專利名稱：具有整聯(lián)蛋白抑制劑性質(zhì)ii的肽和肽模擬物的衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式I的化合物B-Q-X1(I)其中B是生物活性的細(xì)胞粘著-介導(dǎo)的分子，選自 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(ii)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iv)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg(v)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn(vi)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg(vii)，其中對(duì)于(i)X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或
-(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或具有1-4個(gè)碳原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH，NH2或具有1-6個(gè)碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代，Ar是未取代的或者被A，OH，NH2，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的聯(lián)苯基的這樣一種方式取代，Hal是F，Cl，Br或I，Het是具有5-10個(gè)成環(huán)原子的飽和的，部分或完全不飽和的一環(huán)或二環(huán)雜環(huán)基團(tuán)，其中可以存在1-3個(gè)N和/或一個(gè)S或O原子，并且該雜環(huán)基團(tuán)可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代，Het2是具有1-4個(gè)N和/或S原子的5-或6-元芳香雜環(huán)，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4，5；Q不存在或者是有機(jī)間隔基分子和X1是固定分子，選自-CO-CH＝CH2(viii)-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(ix)-CO-(CH2)1-20-SH (x)-CO-CH(NH2)-CH2-SH(xi)-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(xii)-NH-(CH2)2-20-SH (xiii)-NH-CH(CO2H)-CH2-SH (xiv)其中在化合物(viii)至(xi)的情況下，基團(tuán)B的自由氨基與間隔基分子Q的自由羧基或固定分子X1的自由羧基，或者基團(tuán)Q的自由氨基與基團(tuán)X1的自由羧基相互連接成肽，并且在化合物(xii)至(xiv)的情況下，基團(tuán)B的自由羧基與間隔基分子Q的自由氨基或固定分子X1的自由氨基，或者基團(tuán)Q的自由羧基與基團(tuán)X1的自由氨基相互連接成肽和它們的鹽。
類似化合物公開于DE 19932796，DE 19755800和DE 19831710中。
本發(fā)明是以發(fā)現(xiàn)具有有價(jià)值的性質(zhì)特別是可以用于制備藥物的那些性質(zhì)的新的化合物這一客體為基礎(chǔ)的。
發(fā)現(xiàn)了式I的化合物和它們的鹽具有非常有價(jià)值的藥學(xué)性質(zhì)，還有好的耐受性。它們特別作為整聯(lián)蛋白抑制劑起作用，特別抑制αv，β3或β5整聯(lián)蛋白受體與配體的相互作用，例如血纖蛋白原與β3整聯(lián)蛋白受體的結(jié)合。在整聯(lián)蛋白αvβ3，αvβ5，αIIbβ3，αvβ1，αvβ6，和αvβ8的情況下，這些化合物表現(xiàn)出特殊活性。
根據(jù)例如J.W.Smith等，J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)描述的方法可以證實(shí)該作用。P.C.Brooks，R.A.Clark和D.A.Cheresh，Scienee 264，569-71(1994)描述了血管發(fā)生進(jìn)展對(duì)血管整聯(lián)蛋白和胞外基質(zhì)蛋白之間的相互作用的依賴性。
阻斷整聯(lián)蛋白受體和配體的相互作用，例如血纖蛋白原與血纖蛋白原受體(糖蛋白IIb/IIIa)，的相互作用的式I的化合物，作為GPIIb/IIIa拮抗劑，防止腫瘤細(xì)胞通過轉(zhuǎn)移而擴(kuò)散。這通過下面的觀察而證實(shí)通過腫瘤細(xì)胞與血小板的相互作用通過形成微聚集(微血栓)發(fā)生腫瘤細(xì)胞從腫瘤病灶向血管系統(tǒng)的擴(kuò)散。通過微聚集中的保護(hù)作用篩選腫瘤細(xì)胞，而且免疫系統(tǒng)細(xì)胞不識(shí)別腫瘤細(xì)胞。微聚集接觸血管壁，因此更有利于腫瘤細(xì)胞向組織的滲透。因?yàn)檠w蛋白原與激活的血小板上的血纖蛋白原受體的結(jié)合介導(dǎo)微血栓的生成，所以GP IIb/IIIa拮抗劑可以被認(rèn)作有效的轉(zhuǎn)移抑制劑。
