專利名稱：：用于基因治療的高溫誘導(dǎo)表達(dá)載體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，尤其涉及提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法和組合物。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)人們期望基因治療可被廣泛應(yīng)用于治療一系列癌癥和大量的其它疾病。病毒載體是目前使用的一種轉(zhuǎn)基因載體。人們已經(jīng)構(gòu)建了許多病毒表達(dá)系統(tǒng)并對(duì)它們把外源基因轉(zhuǎn)入體細(xì)胞的能力進(jìn)行了評(píng)估。特別的，對(duì)于基于反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的載體系統(tǒng)，人們已經(jīng)進(jìn)行了十年以上的深入研究。最近，腺相關(guān)病毒(AAV)已經(jīng)向人們展示了代替目前更常用的反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體的可能性。包括陽(yáng)離子脂和脂質(zhì)體在內(nèi)的脂載體也可以用來轉(zhuǎn)化含有治療基因的質(zhì)粒DNA?；蛑委熂膊『筒∽兊倪^程包括基因轉(zhuǎn)入和新遺傳信息穩(wěn)定的或暫時(shí)的插入細(xì)胞。通過把以想要得到的功能編碼的基因的正常等位基因重新轉(zhuǎn)入體內(nèi)來校正基因的遺傳缺陷的試驗(yàn)表明，基因治療這種方法在臨床上是可行的(Rosenberg等，NewEng.J.Med_323:570(1990))。實(shí)際上，目前進(jìn)行的覆蓋范圍很廣的關(guān)于遺傳疾病的前期臨床和臨床研究為解決基因轉(zhuǎn)化效率、基因表達(dá)調(diào)控、使用病毒載體的潛在危險(xiǎn)等基因治療的相關(guān)難題奠定了基礎(chǔ)。大部分用病毒為載體的基因治療試驗(yàn)是先在體外作轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞試驗(yàn)，然后再進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。病毒載體也可以直接進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，但是反復(fù)使用會(huì)誘導(dǎo)出中性抗體。潛在臨床基因治療面臨的一個(gè)主要問題是如何使外源基因在人體的特定細(xì)胞組織中的大量臨床表達(dá)?；蛘{(diào)劑元素為解決這個(gè)問題提供了一個(gè)可能的方法?；蛘{(diào)劑元素如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，抑制細(xì)胞特定性活性，它們能被一些特定因子通過相應(yīng)元素激活。應(yīng)用調(diào)劑元素如啟動(dòng)子來啟動(dòng)基因表達(dá)，使外源基因在載體構(gòu)建體中的控制性和選擇性表達(dá)變得容易起來，例如可以通過熱激使熱激啟動(dòng)子表達(dá)外源基因。美國(guó)專利5,614,381;5,646,010，以及PCT公開專利申請(qǐng)WO89/00603是關(guān)于使用高于42℃的熱激來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這個(gè)溫度在人類基因治療中是不可行的，因?yàn)槌掷m(xù)這個(gè)溫度一段時(shí)間而不對(duì)人體造成傷害是不可能的。基因治療可以和其它一些包括細(xì)胞毒性藥物和放射性治療等傳統(tǒng)的癌癥治療方法聯(lián)合使用。有研究表明(Harisiadis等，Cancer,41:2131-2142(1978))，高溫能增強(qiáng)射線的細(xì)胞殺傷作用，特別是在動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，這改進(jìn)了隨機(jī)臨床試驗(yàn)中的結(jié)果。然而，高溫治療面臨的主要問題是它不能有效的熱激大型的和深入體內(nèi)的腫瘤。因此，開發(fā)能在42℃或更低溫度下使用的載體，通過在身體部位有選擇的誘導(dǎo)治療基因的表達(dá)，對(duì)病人進(jìn)行系統(tǒng)的或定位的治療，將是很有用的。本發(fā)明概述本發(fā)明提供了如何控制多肽在細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)的方法。它還特別提供了控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中多聚核甘酸的誘導(dǎo)表達(dá)的方法中的熱激啟動(dòng)子的使用。本發(fā)明通過提供可以在42℃或更低溫度使用的熱激控制載體，克服了前面相關(guān)技術(shù)中提到的缺陷。這些方法通過治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)來治療病人。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種控制轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)方法。該方法首先提供一個(gè)表達(dá)載體，該載體包括兩部分(ⅰ)與一個(gè)編碼反向激活因子相連的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，和(ⅱ)與所選多聚核甘酸(治療基因)連接的第二啟動(dòng)子。第二啟動(dòng)子由同一個(gè)構(gòu)建體表達(dá)的反向激活因子激活。該方法還包括了把表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)入細(xì)胞的步驟。最后，使細(xì)胞處于誘導(dǎo)啟動(dòng)子被激活的狀態(tài)并開始表達(dá)所選蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，先誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是一個(gè)熱激啟動(dòng)子，它的激活條件是高溫。該高溫的范圍是從基本溫度到大約42℃。在使用過程中，基本溫度定義為細(xì)胞處于自然狀態(tài)的溫度，例如，哺乳動(dòng)物的表皮細(xì)胞的基本溫度是33℃，然而肺可能是39℃。在特殊情況下，高溫誘導(dǎo)載體的使用包括把細(xì)胞的溫度從基本溫度升高，最常用的是從37℃升高到大約42℃。高溫狀態(tài)可以從37℃到大約41℃，或者從39℃到大約40℃。熱激啟動(dòng)子是從一組熱激蛋白啟動(dòng)子HSP70,HSP90,HSP27,HSP27,HSP73,HSP25,HSP28中衍生出來的。該通用啟動(dòng)子也可以在表達(dá)構(gòu)建體中用作誘導(dǎo)啟動(dòng)子。一個(gè)從熱激啟動(dòng)子HSP70演化來的最小啟動(dòng)子和包括大約400bp的HSP70B啟動(dòng)子可被選用于本發(fā)明中。在根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括一個(gè)低氧反應(yīng)元素(HRE)。該反應(yīng)元素至少包括一個(gè)低氧誘導(dǎo)因子-I(HIF-Ⅰ)的結(jié)合位點(diǎn)。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，第二個(gè)啟動(dòng)子可以從一組包含人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)啟動(dòng)子和人類免疫缺陷病毒-2(HIV-2)啟動(dòng)子中篩選。在根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施例中，反式激活因子是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子(TAT)。特定多聚核甘酸可以編碼一個(gè)蛋白或一段多肽。例如，選擇的多聚核甘酸可以編碼以下任何一個(gè)蛋白，鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白，p53,p16，神經(jīng)分化因子，白細(xì)胞介素-1(IL1)，白細(xì)胞介素-2(IL2)，白細(xì)胞介素-4(IL4)，白細(xì)胞介素-7(IL7)，白細(xì)胞介素-12(IL12)，白細(xì)胞介素-15(IL15)，F(xiàn)LT-3配體，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(CM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，γ-干擾素(IFNγ)，α-干擾素(IFNα)，腫瘤壞死因子(TNF)，單純苞疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，I-CAM1，人白細(xì)胞抗原-B7(HLA-B7)，或金屬蛋白酶組織抑制子(TIMP-3)。在這種情形下，特定核甘酸位于由第二個(gè)啟動(dòng)子控制的敏感起始區(qū)內(nèi)。另一種情形下，所選核甘酸的表達(dá)只有轉(zhuǎn)錄而沒有翻譯，它產(chǎn)生核酶。在這種情形下，所選核甘酸也是位于由第二個(gè)啟動(dòng)子控制的敏感起始區(qū)內(nèi)。在又一種情形下，所選核甘酸的表達(dá)只有轉(zhuǎn)錄而沒有翻譯，它產(chǎn)生作為反義核算發(fā)揮功能的RNA分子。在這種情形下，所選核甘酸可以是靶基因或者功能片段，它位于與所述第二個(gè)啟動(dòng)子相關(guān)的反義起始區(qū)中的表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)。表達(dá)構(gòu)建體還可以包含一個(gè)對(duì)篩選標(biāo)志進(jìn)行編碼的基因，如潮莓素抗性，新莓素抗性，嘌呤莓素抗性，赤莓素，gpt,DHFR,綠色熒光蛋白或組氨醇。表達(dá)構(gòu)建體也可以包含(ⅰ)與第二啟動(dòng)子連接的第二特定多聚核甘酸，以及(ⅱ)位于第一和第二啟動(dòng)子之間的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)。靶細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞，位于腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞，或者哺乳動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞。把表達(dá)構(gòu)建體入細(xì)胞可以在體內(nèi)或體外完成。在一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建體的導(dǎo)入是由轉(zhuǎn)運(yùn)工具控制的，該轉(zhuǎn)運(yùn)工具是從脂質(zhì)體，反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，豆?fàn)畈《?，單純苞疹病毒，或痘病毒中篩選出來的。在根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了使轉(zhuǎn)入基因表達(dá)達(dá)到治療要求的方法。該方法首先提供了一個(gè)第一表達(dá)構(gòu)建體，它包括一個(gè)和反式轉(zhuǎn)錄激活因子相連的誘導(dǎo)啟動(dòng)子，該方法還提供了一個(gè)第二表達(dá)構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含和第二特定多肽相連的第二啟動(dòng)子，該第二啟動(dòng)子由第一表達(dá)構(gòu)建體中編碼的反式激活因子激活。第一和第二表達(dá)構(gòu)建體同時(shí)轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞中，同時(shí)使靶細(xì)胞處于誘導(dǎo)啟動(dòng)子激活的狀態(tài)，這樣特定的核甘酸就開始誘導(dǎo)表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第一和第二表達(dá)構(gòu)建體位于同一個(gè)載體上。而且誘導(dǎo)啟動(dòng)子通常是一個(gè)熱激啟動(dòng)子，它的激活條件是低于42℃而高于正常體溫的誘導(dǎo)溫度。把一個(gè)或者兩個(gè)表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)入細(xì)胞可以在體內(nèi)或體外完成。所選核甘酸的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)靶體內(nèi)的病原體有毒害作用，這些病原體包括病毒、細(xì)菌、真菌、或寄生蟲。在一些情況下，表達(dá)產(chǎn)物可以抑制靶細(xì)胞的生長(zhǎng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)產(chǎn)物代替了靶體內(nèi)的缺陷蛋白。表達(dá)產(chǎn)物有時(shí)還可以刺激神經(jīng)的再生。