專利名稱：在可生物降解的微球體中含有抗原、基因載體和佐劑的免疫組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)藥物組合物的方法，在免疫接種了抗原或編碼目的抗原的基因載體的宿主體內，該藥物組合物能夠刺激特異性細胞和/或體液免疫應答。這種組合物包含基于得自聚酯的共聚物的可生物降解的微球體，該微球體能夠對抗原、基因載體和刺激免疫應答遞質的佐劑進行包封和控釋。
已知包括6-單酯和6，6雙酯α，α-D-海藻糖(其中含30至90個碳原子的酯基被稱作海藻糖單霉菌酸酯和海藻糖雙霉菌酸酯)在內的一類化合物能夠刺激抗原呈遞細胞的募集和細胞因子的誘導產(chǎn)生，因而成為疫苗和免疫療法中的潛在候選對象。在本發(fā)明中，術語“佐劑”是指不與目的抗原本身共有免疫表位，卻能刺激針對目的抗原的免疫應答。
專利US4340588記載了海藻糖雙霉菌酸酯在含有流產(chǎn)布魯氏菌(BA，45/20株)抗原的疫苗組合物中作為佐劑的用途。在該組合物中，海藻糖雙霉菌酸酯的天然混合物得自于幾個來源并且被命名為“索狀因子”。利用色譜技術進行適當純化后，這些因子通常含有90％的雙霉菌酸酯和10％的單霉菌酸酯以及含有95-90％海藻糖雙霉菌酸酯的少量外源物質與僅僅基于BA45/20株的可溶性抗原的組合物相比，施用含有抗原和海藻糖雙霉菌酸酯的水包油乳劑形式的疫苗后明顯減少了感染。在該研究中，將提取物與作為乳劑的油混合。盡管已知油相的存在提高了幾種不希望在用藥位點發(fā)生反應的幾率而且可能導致肉芽瘤的產(chǎn)生，但是該油相的內含物可根據(jù)其作為提取物載體的重要程度來進行調節(jié)從而刺激適當?shù)拿庖邞?，其中所述提取物得自分枝桿菌的細胞壁。
在克服具有免疫原活性的制劑中由于有油的存在而導致問題出現(xiàn)的嘗試中，提出了使用含分枝桿菌細胞壁的不溶性成分的含水懸浮液的建議(US5759554)。含水懸浮液通過以下步驟來制備(i)裂解細菌以及隨后進行離心；(ii)采用蛋白水解酶從胞壁基的成分中去除蛋白(得自離心步驟的細胞碎片)；(iii)用去污劑進行處理并沖洗得自步驟(ii)的級分；(iv)凍干和(v)將凍干的級分懸浮在水溶液如鹽水溶液中。在該發(fā)明中，采用基于分枝桿菌成分的懸浮液對免疫系統(tǒng)進行刺激從而激發(fā)了人體或動物體對傳染病原體的中和作用并且延緩了癌細胞的生長。然而，該方法不能實現(xiàn)佐劑的可控釋放，而可控釋放可以使免疫應答最佳化。
針對抗原、基因載體和/或佐劑的方法也被記載在如US5643605專利文獻中。在該發(fā)明中，佐劑和/或微囊包封抗原的用途被記載用于治療或預防目的。
專利US5643605提供的組合物含有平均直徑為20至100μm的包封了這種免疫佐劑的PLGA(D-L-丙交酯-共-乙交酯)微球體。所使用的佐劑是皂甙(QS21)或胞壁酰二肽(MDP)，該佐劑能夠刺激以下條件的免疫應答(i)結合到聚合物中的含水佐劑的體積相對3克的聚合物為1mL或小于1mL；(ii)乳酸和乙醇酸單體間的摩爾比范圍為100∶0至0∶100；(iii)PLGA聚合物的固有粘度范圍為0.1至1.2dL/g；(iv)微球體的直徑范圍為20至100μm，和(v)所述佐劑按照三階段模式從微球體中釋放出來，其中在第一階段中，一天內釋放出少于30％的佐劑；在第二階段中，約30至200天內，其在一天后釋放出少于10％的佐劑；以及其中在第三階段中，釋放出前兩階段所剩余的佐劑。
然而，重要地是應當指出本發(fā)明提供的微球體的直徑范圍是20至100μm，當以用藥途徑如經(jīng)口或經(jīng)肺途徑進行使用時阻止免疫應答的誘導。用于這些途徑的理想直徑應當是在1至10μm的范圍內，據(jù)文獻記載，該直徑范圍也是皮下施用免疫原性組合物的理想直徑范圍。在該發(fā)明中，將皂甙溶解在乙醇溶液中并加入到聚合物相中，并且在另一種制劑中，將MDP溶解在含水相中后再加入到聚合物相中。在兩種制劑中，含有佐劑的相相當于制備方法的內部含水相。然而，該方法不允許加入可溶于非極性溶劑的佐劑。
幾種疫苗制劑采用了目的在于當主要以亞單位疫苗的形式施用抗原時能夠優(yōu)化免疫應答的佐劑。最近十年來，在疫苗研制中取得的進展使得引進用于獲得和生產(chǎn)抗原的新策略以及施用并將這些抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的新途徑成為可能。這些策略實現(xiàn)了改進，尤其是在研制安全、有效和通用疫苗的過程中實現(xiàn)了改進。在本文中，DNA疫苗，尤其是在需要細胞免疫應答的時候，作為引發(fā)保護反應所需的有吸引力的替代物。