甲基丙烯酸殘基用來與例如植入物的生物適應(yīng)表面共價(jià)或吸附結(jié)合肽和肽模擬物，所述植入物包含自由丙烯酸或甲基丙烯酸殘基，例如聚甲基甲基丙烯酸成型物品(骨膠結(jié)劑)或在例如金屬表面上含有丙烯酸或甲基丙烯酸層。因此，巰基用來結(jié)合肽，例如結(jié)合金屬表面或者結(jié)合含有自由氨基的表面例如膠原(例如利用馬來酰亞胺)，和血漿處理過的聚合物或金屬表面(參見D.M.Ferris，G.D.Moodie，P.M.Dimond，C.W.D.Giovanni，M.G.Ehrl ich，R.F.Valentini，Biomaterials 20，2323-2331(1999)；D.F.Meyers等，J.Immunol.Methods 121，129-142(1989))或者和經(jīng)CVD-技術(shù)處理過的表面(參見Lahann，J.等，Macromol.Rapid Commun.19，441-444(1998))。
因此本發(fā)明涉及通過基團(tuán)X1官能團(tuán)與生物適合表面共價(jià)或吸附結(jié)合的式I的化合物。
在這一點(diǎn)上，參考申請(qǐng)人在同一日期申請(qǐng)的第二個(gè)申請(qǐng)，其中基團(tuán)X1具有另外的意義。
現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的肽和肽模擬物利用其包被，主要是被刺激的那些細(xì)胞物種的粘著，使得生物材料，特別是所有想得到的器官的植入物的生物功能化成為可能，所述細(xì)胞物種在各種情況下應(yīng)該影響相應(yīng)的生物材料的組織整合作用。使用這樣的包被，能夠?qū)崿F(xiàn)插入到身體之后具有提高的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的各種生物材料/植入物的加速和增強(qiáng)的整合作用。
根據(jù)本發(fā)明的肽選擇性結(jié)合整聯(lián)蛋白。在生物適應(yīng)表面例如植入物上固定之后，它們刺激攜帶整聯(lián)蛋白的細(xì)胞的粘著。
在表面上包被化合物之后，選擇性刺激那些細(xì)胞物種以結(jié)合，該結(jié)合也應(yīng)該在天然組織中植入之后影響植入物的整合作用，在成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，這些是例如攜帶αv-細(xì)胞物種。
因此本發(fā)明涉及作為植入物中選擇性細(xì)胞富集的整聯(lián)蛋白抑制劑的式I的化合物。
固定于作為藥物活性物質(zhì)的生物適應(yīng)表面之后，可以在人用或獸用藥物中使用式I的化合物，特別是它們可以用作治療植入物引起的疾病，缺陷和炎癥的整聯(lián)蛋白抑制劑，例如生物材料和植入物的，植入物引起的血栓形成的，骨和牙缺陷的，骨質(zhì)溶解性疾病例如骨質(zhì)疏松，血栓形成，心肌梗塞，動(dòng)脈粥樣硬化的，促進(jìn)愈合進(jìn)程的傷口愈合中的不適和延遲的整合作用，還用于促進(jìn)和加強(qiáng)植入物或生物適應(yīng)表面進(jìn)入組織的整合作用進(jìn)程。
式I的化合物可以用作在其中使用生物材料，植入物，導(dǎo)管或心臟起搏器的手術(shù)中具有殺微生物作用的物質(zhì)。它們?cè)谶@里具有抗菌作用。通過P.Valentin-Weigund等，Infection and Immunity，2851-2855(1988)描述的方法可以證明殺微生物活性的效力。
因此本發(fā)明涉及用作治療植入物引起的疾病，缺陷和炎癥的，例如骨質(zhì)疏松，血栓形成，心肌梗塞和動(dòng)脈粥樣硬化的骨質(zhì)溶解疾病的，還用于促進(jìn)和加強(qiáng)植入物或生物適應(yīng)表面進(jìn)入組織的整合作用進(jìn)程的整聯(lián)蛋白抑制劑的式I的化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及式I的化合物制備用于治療植入物引起的疾病，缺陷和炎癥，例如骨質(zhì)疏松，血栓形成，心肌梗塞和動(dòng)脈粥樣硬化的骨質(zhì)溶解疾病，用于促進(jìn)和加強(qiáng)植入物或生物適應(yīng)表面進(jìn)入組織的整合作用進(jìn)程的藥物的用途。
攜帶巰基固定基團(tuán)的相應(yīng)的肽能夠共價(jià)連接金-平面載體，例如植入物，親和色譜或微量滴定平板。
本發(fā)明還涉及式I的化合物利用共價(jià)或吸附結(jié)合來包被用于人或動(dòng)物器官的植入物的用途。
上文和下文提到的氨基酸殘基的縮寫表示下面氨基酸殘基Abu4-氨基丁酸Aha6-氨基六酸，6-氨基己酸Ala丙氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Arg精氨酸Cys半胱氨酸Dab2，4-二氨基丁酸Dap2，3-二氨基丙酸Gln谷氨酰胺Glp焦谷氨酸Glu谷氨酸Gly甘氨酸His組氨酸homo-Phe高苯丙氨酸Ile異亮氨酸Leu亮氨酸Lys賴氨酸