在根據(jù)本發(fā)明其它的實(shí)施例中，提供了治療包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物癌癥的方法，它的步驟包括(a)提供一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括(ⅰ)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，通常是熱激啟動(dòng)子，它和編碼反式激活因子的基因相連，(ⅱ)與所選核甘酸連接的第二啟動(dòng)子，它由反式激活因子激活；(b)把該表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞；以及(c)使腫瘤細(xì)胞處于誘導(dǎo)啟動(dòng)子激活的狀態(tài)，使所選多核苷酸以足夠高的數(shù)量表達(dá)以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果誘導(dǎo)啟動(dòng)子是一個(gè)熱激啟動(dòng)子，那么它的誘導(dǎo)條件是低于42℃而高于正常體溫的溫度。該治療方法可以和一些已知的治療癌癥的方法聯(lián)合使用，這些方法包括外部射線療法，近距放射治療，化學(xué)療法和手術(shù)?？梢灾委煹陌┌Y包括腦，肺，肝，脾，腎，淋巴，小腸，胰臟，血細(xì)胞，胃，乳房，子宮，前列腺，睪丸，口腔，會(huì)陰，皮膚，頭和頸，食管，骨髓，和血癌等。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施例中，特定的基因是鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白。在使細(xì)胞處于誘導(dǎo)啟動(dòng)子激活的狀態(tài)后，用抗輻射藥物WR-33278或WR-1065處理腫瘤細(xì)胞，最后，用射線來殺死腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明也提供了激活哺乳動(dòng)物，例如人的免疫反應(yīng)的方法。激活的免疫反應(yīng)包括體液免疫和細(xì)胞免疫。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包含(a)提供一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含(ⅰ)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，通常是熱激啟動(dòng)子，它與一個(gè)編碼反式激活因子的基因相連；以及(ⅱ)與特定核甘酸連接的第二啟動(dòng)子，它由反式激活因子激活；(b)把表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及(c)調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)激活誘導(dǎo)啟動(dòng)子，使特定基因高效表達(dá)來激活哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。如果該誘導(dǎo)啟動(dòng)子是一個(gè)熱激啟動(dòng)子，那么它的激活條件是一個(gè)高于基礎(chǔ)溫度而低于42℃的溫度。在另一個(gè)實(shí)施例中，激活的免疫反應(yīng)是殺死那些含有表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這種方法也涉及一些成熟的治療癌癥的方法，這些方法包括化學(xué)療法，外部射線療法，近距放射治療，和手術(shù)。在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括(a)一個(gè)對(duì)反式激活因子編碼的基因；(b)一個(gè)與該基因連接的誘導(dǎo)啟動(dòng)子；(c)一個(gè)所選多聚核甘酸；以及(d)與該核甘酸連接的第二啟動(dòng)子。構(gòu)建體中的第二啟動(dòng)子由反式激活因子激活。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，誘導(dǎo)啟動(dòng)子是一個(gè)熱激啟動(dòng)子，所選多聚核甘酸可以在高溫狀態(tài)下被誘導(dǎo)表達(dá)，該高溫介于37℃和42℃之間。在一個(gè)可選實(shí)施例中，誘導(dǎo)啟動(dòng)子還包括低氧反應(yīng)元素。該表達(dá)構(gòu)建體也可以包括一個(gè)第二所選多聚核甘酸，該第二所選多聚核甘酸也與第二啟動(dòng)子連接，并被一個(gè)IRES將其與第一所選多聚核甘酸隔開。本發(fā)明提供了包含表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞。所提供的表達(dá)構(gòu)建體可以用在改變哺乳動(dòng)物的遺傳物質(zhì)的方法中。本發(fā)明的其它目的、特性和優(yōu)點(diǎn)將在下面的章節(jié)詳細(xì)闡述。應(yīng)該理解的是，關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施例的描述僅僅是一種闡述，在掌握本發(fā)明的精髓和范圍的基礎(chǔ)上，對(duì)本發(fā)明的適當(dāng)?shù)淖兓托薷娜匀粚儆诒景l(fā)明的范疇。附圖的簡(jiǎn)要說明以下圖解是本說明的一部分，它進(jìn)一步闡述本發(fā)明的一些特性。人們可以結(jié)合圖解和以下的對(duì)實(shí)施例的詳細(xì)解釋來更好地了解本發(fā)明。圖1示出了關(guān)于定量分析熱激啟動(dòng)子活性的基本載體。該質(zhì)粒包含一個(gè)從HSP70B啟動(dòng)子演化來的最小啟動(dòng)子。把一個(gè)報(bào)告基因，如增強(qiáng)熒光蛋白(EGFP)，β-gal，或IL-2插入到多克隆位點(diǎn)中，以使它的表達(dá)受基本HSP70B啟動(dòng)子的控制。該質(zhì)粒也包含新莓素抗性和安芐青莓素抗性基因，它們對(duì)于該質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌培養(yǎng)體系中的篩選是必要的。S8質(zhì)粒包含與插入多克隆位點(diǎn)的EGFP一起顯示的質(zhì)粒。圖2顯示了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)入了S8質(zhì)粒的DU-145細(xì)胞的熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)柱形圖。熒光從左到右增強(qiáng)，上面的柱形圖是轉(zhuǎn)入了S8的DU-145細(xì)胞，但沒有經(jīng)過熱激。下面的柱形圖是在42℃下熱激一個(gè)小時(shí)的轉(zhuǎn)入成功的DU-145細(xì)胞。圖3示出了三個(gè)不同的S8轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞系的FACS柱形圖。轉(zhuǎn)入了S8構(gòu)建體的MCF7細(xì)胞根據(jù)FACS分類。原始細(xì)胞系來自一個(gè)多克隆選擇的細(xì)胞系。激活的細(xì)胞系(即表達(dá)EGFP的細(xì)胞)和非激活細(xì)胞系分開。在分離一次后，培養(yǎng)陽(yáng)性菌株并對(duì)它再次篩選以得到更純的陽(yáng)性細(xì)胞系。在這個(gè)例子中，多克隆陽(yáng)性細(xì)胞系MCF7-S8-PS2是在MCF7-S8-P基礎(chǔ)上兩次篩選的產(chǎn)物。圖4顯示的是通過FACS分析的不同細(xì)胞系中EGFP的表達(dá)情況。細(xì)胞系首先轉(zhuǎn)入S8質(zhì)粒，克隆細(xì)胞系或者培養(yǎng)多克隆細(xì)胞系。在一些情形下，通過FACS分析EGFP的表達(dá)來分選。對(duì)總的熒光平均值定量并作圖。圖5顯示了兩次熱激篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)入的DU-145細(xì)胞系(DU-S8-PS2)的EGFP的表達(dá)情況。DU-S8-PS2細(xì)胞系在40℃或42℃熱激并恢復(fù)幾次，然后由FACS分析細(xì)胞。圖6顯示了經(jīng)過熱激后恢復(fù)16小時(shí)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系DU-145的EGFP表達(dá)情況。其中一個(gè)細(xì)胞系(DU-S8-PS2)轉(zhuǎn)入了S8質(zhì)粒，另一個(gè)細(xì)胞系(DU-V9-PS2)轉(zhuǎn)入了V9質(zhì)粒，V9質(zhì)粒和S8質(zhì)粒的區(qū)別在于V9質(zhì)粒的是和CMV啟動(dòng)子相連而不是和HSP70B(見圖7)相連。細(xì)胞系用不同的溫度熱激并使它恢復(fù)16小時(shí)。沒有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的DU-145細(xì)胞系作為對(duì)照。圖7顯示了含有與增強(qiáng)熒光蛋白(EGFP)相連接的MCV啟動(dòng)子的V9質(zhì)粒的分析柱形圖。圖8顯示的是包含放大熱激效應(yīng)的第二啟動(dòng)子的基本載體。該質(zhì)粒包含一個(gè)受HSP70B調(diào)控的多克隆位點(diǎn)(MCS)，而且它還包含一個(gè)由第二啟動(dòng)子控制的治療基因。該質(zhì)粒還包含有新莓素抗性，氨芐青霉素抗性基因和在細(xì)菌中生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)元素。在pC8質(zhì)粒中，它的第二啟動(dòng)子是HIV-1的長(zhǎng)末端重復(fù)片段(LTR)，治療基因是IL2。在質(zhì)粒pf12中，MCS中插入了tat基因，第二啟動(dòng)子是HIV-Ⅰ的LTR，治療基因是IL2。另一個(gè)啟動(dòng)子p007除了第二啟動(dòng)子是用HIV-2的LTR外，其它部分與pf12是一致的。圖9顯示的是一個(gè)擴(kuò)增構(gòu)建體，它的治療基因是IL2，由HIV-1或HIV-Ⅱ啟動(dòng)子調(diào)控。擴(kuò)增部分由調(diào)控TAT表達(dá)的CMV或HSP70啟動(dòng)子控制。該質(zhì)粒也含有新霉素抗性基因和在細(xì)菌中生長(zhǎng)所必須的元素。這樣的構(gòu)建體被用于例2和3的擴(kuò)增分析。圖9A包含CMV-TAT-HIV-1-IL2表達(dá)序列的質(zhì)粒X14。圖9B包含CMV-TAT-HIV-2-IL2表達(dá)序列的質(zhì)粒Y15。圖9C包含HSP-TAT-HIV-1-IL2表達(dá)序列的質(zhì)粒pf12。圖9D包含HSP-TAT-HIV-2-IL2表達(dá)序列的質(zhì)粒p007。圖10示出了StressGenBiotechnologyCorp公司的p173OR質(zhì)粒中包含BamH1-HindⅢ片段的DNA序列。這個(gè)片段包括大約400bp最小、HSP70B啟動(dòng)子片段，該片段常常用于特殊構(gòu)建體中，如下面將要提到的例1和例3。優(yōu)選實(shí)施例的敘述1．本發(fā)明介紹基因治療面臨兩個(gè)主要的技術(shù)難題如何調(diào)控和增強(qiáng)治療基因在體內(nèi)的表達(dá)。本發(fā)明通過把高溫處理和誘導(dǎo)性表達(dá)構(gòu)建體整合起來解決了這兩個(gè)難題。發(fā)明者已經(jīng)證實(shí)了能夠提高特定的誘導(dǎo)性表達(dá)基因的表達(dá)效率。高水平地表達(dá)治療基因和有效控制表達(dá)水平是基因治療發(fā)展中的兩個(gè)重要課題。但是發(fā)明者已經(jīng)發(fā)明了一組新的高效表達(dá)載體來克服這兩個(gè)難題，發(fā)明者使用擴(kuò)增策略來控制目的基因的表達(dá)。這些放大子由人的HSP70B啟動(dòng)子組成，該啟動(dòng)子啟動(dòng)控制其它啟動(dòng)子的反式轉(zhuǎn)錄激活因子的表達(dá)，反過來這些反式轉(zhuǎn)錄因子又啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。這些額外的啟動(dòng)子和與它們相連的報(bào)告基因包含在具有HSP70B啟動(dòng)子元素和對(duì)反式激活蛋白編碼的同一個(gè)載體中。在使用人的IL-2作為報(bào)告基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究中，發(fā)明者已經(jīng)表明，和由組成型CMV啟動(dòng)子或HSP70B單獨(dú)啟動(dòng)的報(bào)告基因表達(dá)率相比(見下面特定例子，例3)，擴(kuò)增構(gòu)建體在所有試驗(yàn)的溫度中，報(bào)告基因的表達(dá)都有大幅度提高。同時(shí)含有HSP70B啟動(dòng)子，人類免疫缺陷病毒(HIV)上游，tat基因和HIV1或HIV2長(zhǎng)末端重復(fù)序列，白介素-2基因上游的構(gòu)建體，展示了在高溫下啟動(dòng)子的活性比37℃下有大幅度提高。哺乳動(dòng)物細(xì)胞共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明，啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)建體HSP,HSP/HIVⅠ和HSP/HIV2的表達(dá)效率分別是CMV表達(dá)啟動(dòng)子的0.4,6.9,83.3倍。