專利名稱：以人類凝血酶生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法
技術領域：
本發(fā)明有關一種纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法，尤其有關一種以人類凝血酶生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法。
(2)背景技術纖維蛋白膠(Fibrin glue)又稱為纖維蛋白封合物(Fibrin sealant)或纖維蛋白黏著劑(Fibrin adhesive)，其可以經(jīng)由混合兩種血漿成份--纖維蛋白原濃縮物(Fibrinogen concentrate)和凝血酶濃縮物(Thrombin concentrate)而得，已成為人類血漿最重要的制品之一。
纖維蛋白膠是一種使用于局部的血漿制品，其為模擬凝血機制的最后一個步驟而最終行成一個纖維蛋白凝血塊黏附于其所應用的局部組織。纖維蛋白膠有助于止血與傷口的愈合兩種特性，因此其應用主要在醫(yī)療手術中，如傷口愈合、矯形手術、皮膚移植、骨頭重建或燒燙傷治療，在細胞培養(yǎng)(cell culture)方面可成為纖維原細胞(fibroblasts)、角質(zhì)細胞(keratinocytes)等生醫(yī)材料的培養(yǎng)基質(zhì)。
纖維蛋白膠相較于人工合成的黏著劑，如氰丙烯酸衍生物(cyanacrylatederivatives)或明膠-苯間二酚(雷瑣辛)-甲醛化合物(gelatin-resorcinol-formaldehyde composite)等，纖維蛋白膠由于由血漿衍生而來，所以具有生物相容性及生物分解性的優(yōu)點。因此，不會造成發(fā)炎反應(inflammatory reactions)、異物反應(foreign body reaction)、組織壞死(tissue necrosis)或嚴重纖維化(extensive fibrosis)，并在使用于傷口愈合數(shù)日到數(shù)周之間自然被人體所吸收。
近年來，纖維蛋白膠已經(jīng)成為醫(yī)學界所注目的議題，其制造方式主要分為兩種商業(yè)化大量制造的纖維蛋白膠產(chǎn)品與少量由外科醫(yī)生自行制作的纖維蛋白膠(Home-brew fibrin glue)。
傳統(tǒng)商業(yè)化產(chǎn)品是由數(shù)千公升的人類集合血漿經(jīng)工業(yè)化分餾制成，然而此種產(chǎn)品并不普及，同時具有病毒感染的危險性，因此在歐美有許多外科醫(yī)生便發(fā)展出自制的纖維蛋白膠，由醫(yī)院人員制備，把來自單一捐血者血漿的冷凍沉淀物或病患自身的血漿，與凝血酶相混合制成。
然而，因缺乏人類血漿制成的凝血酶，因此后者的方法需要使用源自小牛血漿(Fetal bovine serum)的凝血酶，此為異種蛋白質(zhì)，同時有種種的抗原性疑慮及病原蛋白顆粒(prion)感染的危險性，甚至引起嚴重的免疫反應和致命的出血，因為部份病人會發(fā)展出抗第五凝血因子抗體(anti-FV antibody)，而與其本身自身的第五凝血因子進行交叉反應。
因此，就現(xiàn)階段的纖維蛋白膠制備方法而言，仍然有其需要改進及克服的缺憾，極需新的研制方法來減輕或避免上述的問題。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種以人類凝血酶生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法。
