專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)能特異與細(xì)胞間粘附分子－1結(jié)合的十五肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一個(gè)能特異與細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)結(jié)合的十五肽分子。
本發(fā)明的能特異與細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)結(jié)合的十五肽，其編碼序列及推測(cè)的氨基酸序列分別見(jiàn)序列表1(SEQ ID No.1)和序列表2 SEQ ID No.2)。
本發(fā)明的十五肽的獲得方法是通過(guò)從噬菌體展示隨機(jī)十五肽庫(kù)中，運(yùn)用生物淘選(biopanning)的方法，富集并擴(kuò)增能與ICAM-1特異結(jié)合的噬菌體克隆，經(jīng)測(cè)序后推測(cè)其氨基酸序列。具體步驟如下(1)ICAM-1特異結(jié)合肽展示克隆的淘選從噬菌體展示隨機(jī)十五肽庫(kù)中，運(yùn)用生物淘選(biopanning)的方法，富集并擴(kuò)增能與ICAM-1特異結(jié)合的噬菌體克?。?2)ICAM-1特異結(jié)合肽噬菌體克隆的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)挑選單個(gè)噬菌體克隆，通過(guò)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)，獲得ICAM-1特異結(jié)合肽噬菌體克??；(3)測(cè)序?qū)⑻赃x到的ICAM-1特異結(jié)合肽噬菌體克隆測(cè)序，測(cè)序引物為M13反向引物。編碼序列及推測(cè)的氨基酸序列分別見(jiàn)序列表1(SEQ ID No.1)和序列表2(SEQID No.2)。
經(jīng)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)證明該十五肽能特異與ICAM-1結(jié)合。ICAM-1特異結(jié)合肽噬菌體克隆可以抑制單克隆抗體sc-107與ICAM-1的結(jié)合。
ICAM-1特異結(jié)合十五肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞p38活性的影響通過(guò)western雜交證明，ICAM-1特異結(jié)合十五肽能夠抑制細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞p38蛋白激活。P38激酶介導(dǎo)著炎癥的信號(hào)通路，抑制該激酶就能有效的抑制炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而阻止炎癥的發(fā)展。這個(gè)十五肽分子可作為抗炎和ICAM-1相關(guān)疾病的藥物或藥物的先導(dǎo)物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的十五肽分子具有明確的靶分子。
2.利用生物淘選的方法獲得的十五肽，通過(guò)化學(xué)合成可以具有生物學(xué)活性。
3.該十五肽可以抑制由細(xì)胞粘附分子1介導(dǎo)的MAPK38的活性。
1.將重組人ICAM-1包被于酶標(biāo)板，加入噬菌體展示隨機(jī)十五肽庫(kù)孵育；2.在酸性條件下將與ICAM-1結(jié)合的噬菌體洗脫；3.洗脫的噬菌體感染宿主菌，經(jīng)擴(kuò)增后純化噬菌體；4.取部分?jǐn)U增的噬菌體與ICAM-1再次孵育，進(jìn)行第二輪淘選。
總共進(jìn)行四輪淘選。
二、ICAM-1特異結(jié)合肽噬菌體克隆的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)挑選單個(gè)噬菌體克隆，通過(guò)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)，獲得ICAM-1特異結(jié)合肽噬菌體克隆。
1.最后一輪淘選出的噬菌體感染宿主菌，鋪于固體培養(yǎng)基，得到分散良好的單克隆；2.挑取分散良好的單克隆，分別擴(kuò)增提取噬菌體；3.將提取的噬菌體包被于酶標(biāo)板；4.加入生物素標(biāo)記的重組人ICAM-1孵育；5.加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素孵育；6.加入鄰苯二胺底物孵育，測(cè)A490，挑選陽(yáng)性克隆。
三、測(cè)序?qū)⒌玫降年?yáng)性克隆用M13反向引物進(jìn)行測(cè)序，所得ICAM-1特異結(jié)合十五肽編碼序列及推測(cè)的氨基酸序列分別見(jiàn)序列表1(SEQ ID No.1)和序列表2(SEQID No.2)。
四、ICAM-1特異結(jié)合肽展示克隆對(duì)抗體作用的影響通過(guò)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)證實(shí)ICAM-1特異結(jié)合肽噬菌體克隆可以抑制單克隆抗體sc-107與ICAM-1的結(jié)合。
1.將噬菌體包被于酶標(biāo)板；2.加入ICAM-1孵育；3.加入ICAM-1單克隆抗體sc-107孵育；4.加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育；5.加入鄰苯二胺底物孵育，測(cè)A490。
噬菌體與ICAM-1結(jié)合的A490與二者結(jié)合后再與sc-107結(jié)合的A490之差值為1.506，證明此十五肽能特異地與ICAM-1的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
五、ICAM-1特異結(jié)合十五肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞p38活性的影響細(xì)菌脂多糖(LPS)與ICAM-1特異結(jié)合十五肽同時(shí)處理RAW264.7細(xì)胞。使用抗磷酸化p38單克隆抗體，通過(guò)western雜交證明ICAM-1特異結(jié)合十五肽能夠抑制細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞p38蛋白激活。
序列表1(SEQ ID No.1)GGT CGG GGT GAG TTT CGT GGT AGG GAT AAT TCT GTT TGG GTG GTT序列表2(SEQ ID No.2)G R G E F R G R D N S V S V V
權(quán)利要求
1.一種十五肽，具有序列表1所述的編碼序列或序列表2所述的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的十五肽分子用于抑制P38激酶的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)能特異與細(xì)胞間粘附分子－1(ICAM－1)結(jié)合的十五肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。ICAM－1特異結(jié)合十五肽能夠抑制細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞p38蛋白激活。P38激酶介導(dǎo)著炎癥的信號(hào)通路，抑制該激酶就能有效的抑制炎癥信號(hào)通路，進(jìn)而阻止炎癥的發(fā)展。這個(gè)十五肽分子可作為抗炎和ICAM－1相關(guān)疾病的藥物或藥物的先導(dǎo)物。
文檔編號(hào)A61K38/10GK1392158SQ0212554
公開(kāi)日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者顧軍, 朱圣庚, 韋錦學(xué) 申請(qǐng)人:北京大學(xué)