這些數(shù)據(jù)表明雖然最小熱激啟動(dòng)子的表達(dá)效率比CMV啟動(dòng)子要低，但它可以和第二個(gè)啟動(dòng)子聯(lián)合來顯著的放大表達(dá)效率，同時(shí)還保存一定程度的對(duì)溫度的依賴。早期的研究都是用熱激啟動(dòng)子來啟動(dòng)反式激活因子表達(dá)，從而激活其它啟動(dòng)子(Schweinfest等，Gene,71(1):207-210,1988;EPO0118393;WO89/00603，美國(guó)專利5,614,381，美國(guó)專利5,646,010;EP0299127)。本發(fā)明提出了不同于早期的方法，例如1)不同的熱激啟動(dòng)子(Schweinfest等，使用Drosophila啟動(dòng)子)；2)不同的轉(zhuǎn)運(yùn)方式(本發(fā)明已經(jīng)把兩個(gè)啟動(dòng)子整合到一個(gè)簡(jiǎn)單的構(gòu)建體中-其它的方法還在使用共轉(zhuǎn)染)；3)不同的誘導(dǎo)溫度(早期的研究工作使用的溫度高于42℃，而本發(fā)明可以在42℃和更低的溫度下操作)；4)適用于基因治療而不是工業(yè)生產(chǎn)。還有，本發(fā)明能夠使用HIV-1或HIV-2啟動(dòng)子并且顯示出兩者的表達(dá)水平有明顯差異。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面是通過適用熱激誘導(dǎo)元素來控制轉(zhuǎn)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，熱激序列是用來啟動(dòng)反式激活因子基因的表達(dá)的，因此當(dāng)表達(dá)構(gòu)建體被給予高溫誘導(dǎo)時(shí)，反式因子開始表達(dá)。反式激活因子啟動(dòng)第二啟動(dòng)子，進(jìn)而啟動(dòng)治療基因的表達(dá)。在一個(gè)特殊的實(shí)施例中，還使用了從HSP70啟動(dòng)子演化來的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的一個(gè)特別有用的特性是它在正常的環(huán)境溫度下表達(dá)水平很低并且是誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了使治療基因的表達(dá)達(dá)到治療要求的水平的方法來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或激活免疫系統(tǒng)。下面將要詳細(xì)討論與本發(fā)明有關(guān)的組合物和方法。2．熱激反應(yīng)熱激或者刺激反應(yīng)廣泛存在于從植物到哺乳動(dòng)物的組織中，它不僅僅是熱激的結(jié)果，而且也是其它包括局部缺血，缺氧，葡萄糖缺乏，離子化葡萄糖和氨基酸類似物，乙醇，過渡系金屬(transitionseriesmetals)，藥物，激素，細(xì)菌和病毒感染等刺激的結(jié)果。還有證據(jù)表明熱激蛋白的過量表達(dá)與細(xì)胞增生和腫瘤細(xì)胞刺激有關(guān)。(Finch等，CellGrowthandDifferentiation3(5):269-278,1992)。熱激反應(yīng)的主要特征是合成一族序列高度保守但分子量不等的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)條件和定位是不同的。這些蛋白質(zhì)在種屬之間是高度保守，它們是依據(jù)其分子量來劃分的。當(dāng)環(huán)境變化或身體受到傷害時(shí)，蛋白基因轉(zhuǎn)錄的激活能在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，這么快的反應(yīng)速度歸因于大部分熱激蛋白的基因缺乏內(nèi)含子，缺乏內(nèi)含子使熱激蛋白能夠在高溫下繞過內(nèi)含子對(duì)基因的封閉。這樣可以使熱激蛋白高效率表達(dá)，同時(shí)經(jīng)常會(huì)使其它蛋白的表達(dá)率下降。應(yīng)激基因的激活是由熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)的構(gòu)相轉(zhuǎn)變來調(diào)節(jié)的，在受到刺激時(shí)，已經(jīng)存在的蛋白由非活性構(gòu)相轉(zhuǎn)變成活性構(gòu)相。這個(gè)DNA結(jié)合蛋白的分子量的種屬差異巨大(例如，人的是83kDa而酵母是150kDa)。熱激元素是HSP70的保守上游調(diào)控序列，HSF是和它結(jié)合起作用的。雖然熱激蛋白的主要功能是幫助蛋白折疊和防止蛋白凝聚，但是有證據(jù)表明它們?cè)诮M織對(duì)外界的刺激的保護(hù)性反應(yīng)和創(chuàng)傷恢復(fù)中起作用。和大部分真核生物的序列特定性轉(zhuǎn)錄因子相似，HSF通過和熱激基因上游以多拷貝存在的高度保守的反應(yīng)元素結(jié)合而起作用。熱激反應(yīng)元素由三個(gè)連續(xù)的反向重復(fù)5堿基序列組成，該堿基序列為nGAAn，但更通常的是AGAAn。HSF的調(diào)節(jié)作用主要是活性的轉(zhuǎn)變而不是合成和穩(wěn)定性的改變。3．高溫治療很多臨床研究表明高溫作為放射治療和化學(xué)治療的輔助方法對(duì)很多惡性疾病是有效的(Hahn,G.M.HyperthermiaandCancer，第二版，NewYork,Plenum,1982;Scott等，Int.J.Rad.Oc.Biol,Phys.10(11)2219-2123,1984;Lindhol等，Rec.ResinCancerRes.107:152-156.1988)。熱激應(yīng)用，適應(yīng)和禁忌的理論是在熱激應(yīng)用可以產(chǎn)生顯著生理作用的試驗(yàn)證據(jù)和對(duì)照臨床研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。Lehman提出了關(guān)于熱激治療在其它領(lǐng)域的應(yīng)用的論證(TherapeuticHeatandCold,RehabilitationMedicineLibrary,Williams&amp;Wilkins出版，1990，在此引入本文作為參考)。讀者特別注意第九章，在其中討論了熱激在內(nèi)科和外科治療中的應(yīng)用?！案邷亍蓖ǔＪ侵父哂谠囼?yàn)體所處環(huán)境溫度的溫度。這里使用的高溫溫度通常是介于37℃和42℃之間。在一些特別實(shí)施例中，該溫度可以從38℃到42℃，在另一些實(shí)施例中，是39℃至41℃，還有一些實(shí)施例中，這個(gè)溫度大約是40℃。在目前所能得到的技術(shù)幫助下，高溫作為輔助治療應(yīng)用，可以使溫度保持在與42℃相差0.5℃的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的治療處理可以在37.0℃,37.2℃,37.4℃,37.6℃,37.8℃,38.2℃,38.4℃,38.6℃,38.8℃,39.2℃,39.4℃,39.6℃,39.8℃,40.2℃,40.4℃,40.6℃,40.8℃,41.2℃,41.4℃,41.6℃,41.8℃,或42℃。在本發(fā)明之前，有效的高溫治療要求腫瘤中的溫度保持在43℃以上30到60分鐘，而正常組織的安全溫度是42℃以下，而僅僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)使溫度保持在42℃以上是很困難的，經(jīng)常很難做到。可以用一系列的技術(shù)來熱激哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞，這些技術(shù)包括超聲，電磁技術(shù)，電磁技術(shù)又包括傳導(dǎo)波(如微波)，抗性(如輻射)或誘導(dǎo)性(如輻射或電磁波)產(chǎn)生器(Hahn,G.M_HyperthermiaandCancer,第二版，NewYork,Plenum,1982;Lehman,L.B_PostgardMed_88(3):240-243,1990；在此引入本文作為參考)在一些簡(jiǎn)單的應(yīng)用中，組織溫度可以用循環(huán)的熱水或熱空氣來加熱。LeVeen的美國(guó)專利4,230,129(在此引入本文作為參考)，該文提到一種在閃爍記數(shù)器的幫助下加熱身體組織和檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部溫度變化的方法。該方法是使放射(RF)能量和身體耦合以避免脂肪組織過量吸收放射性熱量，通過一種治療器械作軌道運(yùn)動(dòng)使放射性能量不是集中于身體內(nèi)的某一區(qū)域而集中于腫瘤細(xì)胞。LeVeen的美國(guó)專利4,230,129(在此引入本文作為參考)，該文中提到一種方法是把帶有腫瘤細(xì)胞的人體部分置于一個(gè)放射性電磁區(qū)域來加熱腫瘤細(xì)胞，而不傷害和腫瘤細(xì)胞相連的正常組織。在本發(fā)明常用的實(shí)施例中，高溫處理是和基因治療載體聯(lián)合使用的，用高溫來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)入了腫瘤部位治療基因的表達(dá)。而且高溫/基因治療處理方法也可以和其它傳統(tǒng)的治療方法如下面要討論的化學(xué)療法和射線療法等聯(lián)合使用，以取得更好的效果。其它的高溫誘導(dǎo)治療方法見技術(shù)章節(jié)。關(guān)于高溫治療法的區(qū)域或系統(tǒng)應(yīng)用方法和工具見相關(guān)技術(shù)簡(jiǎn)介章節(jié)，同時(shí)也可以在下列美國(guó)專利文獻(xiàn)中找到相關(guān)的敘述美國(guó)專利5,284,144;4,230,129;4,186,729;4,346,716;4,848,362;4,815,479;4,632,128，在此均引入本文作為參考。4．工程表達(dá)構(gòu)建體在一些特殊的實(shí)施例中，本發(fā)明包括了對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行操作得到克隆有治療基因的表達(dá)構(gòu)建體的方法。這些方法的步驟包括使用含有編碼治療蛋白的外源DNA的載體和它表達(dá)的途徑，然后在輔助細(xì)胞中復(fù)制該載體以獲得病毒顆粒，然后再用重組的病毒去感染細(xì)胞。該外源基因一般是一個(gè)治療基因，如殺死癌細(xì)胞的基因，抗病毒感染的免疫調(diào)節(jié)基因或代替體內(nèi)缺陷的基因。在病毒載體中，治療基因是外源的，也就是說它不是來自構(gòu)成載體骨架的病毒基因組。最后，病毒可以作為活的疫苗并表達(dá)抗原以刺激特定抗體的表達(dá)。外源基因可以來自原核或真核生物，如細(xì)菌，病毒，酵母，寄生蟲，植物或者動(dòng)物，也可以來自不止一條途徑如多克隆基因構(gòu)建體或一個(gè)融合蛋白，外源DNA也可以包含一段與自身來源不同的調(diào)節(jié)序列。a)治療基因本發(fā)明中的所選多聚核甘酸可以作為治療基因發(fā)揮作用。任何來源廣泛的治療基因都適用于本發(fā)明中的載體和方法。本發(fā)明可以將治療基因用于特殊病變，醫(yī)療事故，或與本發(fā)明相關(guān)的疾病的治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，特定的多聚核甘酸是編碼鳥氨酸脫羧梅(ODC)抗酶蛋白，該酶是細(xì)胞內(nèi)多胺的一個(gè)重要反饋調(diào)節(jié)因子(Hayashi等，TrendsinBiochemicalSciences21(1):27-30,1996)。該蛋白的表達(dá)水平與細(xì)胞內(nèi)的多胺水平直接相關(guān)，它可以刺激該蛋白的表達(dá)?？姑傅鞍鬃饔糜邙B氨酸脫羧梅，它是多胺合成中的第一個(gè)酶，經(jīng)常也是限速酶來降解多胺。這個(gè)蛋白也抑制多胺的攝入。因此低水平的多胺導(dǎo)致低水平的抗酶蛋白表達(dá)，而低水平的抗酶蛋白又導(dǎo)致通過ODC合成和攝入的多胺最高水平的合成。相反，高水平的多胺導(dǎo)致高水平的抗酶蛋白表達(dá)，高水平的抗酶蛋白使多胺以最低水平合成。輻射防護(hù)劑WR-33278(N,N″-(dithiodi-2,1-ethanediyl)bis-1,3-propanediamine)含有二锍鍵的多氨類似物，細(xì)胞可以通過多氨轉(zhuǎn)運(yùn)子吸收它(Mitchell等，Carcinogenesis,16:3063-3068,1995)，該轉(zhuǎn)運(yùn)子被抗酶抑制。WR-33278動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻髦辽倌承┱＝M織可以比一些腫瘤吸收更多的WR-33278(Ito等，InternationalJournalofRadiationOncology,Biology,Physics28:899-903,1994)象WR-33278這樣的試劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床放射性治療，它能保護(hù)劑量限制的正常組織而同時(shí)不減小對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射治療效果。