專利名稱：一種攜帶質(zhì)粒pBIF10的兩歧雙歧桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的兩歧雙歧桿菌菌株及其在乳制品和保健食品生產(chǎn)上應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌屬中攜帶天然質(zhì)粒的情況比較少見，1982年Sgorbat等人對(duì)雙歧桿菌屬的24個(gè)菌種1461株雙歧桿菌使用瓊脂糖凝膠電泳探討質(zhì)粒情況，僅在4種雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒，它們分別是長雙歧桿菌(B.longum)，球雙歧桿菌(B.globosum)，星狀雙歧桿菌(B.asterides)，蜜蜂雙歧桿菌(B.indicum)。其中僅長雙歧桿菌來源于人。1989年Iwata等對(duì)分離不同人來源的42株雙歧桿菌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)18株短雙歧桿菌(B.breve)存在質(zhì)粒，其中13株的質(zhì)粒DNA電泳圖完全相同(康白主編，雙歧桿菌，第一版.大連海事大學(xué)出版社，1998.P3-41；p66-68；p99-166.)。上述兩個(gè)研究均沒有在兩歧雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)有天然的質(zhì)粒存在。
關(guān)于兩歧雙歧桿菌天然質(zhì)粒的報(bào)道就更少，黃耀堅(jiān)等對(duì)國外保藏的6種20株的雙歧桿菌進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，只在4個(gè)種的6株菌中發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在，其中短雙歧桿菌(B.breve)2株、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)2株、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)1株和兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)1株。該兩歧雙歧桿菌為ATCC29521標(biāo)準(zhǔn)株，攜帶有3.4Kb和5.7Kb的質(zhì)粒各一個(gè)(參見雙歧桿菌質(zhì)粒的檢測(cè)及其對(duì)抗生素敏感性.中國微生態(tài)學(xué)雜志，1997，9(3)10-12)。
丹麥JORGENSEN F等從兩歧雙歧桿菌DSM20215(Bifidobacteriumbifidum DSM20215)中分離出β-牛乳糖、BIF3氨基酸多肽等物質(zhì)。其中分離到了攜帶3Kb天然多拷貝質(zhì)粒(pBIF3)，以及以pBIF3構(gòu)建成的雙歧桿菌表達(dá)載體系統(tǒng)。(見‘High-efficiency synthesis of oligosaccharides with atruncated beta-galactosidase from Bifidobacterium bifidum.’APPLIEDMICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，2001，57(5-6)647-652)。
2003年6月20日在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide中檢索到的有關(guān)雙歧桿菌質(zhì)粒的基因接受號(hào)26個(gè)，(AE014781；AE014648；AF540971；AF538869；AF538868；AF359574；AF139129；AF085719；AY112722；AY112723；AY112724；AY066026；E05040；NC002133；NC004252；NC004253；NC002635；NC004307；NC004768；NC004769；NC004770；NC003527；NC002133；X84655；Y11549；U76614)；其中長雙歧桿菌質(zhì)粒20個(gè)，短雙歧桿菌質(zhì)粒4個(gè)，星狀雙歧桿菌質(zhì)粒1個(gè)，擬鏈狀雙歧桿菌2個(gè)；沒有發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌質(zhì)粒核苷酸序列的相關(guān)資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是獲得攜帶天然質(zhì)粒的新的兩岐雙岐桿菌。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是提供一種兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其含有DNA大小為10kb的天然質(zhì)粒pBIF10。
上述的兩岐雙岐桿菌攜帶的質(zhì)粒是1種多拷貝質(zhì)粒。
更具體的，本發(fā)明所述的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NoM203049的兩岐雙岐桿菌SHQ004。
以上所述的兩岐雙岐桿菌可應(yīng)用于乳制品和保健食品的生產(chǎn)。
