(n＝23)。給予PBS/MSA的對照組小鼠的平均白細(xì)胞計數(shù)為2.87±0.2×106/毫升血。用平均數(shù)±平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)表示各組數(shù)據(jù)。
實施例2研究實施例1中的小鼠每毫升血中形成總的集落細(xì)胞(CFC)的動員動力學(xué)。給予PBS/MSA的對照組小鼠的平均CFC計數(shù)為39±12/毫升血。數(shù)據(jù)見圖2，并用平均數(shù)±SEM表示，其是由每個時間點上對每個動物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實施例3實施例1中小鼠的每105個外周血的棕黃層細(xì)胞(buffy-coat cell)中總CFC(CFU-GM+BFU-E+CFU-Mix+HPP-CFC)的頻數(shù)改變。對照組小鼠中的平均CFC計數(shù)為3.5±1；數(shù)據(jù)見圖3，并用平均數(shù)±SEM表示，其是由每個時間點上對每個動物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實施例4實施例1中經(jīng)過5天治療的小鼠每毫升血中總CFC(CFU-GM+BFU-E+CFU-Mix+HPP-CFC)數(shù)量。數(shù)據(jù)見圖4，并用平均數(shù)±SEM表示，其是對每個動物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實施例5實施例1中小鼠的每105個外周血的棕黃層細(xì)胞中總CFC(CFU-GM+BFU-E+CFU+Mix+HPP-CFC)的頻數(shù)。數(shù)據(jù)見圖5，并用平均數(shù)±SEM表示，其是對每個動物的樣品進(jìn)行雙份培養(yǎng)而得出的。
實施例6該實驗用于評價施用G-CSF和/或DEF對猴外周血循環(huán)中造血祖細(xì)胞/干細(xì)胞(高增殖潛能集落刺激細(xì)胞，或HPP-CFC)數(shù)量的影響。實驗中使用4-6歲的、健康的獼猴(Macaca Mulatta)，其血液學(xué)和臨床化學(xué)的檢測指標(biāo)均正常。皮下注射G-CSF，劑量為100μg/kg，連續(xù)使用2個周期，每周期5天；在第二個周期中靜脈輸注DEF，劑量為15mg/kg/hr，連續(xù)5天。進(jìn)行采血、G-CSF給藥、換藥時對受試動物實施麻醉。本實驗的結(jié)果見圖6。從該圖中可以看出，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸的猴子中的HPP-CFC的動員能力是單獨使用G-CSF的猴子的8倍。
結(jié)論從圖1可以很容易地看出，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸使小鼠血液循環(huán)中白細(xì)胞的含量顯著增加。需要特別指出的是，單獨使用去纖維蛋白多核苷酸對血液循環(huán)中白細(xì)胞的含量并無積極作用。因此，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸能夠使白細(xì)胞數(shù)量驚人地增加，并存在著劑量-效果關(guān)系，其并不僅僅是兩個相互獨立效應(yīng)的加和。
圖2至圖5清楚地表明在小鼠中聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸而達(dá)到的動員水平是單獨使用G-CSF的動員水平的10倍至100倍。最后，圖6證實，聯(lián)合使用G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸使猴子中干細(xì)胞(HPP-CFC)的動員能力是單獨使用G-CSF的8倍。
兩個活性成分的聯(lián)合效應(yīng)存在著劑量-效果關(guān)系，因為動員能力的增加與施用的去纖維蛋白多核苷酸的量呈現(xiàn)一定的比例；所有情況下動員能力的最高峰均在施用藥物的大約第5天左右出現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種制劑，包括作為活性成分的去纖維蛋白多核苷酸和至少一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。
2.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子是G-CSF。
3.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述制劑為水溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于由兩個不同的、單獨服用的制劑組成，其中一個含有具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，另一個含有去纖維蛋白多核苷酸。
5.一種作為復(fù)合制劑使用的制劑，含有去纖維蛋白多核苷酸和至少一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子，優(yōu)選為G-CSF，用于同時、單獨或依次施用以增加哺乳動物外周血液循環(huán)中的干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞的數(shù)量。
6.如權(quán)利要求1-5所述的制劑，進(jìn)一步含有常用的賦形劑和/或輔助劑。
7.與至少一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子聯(lián)合使用的去纖維蛋白多核苷酸在制備能夠增加哺乳動物外周血液循環(huán)中干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞數(shù)量的制劑中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子是G-CSF。
9.一種增加哺乳動物外周血液循環(huán)中的干細(xì)胞和/或造血祖細(xì)胞數(shù)量的方法，其特征在于，給予哺乳動物去纖維蛋白多核苷酸，并聯(lián)合或依次使用至少一種具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，具有動員造血祖細(xì)胞能力的造血因子是G-CSF。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，G-CSF的劑量為5-24ug/kg，去纖維蛋白多核苷酸的劑量為5-15mg/kg/hr。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，連續(xù)2-7天給予G-CSF和去纖維蛋白多核苷酸。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，哺乳動物為人類。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增加哺乳動物外周血液循環(huán)中干細(xì)胞和祖細(xì)胞數(shù)量的方法。其特征在于，施用去纖維蛋白多核苷酸，并聯(lián)合或依次施用至少一種能夠動員造血祖細(xì)胞的造血因子，優(yōu)選為粒細(xì)胞集落刺激因子(G－CSF)。
文檔編號A61P43/00GK1434719SQ01808202
公開日2003年8月6日 申請日期2001年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者L·費羅, R·波塔, M·艾克貝里, A·M·吉亞尼, C·C·司泰拉 申請人:金蒂姆股份公司