(SpencerandGoa,Drugs,50(6):1001-31,1995,在此引入本文作為參考)。關(guān)于WR-33278吸收的差異理論可以歸結(jié)為增生的腫瘤細(xì)胞比非增生正常細(xì)胞含有更多的多氨，因此腫瘤細(xì)胞要比正常組織中表達(dá)更高水平的抗酶。本發(fā)明把缺失了多氨依賴性調(diào)控必須的序列的抗酶cDNA置于人熱激啟動(dòng)子HSP70B的調(diào)控之下，本發(fā)明用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化由人前列腺癌細(xì)胞演化來的DU-145細(xì)胞系并且篩選出了有熱激誘導(dǎo)多氨吸收的克隆系(表明有熱誘導(dǎo)抗酶活性)。該基因治療方法(HSP70B啟動(dòng)子調(diào)控抗酶的表達(dá))將來可以用于前列腺癌患者的臨床試驗(yàn)，該方法可以與WR-33278和定位輻射聯(lián)合治療前列腺患者。當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗酶被定位高溫激活表達(dá)的時(shí)候，和癌細(xì)胞相鄰的正常的劑量限制細(xì)胞不會(huì)在高溫下表達(dá)抗酶蛋白從而吸收抗輻射劑WR-33278，同時(shí)腫瘤細(xì)胞由于在高溫下表達(dá)抗酶蛋白而不能吸收抗輻射劑。這種方法允許對(duì)前列腺部位進(jìn)行高劑量的輻射照射從而殺死前列腺腫瘤細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞保護(hù)藥物ethol(也叫amifostine,WR-2721，或S-2-(3-aminopropylamino)ethylphosphorothioic酸)其它代謝產(chǎn)物也可以和本文中介紹的表達(dá)構(gòu)建體聯(lián)合使用，例如，WR-1065(2-(3-aminopropylamino)乙硫醇)也可以用作輻射保護(hù)劑。還有其它很多的基因也可以用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化，例如，試驗(yàn)證明本發(fā)明中的載體可以用來轉(zhuǎn)入腫瘤抑制子，反義原?；蚝拖馠SV-TK基因之類的前藥激活子(Rosenfeld等，AnnalsofSurgery,225:609-618,1997;Esandi等,GeneTherapy,4:280-287,1997)等來治療癌癥。其它能夠利用本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)入的基因包括p53,p16,p21,p27,C-CAM,HLA-B7(Gleich等，ArchOtolaryngolHeadNeckSurg,124:1097-104,1998；Heo等，Hum.GeneTher.9:2031-8,1998；Nabel等，Proc.Nat.Acad.SciencesUSA,90:15388-15393,1996；Stopeck等，JournalofClinicalOncology,15:341-349,1997),IL2(O’Malley等，MolecularEndocrinology,11:667-673,1997;Otova等，F(xiàn)oliaBiologica,43:25-32,1997),IL4(Kling,NatureBiotechnology,15:316-317,1997),IL7(Toloza等，AnnalsofSurgicalOncology,4:70-70,1997);Sharma等，CancerGeneTherapy,3:303-313,1996),IL12(HiscoxandJiang,InVivo,11:125-137,1997;Chen等，JournalofImmunology,159:351-359,1997),GM-CSF(KreitmanandPastan,Blood,90:252-259,1997;Homick等，Blood,89:4437-4447,1997;Lanza等，Haematologica,82:239-245,1997),IFNγ(Noguchi等，MclinicalInfectiousDiseases,24:992-994,1997;Kanemaru等，EuropeanArchibesofOto-Rhino-Laryngology,254:158-162,1997;Tanaka等，JournalofGastroenterologyandHepatology,11:1155-1160,1996;Imai等，Liver,17:88-92,1997),I-CAMI和TNF(Corcione等，AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,815:364-366,1997)。(在此均引入本文作為參考。)p53近來被人們認(rèn)為是一個(gè)腫瘤抑制基因(Montenarh,Crit.Rev.Oncogen,3:233-256,1992)。在許多被化學(xué)致癌物質(zhì)，紫外線照射和SV40的惡性病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了有高水平的突變p53表達(dá)。P53基因在很多人腫瘤中是突變失活的，它也是人類癌癥中最容易突變的基因，它在超過50％的人類NSCLC和很多其它腫瘤中也是突變的。P16INK4屬于一個(gè)新的CDK-抑制蛋白族，該蛋白家族包括p16B,p21WAFⅠ,CIPⅠ,SDⅡ和p27KIP1。p16INK4基因位于染色體的9p21區(qū)域，在很多腫瘤細(xì)胞中該區(qū)域是被刪除的。P16TNK4基因的同源刪除和突變?cè)诤芏嗳四[瘤細(xì)胞系中是很普遍的，它表明該基因是一個(gè)腫瘤抑制因子。然而該推論隨著人們發(fā)現(xiàn)在原始的非培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞中該基因的改變幾率遠(yuǎn)比培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系中要低而改變。用含有野生型p16INK4基因的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染一些人癌細(xì)胞中可以減少轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆。(Okamoti等，Proc,Natl,Acad.Sci,USA,91:11045-11049,1994:Arap等，CancerRes_55:1351-1354,1995,在此均引入本文作為參考)。C-CAM在所有的上皮細(xì)胞中都是有效表達(dá)的，其分子量大約為105kD，最初是用抗血細(xì)胞凝聚的特定抗體從大鼠肝細(xì)胞質(zhì)膜上純化出來的。最近的研究表明在結(jié)構(gòu)上C-CAM是屬于免疫球蛋白(Ig)超家族，其序列和癌胚抗原(CEA)是高度同源的，C-CAM的第一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域?qū)λ募?xì)胞黏附活性是必須的。細(xì)胞黏附分子(CAM)參與了調(diào)節(jié)組織發(fā)育和細(xì)胞分化的復(fù)雜分子作用網(wǎng)絡(luò)(Edelman,Annu.Rev.Biochem_54:135-169,1985)。最近的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明CAM的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，例如E-cadherin(在上皮細(xì)胞中有顯著表達(dá))表達(dá)水平的降低和某些腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Giancotti和Ruoslahti(Giancotti和Ruoslahti,Cell,60:849-859,1990)證明在體外通過基因轉(zhuǎn)入提高整合蛋白α5β1的表達(dá)可以減少中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的腫瘤發(fā)生。C-CAM能在體外和體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。其它腫瘤抑制因子也可以在本發(fā)明中應(yīng)用。例如，所選多聚核甘酸可以是下列基因中的任何一個(gè)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(Rb)；腺瘤多孔結(jié)腸基因(APC)；缺陷的結(jié)腸癌基因(DCC)；神經(jīng)纖維瘤基因1(NF-1)；神經(jīng)纖維瘤基因2(NF-2)；Wilm的腫瘤抑制基因(WT-1)；一型多內(nèi)分泌腫瘤基因(MEN-1)；二型多內(nèi)分泌腫瘤基因(MEN-2);BRCA1;vonHippel-Lindau綜合癥基因(VHL)；缺失結(jié)腸癌基因(DCC);p16;p21;p57;p27和BRCA2。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，它提供了通過刺激生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的表達(dá)來啟動(dòng)再生過程(如神經(jīng)再生)的方法和載體。在這個(gè)實(shí)施例中，特定核甘酸可以是一個(gè)神經(jīng)因子。例如可以編碼睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)，腦演化來的神經(jīng)因子(BDNF)，膠質(zhì)細(xì)胞系演化來的神經(jīng)因子(GDNF)(Mitsumoto等，Science,265:1107-1110,1994;Cash等，Ann.Neurol_44(3suppl1):s121-125,1998，在此均引入本文作為參考)。表達(dá)載體中的特定核甘酸也可以編碼酪氨酸羥化酶，GTP環(huán)化水解酶1，芳香性L-氨基酸脫羧梅(Kang,Mov,Disord_13supp11:59-72,1998，在此均引入本文作為參考)。在另一個(gè)實(shí)施例中，治療表達(dá)構(gòu)架體可以表達(dá)一個(gè)生長(zhǎng)因子，如類胰島素生長(zhǎng)因子1(IGF-1)(Webster,Mult.Scler_3:113-120,1997，在此均引入本文作為參考)。本發(fā)明不僅僅能用于治療高增生型的疾病和病變，還可以通過轉(zhuǎn)入如編碼血管發(fā)生抑制因子或細(xì)胞周期抑制因子的治療基因用于其它如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或(尤指心瓣手術(shù)后)再狹窄(renstenosis)等疾病的治療。b)反義構(gòu)建體諸如ras,myc,neu,raf,erb,sec,fins,jun,trk,ret,gsp,hst,bcl，和abl等原癌基因都是合適的治療基因。然而為了取得好的治療效果，這些原癌基因是以反義核酸的形式表達(dá)來抑制原癌基因的表達(dá)的?！胺戳x核酸”是指與原癌基因編碼的DNA或RNA互補(bǔ)的核甘酸序列，當(dāng)反義核酸在靶細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)候，它特定的與靶核酸序列結(jié)合干擾轉(zhuǎn)錄、RNA合成、轉(zhuǎn)運(yùn)或者翻譯，當(dāng)它和雙鏈DNA結(jié)合的時(shí)候形成三螺旋構(gòu)相，和RNA結(jié)合的時(shí)候雙鏈構(gòu)相。反義構(gòu)建體可以設(shè)計(jì)成和一個(gè)基因的啟動(dòng)子和其它調(diào)控區(qū)域，外顯子，內(nèi)含子，甚至外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)結(jié)合的形式來封閉基因的表達(dá)。無論在體外或者包括人在內(nèi)的體內(nèi)試驗(yàn)，反義RNA構(gòu)建體或編碼RNAS的DNA構(gòu)建體可以用來抑制宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄或翻譯或兩者都抑制。包括互補(bǔ)核甘酸在內(nèi)的核酸序列是能在標(biāo)準(zhǔn)的Wstson-Crick原則下配對(duì)的。該原則是，稍大的嘌呤和稍小的嘧啶配對(duì)，在DNA中形成G:C和A:T配對(duì)形式，在RNA中形成A:U的配對(duì)形式。在此處提到的“互補(bǔ)序列”或“反義序列”是指核酸序列在整個(gè)序列上是穩(wěn)定互補(bǔ)的，并且很少有錯(cuò)配。例如，一段有15個(gè)堿基的核酸序列如果它有13或14個(gè)(一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)配)堿基與另一段序列配對(duì)才能稱為互補(bǔ)。通常情況下，“完全互補(bǔ)”的核酸序列是在整個(gè)片段上完全互補(bǔ)和沒有錯(cuò)配的。所有的或者部分基因序列可以用于反義構(gòu)建體中，統(tǒng)計(jì)表明任何一段17堿基長(zhǎng)的序列在基因組中只會(huì)出現(xiàn)一次，這足以保證它只有唯一的一個(gè)靶序列。雖然短核酸序列容易制備和在體內(nèi)容易轉(zhuǎn)入，但還有其它很多的因素影響其雜交特定性。