Met蛋氨酸Nle正亮氨酸Orn鳥氨酸Phe苯丙氨酸Phg苯基甘氨酸4-Hal-Phe4-鹵代-苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val纈氨酸另外，下面的縮寫具有下面的意義Ac乙?；鵅OC叔丁氧羰基CBZ或Z芐基氧羰基DCCI二環(huán)己基碳化二亞胺DMF二甲基甲酰胺EDCIN-乙基-N，N′-(二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺Et乙基FCA熒光素羧酸FITC熒光素異硫代氰酸酯Fmoc9-芴基甲氧羰基FTH熒光素硫代脲HATUO-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基uronium-六氟磷酸鹽HOBt1-羥基苯并三唑Me甲基MBHA4-甲基-二苯甲基胺Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基-磺?；鵋ONSuN-羥基琥珀酰亞胺
OtBu叔丁基酯Oct辛?；鵒Me甲酯OEt乙酯POA苯氧乙?；鵓bf五甲基苯并呋喃基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；鵖al水楊酰基Su丁二?；鵗FA三氟乙酸Trt三苯甲基(三苯基甲基)。
如果上述氨基酸可以以多種對(duì)映異構(gòu)體存在，例如，包括上文和下文中所有的這些形式和它們的混合物(例如DL形式)是式I的化合物的一部分。另外，作為式I的化合物的一部分，可以提供帶有本身已知的相應(yīng)的保護(hù)基團(tuán)的氨基酸或自由氨基(xi)或自由羧基(xiv)?？傊?，例如，在非肽αvβ3拮抗劑情況下進(jìn)行精氨酸的側(cè)鏈修飾(例如R.Keenan等，摘要Pap.211th ACS國(guó)際會(huì)議(NewOrleans，USA)1996，MEDI 236)，也可以在環(huán)肽的情況下使用，例如苯并咪唑衍生物代替胍基。
“前體藥物衍生物”也包括在根據(jù)本發(fā)明的化合物中，即例如用烷基或?；?，糖或寡肽修飾的式I的化合物，它們?cè)隗w內(nèi)快速裂解，給出根據(jù)本發(fā)明的活性化合物。這些還包括根據(jù)本發(fā)明的化合物的生物可降解聚合物衍生物，例如描述于，Int.J.Pharm.115，61-67(1995)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及適合人和動(dòng)物器官的植入物，由下述組成載體基質(zhì)和生物活性層，細(xì)胞粘著介導(dǎo)的圍繞該基質(zhì)的分子，由式I的化合物形成的包圍層，載體基質(zhì)和該化合物之間存在的共價(jià)鍵或吸附鍵。優(yōu)選地，載體基質(zhì)和/或其表面由金屬或金屬氧化物或聚合物組成。合適的聚合物優(yōu)選是聚甲基丙烯酸甲酯，聚羥乙基甲基丙烯酸酯，聚交酯，聚乙二醇酸或者它們的共聚物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的式I的化合物和它的鹽的制備方法，特征在于，可以帶有保護(hù)基團(tuán)的生物活性分子B，和帶有保護(hù)基團(tuán)的間隔基團(tuán)-固定分子(Q-X1)或者固定分子(X1)彼此以肽的方式連接，然后去除保護(hù)基團(tuán)，和/或特征在于通過用酸或堿處理而將式I的堿性或酸性化合物轉(zhuǎn)化為它的一種鹽。
上文和下文中，除非另有說明，基團(tuán)B，Q和X1具有對(duì)于式I指出的定義。
Q不存在或者是有機(jī)間隔分子。優(yōu)選地，這是[CO-(CH2)x-NH-]m-，[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-，[CO-(CH2)z-CO-]-，[NH-(CH2)z-NH-]-，[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-或[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-基團(tuán)，和它們的組合，其中權(quán)利要求2定義的值的范圍適用于m，x，y和z指標(biāo)。特別有利地提供其中設(shè)定m值在1和8之間，x值在1和5之間，并且y和z值在1和6之間的上述化合物。
X1是固定分子，優(yōu)選選自基團(tuán)-CO-CH＝CH2，-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2，-CO-(CH2)1-20-SH，-CO-CH(NH2)-CH2-SH，-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2，-NH-(CH2)2-20-SH，或-NH-CH(CO2H)-CH2-SH。
X優(yōu)選是H2N-C(＝NH)-NH-，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH或Het基團(tuán)。
Y優(yōu)選是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-基團(tuán)。
