專利名稱：腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別是涉及一種腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的的技術(shù)方案的制備方法由以下幾個步驟組成A.制備抗原制備所需的原料為癌癥患者的癌組織，制備過程為勻漿后，以5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心20～60分鐘后，棄沉淀，再以8000～12000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心20～60分鐘，最后收上清液除菌，定性定量，分裝保存；B.動物免疫免疫過程為采取腹股溝、頸背、腹腔等多點皮下注射，共8～12點，每周免疫1次，共免疫4次，首次免疫和第二次免疫采用抗原加佐劑；第三、四次免疫只用抗原。
C.制備腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子將經(jīng)癌細(xì)胞抗原免疫的動物脾臟、淋巴結(jié)絞碎，勻漿后，凍融凍結(jié)溫度為-20～-70℃，融化溫度為20～30℃，凍融2～5次，最后低溫透析，定量定性，無菌分裝。四具體實施方式
本發(fā)明的具體實施步驟為1.制備抗原取手術(shù)切下的新鮮癌標(biāo)本，用1～3倍體積的勻漿液，勻漿分散，勻漿液條件是0.9％NaCL、20mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)(PH7.4)，或20mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)緩沖液(PH7.4)；離心5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘、20～60分鐘，棄沉淀；再離心收上清，離心8000～12000轉(zhuǎn)/分鐘、20～60分鐘，收上清除菌，定性定量，分裝保存。
2.免疫動物選擇符合規(guī)定之健康山羊，每只重約20Kg，采取腹股溝、頸背、腹腔等多點皮下注射，共8～12點，每周免疫1次，共免疫4次。首次免疫抗原10～30毫克/次，加等量完全福氏佐劑；第2次免疫抗原10～30毫克/次，加等量不完全福氏佐劑；第3、4次免疫單用抗原50～100毫克/次。用皮試法檢查山羊的致敏狀態(tài)。
3.制備腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子將經(jīng)腫瘤抗原免疫的山羊脾臟、淋巴結(jié)處理干凈，絞碎勻漿，凍于-20～-70℃低溫下并于20～30℃溫度下融化、如此反復(fù)凍融2～5次，對生理鹽水透析(5000～14000D透析袋)、在溫度2～10℃條件下，收透析外液，無菌抽濾，定性定量，并做生物活性檢測，分裝。
本發(fā)明的特點1.制備過程采用二次離心，可提高抗原的純度；2.配制的勻漿液利于抗原的釋放溶解及保護(hù)抗原的完整性；3.免疫的次數(shù)及用量既可保證腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的質(zhì)量又能提高其產(chǎn)量；4.透析條件能提高腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的純度。
本發(fā)明的優(yōu)點腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子本身不具免疫原性，可長期反復(fù)注射，使用安全、效果明顯，是目前預(yù)防和治療惡性腫瘤的一個安全有效實用的新方法新技術(shù)，具有廣泛的市場應(yīng)用前景及一定的社會價值。且對于消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌、腎癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤、顱內(nèi)易復(fù)發(fā)性腫瘤等均有較好療效。
具體實施例方式1.制備抗原收集手術(shù)切下的新鮮癌標(biāo)本，剔除癌灶周圍的正常組織，以PH7.4，20mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)緩沖液清洗、浸泡、勻漿分散，在4℃、7000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心30分鐘；收上清，再次在4℃、12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心50分鐘，收上清液除菌，留少部分測蛋白量，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.免疫動物選擇符合《實驗動物管理規(guī)程》山羊，每只20公斤，采用腹股溝、頸背、腹腔等多點皮下注射，共8～12點、每點0.5毫升，每周免疫1次，共免疫四次。首次免疫取20毫克/次癌抗原加等量完全福氏佐劑；第二次免疫取20毫克/次癌抗原加等量不完全福氏佐劑；后二次免疫用80毫克/次癌抗原。用皮試法檢查山羊的致敏狀態(tài)。
