專利名稱：心肌基因治療質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因治療質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種心肌基因治療的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
心肌基因治療是一種治療遺傳性和先天性心臟病的新型方法。將外源基因轉(zhuǎn)入心肌細胞內(nèi)，通過基因表達，從而達到糾正或增強心肌細胞功能的目的。
基因轉(zhuǎn)移作為基因治療的關(guān)鍵技術(shù)，在將基因有效地轉(zhuǎn)移到足夠多的靶細胞，并使細胞表達目的基因。
根據(jù)所用載體不同可將基因轉(zhuǎn)移法分為四類病毒載體法、非病毒性生物載體法、非生物性載體法和非載體法。質(zhì)粒DNA注射屬于非載體法，質(zhì)粒DNA直接肌肉注射，簡單易行，且注入的DNA不能整合入染色體中而游離于染色體之外，不會引起突變和腫瘤的發(fā)生，因此是一種較為安全的基因治療手段。目前進行的心肌基因治療主要包括心肌缺血區(qū)血管發(fā)生、逆轉(zhuǎn)心肌細胞肥厚和降低心肌細胞凋亡等方面。由于一般的真核表達質(zhì)粒沒有心肌細胞特異性啟動子，不能控制在心肌細胞中特異地表達目的基因，因而大大降低了基因治療的特異性和有效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了解決心肌基因治療的靶向性問題，提供一種基因治療的靶向性和有效性均好的心肌基因治療的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供這種質(zhì)粒載體在心肌基因治療載體中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過下列方法得以實現(xiàn)采用美國Clontech公司pEGFP-N3真核表達載體或與其相近似的載體的基礎(chǔ)上改建?？梢詮腉enBack數(shù)據(jù)庫(http//ncbi.nlm.nih.gov)獲取其信息，登錄號U57609；也可從http//www.clontech.com上獲得其結(jié)構(gòu)和序列信息。
本發(fā)明的質(zhì)粒的構(gòu)建采用了人心肌肌球蛋白輕鏈(MLC-2V)啟動子，取代原質(zhì)粒pEGFP-N3的CMV啟動子，并將單純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22的編碼序列插入多克隆位點5’端，使之與外源基因融合表達。
本發(fā)明的質(zhì)粒的堿基序列在人心臟肌球蛋白輕鏈2啟動子區(qū)與多克隆位點間(即1～1591位堿基)不能變動，質(zhì)粒部分的堿基序列可以在1％范圍內(nèi)變異，即99％以上相同，而不影響本發(fā)明的效果。
構(gòu)建的質(zhì)粒的堿基序列為SEQ ID NO1該載體具有以下三個特點1、包含綠色熒光蛋白(GFP)的編碼序列，可與目的基因融合表達，便于檢測目的基因的轉(zhuǎn)染效率和細胞內(nèi)定位。2、該載體的多克隆位點上游采用人心肌肌球蛋白輕鏈(MLC-2V)啟動子，MLC-2V啟動子是心肌細胞的特異性表達的啟動子，因此可使載體攜帶的目的基因特異性地在心肌細胞內(nèi)表達。3、在MLC-2V啟動子和多克隆位點間插入了單純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22基因，VP22可與目的基因融合表達。
VP22的獨特作用是，它能將與其融合表達的蛋白通過細胞間介質(zhì)在鄰近細胞間轉(zhuǎn)移。因此，VP22可將與其融合表達的目的蛋白從轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)移到鄰近未轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)，從而提高基因治療中目的基因?qū)Π屑毎霓D(zhuǎn)染率，增強基因治療的效果。
本發(fā)明的質(zhì)粒的構(gòu)建可以不采用上述商業(yè)質(zhì)粒，而采用直接改建其它真核表達質(zhì)粒的多克隆位點上游的增強子和啟動子序列及引入VP22編碼序列的方式獲得。
本發(fā)明采用的是非載體法，因此本發(fā)明的質(zhì)?？梢灾瞥勺⑸鋭?br> 本發(fā)明的質(zhì)?？捎糜诨蛑委熜呐K疾病。并可與其它心血管疾病藥物聯(lián)合應(yīng)用。包括制成復(fù)方制劑。


圖1為本發(fā)明的pEGFP-MLC-VP22質(zhì)粒的構(gòu)建。其構(gòu)件為pEGFP-MLC-VP22載體構(gòu)件(5703bp)1、人心臟肌球蛋白輕鏈2啟動子區(qū)1-6672、VP22 ORF687-15903、多克隆位點1592-16464、綠色熒光蛋白ORF1656-23755、SV40早期mRNA多聚腺苷酸化信號2529-2534和2558-2563；mRNA 3′終止點2567和2579
6、f1單鏈DNA起始點2626-30817、SV40復(fù)制起始點3422-35578、卡那霉素抗性基因3606-44009、pUC質(zhì)粒復(fù)制起始點4985-5628具體實施方式