通過對(duì)長(zhǎng)度為8,9,1O,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或者更多堿基的核甘酸序列被用于試驗(yàn)分析，核甘酸的結(jié)合特定性和序列特定性是隨其長(zhǎng)度增加而增加的。通過體外試驗(yàn)中分析表達(dá)構(gòu)建體是否影響相應(yīng)的內(nèi)源基因功能或者含有互補(bǔ)序列的相關(guān)基因的表達(dá)是否受到影響，我們可以很容易判斷反義核酸是否能在靶細(xì)胞中起作用。在一些特殊實(shí)施例中，人們希望反義構(gòu)建體中包括其它元素，例如C-5丙基嘧啶。試驗(yàn)證明含有尿嘧啶和胞嘧啶的C-5丙基類似物的多聚核甘酸能與RNA高親和度結(jié)合，是一個(gè)潛在的基因表達(dá)反義抑制劑(Wagner等，Science,260:1510-1513,1993，在此引入本文作為參考)。c)核酶構(gòu)建體核酶可以用來替代反義構(gòu)建體?！昂嗣浮笔悄茏R(shí)別并切割NDA通常是RNA分子中的特定堿基序列的RNA分子。在本發(fā)明中，核酶被導(dǎo)入細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)核酶RNA。核酶的靶序列和反義核酸的靶序列是相同的。很多核酶能在生理?xiàng)l件下催化磷酸二脂鍵的水解。本發(fā)明中的核酶能催化對(duì)另一個(gè)核酸分子的特定序列性切割，通常是一段轉(zhuǎn)錄的mRNA分子，也可以是原癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA。通常情況下核酶通過位于其酶活位點(diǎn)側(cè)面的結(jié)合位點(diǎn)和靶RNA結(jié)合，然后酶活位點(diǎn)切割RNA。對(duì)靶RNA的刪除能夠直接或間接地破壞它編碼蛋白的能力。當(dāng)核酶切割完成后，它從靶RNA上釋放出來并尋找下一個(gè)靶體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，應(yīng)用的核酶是腦錘骨核酶，它是一個(gè)從植物病毒演化來的小分子RNA(Symons,Ann.Rev.Biochem.61:641-671,1992;Clouet-D’Orval和Uhlenbeck,RNA,2:483-491,1996;Haseloff和Gerlach,Nature334:585-591,1988;Jeffries和Symons,NecleicAcidsRes,17:1371-1377,1989;Uhlenbeck,Nature,328:596-600,1987；在此均引入本文作為參考)。在其它實(shí)施例中，核酶可以是第一組內(nèi)含子，發(fā)卡核酶，VSRNA，肝炎Delta病毒核酶或者RnaseP-RNA核酶(與一段RNA引導(dǎo)序列有關(guān))。關(guān)于發(fā)卡的作用見文章Hampel等，NucleiAcidsRes.18:299,1990以及Hampel和Tritz,Biochemistry28:4929,1989；肝炎delta病毒見Perrotta和Been的文章，Biochemistry31:16,1992;Yuan等的美國(guó)專利5,624,824描述了RNAsep的示例；在Sabulle和Collins的文章,Cell61:685-696,1990,Saville和Collins的文章，Proc.Natl.Acid.Sci.USA88:8826-8830,1991,Collins和Olive的文章，Biochemsitry32:2795-2799(1993)描述了脈孢菌VS核酶RNA。第一組內(nèi)含子的描述見Ceth等的文章，美國(guó)專利5,354,855。本發(fā)明不僅僅局限于上面提到的核酶，含有和靶mRNA互補(bǔ)的底物結(jié)合位點(diǎn)的核酶均可以應(yīng)用于本發(fā)明中，該核酶也含有一個(gè)切割RNA分子的酶活位點(diǎn)，它位于底物結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)部或在其周圍。d)選擇性標(biāo)記在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，無論在體內(nèi)或體外，表達(dá)載體中的治療基因的表達(dá)可以通過載體內(nèi)部的一個(gè)標(biāo)記物來鑒定。這樣一些標(biāo)記可以使轉(zhuǎn)入了該表達(dá)載體的細(xì)胞發(fā)生顯著變化而容易和其它細(xì)胞分開。通常在表達(dá)構(gòu)建體和選擇轉(zhuǎn)化體中都含有一個(gè)藥物選擇標(biāo)記。例如表達(dá)載體中可以使用抗新莓素，嘌呤莓素，潮霉素，DHFR,GPT,zeocin和組氨醇的基因作為選擇標(biāo)記。當(dāng)然象單純苞疹病毒胸嘧啶激梅等酶和免疫球蛋白也可以用作篩選標(biāo)記。只要和治療基因同時(shí)表達(dá)，那么選擇什么樣的選擇標(biāo)記就顯得不十分重要。其它更多的選擇性標(biāo)記包括EGFP,β-gal，和氯莓素乙成轉(zhuǎn)移酶(CAT)。e)復(fù)合基因構(gòu)建體和內(nèi)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)在本發(fā)明的一些特殊實(shí)施例中，應(yīng)用了內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)元素來產(chǎn)生復(fù)合基因或多順反子信使。IRES元素可以使核糖體在翻譯時(shí)擺脫對(duì)5′-甲基化帽子的依賴而可以從內(nèi)部位點(diǎn)開始翻譯。來自病毒家族picanovirus的兩個(gè)成員(polio和encephalomyocarditis)的IRES元素(Pelletier和Sonenber,Nature,334:320-325,1988)和來自哺乳動(dòng)物信使基因中的IRES(Macejak和Sarnow,Nature,353:90-94,1991)已經(jīng)被闡述清楚。IRES元素可以與異源基因的開放閱讀框架連接。多重閱讀框架可以通過中間插入IRES元素而連在一起轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多順反子信使。在IRES元素的幫助下，每個(gè)閱讀框架都可以和核糖體結(jié)合進(jìn)行有效的翻譯，這樣就可以通過一個(gè)簡(jiǎn)單的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子來轉(zhuǎn)錄復(fù)合基因，產(chǎn)生單一信使。任何外源的開放閱讀框架都可以和IRES元素連接使用。這些基因包括編碼分泌蛋白的基因，獨(dú)立基因編碼的多亞基蛋白，細(xì)胞內(nèi)蛋白或膜連蛋白和選擇標(biāo)記基因。f)調(diào)控區(qū)域?yàn)榱耸箍刂票磉_(dá)載體中的治療基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，必須把它置于啟動(dòng)子和多腺苷酸信號(hào)的調(diào)控之下?！皢?dòng)子”是指能被宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)或?qū)氲暮铣上到y(tǒng)識(shí)別的DNA序列，它是啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄所必需的。多腺苷酸信號(hào)是指能被宿主細(xì)胞內(nèi)的合成系統(tǒng)或者導(dǎo)入的合成系統(tǒng)識(shí)別的DNA序列，它對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)束時(shí)給它加上一系列的核甘酸是必需的和介導(dǎo)了mRNA從核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移。“轉(zhuǎn)錄調(diào)控”是指啟動(dòng)子位于和特定核甘酸有關(guān)的準(zhǔn)確的位點(diǎn)，調(diào)控RNA聚合酶的起始和表達(dá)。啟動(dòng)子在這里是指一組位于RNA聚合酶Ⅱ起始位點(diǎn)周圍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子。關(guān)于轉(zhuǎn)錄時(shí)啟動(dòng)子是如何組織的這個(gè)問題的很多理論是通過對(duì)幾個(gè)病毒啟動(dòng)子的分析研究得出的，其中包括HSV胸嘧啶激酶(tk)和SV40的早期轉(zhuǎn)錄單元。這些研究(最近更多的工作增加其論證)表明啟動(dòng)子是由一些不連續(xù)的功能子組成的，其中每個(gè)功能子含有大約7-20個(gè)堿基，一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制子結(jié)合位點(diǎn)。在每一個(gè)啟動(dòng)子中至少有個(gè)一個(gè)功能子的功能是確定RNA合成的起始位點(diǎn)。最著名的例子就是TATAbox，但有一些啟動(dòng)子缺乏TATAbox，如哺乳動(dòng)物末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶和SV40的晚期基因啟動(dòng)子，TATAbox是一個(gè)不連續(xù)的自身覆蓋起始位點(diǎn)的元素，它決定RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。其它的啟動(dòng)子元素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率。一般情況下這些啟動(dòng)子元素位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域，但最近的研究表明很多啟動(dòng)子含有位于起始位點(diǎn)下游的功能元素。啟動(dòng)子元素之間的序列是柔性和可變的，因此當(dāng)這些元素倒置或改變相對(duì)位置時(shí)不影響啟動(dòng)子的功能。在tk啟動(dòng)子中，當(dāng)啟動(dòng)子元素間的距離增大得到50bp是啟動(dòng)子的活性才開始下降。在啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元素似乎可以協(xié)同或單獨(dú)激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)靶細(xì)胞是人體細(xì)胞時(shí)，首先要把治療基因的編碼區(qū)域和能在人體細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子連接并在它的調(diào)控之下。通常情況下，這類啟動(dòng)子包括人或病毒的啟動(dòng)子。表1是一些啟動(dòng)子列表。表1(續(xù)前頁(yè))對(duì)用于控制治療基因表達(dá)的特殊啟動(dòng)子的要求不是很挑剔，只要它能被誘導(dǎo)啟動(dòng)子控制的基因產(chǎn)物激活就可。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，反式激活蛋白是tat，和治療基因相連的啟動(dòng)子是HIV-1或HIV-2的長(zhǎng)末端重復(fù)序列。例如，含有AP-1位點(diǎn)的啟動(dòng)子元素可受誘導(dǎo)表達(dá)的c-jun或c-fos蛋白的調(diào)控，其它適合的反式激活因子/啟動(dòng)子組合模式詳見該技術(shù)中?？刂品词郊せ钜蜃踊虮磉_(dá)的啟動(dòng)子必須是一個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子。誘導(dǎo)啟動(dòng)子在沒有誘導(dǎo)底物存在的情況下沒有活性或者活性相對(duì)較低。本發(fā)明中應(yīng)用的啟動(dòng)子包括(但不局限于)MTII,MMTV膠原酶，stromelysin,SV40，鼠MX基因,α-2-巨球蛋白，I型MHC基因h-2kb，增值蛋白，腫瘤壞死因子，甲狀腺激素刺激α基因。該基因相關(guān)的刺激因子見表2。Egr-1啟動(dòng)子和多重藥物抗性基因(MDR1)啟動(dòng)子也是合適的誘導(dǎo)啟動(dòng)子。通常情形下誘導(dǎo)啟動(dòng)子是熱激誘導(dǎo)的，它是從下列啟動(dòng)子中的一個(gè)演化來的HSP70,HSP90,HSP60,HSP27,HSP72,HSP73,HSP25，泛激素和HSP28。在另一種常用實(shí)施例中，誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括一個(gè)低氧反應(yīng)元素，如HIF-1。應(yīng)當(dāng)明了的是任何一個(gè)誘導(dǎo)啟動(dòng)子都可以在本發(fā)明中應(yīng)用，所有這樣的啟動(dòng)子都不超出本發(fā)明的核心思想和范圍。表2(續(xù)前頁(yè))<tablesid="table4"num="004"><table>SV40負(fù)離子酯(TPA)鼠MX基因干擾素，新城疫病毒GRR78基因A23187α-2巨球蛋白IL-6Vimentin血清I型MHC基因H-2kB干擾素HSP70Ela,SV40大T抗原多育曲菌素(Proliferin)負(fù)離子脂-TPa腫瘤壞死因子FMA糖皮質(zhì)刺激激素α基因糖皮質(zhì)激素</table></tables>在一些特殊實(shí)施例中，反式激活因子是tat蛋白。