Z優(yōu)選是N-R2或CH-R2，其中R2優(yōu)選是氫原子或具有1-4個(gè)碳原子的烷基。
R3優(yōu)選是氫原子，Ar，Het或A-基團(tuán)，其中A，Ar和Het具有上文和下文指出的定義之一。
R4優(yōu)選是氫原子，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Ha1，CN，NO2，CF3或OCF3基團(tuán)。芳基烷基優(yōu)選是芐基，苯乙基，苯丙基，或萘基甲基，特別優(yōu)選芐基。
A優(yōu)選是COOH-，NH2-或具有1-6個(gè)，優(yōu)選1，2，3，4，5或6個(gè)碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代。A優(yōu)選是甲基，還有乙基，丙基，正丁基，異丁基，仲丁基，或叔丁基，另外還有正戊基，1-，2-或3-甲基丁基，1，1-，1，2-或2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，1-，2-，3-或4-甲基戊基，1，1-，1，2-，1，3-，2，2-，2，3-或3，3-二甲基丁基，1-或2-乙基丁基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，1，1，2-或1，2，2-三甲基丙基。A特別優(yōu)選甲基。
Ar優(yōu)選是未取代的或者A，OH，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，NH2，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的聯(lián)苯基的這樣一種方式取代。
Ar因此優(yōu)選是苯基，鄰-，間-或?qū)?甲基苯基，鄰-，間-或?qū)?乙基苯基，鄰-，間-或?qū)?丙基苯基，鄰-，間-或?qū)?異丙基苯基，鄰-，間-或?qū)?叔丁基苯基，鄰-，間-或?qū)?羥基苯基，鄰-，間-或?qū)?甲氧基苯基，鄰-，間-或?qū)?乙氧基苯基，鄰-，間-或?qū)?三氟甲基苯基，鄰-，間-或?qū)?三氟甲氧基苯基，鄰-，間-或?qū)?氟苯基，鄰-，間-或?qū)?氯苯基，鄰-，間-或?qū)?溴苯基，鄰-，間-或?qū)?硝基苯基。
Het是具有5-10個(gè)成環(huán)原子的飽和的，部分或完全不飽和的一環(huán)或二環(huán)雜環(huán)基團(tuán)，其中可以存在1-3個(gè)N和/或一個(gè)S或O原子，并且該雜環(huán)基團(tuán)可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代。
Het優(yōu)選是鄰-，間-或?qū)?取代的吡啶基，2-，4-，5-或6-取代的嘧啶基或3-，4-，5-或6-取代的噠嗪基，其優(yōu)選是未取代的或者被甲基，乙基，丙基或甲基氨基，乙基氨基，或丙基氨基取代[涉及提到的所有三種雜芳基]，還有未取代的或者被3-甲基，3-乙基，或3-芐基取代的2-取代的苯并咪唑基，還有2-取代的二氫咪唑基，四氫嘧啶基或四氫吡啶基。
Het優(yōu)選的例子是 Het1是具有1-4個(gè)N和/或S原子的5-或6-元芳香雜環(huán)，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代。
Het1優(yōu)選是2，4-，3，5-，2，5-二取代吡啶基或2，4-，2，5-，2，6-，或4，6-二取代嘧啶基，2，4-，或2，5-二取代1，3-噁唑基或1，3-噻唑基。
OA優(yōu)選是甲氧基，乙氧基，丙氧基或丁氧基，還有戊氧基或己氧基。
Hal優(yōu)選是F，Cl，或Br，還有I。
除非另有說明，指標(biāo)n，m，o，p，q，s和t具有權(quán)利要求1指出的意義。
式I的化合物可以具有一個(gè)或多個(gè)手性中心，因此存在各種立體異構(gòu)體形式。式I包括這些所有的形式。
因此，本發(fā)明特別涉及其中提到的至少一個(gè)基團(tuán)具有上述優(yōu)選定義之一的那些式I的化合物。
特別優(yōu)選的式I的化合物如下a)
b)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysc)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lysd)Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cyse)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Argf)Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysg)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala另外通過本身已知的方法制備式I的化合物還有用于它們的制備的起始物，例如文獻(xiàn)中描述的那些技術(shù)(例如標(biāo)準(zhǔn)著作中，例如Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart或The Journal of Biological Chemistry，Vol.271，No.44，pp.27221 ff.(1996))，即在已知的并且適合提到的反應(yīng)的反應(yīng)條件下進(jìn)行。在本身已知的變體的情況下也可以使用，但是這里沒有更詳細(xì)地說明。