實施例1 pEGFP-MLC-VP22質(zhì)粒的構(gòu)建以PCR擴增連接法制備CMV增強子—MLC-2V連接片段，以定向克隆法將該片段替換原pEGFP-N3載體的CMV增加子和啟動子，制成pEGFP-MLC載體；將5’、3’端分別引入Bgl II和HindIII識別序列的VP22基因以定向克隆法插入pEGFP-MLC載體MLC-2V啟動子下游單一的Bgl II和HindIII位點間，從而構(gòu)建成pEGFP-MLC-VP22載體。
具體作法如下根據(jù)已知的人MLC-2V啟動子序列，設(shè)計合成PCR引物上游引物，5′-AATGGGAGTTTGTTTTGGACCCAGAGCACAGAG-3′，下游引物，5′-TAATAGCTAGCGGCCGGCCCCTGCTGT-3′(Nhe I)，以人基因組DNA為模板，擴增獲得MLC-2V片段(250 bp)。序列SEQ ID NO2如下GACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCACGTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCCTCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGCGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCAGGGGCCGGCC根據(jù)pEGFP-N3載體的CMV增強子序列(CMV enhancer)，設(shè)計合成PCR引物上游引物，5′-GCCCATTAATCGCGTTACATAACTTAC-3′(Ase I)，下游引物，5′-CTCTGTGCTCTGGGTCCAAAACAAACTCCCATT-3′，以pEGFP-N3載體為模板，擴增獲得CMV增強子片段(406 bp)。序列SEQ ID NO3如下GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG由于CMV enhancer的下游引物和MLC-2V的上游引物是完全互補序列，因此，用CMV enhancer的上游引物和MLC-2V的下游引物，以PCR擴增連接法制備CMV enhancer MLC-2V連接片段，并使其5′，3′端分別引入Ase I和Nhe I識別序列。根據(jù)pEGFP-N3多克隆位點上游CMV增強子和啟動子兩側(cè)單一的Ase I和Nhe I位點。用定向克隆法將CMV增強子—MLC-2V片段插入pEGFP-N3載體，替換原有的CMV增強子和啟動子，從而構(gòu)建成pEGFP-mlc。
根據(jù)已知的單純皰疹病毒VP22基因序列，設(shè)計合成一對PCR引物上游引物，5′-ATTAGATCTATGACCTCTCGCCGCTC-3′(Bgl II)，下游引物，5′-TATAAGCTTGCTCGACGGGCCGTCTG-3′(Hind III)，以單純皰疹病毒基因組DNA為模板，擴增獲得VP22基因(903 bp)。序列SEQ ID NO4如下ATGACCTCTCGCCGCTCCGTGAAGTCGGGTCCGCGGGAGGTTCCGCGCGATGAGTACGAGGATCTGTACTACACCCCGTCTTCAGGTATGGCGAGTCCCGATAGTCCGCCTGACACCTCCCGCCGTGGCGCCCTACAGACACGCTCGCGCCAGAGGGGCGAGGTCCGTTTCGTCCAGTACGACGAGTCGGATTATGCCCTCTACGGGGGCTCGTCTTCCGAAGACGACGAACACCCGGAGGTCCCCCGGACGCGGCGTCCCGTTTCCGGGGCGGTTTTGTCCGGCCCGGGGCCTGCGCGGGCGCCTCCGCCACCCGCTGGGTCCGGAGGGGCCGGACGCACACCCACCACCGCCCCCCGGGCCCCCCGAACCCAGCGGGTGGCGTCTAAGGCCCCCGCGGCCCCGGCGGCGGAGACCACCCGCGGCAGGAAATCGGCCCAGCCAGAATCCGCCGCACTCCCAGACGCCCCCGCGTCGACGGCGCCAACCCGATCCAAGACACCCGCGCAGGGGCTGGCCAGAAAGCTGCACTTTAGCACCGCCCCCCCAAACCCCGACGCGCCATGGACCCCCCGGGTGGCCGGCTTTAACAAGCGCGTCTTCTGCGCCGCGGTCGGGCGCCTGGCGGCCATGCATGCCC
GGATGGCGGCGGTCCAGCTCTGGGACATGTCGCGTCCGCGCACAGACGAAGACCTCAACGAACTCCTTGGCATCACCACCATCCGCGTGACGGTCTGCGAGGGCAAAAACCTGCTTCAGCGCGCCAACGAGTTGGTGAATCCAGACGTGGTGCAGGACGTCGACGCGGCCACGGCGACTCGAGGGCGTTCTGCGGCGTCGCGCCCCACCGAGCGACCTCGAGCCCCAGCCCGCTCCGCTTCTCGCCCCAGACGGCCCGTCGAG將5′，3′端分別引入Bgl II和Hind III識別序列的VP22基因定向插入pEGFP-MLC載體MLC-2V啟動子下游單一的Bgl II和Hind III位點間，從而構(gòu)建成pEGFP-MLC-VP22。DNA測序結(jié)果表明，MLC-2V，VP22已整合到質(zhì)粒pEGFP-MLC-VP22中。
技術(shù)路線如下 實施例2 質(zhì)粒擴增、提取與純化以原生生物大腸桿菌為宿主細胞，用常規(guī)分子生物學(xué)方法擴增pEGFP-MLC-VP22，并提取、純化。具體操作見文獻《分子克隆實驗指南》([美]J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，第二版)。