HIV-1和HIV-2病毒的基因組和猴免疫缺失病毒(SIVS)的基因組有很高的同源性，都對(duì)他們進(jìn)行了深入的研究。研究發(fā)現(xiàn)除了gag,env,pol基因在所有的翻轉(zhuǎn)錄病毒中是相同以外，還有許多在病毒的轉(zhuǎn)錄起重要作用的調(diào)節(jié)基因也是相同的。病毒蛋白tat就是這樣一個(gè)調(diào)節(jié)因子，它能顯著地提高HIV-1和HIV-2啟動(dòng)子的活性。(Sodroski等，J.Virol_55(3):831-835,1985a;Sodroski等，Science,229(4708):74-77,1985b;Sodroski等，Science,228(4706):1430-1434,1985c;Sodroski等,Science,227(4683):171-173,1985d；在此均引入本文作為參考)。Tat蛋白被認(rèn)為是和HIVLTR中的反式激活元素(TAR)結(jié)合并提高穩(wěn)定的HIV特定的RNA水平。也有證據(jù)表明tat不僅僅像其它的傳統(tǒng)反式激活因子一樣起作用，它還能和其它反式激活因子相互作用。Tat和腺病毒反式激活因子ELA能顯著的提高穩(wěn)定RNA的水平。(Laspis等，GenesDev_4(12B):2397-2408,1990)。這樣，一個(gè)可以進(jìn)一步提高HIV-LTR/TAT構(gòu)建體活性的方法是把EIA整合到該構(gòu)建體中。在構(gòu)建體插入cDNA的地方，通常要含有一個(gè)多腺苷酸信號(hào)區(qū)以便能控制轉(zhuǎn)錄基因的正常多聚腺苷酸化。在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中，多聚腺苷酸信號(hào)區(qū)的特性并不重要，任何這樣的序列都可以用于本發(fā)明中。像來自SV40，牛生長(zhǎng)激素，單純苞疹病毒胸嘧啶激酶基因的多腺苷酸信號(hào)區(qū)已經(jīng)成功應(yīng)用于很多細(xì)胞中。5．基因轉(zhuǎn)入方式要控制細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，首先要把本發(fā)明中的治療基因表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入或轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，這樣的轉(zhuǎn)入方式可以是病毒或非病毒介導(dǎo)的。這一部分將要討論基因轉(zhuǎn)入的方法和組合物。A．非病毒轉(zhuǎn)入方式在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，不同的基因表達(dá)構(gòu)建體必須轉(zhuǎn)入細(xì)胞才能起作用。在某些情形下，表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)入是通過非病毒形式進(jìn)行的。本發(fā)明提供了幾種將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)移方法。這些方法包括磷酸鈣沉淀法(Graham和VanDerEb,Vriology,52:456-467,1973;Chen和Okayama,Mol.Cell.Biol_7:2745-2752,1987;Reppe等,Mol.CellBiol_10:689-695,1990)DEAE-葡聚糖法(Gopal,Mol.Cell.Biol,5:1188-1190,1985),電穿孔法(Tur-Kaspa等，Mol.Cell.Biol_6:716-718,1986;Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.81:7161-7165,1984,)，直接顯微注射法(HarlandandWeintraub,Mol.Cell.Bio1_101:1094-1099,1985),DNA填充脂質(zhì)體法(Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982;Fraley等,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979),細(xì)胞聲處理法(Fechheimer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:8461-8467,1987),高速基因槍彈法(Yang等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,87:9568-9572,1990),受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法(Wu和Wu,J.Biol.Chem_262:4429-4432,1987;Wu和Wu,Biochemistry,27:887-892,1988，以上文獻(xiàn)章節(jié)均在此引入本文作為參考)。一旦編碼治療基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，它可被定位于不同的位點(diǎn)表達(dá)。在某些情形下，治療基因可以成功地整合到細(xì)胞基因組中。這些整合位點(diǎn)可以是同源位點(diǎn)和同源重組(genereplacement)起始位點(diǎn)，也可以是隨機(jī)，非特定位點(diǎn)。然而在一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)入的核酸可以以獨(dú)立的、游離的DNA片段穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。這些核酸片段或“游離子”含有使自己獨(dú)立于或者應(yīng)用細(xì)胞合成體系保持和復(fù)制自己的信息。如何把表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)入細(xì)胞以及它位于細(xì)胞內(nèi)部何處取決于表達(dá)構(gòu)建體。在本發(fā)明的一些特殊實(shí)施例中，表達(dá)構(gòu)建體可以包埋在脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)入。脂質(zhì)體是泡狀結(jié)構(gòu)體，它的特點(diǎn)是含有雙層磷脂膜和膜內(nèi)部的水相介質(zhì)。多層脂質(zhì)體是由水相分開多脂層組成的，當(dāng)磷脂懸浮于過量的水溶液中是它會(huì)自發(fā)形成。脂成分在形成閉合結(jié)構(gòu)以前先自我排列，然后把雙脂層之間的水和溶質(zhì)包埋起來形成脂質(zhì)體。當(dāng)把DNA加入到陽(yáng)離子脂質(zhì)體中時(shí)，脂質(zhì)體可以向具有旋光性的流動(dòng)脂體-晶體壓縮球狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這種DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物是一種潛在的非病毒基因治療載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)化和外源DNA在細(xì)胞中的表達(dá)的體外試驗(yàn)是非常成功的。Wong等人(Wong等，Gene,10:87-94,1980，在此引入本文作為參考)通過使用β-半乳糖苷酶作為報(bào)告基因證明脂質(zhì)體介導(dǎo)的外源基因在體外培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞，Hela細(xì)胞，肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)是容易可行的。Nicolau等人(MethodsEnzymol,149:157-176,1987，文獻(xiàn)中列舉)通過體內(nèi)注射，成功的完成了將脂質(zhì)體包埋的基因轉(zhuǎn)入小鼠。本發(fā)明中也包含了涉及“脂轉(zhuǎn)染”技術(shù)的一些商業(yè)方法。在本發(fā)明的某些特定實(shí)施例中，脂質(zhì)體可以和血細(xì)胞凝聚病毒(HVJ)混合使用，這樣可以使復(fù)合物與細(xì)胞膜的融合和脂質(zhì)體包埋的DNA進(jìn)入細(xì)胞更容易。在其它一些實(shí)施例中，脂質(zhì)體可以和細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白-染色體蛋白(HMG-1)聯(lián)合使用。還有一些實(shí)施例中，脂質(zhì)體可以與HVJ和HMG-1兩者共同使用。這些方法無論在體內(nèi)或者體外試驗(yàn)中都能成功地將外源基因轉(zhuǎn)入并在細(xì)胞中表達(dá)，因此對(duì)本發(fā)明而言都是可行的。其它能用來將治療基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞的載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)體系。這種方法利用原理是在幾乎所有的真核細(xì)胞中，受體能介導(dǎo)選擇性吸收大分子的內(nèi)吞作用。由于受體是具有細(xì)胞特定性，因此轉(zhuǎn)運(yùn)方法具有很高的特定性(WuandWu,Adv.Drug.DeliveryRev_12;159-167,1999)。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移運(yùn)載工具包括兩個(gè)組份細(xì)胞受體-特定的配體和DNA結(jié)合物。好幾個(gè)配體已經(jīng)應(yīng)用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化。應(yīng)用最廣泛的配體包括asialoorosomucoid(ASOR)(Wu和Wu,J.Biol.Chem_262:4429-4432,1987)和轉(zhuǎn)運(yùn)子(Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.87(9):3410-3414,1990)。近來，一個(gè)人工合成的新糖蛋白，其識(shí)別ASOR受體，被用于基因轉(zhuǎn)入運(yùn)載工具(Ferkol等，F(xiàn)ASEBJ_7:1081-1091,1993;Perals等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,91:4086-4090,1994)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)也被用來將基因轉(zhuǎn)入鱗片狀腫瘤細(xì)胞中(Myers,EPO0273085)。在其它實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)工具可以由配體和脂質(zhì)體組成。例如Nicolau等人(MethodsEnzymal_149:157-176,1987)將乳糖神經(jīng)酰胺，半乳糖末端-asialganglisside包埋于脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以觀察到肝細(xì)胞吸收胰島素基因水平提高。這樣，在有或沒有脂質(zhì)體的幫助下，通過受體-配體體系可以很容易將治療基因特定地轉(zhuǎn)入前列腺，上表皮或腫瘤等細(xì)胞。例如人前列腺特定的抗原(Watt等，Proc.Natl.Acad.Sci_83(2):3166-3170,1986)可用在受體介導(dǎo)體系中將治療基因轉(zhuǎn)入前列腺組織中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，表達(dá)載體僅僅由裸重組DNA或質(zhì)粒組成。該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化可以通過上面提到的以物理或者化學(xué)方法穿過細(xì)胞膜的任何一種方法。這個(gè)載體特別適合于體外轉(zhuǎn)化，當(dāng)然也可以應(yīng)用于體內(nèi)。Dubensky等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,81:7529-7533,1984)成功地將多性瘤病毒DNA以磷酸鈣沉淀的形式注射到成年或新生小鼠的肝和脾細(xì)胞中，觀察到了活性病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif(Proc,Natl.Acad.Sci.USA,83:9551-9555,1986)也證明了在皮下注射磷酸鈣沉淀的質(zhì)粒能導(dǎo)致它在細(xì)胞中的表達(dá)。也有試驗(yàn)表明編碼CAM的基因也可以通過相似的方法轉(zhuǎn)入體內(nèi)并表達(dá)CAM。本發(fā)明中將裸DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中的方法包括基因槍彈顆粒。該方法是把包被了DNA的微型槍彈顆粒加速到一個(gè)很高的速度，使它能穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞但不殺死細(xì)胞(Klein等，Nature,327:70-73,1987，在此引入本文作為參考)。已經(jīng)發(fā)展了幾種加速這些微型顆粒的方法。