3.制備腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子取經(jīng)免疫的山羊脾臟、淋巴結(jié)，剪除包膜、脂肪、纖維組織、用滅菌生理鹽水反復(fù)洗滌后剪碎，勻漿，-70℃至30℃反復(fù)凍融5次，鏡檢破碎細(xì)胞達(dá)90％以上，離心棄沉淀取上清液，收上清液裝透析袋4℃生理鹽水透析30～40小時，透析袋分子量5000D以下，收透析外液過濾除菌，以最高吸收峰處(251nm)8.0abs為1個腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子單位(單位/毫升)，按生物制品分裝規(guī)程分裝，每支2毫升含2單位。
腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子成品檢定外觀無異物無沉淀無色或淡黃色透明、澄清的液體無菌試驗按2000年版二部《中國藥典》附錄XIH檢查，應(yīng)符合定。
PH值PH6.0～7.2，依2000年版二部《中國藥典》附錄VIH檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
多肽含量Folin-酚法，1.0～1.5毫克/毫升核糖含量3.5-二羥甲苯比色法0.6～0.7毫克/毫升E252±2nm有特征吸收峰E250nm、1cm15～18
E260/280nmE260/280＝2.0～2.3蛋白質(zhì)取本品2毫升加20％磺基水楊酸2毫升振搖，不得產(chǎn)生渾濁熱源按2000年版二部《中國藥典》附錄XIE檢查，應(yīng)符合規(guī)定過敏試驗取體重250～350克的健康豚鼠5只，連續(xù)次隔日腹腔注射本品0.5毫升，放置2周后，再自股靜脈注射本品1.0毫升，注射后15分鐘內(nèi)，觀察動物不得有連續(xù)次干咳、連續(xù)3次前爪抓鼻、明顯豎毛、四肢發(fā)軟、躺臥、呼吸困難、痙攣、虛脫及死亡等現(xiàn)象。
異常毒性取體重17～20克的健康小白鼠5只，分別由尾靜脈注射本品0.5毫升，72小時內(nèi)不得有死亡；如有死亡時，應(yīng)另取體重18～19克的小鼠10只復(fù)試，全部小鼠在72小時內(nèi)不得有死亡。
急性毒性試驗小鼠40只，隨機分成二組。一組肌肉注射20毫升/公斤受試藥(分二次給藥)，另一組一次性靜脈注射30毫升/公斤受試藥，受試藥量分別相當(dāng)于臨床成人擬用劑量的250倍和375倍，連續(xù)觀察7天。結(jié)果表明40只小鼠全部存活，給藥后亦未觀察到明顯的毒性反應(yīng)。小鼠生長良好，飲食如常，體重增加，行為活動未見異常，毛色光滑。試驗結(jié)束，將小鼠脫頸處死尸檢，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，未見明顯病理變化。
活性測定及結(jié)果E-玫瑰花結(jié)實驗取相同小試管4支，2支分別加入Hanks液0.2毫升作對照管，另2支分別加供試液0.2毫升作測定管。每管加入淋巴細(xì)胞懸液0.1毫升，混勻，置37℃恒溫水浴活化60分鐘。取出，離心(200g，10分鐘)，棄去上清液，加0.5％綿羊紅細(xì)胞懸液0.1毫升，搖勻。置37℃溫育10分鐘，離心(100g，5分鐘)，棄去上清液，將細(xì)胞輕輕水平旋轉(zhuǎn)混勻，加固定液0.1毫升，輕輕混勻。置4℃冰箱15分鐘。取出，每管取1滴分別置于載玻片上，用預(yù)先布勻染色液的蓋玻片復(fù)蓋于待染液滴上染色。用高倍鏡鏡檢計數(shù)。凡淋巴細(xì)胞表面粘附4個以上綿羊紅細(xì)胞者，即計算為玫瑰花結(jié)細(xì)胞的百分率，求出各組的平均值。結(jié)果樣品管的活性玫瑰花結(jié)百分率比對照管的活性玫瑰花結(jié)百分率提高10％以上。