實施例3 細胞學(xué)實驗用脂質(zhì)體法將同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP-MLC-VP22分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人Hela(人子宮癌細胞株)、Ea.hy926(人胚臍靜脈內(nèi)皮細胞)、IMA(人腸系膜下動脈中層平滑肌細胞株)和Hep2(人肝癌細胞株)，轉(zhuǎn)染24hr后，觀察各組細胞中的GFP表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pEGFP-N3在以上細胞中都可表達GFP，而pEGFP-MLC和pEGFP-MLC-VP22均不表達GFP。
用脂質(zhì)體法將同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP-MLC-VP22分別轉(zhuǎn)染分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞，轉(zhuǎn)染24hr后，觀察各組細胞中GFP的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pEGFP-N3不表達GFP，而pEGFP-MLC和pEGFP-MLC-VP22均有GFP表達；以100個細胞被轉(zhuǎn)染的數(shù)量進行比較，轉(zhuǎn)染pEGFP-MLC-VP22組表達GFP的細胞數(shù)量(19.83±3.97)顯著多于轉(zhuǎn)染pEGFP-MLC組(12.17±4.02)(p＜0.05)。
實驗表明，本發(fā)明的pEGFP-MLC-VP22質(zhì)粒只能特異地在心肌細胞中表達，而且編碼的VP22可顯著提高細胞的轉(zhuǎn)染率。
實施例4 整體動物實驗用脂質(zhì)體法將同量的pEGFP-N3、pEGFP-MLC和pEGFP-MLC-VP22分別注射新西蘭兔心臟壁，48hr后，取注射區(qū)心肌標本做組織切片觀察GFP表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射pEGFP-N3的心肌組織中無GFP表達，注射pEGFP-MLC-VP22的心肌組織中GFP表達量顯著多于注射pEGFP-MLC的心肌組織。
實驗表明，本發(fā)明的pEGFP-MLC-VP22質(zhì)粒只能特異地在心肌組織中表達，而且編碼的VP22可顯著提高細胞的轉(zhuǎn)染率。
實施例3的細胞學(xué)實驗結(jié)果與實驗例4的整體動物實驗結(jié)果一致。本發(fā)明的上述實施例是用來說明本發(fā)明的可實施的效果，而絕非對本發(fā)明的任何限制。
權(quán)利要求
1.一種心肌基因治療質(zhì)粒，其特征在于在真核表達載體上有心肌細胞特異的啟動子CMV-MLC-2V及單純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心肌基因治療質(zhì)粒，其特征在于其堿基序列與SEQ ID NO1在人心臟肌球蛋白輕鏈2啟動子區(qū)與多克隆位點間即1～1591位堿基不能變動，其余部分的堿基序列99％以上相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的心肌基因治療質(zhì)粒，其特征在于其堿基序列為SEQ ID NO1。
4.權(quán)利要求1所述的心肌基因治療質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于以PCR擴增連接法制備CMV-MLC-2V片段，以定向克隆法將該片段替換原pEGFP-N3載體的CMV增加子和啟動子，制成pEGFP-MLC載體；將5’、3’端分別引入Bgl II和HindIII識別序列的VP22基因以定向克隆法插入pEGFP-MLC載體MLC-2V啟動子下游單一的BglII和HindIII位點間，從而構(gòu)建成pEGFP-MLC-VP22載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的心肌基因治療質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于制成注射劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的心肌基因治療質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于與其它心血管疾病藥物制成復(fù)方制劑。
7.權(quán)利要求1所述的心肌基因治療質(zhì)粒在制備心臟疾病基因治療載體中的應(yīng)用。
全文摘要
一種心肌基因治療質(zhì)粒，其特征在于在真核表達載體上有心肌細胞特異的啟動子(CMV－MLC－2V)及具有細胞穿梭功能的單純皰疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP22基因。本發(fā)明的質(zhì)粒能特異地在心肌細胞內(nèi)表達，可與目的基因融合表達，并能方便地檢測目的基因的轉(zhuǎn)染效率和細胞內(nèi)定位。
文檔編號A61P9/00GK1519032SQ0314036
公開日2004年8月11日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者余細勇, 單志新 申請人:廣東省人民醫(yī)院