其中一種方法是依靠高電壓放電產(chǎn)生電流，電流反過來產(chǎn)生推力(Yang等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,87:9568-9572,1990)使用的微型槍彈由生物惰性物質(zhì)如鎢或金珠組成。B．病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化另一種實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法是通過以具感染性的病毒粒子作為傳輸工具的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，本發(fā)明中以下所描述的以腺病毒為載體的轉(zhuǎn)化。反轉(zhuǎn)錄病毒牛乳頭瘤病毒也可以作為替代的載體，二者皆能將目的基因永久地轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中。因此，在一例子中，病毒感染的細(xì)胞被用來將治療用的有效基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。典型地，在生理?xiàng)l件下病毒被簡(jiǎn)單地暴露給合適的細(xì)胞，使細(xì)胞引入病毒。雖然此處以腺病毒作為例子，本方法可同樣有助于使用在其它病毒載體上，如以下所描述的。本發(fā)明領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都很熟悉這些方法。a)腺病毒腺病毒由于其中等大小的基因組，易于操作，高滴定度，廣宿主范圍，以及高感染性，特別適于用作基因轉(zhuǎn)化載體。其全長(zhǎng)36kB病毒基因組兩端以100-200堿基(bp)長(zhǎng)的反向末端重復(fù)序列(ITR)為邊界，其中含病毒DNA復(fù)制與包裹所必需的順式作用元素。按病毒DNA復(fù)制模式，基因組中所含的不同轉(zhuǎn)錄單位被分為早期(E)與晚期(L)基因區(qū)。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼的蛋白負(fù)責(zé)病毒基因以及一些細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。E2(E2A和E2B)區(qū)的表達(dá)產(chǎn)生病毒復(fù)制所需蛋白。包括病毒DNA復(fù)制，晚期基因表達(dá)以及宿主細(xì)胞的封閉(Renan,1990)。晚期基因的產(chǎn)物(L1,L2,L3,L4與L5)包括主要的病毒外殼蛋白，只在由晚期基因啟動(dòng)子(MLP)引起的一個(gè)單一初級(jí)轉(zhuǎn)錄的有效加工后表達(dá)。MLP(位于16.8染色體圖距)在感染晚期特別的活躍，所有由其引出的mRNA帶有一個(gè)5′端的三葉草前端序列(TL)，使其優(yōu)先被翻譯。為了使腺病毒適于基因治療，需要使其具有最大的搭載容量以便包裹最大量的DNA片段。并且十分有必要減低某些腺病毒產(chǎn)物所帶來的毒性與免疫反應(yīng)。這兩個(gè)目的均可由刪除相應(yīng)的腺病毒基因來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的實(shí)際操作中，能夠達(dá)到這些目的同時(shí)使治療構(gòu)建體保留相應(yīng)簡(jiǎn)單的操作性。大量的DNA替換是可能的，病毒復(fù)制所必需的順式元素都位于線性病毒基因組兩端的反向重復(fù)序列(ITR)(100-200)中。含有ITR的質(zhì)粒能在未失活的腺病毒存在下復(fù)制。因此，在腺病毒載體中含有這個(gè)元素使復(fù)制能夠?qū)崿F(xiàn)。另外，病毒的包裝信號(hào)位于病毒基因組左端194-385bp(0.5-1.1圖距)處。這個(gè)信號(hào)類似于λ噬菌體DNA中的蛋白識(shí)別位點(diǎn)，一個(gè)靠近左末端但位于粘性末端序列之外的特殊序列，介導(dǎo)結(jié)合到將DNA插入頭結(jié)構(gòu)中所必需的蛋白上。E1缺失的腺病毒已表明位于病毒基因組左末端的一個(gè)450bp(0-1.25圖距)能引導(dǎo)在293細(xì)胞中的包裝。之前已表明腺病毒基因組的某些區(qū)能摻入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并表達(dá)所攜帶的基因。這些細(xì)胞系能使這些基因失效的腺病毒載體得以復(fù)制。也有報(bào)導(dǎo)表明復(fù)制失活的腺病毒載體能在幫助載體，如野生型病毒或條件致變的突變體，存在下得到互補(bǔ)的復(fù)制能力。復(fù)制缺陷的腺病毒載體能反式地通過幫助病毒得到互補(bǔ)功能，這個(gè)發(fā)現(xiàn)并不能獨(dú)自地實(shí)現(xiàn)復(fù)制缺陷的載體的分離。相反地，由于必需的提供復(fù)制功能的幫助載體的存在會(huì)引起制備上的污染。因此一個(gè)附加的元素必需用來引入復(fù)制缺陷載體復(fù)制或包裝上的特定性。本發(fā)明所提供的這個(gè)元素由腺病毒的包裝功能中得到。已指出在常規(guī)的腺病毒基因圖的左端存在一個(gè)腺病毒的包裹信號(hào)。近一步的研究表明，基因組E1A(194-358bp)區(qū)缺失的的突變體即使在能提供互補(bǔ)的早期(E1A)功能的細(xì)胞系中也生長(zhǎng)得很緩慢。當(dāng)重組一段腺病毒的補(bǔ)償DNA(0-353)到突變體的右末端時(shí)，病毒能正常地包裝。進(jìn)一步突變分析，在基因組Ad5的左末端得到一短的重復(fù)與位置有關(guān)的元素。發(fā)現(xiàn)這個(gè)重復(fù)序列的一個(gè)單拷貝如果存在于基因組的任意一端都能引起足夠有效的包裝，但不能被移入Ad5DNA的內(nèi)部。使用不同的突變的包裝信號(hào)就有可能得到具有不同包裝效率的幫助病毒。一般地，這些突變?yōu)辄c(diǎn)突變或缺失突變。當(dāng)?shù)桶b效率的幫助病毒在幫助細(xì)胞中生長(zhǎng)時(shí)，盡管與野生型相比效率降低，仍能得到包裝，使得幫助病毒的繁殖能夠?qū)崿F(xiàn)。當(dāng)這些幫助病毒與含野生型包裝信號(hào)的病毒一起在細(xì)胞中生長(zhǎng)時(shí)，野生型的包裝信號(hào)相對(duì)突變的優(yōu)先被選擇。在有限的包裝因子存在的條件下，含野生型信號(hào)的病毒相對(duì)幫助病毒被選擇性地包裝。如果選擇性足夠高，就能達(dá)到均一的產(chǎn)品。b)逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈的RNA病毒，以其能在感染細(xì)胞中將它們的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)變成雙鏈的DNA為特征。DNA產(chǎn)物穩(wěn)定地整合到細(xì)胞染色體上成為原病毒，引導(dǎo)病毒蛋白的合成。整合結(jié)果使病毒基因在受主細(xì)胞及其后代中保留下來。逆轉(zhuǎn)錄病毒含三類基因gag,pol和env-分別編碼外殼蛋白，聚合酶蛋白與包膜蛋白。在gag基因上游找到的一個(gè)序列，記為ψ，起將基因組包裝入病毒粒子的信號(hào)的功能。病毒基因組的5′和3′末端有兩個(gè)長(zhǎng)的末端重復(fù)序列(LTR)，含有強(qiáng)的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子序列，也是整合入宿主細(xì)胞中所必須的。為構(gòu)建一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，一個(gè)編碼啟動(dòng)子的核酸序列被插入到病毒基因組的適當(dāng)位置，得到一復(fù)制失活的病毒。為得到病毒粒子，構(gòu)建了一個(gè)含gag,pol，和env基因但不含有LTR和ψ部分的包裹細(xì)胞系。當(dāng)帶有人的cDNA與逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和ψ序列的重組的質(zhì)粒被引入到此細(xì)胞系中(如用磷酸鈣沉淀法)，ψ序列使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄得的RNA被包裝入病毒粒子，再被分泌到培養(yǎng)基中。含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基被收集，適當(dāng)濃縮，用于基因轉(zhuǎn)化。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染廣范圍的細(xì)胞類型。但許多逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合與穩(wěn)定表達(dá)要求宿主細(xì)胞的分裂。最近通過基于向逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上化學(xué)性加入半乳糖殘基的化學(xué)修飾方法，實(shí)現(xiàn)了使逆轉(zhuǎn)錄病毒感染特定目標(biāo)的設(shè)計(jì)。這種修飾與欲期的一樣，允許經(jīng)由脫唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)感染特定的細(xì)胞，如肝細(xì)胞。另一個(gè)實(shí)現(xiàn)特定導(dǎo)向重組逆轉(zhuǎn)錄病毒設(shè)計(jì)是通過一個(gè)生物素化的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白及抗特定細(xì)胞受體的抗體?？贵w與生物素的結(jié)合通過使用鏈霉抗生物素蛋白(Roux等，Proc.NatlAcad.Sci.USA,86:9079-9083,1989)。通過用抗主要組織復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ抗原的抗體，已在體外展示了用嗜親性病毒感染一系列不同的帶有這些表面抗原的人細(xì)胞。c)腺伴隨病毒AAV是一大約4700bp長(zhǎng)的線性、單鏈DNA病毒。兩側(cè)為反向重復(fù)末端。其基因組中有兩個(gè)基因，能產(chǎn)生若干不同的基因產(chǎn)物。其一為cap基因，產(chǎn)生三個(gè)不同的毒粒蛋白(VP)，記為VP-1,VP-2,VP-3。另一為rep基因，編碼四個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)。一個(gè)或多個(gè)rep基因的產(chǎn)物負(fù)責(zé)AAV轉(zhuǎn)錄的反式激活。AAV中的三個(gè)啟動(dòng)子按其在基因組上位置，以圖距為單位分類。自左到右為p5、p19、和p40。轉(zhuǎn)錄得六個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，每一個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄，其中之一被剪切加工。位于圖距42-46的剪切位點(diǎn)對(duì)每一個(gè)轉(zhuǎn)錄是相同的。四個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白由較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄得到，三個(gè)毒粒蛋白由最小的轉(zhuǎn)錄得到。AAV并不與人的任何病理階段相關(guān)聯(lián)。令人注意的是，AAV要得到有效的復(fù)制，需要有其它病毒提供的“幫助”功能，如單純皰疹病毒Ⅰ和Ⅱ，巨細(xì)胞病毒，假狂犬病毒，以及如其名所述的腺病毒。腺病毒是特征了解得最清楚的幫助病毒，并且其許多早期功能表明是用于協(xié)助AAV的復(fù)制。已確信AAV中rep蛋白的低水平表達(dá)能中止AAV組成性的表達(dá)，幫助病毒的感染能除去這種抑制。AAV載體的末端重復(fù)序列能通過用限制性內(nèi)切酶切割A(yù)AV或象p201一樣含一修飾過的AAV基因組(Sarnulski等，J.Virol_61(10):3096-3101,1987，參照下文附件)的質(zhì)粒而得到?；蛘哂善渌阎墓に嚰夹g(shù)方法得到，包括基于已發(fā)表的AAV序列用化學(xué)或酶法合成末端重復(fù)序列，以及不限于此的其它方法。這些常規(guī)的合成工藝與熟知的方法如缺失突變分析一樣能檢測(cè)AAV的ITR序列，發(fā)揮其諸如穩(wěn)定和位點(diǎn)專一性整合功能所必需的最小部分。以及能檢測(cè)出此序列在保持其穩(wěn)定和位點(diǎn)專一的整合功能的范圍內(nèi)所能允許的微小修飾。以AAV為基礎(chǔ)的載體已在體外被證明是一安全面高效的基因傳輸工具。并且這類載體在體內(nèi)及體內(nèi)衍生系中正應(yīng)用于廣范圍的有治療潛力的基因進(jìn)行臨床前及臨床期的檢測(cè)。在肺中AAV介導(dǎo)的有效的轉(zhuǎn)化與表達(dá)已經(jīng)在囊性纖維化的治療中進(jìn)入了臨床試驗(yàn)(Carter和Flotte,Ann.N.Y.AcadSci.700:79-90,1995;Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10613-10617,1993)。