如果期望，也可以原地制備起始物，這樣不用從反應(yīng)混合物中分離它們，而是立即進(jìn)一步反應(yīng)，給出式I的化合物。
在惰性溶劑中進(jìn)行片段偶聯(lián)，羧酸片段(丙烯酸酯或巰基連接體)溶解于含有HATU，HOAt和2，4，6-三甲吡啶中，然后用胺片段(線性肽，肽模擬物)處理，反之亦然(連接體＝胺片段；肽/模擬物＝羧酸片段)。
合適的惰性溶劑是例如烴類，例如己烷，石油醚，苯，甲苯，或二甲苯；鹵代烴類，例如三氯乙烯，1，2-二氯乙烷，四氯化碳，氯仿，或二氯甲烷；醇類，例如甲醇，乙醇，異丙醇，正丙醇，正丁醇，或叔丁醇；醚類，例如二乙醚，二異丙基醚，四氫呋喃(THF)或二噁烷；二元醇醚類，例如乙二醇一甲基或一乙基醚(甲基乙二醇或乙基乙二醇)，乙二醇二甲醚(二甘醇二甲醚)；酮類，例如丙酮或丁酮；酰胺類，例如乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺，或二甲酰胺(DMF)；腈類例如乙腈；亞砜類，例如二甲亞砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸類，例如甲酸或乙酸；硝基化合物，例如硝基甲烷或硝基苯；酯類，例如乙酸乙酯，水或者提到的溶劑的混合物。
一般操作技術(shù)從Aldrich公司，Bachem，F(xiàn)luka，Neosystem和Novablochem獲得這些試劑，不用進(jìn)一步純化即可使用。從PepChem公司獲得三苯甲基氯/聚苯乙烯樹脂(TCP-樹脂)。
在Waters and Beckman公司生產(chǎn)的儀器上進(jìn)行(RP9)-HPLC-分析和半制備分離，使用Knauer and Amersham Pharmacia Biotech生產(chǎn)的儀器(Uvicord)在220nm波長(zhǎng)下進(jìn)行UV檢測(cè)。下面的柱子材料用于分析(直徑4mm)和半制備分離(直徑21mm或40mm)NucleosilRP18 5μ，Nucleosil RP18 HD 5μ和Nucleosil RP 18 7μ，購(gòu)自Macherey& Nagel)。作為洗脫劑，在梯度操作條件下使用各種情況下含有0.1Vol-％TFA的乙腈和水的流動(dòng)相混合物。
使用購(gòu)自Finnigan公司的LCQ型儀器進(jìn)行ESI-質(zhì)譜。
在Bruker DMX 500上記錄NMR-譜。1H和13C化學(xué)位移的內(nèi)標(biāo)是溶劑DMSO-d52.49ppm(1H-NMR)和39.5ppm(13C-NMR)。
使用從Vetter-Laborbedarf公司(Tübingen)購(gòu)得的帶有PP釉料的10毫升塑料注射管進(jìn)行固相合成。為了充分混合樹脂懸浮液，以大約15rpm從一頭到另一頭旋轉(zhuǎn)該塑料注射管。排除大氣濕度，進(jìn)行固相上激活的氮雜甘氨酸反應(yīng)和脒基化反應(yīng)。
下面的實(shí)施例描述利用具有丙烯酸酯固定基團(tuán)的氮雜-RGD-模擬物多步驟合成根據(jù)本發(fā)明的化合物。
實(shí)施例1Gua-Mab-氮雜Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca(4)的合成 Gua(Boc)2-Mab-氮雜Gly-Asp(Bu)-OH(1)
已知的多步驟合成之后得到Asp(Bu)-TCP樹脂(1.00g，0.6mmol/g，0.6mmol)(參見Gibson，C.；Goodman，S.L.；Hahn，D.；Hlzemann，G.；Kessler，H.，通過Fmoc-方法的氮雜肽和氮雜肽類似物的新的固相合成及其在RGD-模擬物合成中的應(yīng)用(NovelSolid-Phase Synthesis of Azapeptides and Azapeptoides viaFmoc-Strategy and its Application in the Synthesis of RGD-Mimetics)，J.Org.Chem.1999，64，7388-7394和Gibson，C.；Kessler，H.，在N-芳基-和N-烷基-N-嘧啶-2-基胺的固相合成中2-氟代嘧啶作為有效試劑(2-Fluoropyrimidine as an efficientreagent in solidphase synthesis of N-aryl-and N-alkyl-N-pyrimidin-2-ylamines)，Tetrahydron Lett.2000，41，1725-1728)，化合物1是無色油狀物(75.5mg，21％粗產(chǎn)率)。
HPLC(10-90％，30分鐘內(nèi))Rt＝21.9分鐘；ESI-MSm/z 1239.1(30)[2M+Na+]，1217.0(30)[2M+H+]，631.1(30)[M+Na+]，609.0(100)[M+H+]。