MTT-LAI實驗實驗分組對照組為單加培養(yǎng)液、單加普通轉(zhuǎn)移因子、單加腫瘤抗原及普通轉(zhuǎn)移因子+腫瘤抗原；實驗組為腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子+相應(yīng)腫瘤抗原。實驗步驟將小鼠脾淋巴細(xì)胞用含10％小牛血清的RPMI-1640液稀釋成1×106個/毫升，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞液100微升。按實驗分組向每孔再加入培養(yǎng)液或各樣品。加樣完畢，將孔板于37℃培養(yǎng)2.5小時，翻轉(zhuǎn)孔板，棄去孔內(nèi)上清。然后向各孔內(nèi)加入180微升不含小牛血清的RPMI-1640液和20微升的MTT溶液(5毫克/毫升)，37℃再孵育4小時。離心(1000g，15分鐘)微孔板，棄上清，每孔加入200微升二甲基亞砜以溶解細(xì)胞內(nèi)形成的藍(lán)色化合物(Formazan)，室溫放置15分鐘。于ELISA-reader DYNATECH MR4000 570nm比色。每組設(shè)復(fù)孔三份。粘附抑制指數(shù)按下式計算 結(jié)果腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子+相應(yīng)腫瘤抗原組的白細(xì)胞粘附抑制效應(yīng)(LAI指數(shù)％)遠(yuǎn)高于其它各對照組(P＜0.01)，結(jié)果相差非常顯著，提示腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子轉(zhuǎn)移的LAI效應(yīng)是針對相應(yīng)腫瘤抗原的。說明腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子+相應(yīng)腫瘤抗原，如胃癌特異性轉(zhuǎn)移因子+胃癌抗原、肺癌特異性轉(zhuǎn)移因子+肺癌抗原、乳腺癌特異性轉(zhuǎn)移因子+乳腺癌抗原等等。
權(quán)利要求
1.腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于，由以下幾個步驟組成A.制備抗原制備所需的原料為癌癥患者的癌組織，制備過程為勻漿后，以5000～10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心20～60分鐘后，棄沉淀，再以8000～12000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心20～60分鐘，最后收上清液除菌，定性定量，分裝保存；B.動物免疫免疫過程為采取腹股溝、頸背、腹腔等多點皮下注射，共8～12點，每周免疫1次，共免疫4次，首次免疫和第二次免疫采用抗原加佐劑；第三、四次免疫只用抗原。C.制備腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子將經(jīng)癌細(xì)胞抗原免疫的動物脾臟、淋巴結(jié)絞碎，勻漿后，凍融凍結(jié)溫度為-20～-70℃，融化溫度為20～30℃，凍融2～5次，最后低溫透析，定量定性，無菌分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于勻漿液條件是0.9％NaCL、20mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)(PH7.4)，或20mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)緩沖液(PH7.4)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于免疫條件是首次免疫抗原加等量完全福氏佐劑；第二次免疫抗原加等量不完全福氏佐劑，抗原用量為10～30毫克/次；最后兩次免疫只用抗原，抗原用量為50～100毫克/次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于透析條件是用5000～14000道爾頓透析袋，在溫度2～10℃條件下進(jìn)行。
全文摘要
腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于包括制備抗原、免疫動物及制備腫瘤特異性轉(zhuǎn)移因子。本品取材于經(jīng)腫瘤抗原免疫的動物臟器，主要成分為小分子多肽、氨基酸及核苷酸等，不含球蛋白、也不會引起過敏，具有轉(zhuǎn)移細(xì)胞信息，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，特異性地抑制和殺傷相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，是目前預(yù)防和治療惡性腫瘤的一個安全有效實用的方法。
文檔編號A61K38/16GK1438030SQ0311454
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月17日
發(fā)明者王國華, 蘇成芝, 楊安鋼, 張瀝, 藥立波, 毛積芳, 王方, 金明, 劉新平, 王成濟, 陳蘇民, 陳南春, 趙忠良, 柴玉波 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)