專利US6048551記載了一種制備微球體的方法，該微球體含有被用于腫瘤治療的基因載體。在本發(fā)明中，采用了多種乳化方法。將基因載體溶解在含水相中并進行包封，選擇性地與也被溶解在含水相中的抗病毒藥物進行結合。所述顆粒的直徑范圍是1至200μm。
專利US6309569要求保護將DNA包封在聚合物微粒當中的方法，其中通過將(油包水)水包乳濁液加到含水相來萃取過量的有機溶劑，從而在含水溶液中形成粒徑達到10μm的含DNA的聚合物微粒。
迄今為止，將抗原或基因載體和免疫佐劑包封在得自PLGA的可生物降解的微球體的同一制劑中的方法還有待于得到描述。因此，盡管在提供含有或不含共-佐劑分子的可控遞送制劑方面已經(jīng)做出了努力，其中所述制劑能夠增強免疫應答，但是所述技術狀況仍然缺少基于微球體的被動吞噬細胞定向系統(tǒng)，所述微球體具有適當?shù)牧揭蚨軌蛲ㄟ^不同的途徑來進行施用并且仍然能夠定向于特定的細胞群。
研制這種系統(tǒng)的一個重要原因是由于需要抗肺結核的有效疫苗。
本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，該組合物包含至少一種佐劑和/或蛋白質；和/或含有蛋白-表達基因的質粒，該質粒被包埋在平均直徑小于20μm，優(yōu)選地在1至10μm之間的高分子微球體中。因此，除了佐劑，所述組合物還含有一種抗原或編碼該抗原的基因載體(優(yōu)選來源于寄生蟲和病原體)，所述抗原包括胞外和胞內細菌、真核生物如真菌和原生動物等的抗原。所述佐劑優(yōu)選地是那些刺激細胞因子產(chǎn)生的佐劑。理想地是，攜帶分枝桿菌蛋白基因，例如hsp65基因(源自麻風分枝桿菌的65kDa的熱休克蛋白)的質粒，或者甚至是純化的或重組的蛋白可以被包封在得自乳酸和乳酸與乙醇酸的共聚物(單體比例變化范圍是100∶0至0∶100)的聚合物微球體中。而且，海藻糖雙霉菌酸酯可以被包封在PLGA的微球體中。當人或動物宿主已經(jīng)患上了肺結核病時，包含海藻糖雙霉菌酸酯和/或含有hsp65蛋白基因的質粒，或者甚至是所述蛋白本身的系統(tǒng)也可以被用于預防和治療肺結核。
本發(fā)明的基因載體、抗原和/或佐劑的微囊包封可以通過以下方法來實現(xiàn)方法A(i)將由乳酸和乙醇酸產(chǎn)生的聚合物(以重量百分比表示的比例范圍是100∶0至0∶100)以0.2至10％的濃度溶解在有機溶劑，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等中，所述有機溶劑與水不相溶或部分相溶；(ii)將親脂抗原和/或佐劑溶解在含有所述聚合物的溶液(i)中；(iii)將在步驟(ii)中得到的溶液加到多元醇，例如聚乙烯醇(1至10％)中，從而形成水包油乳濁液；(iv)以適當?shù)乃俾?200至1000rpm)攪拌該乳濁液，以便得到平均直徑小于10μm，優(yōu)選地在1至5μm之間的微球體，以及(v)在攪拌條件下，通過利用共溶劑、通過真空蒸發(fā)或其它去除溶劑的技術來實現(xiàn)溶劑的去除而不破壞系統(tǒng)的穩(wěn)定性。或者可以通過離心或過濾、用含水溶劑沖洗、然后凍干來收集所獲得的微球體懸浮體。
方法B(i)將由乳酸和乙醇酸(以重量百分比表示的比例范圍是100∶0至0∶100)產(chǎn)生的聚合物以0.2至10％的濃度溶解在有機溶劑，例如二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿等中，所述有機溶劑含有或不含親脂佐劑如海藻糖雙霉菌酸酯；(ii)將親脂性的基因載體、抗原和/或佐劑溶解在0.1至1mL的水相當中；(iii)將在步驟(ii)中得到的溶液加到在步驟(i)中獲得的聚合物溶液中，然后在500至15000rpm的速度下進行攪拌，結果形成油包水乳濁液(或分散體)；(iv)充分攪拌一段時間(1至10分鐘)后，將該初級乳濁液(或分散體)加到通常含有多元醇溶液，例如聚乙烯醇(1至10％)的乳化水相中，以便形成水包油-油包水的乳濁液；(v)在適當?shù)乃俣?100至1000rpm)下攪拌在步驟(iv)中獲得的多相乳濁液以便除去有機溶劑，結果產(chǎn)生平均直徑小于10μm，優(yōu)選地1至5μm的微球體，所述微球體可以通過過濾或離心、用含水溶劑沖洗并且最終凍干來進行收集。
值得提及的是本技術領域的其它已知方法可以被用來獲得載有抗原和/或佐劑的微球體。這就是本發(fā)明的目標，其不受本文所提供的技術的限制。