本發(fā)明的生產(chǎn)纖維蛋白膠的方法，包括首先從單一捐血人血漿中制備凝血酶，之后與單一捐血人的血漿冷凍沉淀物混合后，即可制成單一捐血人的纖維蛋白膠；或者與病人本身血漿制成的冷凍沉淀物混合即可制成自體性的纖維蛋白膠。
本發(fā)明的以人類凝血酶生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法分為制備凝血酶與纖維蛋白膠兩種，其中制備凝血酶的步驟包括利用全血捐血分離，或血漿分離術所得到的含正常檸檬酸鹽抗凝劑血漿制備凝血酶；使用不同的濃度輔因子(co-factor)在金屬或玻璃物質(zhì)存在下，將凝血系統(tǒng)活化，使血漿中的第二凝血因子活化為凝血酶；決定活化的最佳條件，以控制凝血酶在最短的時間內(nèi)形成，同時評估減低檸檬酸鹽濃度的影響。
本發(fā)明制備纖維蛋白膠的步驟包括當凝血酶完成制備后，與富含纖維蛋白原的人類冷凍沉淀物相混合產(chǎn)生纖維蛋白膠，該纖維蛋白膠的生產(chǎn)同樣控制在以最短的時間內(nèi)產(chǎn)生。
本發(fā)明中制備凝血酶所用的血漿為單一捐血人的血漿，這樣可以避免因血漿來源過于復雜，而受病毒污染的危險。
本發(fā)明中所使用的冷凍沉淀物可為單一捐血人所提供，或由病患本身提供，由病患的冷凍沉淀物混合凝血酶制成的纖維蛋白膠為自體性纖維蛋白膠，不會有排斥性問題。
本發(fā)明中影響活化的條件主要為決定氯化鈣濃度、pH值、活化反應溫度等其它輔因子的濃度。
以上的纖維蛋白膠制備方法同時可應用于它種由血漿中制備的生物性黏著劑，如血小板凝膠等。
(5)具體實施方式
本發(fā)明的以人類凝血酶生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法中，制備凝血酶時的步驟與所使用的最佳條件，以下列的實驗操作來決定1.氯化鈣(CaCl2)濃度的決定以20mM、50mM、80mM三種經(jīng)評估過的最終濃度氯化鈣溶液加入含有玻璃珠的血漿中，在數(shù)階段時間控制下以活化血漿，的后將完成活化的血漿與冷凍沉淀物混合并測量生成纖維蛋白膠的反應時間，其結果如表一。
表一
其中氯化鈣溶液的適合濃度為接近20mM，與血漿的混合活化時間為少于30分鐘，其形成纖維蛋白膠的時間皆短于其它濃度與其它階段的時間控制下的情形，而當氯化鈣溶液濃度在80mM時，纖維蛋白膠完全不會形成。
因此，選擇決定氯化鈣溶液的最適濃度范圍為70-10mM，混合的最適活化時間范圍為5分鐘至1小時；氯化鈣溶液的最適濃度約為20mM?；旌系淖钸m活化時間約為15分鐘。
2.玻璃珠的存在與否當血漿中缺乏玻璃珠時，活化反應并不會發(fā)生，無凝血酶的產(chǎn)生，因為玻璃珠本身提供一帶負電性質(zhì)的表面有助于凝血因子的聚集活化成凝血酶。
3.冰凍實驗本階段實驗的目的為了解是否血漿可被氯化鈣與凝血酶活化后，冰凍至-20℃保存直到使用時解凍到37℃以制造纖維蛋白膠。其結果如表二表二
因此，此種活化血漿可以被冰凍保存至須要制造纖維蛋白膠的時候。
4.溫度測試本階段實驗的目的為了解是否血漿活化時的溫度影響纖維蛋白膠形成的時間，其中以四種經(jīng)評估過的溫度20℃、26℃、30℃、37℃進行溫度測試，氯化鈣溶液的濃度為20mM，混合的活化時間為15分鐘，血漿中混合有玻璃珠，其結果如表三表三
*室溫本發(fā)明中，活化血漿的溫度范圍可介于15-40℃。表三中顯示，溫度介于20～30℃為活化血漿、制造凝血酶的最佳溫度范圍。