Gua(Boc)2-Mab-氮雜Gly-Asp(Bu)-Hda-H(2) Gua(Boc)2-Mab-氮雜Gly-Asp(Bu)-OH(1)(75.2mg，0.123mmol)，HOAt(16.8mg，0.124mmol，1.0當(dāng)量)和HATU(56.5mg，0.148mmol，1.2當(dāng)量)溶解于無水DMF(1.5mL)，然后用三甲吡啶(163微升，149mg，1.23mmol，10當(dāng)量)處理。2小時(shí)之后，10℃下劇烈攪拌下向1，6-二氨基己烷(0.287g，2.47mmol，20當(dāng)量)的DMF(2mL)溶液經(jīng)5分鐘滴加上述溶液。使反應(yīng)在該溫度下進(jìn)行10分鐘，然后在室溫下又?jǐn)嚢?0分鐘。然后用油泵抽真空濃縮反應(yīng)混合物。殘余物溶解于CH2Cl2(15mL)，并且用H2O(2×15mL)萃取。真空濃縮得到化合物2(82.2mg，95％粗產(chǎn)率)，為棕色固體。
HPLC(10-90％，30分鐘內(nèi))Rt＝20.1分鐘，ESI-MSm/z 1435.2(30)[2M+Na+]，1413.2(30)[2M+H+]，729.2(60)[M+Na+]，707.2(100)[M+H+]。
Gua(Boc)-Mab-氮雜Gly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca(3a)和Gua(Boc)2-Mab-氮雜Gly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca(3b)的2∶1混合物 3a R＝H3b R＝Boc6-{[6-(尿膜酸酰基氨基)己?；鵠氨基}己酸(Aca-εAhx-εAhx-OH)(69mg，0.23mmol，2.0當(dāng)量)和HATU(97mg，0.26mmol，2.2當(dāng)量)溶解于無水DMF(2.5mL)，然后用三甲吡啶(340微升，310mg，2.6mmol，22當(dāng)量)處理。1小時(shí)之后，攪拌下經(jīng)5分鐘滴加Gua(Boc)2-Mab-氮雜Gly-Asp(Bu)-Hda-H(2)(82.0mg，0.116mmol)的DMF(1mL)溶液。2小時(shí)之后，用油泵抽真空濃縮反應(yīng)混合物。殘余物溶解于CH2Cl2(1mL)和TFE(250微升)的溶劑混合物，并且緩慢滴加給CH3CN(35mL)，生成無色沉淀，通過離心和傾析去除沉淀。真空去除溶劑并且通過HPLC(30-80％，30分鐘內(nèi))純化，得到3a和3b的混合物，HPLC完全比例是2∶1(33.9mg，32％)，為無色固體。
3aHPLC(10-90％，20分鐘內(nèi))Rt＝11.8分鐘，ESI-MSm/z 909.3(70)[M+Na+]，887.3(40)[M+H+]。
3bHPLC(10-90％，20分鐘內(nèi))Rt＝16.8分鐘，ESI-MSm/z 1009.3(90)[M+Na+]。
Gua-Mab-氮雜Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca(4)3a和3b的2∶1混合物(33mg，36微摩爾)懸浮于CH2Cl2(0.5mL)，然后用95∶5 TFA/H2O混合物處理。1小時(shí)之后，真空濃縮反應(yīng)混合物。用H2O凍干，得到化合物4(29.0mg，95％，有10％去脒基化化合物)，為無色固體。
1H-NMR(500MHz，DMSO)δ＝10.31(s，1H，Ar-CO-NH-NH)，10.02(s，1H，NH-Ar)，8.24(s，1H，Ar-CO-NH-NH)，8.04(mc，1H，CO-NH)7.77(d，J＝7.8Hz，1H，arom)，8.24-7.50(m，8H，2×Ar-H，H2N-CNH2-NH，2×CO-NH)，7.41(d，J＝7.9Hz，1H，arom)，7.17-7.09(m，1H，CO-NH)，6.80(br.s，1H，NH-NH-CO-NH)，6.19(dd，J＝17.2，10.1Hz，1H，CO-CH＝CH2)，6.04(dd，J＝17.1，2.1Hz，1H，CO-CH＝CH順式H反式)，5.54(dd，J＝10.1，2.1Hz，1H，CO-CH＝CH順式H反式)，4.42(dt，J＝J′＝7.9Hz，1H，NH-CH-CO)，3.13-2.94(m，8H，4×CO-NH-CH2)AB-信號(hào)(δA＝2.63，δB＝2.55，Jab＝16.1，另外插入有JA，H(α)＝5.4Hz和JB，H(α)＝7.2Hz，2H，CH-CH2-CO2H)，2.01(t，J＝7.3Hz，4H，2×CO-CH2)，1.51-1.15(m，20H，aliphat.)；13C-NMR(125.0MHz，DMSO)δ＝172.0，171.83，171.76，170.6.164.4，157.6，155.8，135.6，133.9，131.9，129.8，127.6，125.3，124.7，123.4，50.1，38.7，38.4，38.3，38.2，35.3，29.0，28.9，28.8，26.1，25.9，25.0；HPLC(10-80％，30分鐘內(nèi))Rt＝10.6分鐘；ESI-MSm/z 753.3(10)[M+Na+]，731.3(100)[M+H+]。