本發(fā)明通過下列實施例而得到詳細描述實施例1-海藻糖雙霉菌酸酯的制備在氯仿-甲醇混合物(1∶1體積/體積)中將100克的肺結核分枝桿菌H37Rv株勻化幾次。按照以前記載的純化海藻糖雙霉菌酸酯的方法對被提取的物質(18g)進行分級分離(Silva，C.L.，S.M.Ekizlerian，和R.A.Fazioli.1985.Role of cord factor in the modulation of infectioncaused by Mycobacteria.Am.J.Pathol.118238-247)。經(jīng)純化的糖脂(0.530g)在進行薄層層析的過程中通過遷移而形成一條單帶，與商品(SIGMA，St.Louis，USA)類似。
實施例2-含有海藻糖雙霉菌酸酯的微球體的制備和定性微球體按照乳濁液和溶劑蒸發(fā)技術來制備(Lewis，D.H.1990.Controlled release of bioactive agents from lactide/glicolide polymers.In Chasin M & Langer R.Biodegradable polymers as drug deliverysystems.Marcel Dekker，New York，1-43)。用30mL的二氯甲烷稀釋5mg的海藻糖雙霉菌酸酯(SIGMA)和125mg的可生物降解的PLGA(50∶50)(Resomer RG 505，MW 78,000，Boehringer Ingelheim，Germany)。將該有機相與100mL的含3％的聚乙烯醇(Mowiol40-88，SIGMA Aldrich Chemicals)表面活性劑的含水相混合，以便形成水包油的穩(wěn)定乳濁液。為了使有機溶劑蒸發(fā)，在室溫下進行6個小時的機械攪拌(800rpm)。通過在10.000xg下進行離心來收集微球體，用蒸餾水或鹽水沖洗3遍，凍干并貯存在4℃下。將微粒溶解在二氯甲烷中后通過薄層層析測定微球體中的海藻糖雙霉菌酸酯含量。通過CILAS 1064液相設備(Cilas，F(xiàn)rance)中的激光衍射測定微粒直徑，結果表明平均直徑范圍是1至5μm。結果被表示為直徑測定值下的累積值的百分比。不含PLGA的微球體或含海藻糖雙霉菌酸酯的微球體(Sigma，St.Louis，USA)或作為非相關對照的對照脂類(一種甘油酯混合物，Sigma，St.Louis，USA)通過相同方法進行制備并被作為實驗對照。
實施例3-質粒的制備將被基因載體pCDNA3或被修飾的pCDNA3(pCDNA3m)和含hsp65基因的質粒(PCDNA3-hsp65或pCDNA3修飾的-hsp65)轉化的E.coli，DH5α菌株在含100g/mL的氨芐青霉素(SIGMA)的LB肉湯基培養(yǎng)基(GIBCO BRL，Scotland)中進行培養(yǎng)。構建體pCDNA3修飾的-hsp65得自預先被Bam HI和Not I(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)消化的pCDNA3載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，然后將對應于麻風分枝桿菌hsp65基因的3.3kb片段和CMV內含子A(citomegalovirus)插到所述載體中。將不含hsp65基因的載體用作對照。通過陰離子交換樹酯純化質粒(Concert High Purity MaxiprepSystem，GIBCO BRL)。利用Gene Quant II儀器(Pharmacia Biotech)通過λ＝260和280nm的分光光度測定法對質粒濃度進行評估。
實施例4-重組蛋白的制備于37℃下、在振蕩速率為200rpm的振蕩培養(yǎng)箱中，采用含100μg/mL氨芐青霉素(SIGMA)和0.1M IPTG(異丙硫-β-D-半乳糖苷，GIBCO BRL)的500mL的LB肉湯基液體培養(yǎng)基(GIBCO BRL，Scotland)將經(jīng)含麻風分枝桿菌hsp65基因的pIL-161質粒轉化的E.coli，BL21菌株培養(yǎng)18小時。培養(yǎng)后，通過采用J2HS離心機(Beckman，rotor JS-7.5)以7500rpm離心15分鐘來收集細胞，將收集的細胞重懸浮在10mL的CE緩沖液中(30mM檸檬酸鈉，10mM EDTA，pH6.1)并利用Vibra CellTM超聲波探頭(Sonics & Materials，USA)在冰浴條件下進行3次脈沖沖擊，每次脈沖沖擊持續(xù)1分鐘并且強度為100W從而將細胞裂解。以16500rpm離心20分鐘后，棄去上清液并將沉淀重懸浮在30mL的UPE緩沖液中(6M尿素，20mM EDTA，50mM磷酸二氫鉀，pH7.0)并渦旋3分鐘。在室溫下通過輕輕攪拌將懸浮液保持15分鐘并以16500rpm離心20分鐘。將硫酸銨加到上清液中直至終濃度達到1M并在冰浴中溫育30分鐘。以16500rpm離心20分鐘后，將沉淀重懸在3mL的PBS中并對著PBS徹底透析。