5.酸堿值測試本階段實驗的目的為確認酸堿值對血漿活化反應的影響，其中以鹽酸和氫氧化鈉來調(diào)整酸堿值，其它條件固定不變，如血漿中混合有玻璃珠，氯化鈣溶液的濃度為20mM，混合的活化時間為15分鐘等，然后經(jīng)過活化的血漿與冷凍沉淀物混合，量測形成纖維蛋白膠的時間，其結果如表四。
表四
表四的結果顯示，當酸堿值在6.5～8.5之間對纖維蛋白膠的形成時間并無太大的影響，當酸堿值大于9時，凝血酶被抑制，因此無纖維蛋白膠的產(chǎn)生。
所以血漿活化的酸堿度適當范圍為6～8.8之間。
6.血小板濃縮物(I)本階段實驗的目的為嘗試以血小板濃縮物取代血漿來制造纖維蛋白膠，其中其它操作條件仍然如前面數(shù)階段的實驗相同，其結果如表五。
表五
因此，即使在相同條件下，以活化后的血小板濃縮物再混合冷凍沉淀物，并不會產(chǎn)生纖維蛋白膠。
7.血小板濃縮物(Π)由于前述實驗中并無法產(chǎn)生纖維蛋白膠，因此本階段的實驗改變以血小板濃縮物取代冷凍沉淀物來制造血小板凝膠，其操作條件同樣為血漿中混合有玻璃珠，氯化鈣溶液的濃度20mM，混合的活化時間為15分鐘，將活化后的血漿與血小板濃縮物混合觀查血小板凝膠形成的時間，結果如表六。
表六
因此活化血漿的條件方法同樣適用于利用血小板濃縮物來制造血小板凝膠。
8.添加氯化鈣與氯化鈉到冷凍沉淀物中本階段實驗的目的為在兩種冷凍沉淀物---完全冷凍(cryo-rich)的血漿和血小板血漿(PRP platelet-rich plasma)中添加氯化鈣與氯化鈉，以觀察其能否促進纖維蛋白膠/血小板凝膠的品質(zhì)。
其中分別添加0.9％氯化鈉與20mM氯化鈣溶液到兩種冷凍沉淀物中，結果列于表七表七
纖維蛋白膠/血小板凝膠的形成時間在四種條件下幾乎都相同，但質(zhì)地硬度以完全冷凍血漿+20mM CaCl2為最佳，以血小板血漿(PRP)+0.9％NaOH為最脆弱。
9.添加Tris-緩沖液于PRP的影響本階段實驗的目的在于在冷凍沉淀物中添加Tris-緩沖液，以觀察其對纖維蛋白膠形成時間的影響。
其中將PRP冷凍沉淀物以2℃水浴解凍，之后將表面懸浮物除去。
取血漿和Tris-緩沖液各為預定反應量的一半，分別加入PRP冷凍沉淀物中，然后在37℃下解凍15分鐘。再加入活化的血漿(血漿中混合玻璃珠，氯化鈣溶液的濃度為20mM，混合活化的時間為15分鐘)，以量測纖維蛋白膠形成的時間，其結果如表八。
表八
*Tris-緩沖液50mM，pH7.5**Tris-緩沖液的量為血漿溶液的半量由表中可以得知，Tris-緩沖液的添加可以縮短纖維蛋白膠形成的時間，由實驗所得的纖維蛋白膠質(zhì)地較為堅硬，此外，表面懸浮物的去除減量亦可加速纖維蛋白膠的形成。
10.完整血漿的冷凍沉淀物相較于前一階段中所使用的血小板濃縮PRP冷凍沉淀物，本實驗階段擬以完整血漿進行Tris-緩沖液的添加測試。
其步驟與條件與第9階段相同，其結果如表九表九
*Tris-緩沖液的量為血漿溶液的半量實驗結果顯示，針對完整血漿而言，Tris-緩沖液的添加同樣可以縮短纖維蛋白膠形成時間。
11.表面懸浮物本階段實驗的目的在于冷凍沉淀物的表面懸浮物可否取代血漿來制作凝血酶。
以表面懸浮物來制作凝血酶需重新決定氯化鈣的最佳活性濃渡，10mM、20mM、40mM、60mM的氯化鈣溶液分別加入混合有玻璃珠的表面懸浮物，結果如表十
表十
由表十得知，氯化鈣的最佳活性濃渡落于20～40mM之間，因此作進一步細部分析，列于表十一表十一
表十一中顯示，表面懸浮物同樣可以用來制備凝血酶，其氯化鈣最佳活性濃度約為40mM。