B細(xì)胞粘著試驗(yàn)實(shí)施例研究小鼠MC3T3 H1成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)物與包被肽的材料表面的粘著。在該項(xiàng)試驗(yàn)中，接種50000細(xì)胞/cm2，在37℃/95％大氣濕度下在無血清培養(yǎng)基中溫育1小時(shí)之后，測(cè)定粘著細(xì)胞的比例。
細(xì)胞粘著比例[％]＝粘著細(xì)胞/接種細(xì)胞×100肽細(xì)胞粘著比例[％]Gua-Mab-氮雜Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca75Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys105
Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys101Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys96Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg17Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys13Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala7現(xiàn)有技術(shù)公開了用巰基肽對(duì)用牛血清白蛋白(BSA)預(yù)包被的聚苯乙烯制成的培養(yǎng)物表面包被(參見DE 19818098(Merck PatentGmbH)，實(shí)施例2。DE 19818098，實(shí)施例3也描述了用丙烯酸酯肽對(duì)PMMA表面的包被。
權(quán)利要求
1.式1[sic]的化合物B-Q-X11[sic]其中B是生物活性的細(xì)胞粘著-介導(dǎo)的分子，選自 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(ii)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iv)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg(v)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn(vi)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg(vii)，其中對(duì)于(i)X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或具有1-4個(gè)碳原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH，NH2或具有1-6個(gè)碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代，Ar是未取代的或者被A，OH，NH2，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的聯(lián)苯基的這樣一種方式取代，Hal是F，Cl，Br或I，Het是具有5-10個(gè)成環(huán)原子的飽和的，部分或完全不飽和的一環(huán)或二環(huán)雜環(huán)基團(tuán)，其中可以存在1-3個(gè)N和/或一個(gè)S或O原子，并且該雜環(huán)基團(tuán)可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代，Het1是具有1-4個(gè)N和/或S原子的5-或6-元芳香雜環(huán)，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4，5；Q不存在或者是有機(jī)間隔基分子和X1是固定分子，選自-CO-CH＝CH2(viii)-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(ix)-CO-(CH2)1-20-SH (x)-CO-CH(NH2)-CH2-SH (xi)-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(xii)-NH-(CH2)2-20-SH(xiii)-NH-CH(CO2H)-CH2-SH (xiv)其中在化合物(viii)至(xi)的情況下，基團(tuán)B的自由氨基與間隔基分子Q的自由羧基或固定分子X1的自由羧基，或者基團(tuán)Q的自由氨基與基團(tuán)X1的自由羧基相互連接成肽，并且在化合物(xii)至(xiv)的情況下，基團(tuán)B的自由羧基與間隔基分子Q的自由氨基或固定分子X1的自由氨基，或者基團(tuán)Q的自由羧基與基團(tuán)X1的自由氨基相互連接成肽和它們的鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Q選自[CO-(CH2)x-NH-]m-， (xvii)[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-， (xviii)[CO-(CH2)z-CO-]-， (xix)[NH-(CH2)z-NH-]-， (xx)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-， (xxi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-，(xxii)和它們的組合，其中m在各種情況下各自獨(dú)立地是1-20，x是1-12，y是1-50，[lacuna]和z是1-12。