實施例5-質粒或載有重組蛋白的微球體的制備進行多級乳化后通過以下溶劑蒸發(fā)法來獲得微球體利用Ultraturrax T50均化器(IKA-Labortechnik，德國)，在30mL含400mg PLGA 50∶50(來源于Boehringer Ingelheim的Resomer RG 505)的二氯甲烷中通過強烈攪拌(8000rpm)來乳化僅含不編碼hsp65蛋白的質粒載體(pCDNA3或PcDNA3修飾的)；或含有編碼hsp65蛋白(pCDNA3-hsp65，pCDNA3修飾的-hsp65)的基因的載體；或僅僅是重組sp65蛋白的含水相(0.3mL)，以便得到油包水的初級乳化液。為了制備含質粒的微球體，將4mg的質粒溶解在0.3mL的含水相中，針對重組hsp65，將1mg的蛋白溶解在0.3mL的含水相中。將該乳濁液加到含3％聚乙烯醇(Mowiol40-88，Aldrich Chemicals)表面活性劑的外部含水相(100mL)中，并進行均化從而形成多級水包油-油包水乳濁液。通過在室溫下利用Eurostar均化器(IKA-Labortechnik，德國)攪拌(300至800rpm)6小時至10小時進行蒸發(fā)來去除有機溶劑。利用Himac CR21離心機(Hitachi，轉頭R20A2)以10000xg的條件進行離心來收集微球體，用無菌水沖洗三次，凍干后貯存在4℃下。利用CILAS 1064流體設備(Cilas，法國)通過激光衍射學測定粒徑。平均粒徑應當在1至5μm之間。
實施例6-載有二霉菌酸酯和質?；蚨咕狨ズ偷鞍椎奈⑶蝮w的制備通過多級乳化和溶劑蒸發(fā)法獲得微球體利用Ultraturrax T50均化器(IKA-Labortechnik，德國)，在30mL含0.5mg海藻糖雙霉菌酸酯和400mg PLGA 50∶50(Resomer RG 505 da Boehringer Ingelheim)的二氯甲烷中通過強烈攪拌(8000rpm)來乳化含pCDNA3，PcDNA3修飾的、pCDNA3-hsp65、PcDNA3修飾的-hsp65或重組hsp65(對于質粒來說需要4mg，對于蛋白來說需要1mg)的含水相(0.3mL)，以便得到油包水的初級乳化液。將該乳濁液加到含3％聚乙烯醇(Mowiol40-88，Aldrich Chemicals)表面活性劑的外部含水相(100mL)中，并進行均化從而形成多級水包油-油包水乳濁液。通過在室溫下利用Eurostar均化器(IKA-Labortechnik，德國)攪拌(300至800rpm)6小時進行蒸發(fā)來去除有機溶劑。利用Himac CR21離心機(Hitachi，轉頭R20A2)以10000xg的條件進行離心來收集微球體，用無菌水沖洗三次，凍干后貯存在4℃下。利用CILAS 1064流體設備(Cilas，法國)通過激光衍射學測定粒徑。平均粒徑應當在1至5μm之間。
實施例7-在被載有質粒的微球體轉染化的真核細胞中對hsp65的表達進行評估于37℃下，在5％CO2的環(huán)境中，在添加了2％熱滅活的胎牛血清的1640 RPMI培養(yǎng)基(SIGMA)中培養(yǎng)J774細胞(來源于BALB/c小鼠的腫瘤譜系細胞)和J774-hsp65(經(jīng)攜帶麻風麻風分枝桿菌的hsp65基因的逆轉錄病毒載體[pZIPNeoSV(x)]轉染的J774細胞)。將100μL的細胞懸液(5×105個細胞)放置在24孔平板中的無菌蓋玻片上并溫育3小時從而使細胞粘著。溫育后，將1mL的RPMI培養(yǎng)基加到每個樣品中并按照下述方法進行處理A)J774細胞接受1mL的RPMI培養(yǎng)基并被用作hsp65表達的陰性對照；B)J774-hsp65細胞加上1mL的RPMI培養(yǎng)基并被用作hsp65表達的陽性對照；C)J774細胞接受1mL含載有pCDNA3修飾的-hsp65的微球體(10個微球體/細胞)的RPMI培養(yǎng)基。將微粒重懸在培養(yǎng)基中并將該懸液的濃度調節(jié)到5×106個微粒/mL，在Neubauer小室中對微粒進行計數(shù)；D)J774細胞加上1mL含有結合了Lipofectin(GIBCO BRL)的pCDNA3修飾的-hsp65的RPMI培養(yǎng)基。
培養(yǎng)24小時后，除去培養(yǎng)上清液并重新加入1mL的RPMI培養(yǎng)基。每48小時更換一次培養(yǎng)基。試驗開始后的第10天和第20天進行免疫細胞化學分析。