13.肝磷脂凝膠(I)本階段實驗的目的在于利用固定化肝磷脂結合血漿中的第三抗凝血酶，以減少其存量、降低抑制凝血酶生成的機會。其在血漿未被活化前添加肝磷脂凝膠，觀察纖維蛋白膠形成的時間。
其中固定化肝磷脂以0.9％氯化鈉溶液清洗三次，分劑量50μL、100μL、150μL、200μL混合5ml血漿反應20分鐘。2ml血漿表面懸浮物混合玻璃珠以20mM氯化鈣活化15分鐘。最后將消除第三抗凝血酶的血漿與冷凍沉淀物混合以量測纖維蛋白膠的形成時間，其結果如表十二表十二
結果顯示，將血漿預先以肝磷脂凝膠處理可有效縮短反應時間至10秒左右。
14.肝磷脂凝膠(Π)本階段實驗的目的在于確認固定化肝磷脂結合血漿中的第三抗凝血酶的方法，是否可在血漿活化過程中同時進行，以減少活化反應前的步驟。
其將50μL、100μL、150μL、200μL肝磷脂凝膠混合5ml血漿反應20分鐘，該血漿混合有玻璃珠與20mM氯化鈣活化，再加入冷凍沉淀物混合以量測纖維蛋白膠的形成時間，其結果如表十三表十三
表十三中顯示，肝磷脂凝膠劑量為50μL時纖維蛋白膠形成時間較其它劑量為短。然而整體而言，并未顯著地縮短纖維蛋白膠的形成時間，其原因為凝血酶會先行與肝磷脂凝膠結合而失去其效用。
15.決定纖維蛋白膠最佳凝結時間本階段實驗的目的在于確認可否藉由選用活化血漿的時間減少纖維蛋白膠的形成時間。
其中以活化血漿開始形成凝結小塊的后的不同時間來區(qū)分，選用主要為初凝結與凝結開始后5分鐘后來作測試，其結果如表十四表十四
其結果顯示，判斷選用活化血漿(凝血酶)的最簡單判斷方法為凝結塊初形成的時候。
16.血漿抗凝結溶液中檸檬酸鹽濃度對纖維蛋白膠品質(zhì)的影響本階段實驗的目的在于比較血漿中全量濃度與半量濃度檸檬酸鹽對形成纖維蛋白膠的影響。
將血漿以血漿分離法自分為兩份的含有(無水)檸檬酸、檸檬酸鈉與右旋葡萄糖的抗凝血溶液收集出，此為半量濃度的血漿。血漿經(jīng)冷凍后于2℃下融化。
來自半量濃度血漿的冷凍沉淀物(cryo sample)與下列條件的凝血酶混合--半量濃度的非完全冷凍血漿；
--全量濃度的非完全冷凍血漿；--全量濃度完全血漿(標準狀態(tài))；來自全量濃度血漿的冷凍沉淀物同樣被制備出，并與上述條件的凝血酶混合以作為對照組。
以20Mm氯化鈣溶液活化血漿產(chǎn)生凝血酶的時間為15分鐘。
針對形成纖維蛋白膠的時間及品質(zhì)探討的實驗結果分為A.凝血時間實驗數(shù)據(jù)如下表
由上表可知，半量濃度血漿的冷凍沉淀物配合半量濃度非完全冷凍血漿的凝血酶活化形成纖維蛋白膠的時間較短。
B張力強度實驗數(shù)據(jù)如下表
由上表可知，由半量濃度血漿的冷凍沉淀物制成纖維蛋白膠，其強度較強。
C纖維蛋白膠形成后液體的形成現(xiàn)在一般的使用狀況下，纖維蛋白膠形成后往往會發(fā)現(xiàn)液體的存在，進而影響?zhàn)ぶ?，其實驗情況如下表
由上表可知，以半量濃度血漿的冷凍沉淀物來形成纖維蛋白膠可以避免液體的產(chǎn)生，因此可改進纖維蛋白膠的黏著性。
此部份的結果，同樣可以推用血小板凝膠的制備，當血小板濃縮物源自于半量濃度血漿而得時，配合凝血酶所制成的血小板凝膠其品質(zhì)及效果都較佳。
綜上所述，本發(fā)明的以人類凝血酶生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法中，制備凝血酶的步驟的活化血漿最佳條件為1.氯化鈣濃度20mM；2.活化時間少于30分鐘；3.活化溫度20～30℃；4.酸堿度pH6.5～8.5之間；以控制凝血酶在最短的時間內(nèi)形成，其中此條件同樣可以適用于血小板凝膠的制作上，完成活化的血漿可以被冰凍保存。