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Q選自[CO-(CH2)x-NH-]m-， (xvii)[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-， (xviii)[CO-(CH2)z-CO-]-， (xix)[NH-(CH2)z-NH-]-， (xx)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-， (xxi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-，(xxii)和它們的組合，其中m在各種情況下各自獨(dú)立地是1-8，x是1-5，y是1-6，和z是1-6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的式1[sic]的化合物，其是a) b)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysc)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lysd)Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cyse)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Argf)Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysg)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的作為治療植入物引起的疾病，缺陷和炎癥，例如骨質(zhì)疏松，血栓形成，心肌梗塞和動(dòng)脈粥樣硬化的骨質(zhì)溶解疾病，還有用于促進(jìn)和加強(qiáng)植入物或生物適應(yīng)表面進(jìn)入組織的整合作用進(jìn)程的藥物的化合物。
6.適合人和動(dòng)物器官的植入物，主要由下述組成載體基質(zhì)和生物活性層，細(xì)胞粘著介導(dǎo)的圍繞該基質(zhì)的分子，特征在于包圍層由根據(jù)權(quán)利要求1-4的化合物形成，載體基質(zhì)和該化合物之間存在共價(jià)鍵或吸附鍵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的植入物，特征在于所述載體基質(zhì)和/或其表面是金屬或金屬氧化物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的植入物，特征在于所述載體基質(zhì)和/或其表面是聚合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的植入物，特征在于所述聚合物是聚甲基丙烯酸甲酯，聚羥乙基甲基丙烯酸酯或者它們的共聚物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的式1[sic]的化合物和它的鹽的制備方法，特征在于，可以帶有保護(hù)基團(tuán)的生物活性分子B，和帶有保護(hù)基團(tuán)的間隔基團(tuán)-固定分子(Q-X1)或者固定分子(X1)彼此以肽的方式連接，然后去除保護(hù)基團(tuán)，和/或特征在于通過用酸或堿處理而將式I的堿性或酸性化合物轉(zhuǎn)化為它的一種鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的化合物制備用于治療植入物引起的疾病，缺陷和炎癥，例如骨質(zhì)疏松，血栓形成，心肌梗塞和動(dòng)脈粥樣硬化的骨質(zhì)溶解疾病，和用于促進(jìn)和加強(qiáng)植入物或生物適應(yīng)表面進(jìn)入組織的整合作用進(jìn)程的藥物的用途。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的化合物用于利用共價(jià)結(jié)合或吸附結(jié)合包被人和動(dòng)物器官植入物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的化合物B－Q－X
文檔編號(hào)A61P41/00GK1446230SQ01814101
公開日2003年10月1日 申請(qǐng)日期2001年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月17日
發(fā)明者J·梅耶爾, B·尼斯, M·達(dá)德, G·赫爾策曼, H·凱斯勒, M·坎特勒納, U·赫澤爾, C·吉布森, G·舒爾約克 申請(qǐng)人:默克專利股份公司