為了進行免疫細胞化學評估，用含1％牛血清白蛋白(BSA)(SIGMA)的PBS溶液將細胞沖洗3遍。在室溫下用4％的低聚甲醛將細胞固定30分鐘后再次進行沖洗。所有沖洗都進行3次沖洗。然后，通過在室溫下利用含3％H2O2的PBS進行溫育來封閉內源性過氧化物酶。沖洗后，在室溫下用封閉緩沖液(3％的兔血清，1％of BSA和0.01％的Triton X 100)將細胞溫育1小時，以便阻斷非特異性結合。然后，加入抗-hsp65抗體并在潮濕的4℃室內將細胞溫育過夜。用封閉緩沖液稀釋單克隆抗體(1∶100)，溫育并沖洗后，在室溫下，將樣品與生物素化的抗-小鼠IgG抗體(B-7022，Sigma)一起溫育，然后用封閉緩沖液稀釋(1∶200)1小時。沖洗后，在室溫下將樣品與鏈霉抗生物素生物素-過氧化物酶復合物(鏈霉抗生物素蛋白-Dako Corporation，CA-USA)再溫育30分鐘。然后進行沖洗并用3-3′二氨基聯(lián)苯胺底物(SIGMA)(10ml的PBS中含5mg)來顯色，同時加入180μL的H2O2(20個體積)。用蒸餾水終止反應并在室溫下用Mayer蘇木精將細胞染色5至10分鐘。用蒸餾水沖洗后，用0.5％的氫氧化銨溶液對其進行處理。然后再次進行沖洗，室溫干燥并放置在涂有加拿大香脂的載玻片上。通過將初次抗體替換成PBS或同型非相關抗體來獲得陰性對照。觀測細胞并利用配置了MC80DX攝像系統(tǒng)的Aristoplan顯微鏡(Leitz)拍攝照片。結果表明包封加工過程不影響DNA的功能，這是因為經(jīng)歷了上述過程的巨噬細胞能夠表達hsp65蛋白。
實施例8-免疫和攻擊感染從 Paulo大學的 Preto醫(yī)科學校的動物機構獲得6至8周齡的BALB/c小鼠并在標準實驗條件下進行飼養(yǎng)。所有過程都是按照倫理委員會的建議進行的。
通過肌內或氣管內途徑施用不同的微球體制劑來免疫小鼠。
微球體的用量范圍是100至500mg/kg并且方案是氣管內途徑單次施用而肌內途徑施用1或3次。施用微球體后的第30天或第60天，攻擊或殺死小鼠，以便對免疫應答進行評估。
當進行攻擊感染時，在用200μl 2.5％三溴甲醇(Sigma)的PBS溶液進行麻醉的情況下，通過氣管內途徑給小鼠施用105個菌落形成單位(CFU)的結核分枝桿菌H37Rv株。將被感染的動物保存在適當?shù)纳锇踩珬l件下。在不同的時間間隔殺死被感染的動物以便對肺部的炎癥反應進行定性和對防護能力進行評估。
實施例9-細胞因子的測定通過ELISA測定由經(jīng)微球體免疫的小鼠的肺和脾細胞產(chǎn)生的細胞因子的濃度。在4℃下，利用Ultraturrax T 25 IKA(Labortechnik，德國)將整個肺部組織均化5分鐘。以10000xg將被均化的組織離心15分鐘并通過0.22μm的膜濾出上清液，然后將該上清液用來測定細胞因子的產(chǎn)量。在37℃下，于5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)脾細胞并利用作為非特異性刺激物的伴刀豆凝集素A或利用作為特異性刺激物的重組hsp65對脾細胞進行體外刺激。
48小時后，收集用于進行細胞因子分析的培養(yǎng)上清液。特異于TNF-α(MP6-XT22，MP6 XT3)，IL-10(JES5-2A5，JES5-16E3)，IL-6(MP5-20F3，MP532cll)，IL-4(BVD4-1D11，BVD6-24G2)，IFN-γ(R4-6A2，XMG1.2)和IL-12(C15.6，C17.8)的捕獲物和生物素化單克隆抗體以及重組細胞因子可以購自Pharmingen(San Diego，CA)。利用上述ELISA技術(Haagmans，B.L.，A.J.van den Eertwegh，E.Claassen，M.C.Horzinek，和V.E.Schijns.1994.Tumor necrosisfactor-alpha production during cytomegalovirus infection inimmunosuppressed rats.J.Gen.Virol.75779-787)并按照廠商提供的說明書(Pharmingen，San Diego，CA)測定上清液中的TNF-α，IL-10，IL-6，IL-4，IFN-y和IL-12濃度。每次測定試驗都繪制一條重組小鼠rTNF-α，rIL-10，rIL-6，rIL-4，rIFN-γ或rIL-12的標準曲線。所有評估的細胞因子的測定極限都是15pg/Ml。