本發(fā)明還提供一種質(zhì)粒，它是來自兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)的DNA大小為10kb的質(zhì)粒。
進(jìn)一步的，上述的質(zhì)粒是一種多拷貝質(zhì)粒。
本發(fā)明的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)SHQ004是從上百份健康青年糞便樣本，經(jīng)多批次從100多個(gè)平板近1200多個(gè)菌落中分離到的攜帶有多個(gè)10Kb質(zhì)粒(記作pBIF10)的兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)，其特征如下(1)菌落特征該菌種接種在牛奶液體培養(yǎng)基中，在有氧條件下不生長，而在嚴(yán)格厭氧條件下生長良好。平板菌落為圓形、隆起、邊緣較整齊；菌苔乳白色，可見粘液狀，未見色素產(chǎn)生。
(2)菌體形態(tài)特征在光學(xué)顯微鏡下觀察，該菌體為桿狀，多變性，在一定的生長時(shí)期出現(xiàn)明顯的分叉、棍棒型、甚至大的圓點(diǎn)型，菌體變化較大；未見內(nèi)生孢子形成，不運(yùn)動(dòng)，菌體內(nèi)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上明顯的顆粒，革蘭氏陽性。
(3)生理生化特性接觸酶陰性。能利用乳糖、半乳糖、果糖和蔗糖，不能利用海藻糖、麥芽糖、木糖、淀粉、山梨糖、棉子糖、松三糖、纖維二糖、菊糖、阿拉伯糖和核糖；也不能利用甘露醇、水楊苷和山梨醇。
(4)pBIF10質(zhì)粒的特征pBIF10質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，大小約10Kb，在1％瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)出現(xiàn)單一的條帶。
(5)pBIF10質(zhì)粒DNA提取操作方法a、取細(xì)菌沉淀0.5克，用1.0ml pH6.5的生理鹽水將細(xì)菌懸浮混勻，3500轉(zhuǎn)/分離心5-8分鐘，棄上清，沉淀用1.0ml的溶菌酶(40mg/ml，用pH8.0的生理鹽水現(xiàn)配)重懸，再加入300U的變?nèi)芫?mutanolysin，pH6.5)，混勻后37℃酶解30-60分鐘(30分鐘后取少許菌液在顯微鏡下觀察，有50％的原生質(zhì)體出現(xiàn)即可)。
b、4000轉(zhuǎn)/分離心8-10分鐘，棄上清，沉淀用堿法裂解法操作(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，科學(xué)出版社，1999年，P19-22)，方法同大腸桿菌。
c、將DNA樣品最后一步用75％冷酒精沉淀，倒置試管，流出殘余液體，自然空氣干燥10-15分鐘。
(6)質(zhì)粒鑒定在自然干燥后的DNA樣品(沉淀)中加入40μl TE緩沖液溶解，溶解質(zhì)粒DNA10-15分鐘，取10μl質(zhì)粒DNA樣品，按照上述的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所述的電泳方法，在1.0％瓊脂糖凝膠的加樣孔中分別加入λDNA(HindIII)分子量標(biāo)準(zhǔn)(大連寶生物工程公司產(chǎn)品)、未用RNA酶處理的人兩岐雙岐桿菌質(zhì)粒DNA樣品、經(jīng)RNA酶處理的人兩岐雙岐桿菌質(zhì)粒DNA樣品。電泳30-60分鐘，經(jīng)溴化乙錠(EB)染色在紫外燈下觀察?？梢娰|(zhì)粒樣品均有一條單一的DNA帶，位置在標(biāo)準(zhǔn)DNA分子的9.4Kb條帶之上，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，該質(zhì)粒DNA的大小在10Kb左右。同時(shí)，沒有用RNA酶處理的質(zhì)粒樣品，在質(zhì)粒條帶之后近凝膠下邊緣處可見一拖尾的RNA降解物，證明細(xì)菌完全破裂，質(zhì)粒提取是成功的。
本發(fā)明人在提取質(zhì)粒時(shí)發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒DNA的提取量可與相同細(xì)菌濃度的大腸桿菌DH5α質(zhì)粒的量相當(dāng)(EB染色后，紫外燈下與標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度比較定量法)，因此本發(fā)明人認(rèn)為pBIF10是多拷貝質(zhì)粒。如果是單拷貝型質(zhì)粒，其提取產(chǎn)量與相同細(xì)菌濃度的大腸桿菌DH5α質(zhì)粒的量相比就低很多。
上述特征表明，該菌株為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)。它與現(xiàn)有的菌種有明顯區(qū)別，其主要不同點(diǎn)在于本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌是攜帶1種多拷貝10kb天然質(zhì)粒的人兩歧雙歧桿菌，其攜帶的多拷貝10kb質(zhì)粒經(jīng)過分子生物學(xué)手段改造，可以構(gòu)建新的表達(dá)載體系統(tǒng)。