在制備纖維蛋白膠的步驟中，加入的冷凍沉淀物中添加20mM氯化鈣可以使形成的纖維蛋白膠質(zhì)地更致密，此外，添加Tris-緩沖液于PRP或完整血漿的冷凍沉淀物同樣可改善纖維蛋白膠的品質(zhì)。
另一方面，利用肝磷脂凝膠對血漿進行處理，可讓纖維蛋白膠形成時間縮短，特別是對活化前的血漿的處理，可讓形成時間減少為10秒內(nèi)，或者選擇使用活化血漿(凝血酶)的時機為凝結塊初形成的時候，同樣有效控制纖維蛋白膠在最短的時間內(nèi)產(chǎn)生。
另外，以半量濃度檸檬酸鹽血漿的冷凍沉淀物或血小板，來制成纖維蛋白膠的或血小板凝膠強度較佳，同時可以避免液體的形成，讓纖維蛋白膠的黏著性更好。
本發(fā)明中制備凝血酶所用的血漿為單一捐血人的血漿，可避免受病毒污染的危險；冷凍沉淀物亦為單一捐血人所提供，或由病患本身提供，由病患的冷凍沉淀物混合凝血酶制成自體性纖維蛋白膠或血小板凝膠，因此依照本發(fā)明方法所制成的生物凝膠不會在使用上有排斥性問題。
由此可知，本發(fā)明的以人類凝血酶生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法，相較于現(xiàn)階段的纖維蛋白膠生產(chǎn)方法，確實有其顯著的效益進步。
根據(jù)本發(fā)明可作的不同修正及變化對于熟習該項技術的人員而言均顯然不會偏離本發(fā)明的范圍與精神。雖然本發(fā)明已敘述特定的偏好具體事實，必須了解的是本發(fā)明不應被不當?shù)叵拗朴谶@些特定具體事實上。事實上，在實施本發(fā)明的已述模式方面，對于熟習該項技術的人員而言顯而易知的不同修正亦被涵蓋于權利要求所限定的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種生產(chǎn)纖維蛋白膠的方法，其特征在于，包括從單一捐血人血漿中制備凝血酶；及將凝血酶與單一捐血人的血漿冷凍沉淀物混合后制成纖維蛋白膠，或?qū)⒛概c病人本身血漿制成的冷凍沉淀物混合制成自體性的纖維蛋白膠。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，制備凝血酶的步驟包括利用全血捐血分離，或血漿分離術所得到的含正常檸檬酸鹽抗凝劑血漿制備凝血酶；及使用金屬或玻璃物質(zhì)為輔助，將血漿中的第二凝血因子活化為凝血酶。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，制備凝血酶步驟中活化血漿的適當條件為血漿中加入玻璃珠；氯化鈣濃度20mM；活化時間少于30分鐘；活化溫度20～30℃；酸堿度pH6.5～8.5之間。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，制備凝血酶步驟中活化血漿的溫度為26℃。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，在制備纖維蛋白膠的步驟中，在冷凍沉淀物中添加20mM氯化鈣使形成的纖維蛋白膠質(zhì)地更致密。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，在制備纖維蛋白膠的步驟中，在冷凍沉淀物中添加Tris-緩沖液以改善纖維蛋白膠的品質(zhì)。
7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，進而包括增加使用肝磷脂凝膠對血漿進行處理，特別是對活化前的血漿的處理，讓纖維蛋白膠形成時間減少，以達到10秒內(nèi)形成的目的。