實施例10-氧化氮的測定在含10％胎牛血清(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)、10mMHepes、20mM碳酸氫鈉、100μg/ml(GIBCO-BRL)青霉素和鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)從注射了含海藻糖雙霉菌酸酯的微球體的小鼠體內支氣管肺泡灌洗液中回收細胞。通過采用Greiss方法(Stuehr，D.J.和C.F.Nathan.1989.Nitric oxide.A macrophage productresponsible for cystostasis and respiratory inhibition in tumor targetcells.J.Exp.Med.1691543-1555)測定細胞培養(yǎng)上清液中的亞硝酸鹽(NO2-)產(chǎn)量來評估氧化氮的產(chǎn)量。通過將200μM亞硝酸鈉溶液稀釋成系列稀釋度來繪制標準曲線。檢測極限是3μM/105個細胞。
實施例11-對抵抗攻擊感染的防護作用的評估為了評估各種制劑所賦予的抵抗結核分枝桿菌H37Rv株進行攻擊感染的保護作用，殺死預先經(jīng)過免疫和攻擊(如實施例8中所記載的)的動物。取出這些動物的肺，稱重并進行均化。將系列稀釋度的勻漿平鋪在7H11培養(yǎng)基上。在37℃下培養(yǎng)21天后對每只平板上的CFU數(shù)目進行計數(shù)。
在所有實驗中，本發(fā)明的制劑具有適當?shù)奶匦?，諸如平均直徑小于10μm(更精確地是在1至5μm之間)，因而容易被吞噬細胞攝取，使得囊化物質進行被動定向。囊化過程不影響DNA功能，這是由于經(jīng)載有pCDNA3修飾的-hsp65的微球體處理的巨噬細胞能夠表達蛋白。
本發(fā)明通過附加的表格得到進一步的說明。表I和表II表示氣管內施用載有重組hsp65的微球體能夠引發(fā)局部和全身水平的特異性免疫應答。該應答通過測定得自被免疫的BALB/c小鼠的脾細胞培養(yǎng)上清液中的γ干擾素(表I)和肺勻漿中的IL-12水平(表II)來進行評估。利用重組hsp65進行體外刺激后，經(jīng)載有重組hsp65的微球體免疫的小鼠體內的γ干擾素(IFN-γ)水平很高。經(jīng)重組hsp65(r-hsp65)的PBS或空載微球體免疫的小鼠不產(chǎn)生高水平的IFN-γ。將經(jīng)伴刀豆凝集素A(ConA)體外刺激后產(chǎn)生的IFN-γ濃度用作陽性對照。施用了r-hsp65的PBS或載有r-hsp65的微球體的小鼠體內的白介素12(IL-12)水平很高。該結果證實了通過非腸道途徑以外的其它途徑施用本發(fā)明提供的制劑的可能性。
表I免疫后第30天的BALB/c小鼠的脾細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ產(chǎn)量(pg/mL)

表II免疫第30天的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IL-12產(chǎn)量(pg/g)

然而，經(jīng)胃腸外施用后，本發(fā)明的制劑還能引發(fā)特異性免疫應答。每只BALB/c小鼠通過肌內注射單次劑量為5mg的含質粒微球體來進行免疫。免疫60天后，在脾細胞的培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了IFN-γ、IL-12和IL-6，由此表明產(chǎn)生了特異性免疫應答。如表III，IV和V所示，通過采用低于傳統(tǒng)疫苗接種方案的劑量的質粒就能產(chǎn)生該應答，其中如同發(fā)明專利WO95/31216和Silva及其同事(Lowrie等，Nature 400269-271，1999)的研究論文中所記載的那樣，DNA以溶液的形式分三次進行施用。單次劑量為5mg的微球體(含30g的質粒)能夠引發(fā)與肌內注射三次劑量為100μg的裸質粒相類似的免疫應答。該結果說明本發(fā)明的進步性在于降低了產(chǎn)生明顯免疫應答所需的DNA用量，因而減少了需要注射的次數(shù)表III通過肌內注射質?；虮话庠谖⑶蝮w中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60后天，其脾細胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ產(chǎn)量(ng/mL)

表IV通過肌內注射質粒和被包封在微球體中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60天后，其脾細胞培養(yǎng)上清中的IL-12產(chǎn)量(pg/g)

表V通過肌內注射質粒和被包封在微球體中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60天后，其脾細胞培養(yǎng)上清中的IL-6產(chǎn)量(pg/g)