本發(fā)明的有益效果雙岐桿菌作為人體腸道正常微生物，具有抗衰老、防癌化、維持健康的作用。它通過細(xì)胞表面的磷壁酸吸附在小腸上皮細(xì)胞表面的受體上，雙歧桿菌的定植，使腸道菌相的構(gòu)成發(fā)生改變，雙歧桿菌(死菌和活菌)及其代謝產(chǎn)物能抑制某些對(duì)人體有害的腸道菌的滋生，并降解由這些有害菌產(chǎn)生的毒素物質(zhì)和食物中帶來的有致癌物如亞硝酸鹽等，同時(shí)，雙歧桿菌的大量繁殖，還有利于促進(jìn)人體腸道的蠕動(dòng)和消化液的分泌，發(fā)揮潤腸通便的功能，因此，可用于腸道疾病如腹瀉、便秘等的輔助治療和乳制品生產(chǎn)，本發(fā)明提供了一株新的符合衛(wèi)生部規(guī)定的雙岐桿菌益生菌菌株，為保健食品生產(chǎn)擴(kuò)大了生產(chǎn)菌株的來源；同時(shí)還為構(gòu)建新的質(zhì)粒表達(dá)載體系統(tǒng)提供了可能。
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1雙岐奶的制備(1)人兩岐雙岐桿菌SHQ004母液的制備以厭氧菌增菌培養(yǎng)基PYG接種人兩岐雙岐桿菌SHQ004培養(yǎng)24小時(shí)，使兩岐雙歧桿菌SHQ004的細(xì)菌濃度達(dá)到109-1011個(gè)/ml。
(2)雙歧奶的制備取奶粉1.5g，水蘇糖(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院生產(chǎn))2g，蔗糖5g，食用香精適量，冷無菌水溶解后，加熱水至100ml，調(diào)pH6.0，攪拌至完全溶解，裝瓶；將溶液在8磅下高壓滅菌30min，取出后冷至45℃，接種人兩岐雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)SHQ004菌種母液1.0ml混勻；在37℃條件下厭氧發(fā)酵24小時(shí)即可。質(zhì)量控制參考國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。
實(shí)施例2潤腸通便、止腹瀉口服輔助治療制劑的制備以厭氧菌增菌培養(yǎng)基(如PYG或MRS等)培養(yǎng)24小時(shí)，使兩岐雙歧桿菌SHQ004的菌種濃度達(dá)到109-1011個(gè)/ml。取上述濃度菌液30％-40％(體積百分比)，加30％-40％(體積百分比)脫脂牛乳、20％-10％(體積百分比)蔗糖、5％-10％(體積百分比)海藻糖做分散劑和保護(hù)劑，充分混合后，于-80℃低溫冰箱預(yù)凍60分鐘，22-24小時(shí)內(nèi)-30℃--70℃冷凍干燥。如果條件允許，可在真空干燥器內(nèi)放置適量的無毒無嗅的干燥劑如硅膠等以縮短干燥時(shí)間，增加活菌數(shù)量，最后分裝成活菌粉膠囊或壓片，使每?；蛎科幒p歧桿菌活菌大于或等于0.5億。用于便秘、腹瀉等的輔助治療。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于其含有DNA大小為10kb的天然質(zhì)粒pBIF10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于所述的質(zhì)粒是1種多拷貝質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NoM203049的兩岐雙岐桿菌SHQ004。
4.上述權(quán)利要求所述的兩岐雙岐桿菌在乳制品和保健食品生產(chǎn)上的應(yīng)用。
5.一種質(zhì)粒，其特征是來自兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)的DNA大小為10kb的質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒，其特征是它是一種多拷貝質(zhì)粒。
全文摘要
一種攜帶質(zhì)粒pBIF10的兩歧雙歧桿菌菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種新的兩歧雙歧桿菌菌株及其在乳制品和保健食品生產(chǎn)上應(yīng)用。解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是提供一種兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其含有1種DNA大小為10kb的多拷貝天然質(zhì)粒pBIF10。更具體的，所述的兩岐雙岐桿菌是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號(hào)為CCTCC NoM203049的兩岐雙岐桿菌SHQ004。本發(fā)明還提供一種質(zhì)粒，它是來自本發(fā)明兩歧雙歧桿菌的一種DNA大小為10kb的多拷貝質(zhì)粒。所述的兩岐雙岐桿菌可應(yīng)用于乳制品和保健食品的生產(chǎn)。本發(fā)明的有益效果是提供了一株新的符合衛(wèi)生部規(guī)定的雙岐桿菌益生菌菌株，為保健食品生產(chǎn)擴(kuò)大了生產(chǎn)菌株的來源；同時(shí)還為構(gòu)建新的質(zhì)粒表達(dá)載體系統(tǒng)提供了可能。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1513984SQ03135638
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月21日
發(fā)明者馬永平, 宋方洲, 邱宗蔭 申請(qǐng)人:馬永平