8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，進而包括選擇使用活化血漿(凝血酶)的時機為凝結塊初形成的時候，以有效縮短纖維蛋白膠形成時間。
9.一種以人類凝血酶生產(chǎn)血小板凝膠的方法，其特征在于，包括從單一捐血人血漿中制備凝血酶；及將凝血酶與單一捐血人的血小板濃縮物混合制成血小板凝膠，或?qū)⒛概c病人本身血漿制成的血小板濃縮物混合制成自體性的血小板凝膠。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，制備凝血酶的步驟包括利用全血捐血分離，或血漿分離術所得到的含正常檸檬酸鹽抗凝劑血漿制備凝血酶；及使用金屬或玻璃物質(zhì)為輔助，將血漿中的第二凝血因子活化為凝血酶。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，制備凝血酶的步驟中活化血漿的適當條件為血漿中加入玻璃珠；氯化鈣濃度20mM；活化時間少于30分鐘；活化溫度20～30℃；酸堿度pH6.5～8.5之間。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，制備凝血酶步驟中活化血漿的溫度為26℃。
13.如權利要求10所述的方法，其特征在于，在制備血小板凝膠的步驟中，在血小板濃縮物中添加20mM氯化鈣使形成的血小板凝膠質(zhì)地更致密。
14.如權利要求10所述的方法，其特征在于，在制備血小板凝膠的步驟中，在血小板濃縮物中添加Tris-緩沖液以改善血小板凝膠的品質(zhì)。
15.如權利要求10所述的方法，其特征在于，增加使用肝磷脂凝膠對血漿進行處理，特別是對活化前的血漿的處理，讓血小板凝膠形成時間縮短。
16.如權利要求10所述的方法，其特征在于，選擇使用活化血漿(凝血酶)的時機為凝結塊初形成的時候，以有效縮短血小板凝膠形成時間。
17.如權利要求2所述的方法，其特征在于，以表面懸浮物取代血漿制備凝血酶，其活化適當條件為血漿中加入玻璃珠；氯化鈣濃度40mM；活化時間少于30分鐘；活化溫度20～30℃；酸堿度pH6.5～8.5之間。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，制備凝血酶步驟中活化血漿的溫度為26℃。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，冷凍沉淀物是由半量濃度血漿所制成。
20.如權利要求9所述的方法，其特征在于，血小板濃縮物是由半量濃度血漿所制成。
全文摘要
本發(fā)明是關于一種以人類凝血酵素生產(chǎn)纖維蛋白膠與血小板凝膠的制備方法，尤其是指以一種來自單一捐血人或使用自體性凝血酶(Thrombin)，來產(chǎn)生具有生物相容性(Bio－compatible)、生物分解性(Bio－degradable)的纖維蛋白膠與血小板凝膠。本發(fā)明制備方法可以降低病毒感染及抗原性危害的機會，提高纖維蛋白膠在醫(yī)學上及細胞培養(yǎng)方面的應用。
文檔編號A61P7/00GK1507924SQ02157480
公開日2004年6月30日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權日2002年12月20日
發(fā)明者泰瑞·玻諾夫, 泰瑞 玻諾夫 申請人:新?lián)P行實業(yè)有限公司