關于載有TDM的微球體的免疫刺激特性，表VI和VII表明，本發(fā)明獲得的制劑通過氣管內用藥后能夠引起肺細胞產(chǎn)生數(shù)種細胞因子以及激活肺泡巨噬細胞，所述肺泡巨噬細胞的激活通過一氧化氮的產(chǎn)生來確定。表VI顯示了由注射了含TDM的微球體的小鼠和注射了對照物(PBS，對照脂質CtLip和海藻糖雙霉菌酸酯DBT)的小鼠的肺細胞產(chǎn)生細胞因子的結果。所述動物通過氣管內途徑進行注射。60天后，將肺取出并進行勻漿以便利用ELISA測定上清中的細胞因子。數(shù)據(jù)代表一次實驗，重復3次。
表VI通過氣管內途徑處理的BALB/c小鼠在注射后第60天，其肺勻漿中的細胞因子的產(chǎn)量

表VII顯示了由注射了含TDM的微球體的小鼠和注射了對照物(PBS，對照脂質和海藻糖雙霉菌酸酯)的小鼠的支氣管肺泡灌洗液中的細胞產(chǎn)生一氧化氮的結果。每次實驗獲得了約105個支氣管肺泡灌洗液中的細胞并于37℃下，在5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24小時。接著，收集培養(yǎng)上清液并通過Greiss法測定亞硝酸鹽濃度。通過多重比較Dunnett’s檢驗進行統(tǒng)計學分析，結果表明與注射了PBS的小鼠相比，采用TDM(*p＜0.01)和采用DBT(*p＜0.01)進行的處理之間存在著顯著差異。
表VII經(jīng)氣管內途徑處理的BALB/c小鼠的支氣管肺泡灌洗液細胞培養(yǎng)上清中的一氧化氮的評估

表VIII闡述了在得自被含有質粒和TDM的微球體和對照免疫的BALB/c小鼠的脾細胞培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生IFN-γ的水平。
表VIII在免疫30天后的BALB/c小鼠的脾細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ產(chǎn)量(pg/ml)

表IX闡述了在得自被含有質粒和TDM的微球體和對照免疫的BALB/c小鼠在免疫30天后，其血清液中產(chǎn)生抗體的水平。
表IX通過肌內注射含有質粒和TDM微球體而被免疫的BALB/c小鼠在免疫30天后，其血清中抗體產(chǎn)量的評估。

表X，XI和XII闡述了在得自注射了含有質粒和TDM的微球體和對照后又經(jīng)肺結核分枝桿菌H37Rv株攻擊后的BALB/c小鼠的肺勻漿中產(chǎn)生細胞因子的水平。
表X得自被免疫并受肺結核分枝桿菌攻擊的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IL-10產(chǎn)量(pg/mL)

表XI得自被免疫并受肺結核分枝桿菌攻擊的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IL-12產(chǎn)量(pg/mL)


表XII得自被免疫并受肺結核分枝桿菌攻擊的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IFN-γ產(chǎn)量(pg/mL)

表XIII闡述了含有DNA或蛋白與TDM的不同微球體賦予BALB/c小鼠以抵抗肺結核分枝桿菌毒株攻擊的防御功能的能力

如表XIII所示，只有含有載入了pCDNA3m-hsp65與TDM的微球體的制劑能夠保護小鼠免受感染。重要的是需要單獨施用劑量低于10倍的質粒就能誘導產(chǎn)生類似于由裸DNA方法獲得的保護作用。蛋白的最佳包封率達到了95％；而質粒的包封率為60至70％。佐劑/聚合物的最佳比例是6μg的佐劑∶1mg的聚合物。
權利要求
1.一種獲得免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物含有被共同包埋在可生物降解的微球體中的抗原或基因載體和免疫佐劑從而在被單次或多次施用后能夠引發(fā)包括細胞和體液應答在內的特異性免疫應答。
2.一種如權利要求1所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，其能通過上呼吸道(氣管內、肺部和鼻腔)、口腔和腸胃外途徑來進行施用。
3.一種如權利要求1和2所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，包含得自乳酸的聚合物和得自乳酸與乙醇酸的共聚物。
4.一種如權利要求1和2所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，其被包埋到平均粒徑為1至20μm的微球體當中。
5.一種如權利要求1和2所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，其中生產(chǎn)方法以及施加在其中的有機溶劑不會引起被包封的抗原、質?；蛎庖咦魟┕δ艿膯适А?br> 6.一種如權利要求1和2所述的藥物組合物，其中所述免疫佐劑增強了針對抗原或基因載體的免疫應答，從而降低了誘發(fā)免疫應答所需抗原或基因的劑量。
7.一種如權利要求1和2所述的藥物組合物，其中所述免疫佐劑增強了針對抗原或基因載體的免疫應答，從而在單劑量施用后能夠引發(fā)細胞和體液特異性免疫應答。
8.一種獲得如權利要求1和2所述組合物的方法，其中在所述方法的第一個步驟中，所述抗原或基因載體被加到初級乳濁液的含水相中而免疫佐劑被加到相同乳濁液的有機相(其含有所述的聚合物)中，從而形成油包水的含有抗原或基因載體與佐劑的乳濁液。
9.一種獲得如權利要求1和2所述組合物的方法，其中在權利要求8中獲得的油包水乳濁液被再次乳化到含有適當表面活性劑的含水相中從而獲得水包油-油包水的乳濁液。
10.一種如權利要求1和2所述藥物組合物，其中所述抗原是被重組或純化的源自麻風分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白。
11.一種如權利要求1和2所述藥物組合物，其中所述基因載體是含有編碼源自麻風分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白的基因的質粒。
12.一種如權利要求1，2和7所述藥物組合物，其中所述佐劑是海藻糖雙霉菌酸酯。
13.一種如權利要求1，2和7所述藥物組合物，其中所述抗原是源自麻風分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白以及佐劑是海藻糖雙霉菌酸酯。
14.一種如權利要求1，2和7所述藥物組合物，其中所述基因載體是含有編碼源自麻風分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白的基因的質粒以及佐劑是海藻糖雙霉菌酸酯。
15.一種如權利要求1，2和7所述藥物組合物，該組合物經(jīng)肺施用后能夠引發(fā)免疫應答，該免疫應答的特征在于-刺激細胞因子如IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ和TNFα的產(chǎn)生；-IgG1和IgG2a同種型抗體的產(chǎn)生；-由肺泡巨噬細胞產(chǎn)生的一氧化氮增多；-刺激局部和全身的免疫應答。
16.一種如權利要求1，2和7所述藥物組合物，該組合物經(jīng)腸胃外施用后能夠引發(fā)免疫應答，該免疫應答的特征在于-刺激細胞因子如IL-6，IL-10，IL-12和IFN-γ的產(chǎn)生；-特異于所述抗原的Th1型血清免疫球蛋白的產(chǎn)生；-IgG1和IgG2a同種型，尤其是IgG2a同種型抗體的產(chǎn)生。
17.如權利要求1，2和7所述藥物組合物用于預防傳染病的用途，其在人和動物宿主體內需要一種特征如權利要求15和16中所述的特異性免疫應答。
18.如權利要求1，2和7所述藥物組合物作為治療劑用于治療傳染病、哮喘、自身免疫疾病和癌癥的用途，其在人和動物宿主體內需要一種特征如權利要求15和16中所述的特異性免疫應答。
19.如權利要求1，2和7所述藥物組合物用于預防人類和動物肺結核的用途。
20.如權利要求1，2和7所述藥物組合物用于治療人類和動物肺結核的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠在接種了目的抗原或編碼該目的抗原的基因載體的宿主體內刺激免疫應答的組合物。該組合物包含基于得自乳酸和乙醇酸的共聚體的微球體，該微球體包封了具有得自分枝桿菌成分的免疫刺激特性的抗原、基因載體和/或佐劑。本發(fā)明的具體應用在于被包封在粒徑小于10μm的微球體內的與熱休克蛋白結合的或與含有編碼所述熱休克蛋白基因的質粒結合的海藻糖雙霉菌酸酯在被單次或多次施用后能夠誘導產(chǎn)生特異性抗體和細胞免疫應答，以及能夠誘導分泌與預防傳染病和癌癥相關的細胞因子的用途。
文檔編號A61K9/00GK1549728SQ02817186
公開日2004年11月24日 申請日期2002年7月17日 優(yōu)先權日2001年7月17日
發(fā)明者約瑟·馬奇爾·小羅德里格斯, 切利奧·洛佩斯·席爾瓦, 洛佩斯 席爾瓦, 約瑟 馬奇爾 小羅德里格斯 申請人:米納斯吉拉斯聯(lián)合大學, 切利奧·洛佩斯·席爾瓦