類似的，預(yù)期中的用AAV介導(dǎo)將肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因傳輸?shù)焦趋兰≈幸灾委熂∪馕s癥，及將酪氨酸羥化酶?jìng)鬏斎氪竽X中以治療帕金森病，將因子Ⅸ基因傳輸入肝中以治療血友病B，以及很具潛力的將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因?qū)胄呐K中以治療心肌梗塞，由于最近實(shí)驗(yàn)表明AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因能在這些器官中很高效率的表達(dá)，已經(jīng)顯得是可行的。(Fisher等，J.Virol,70:520-532,1996;Flotte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10613-10617,1993;Kaplitt等，Nat.Genet_8:148-153,1994；Kaplitt等，ArmThord.Surg_62:1669-1676,1996;Koeberl等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:1426-1431,1997；McCown等，BrainRes_713:99-107,1996;Ping等，Microcirculation,3:225-228,1996;Xiao等,J.Virol_70:8098-8108,1996)d)其它病毒載體其它病毒載體在本發(fā)明中可作為表達(dá)組件而被應(yīng)用到。包括由牛痘病毒衍生得的載體(Ridgeway,In:Vectors:Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,RodriguezRL,DenhardtDT.Ed_Stoneham:Butterworth,pp.467-492,1988；Baichwal和Sugden,In:GeneTransfer,KucherlapatiR,ed_NewYork,PlenumPress,pp.117-148,1986;Coupar等，Gene,68:1-10,1988)，及由雀痘病毒、慢性病毒、皰疹病毒所得的載體。6．目標(biāo)細(xì)胞本發(fā)明所涉及的方法及質(zhì)?？梢砸圆溉閯?dòng)物中的一系列細(xì)胞、器官、及組織作為靶目標(biāo)。在一些實(shí)施例中，本文描述的表達(dá)構(gòu)建體被用于癌癥治療。靶細(xì)胞或者為腫瘤細(xì)胞，或者為腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞或附近的細(xì)胞。腫瘤則可位于大腦、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、膀胱、淋巴節(jié)、小腸、胰臟、直腸、胃、乳房、子宮、前列腺、睪丸、陰門、子宮頸、卵巢、皮膚、頭頸部、食管、骨髓、或血液中。本發(fā)明領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以很容易地檢出在給定的腫瘤類型中所要表達(dá)的適于治療用的基因。在另一些實(shí)施例中，應(yīng)用于治療非癌的藥理情況。例如，本發(fā)明提供的高效的蛋白替代療法。在這例子中，特定類型的細(xì)胞、組織及器官可作為在患者體內(nèi)表達(dá)某種蛋白的靶目標(biāo)，尤其是這種蛋白的活性僅僅被限制于這種特定的細(xì)胞、組織、或器官中。同樣的，本發(fā)明領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都很可以很容易地檢出哪些細(xì)胞最適于作為靶目標(biāo)?？赏ㄟ^體外、來自體內(nèi)、或體內(nèi)的方法將表達(dá)構(gòu)建體引入到所感興趣的細(xì)胞中。由于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)分離的細(xì)胞一般來說要有效得多，現(xiàn)在許多基因治療采用了來自體內(nèi)的方法。導(dǎo)入方法以及特定傳輸載體的選擇將依據(jù)靶目標(biāo)細(xì)胞、組織、或器官的類型。本發(fā)明領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以簡(jiǎn)單地指導(dǎo)選擇過程。由于本發(fā)明中的表達(dá)構(gòu)建體需要經(jīng)誘導(dǎo)才能被激活，在許多例子中表達(dá)構(gòu)建體能被轉(zhuǎn)入到患者身體的一較大范圍的部位中，而不是設(shè)想的僅僅是特定的細(xì)胞、組織、或器官。要限制將患者暴露于誘導(dǎo)表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)的激活條件下，以得到特定性的表達(dá)。在許多例子中，這是最好的。例如，將患者暴露于射線中進(jìn)行治療時(shí)，要限制于只有那些需要照射的部位。熱溫療法的應(yīng)用也必須限制其范圍。在其它一些實(shí)施例中，活性條件就是靶細(xì)胞本身所特定具有的。舉例來說，腫瘤所具有的低氧環(huán)境能激活具有含可誘導(dǎo)的低氧反應(yīng)元素啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)。在這樣的例子中，所導(dǎo)致的表達(dá)將十分自然地實(shí)現(xiàn)區(qū)域化，盡管表達(dá)構(gòu)建體的引入可能并不是區(qū)域化的。7．配合治療本發(fā)明所涉及的表達(dá)構(gòu)建體具有可與一種或多種其它傳統(tǒng)的治療方法相結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)今癌癥治療的一個(gè)目標(biāo)就是尋找能提高化療及放療效率的途徑。其一即可將傳統(tǒng)的治療與基因治療相結(jié)合。例如，單純皰疹胸腺嘧啶核苷激酶(HS-tk)基因，當(dāng)其經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)被引入腦瘤中后，能成功地誘導(dǎo)出對(duì)抗病毒試劑鳥嘌呤的感受性。但基因治療配合其它傳統(tǒng)療法的效率仍被基因轉(zhuǎn)入到目標(biāo)細(xì)胞后所需達(dá)到的臨床有效表達(dá)量所局限。要?dú)⑺兰?xì)胞，遏制細(xì)胞生長(zhǎng)及新陳代謝，減小腫瘤的大小，或者是逆轉(zhuǎn)或降低腫瘤細(xì)胞惡性擴(kuò)增的表現(xiàn)型，用本發(fā)明提供的方法及組件，就可一般性地將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中并通過應(yīng)用熱激或其它能激活可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的條件獲得誘導(dǎo)表達(dá)。這種基因治療可與其它含有對(duì)癌癥治療有效的試劑的組合物配合使用。這些組合物應(yīng)使用相應(yīng)的劑量以便能有效地殺死或抑制細(xì)胞的擴(kuò)增。這個(gè)過程可以采用將表達(dá)構(gòu)建體與對(duì)應(yīng)藥劑或因子同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞?？赏ㄟ^讓細(xì)胞接觸單一的含有二者的組合物或藥用藥方，或者將細(xì)胞同時(shí)暴露給兩不同的組分或藥方，其一含表達(dá)構(gòu)建體，另一個(gè)含其它用到的藥劑。另外基因治療/熱激治療也可以超前或滯后于其它藥劑治療，間隔可從幾分鐘到幾周。在一些實(shí)施例中，其它藥劑與表達(dá)構(gòu)建體被分開來應(yīng)用到細(xì)胞上，其一一般地能保持足夠長(zhǎng)的作用時(shí)間以保證在每一個(gè)導(dǎo)入的間隔間不失效，因此藥劑與表達(dá)構(gòu)建體仍能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞配合治療的優(yōu)點(diǎn)。在這些例子中，可以設(shè)想其一若要作用于在12-24小時(shí)、或更可取的6-12小時(shí)內(nèi)同時(shí)含有兩種作用模式的細(xì)胞時(shí)，采取僅12小時(shí)的延遲時(shí)間是首選的。在某些情況下，可預(yù)期治療期間可延長(zhǎng)至每個(gè)單獨(dú)的用法之間間隔上幾天(2、3、4、5、6、或7)，甚至是幾周(1、2、3、4、5、6、7、或8)。同樣也可以設(shè)想，可預(yù)期表達(dá)構(gòu)建體與藥劑間有多于一種的使用方法。各種可能的配合方式都可能應(yīng)用到，如以“A”表示表達(dá)構(gòu)建體，以“B”表示另一藥劑，可舉例如下A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BB/A/AA/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BB/B/B/AA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/A/B同樣地，其它配合方式也是可預(yù)期的。再一次說明，要達(dá)到殺死細(xì)胞的目的，二者要用能殺死細(xì)胞的有效配合劑量導(dǎo)入細(xì)胞。適于配合治療的藥劑或因子有任何應(yīng)用到細(xì)胞上時(shí)能誘導(dǎo)DNA損傷的化學(xué)藥劑或治療方法。這樣的藥劑或因子包括能誘導(dǎo)DNA損傷的放射線或電磁波，如γ-射線、X-射線、紫外照射、微波、電子射線等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與基因治療配合的放射治療由外部的射線束組成。外部射線束一般為攜高能的射線，如高能x-射線束。另一可與基因治療配合使用的途徑為內(nèi)部放射，或短暫治療。進(jìn)行短暫治療的方法包括內(nèi)腔或間質(zhì)放置放射性源，灌注膠質(zhì)溶液，非腸道的或口部服用等。封閉性的源包裹于金屬、導(dǎo)線、管子、針、或其它類似物中。非封閉的放射源制備成懸浮溶液。包裹好的放射元素被放置于體腔中，或用適當(dāng)裝置直接插入組織中。裝置一般用外科方法放入體腔或組織中或是使用熒光的方法。這些裝置一般為塑料或金屬小管，可被縫合進(jìn)并維持在靠近腫瘤的位置。放射性的同位素稍后才被放入裝置中(后裝載)。放射性植入用于治療位于舌頭，唇部，乳房，陰道，子宮頸，子宮，直腸，膀胱，及腦部的癌癥。包裹好的源也可以留在病人體內(nèi)作為永久性的植入。植入由放射性物質(zhì)組成的小球是治療區(qū)位性前列腺癌，及區(qū)位性但不適于手術(shù)的肺癌的一個(gè)途徑。一系列具誘導(dǎo)DNA損傷功能的化學(xué)物質(zhì)，也被描述作化學(xué)治療劑，都可與本文提出的方法一起用于配合治療。設(shè)想可用化合物包括有如，阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，鬼臼亞乙苷(VP-16)，喜樹堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，順式鉑氨(CDDP)，以及甚至可用到的過氧化氫。本發(fā)明同樣地包括了同時(shí)配合使用一種或多種DNA損傷試劑，不管是基于射線的或是真正的化合物，例如將X-射線與順式鉑氨一起使用，或同時(shí)使用順式鉑氨與鬼臼亞乙苷。舉例來說，依本發(fā)明在治療癌癥時(shí)，我們可以讓腫瘤細(xì)胞接觸藥劑，同時(shí)附加上表達(dá)構(gòu)建體并通過熱激誘導(dǎo)基因的表達(dá)。這可以通過對(duì)腫瘤部位進(jìn)行局部熱激或?qū)€(gè)體的全身熱激來實(shí)現(xiàn)。這個(gè)過程可以與對(duì)腫瘤的放射性照射配合進(jìn)行，可用的射線有諸如X-射線、紫外光、γ-射線、以至微波。腫瘤細(xì)胞接觸其它的藥劑，也可是通過讓病人服用有治療效力的一定量的藥用組分，包括的化合物有阿霉素，5-氟尿嘧啶，鬼臼亞乙苷，喜樹堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，及更常取的順式鉑氨。這些藥劑可以被制備成類似配合治療組分或試劑盒的方式，并如所描述的與用于治療的表達(dá)構(gòu)建體配合著使用。那些能導(dǎo)致核酸尤其是DNA交連的藥劑也被設(shè)想用于輔助DNA損傷以得到配合本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體的共同的抗腫瘤效果。這樣的藥劑有如順式鉑氨與其它的DNA烷化劑。順式鉑氨不能通過口服吸收，因此必須通過向靜脈、皮下、腫瘤內(nèi)、或腹膜內(nèi)注射來傳輸。其它能損傷DNA的藥劑還包括能干擾DNA復(fù)制、有絲分裂、染色體分離的化合物。這些化療物質(zhì)包括阿霉素，鬼臼亞乙苷，異博定，鬼臼毒素，以及其它類似物。在廣泛的臨床治療腫瘤時(shí)，這些化合物的攝入通過大劑量靜脈注射，劑量可從阿霉素的每隔21天的25-75mg/m2到鬼臼亞乙苷的100mg/m2或通過口服兩倍的該劑量。干擾核苷酸前體合成或可靠性的試劑也能導(dǎo)致DNA的損傷。如此開發(fā)了許多核苷酸的前體。那些已經(jīng)得到廣泛測(cè)試并易于得到的前體尤其有用。這樣的藥劑有如5-氟尿嘧啶(5-FU)，由于腫瘤細(xì)胞偏向于優(yōu)先選擇使用5-FU，使得其特別有利于應(yīng)用到腫瘤細(xì)胞上。盡管5-FU具強(qiáng)毒性，其仍被多方面地應(yīng)用，甚至包括常用的劑量范圍為450-1000mg/m2/天的靜脈攝入。其它廣范應(yīng)用的能引起DNA損傷的因子包括有熟知的諸如γ-射線、X-射線及直接導(dǎo)入放射性同位素到腫瘤細(xì)胞中。還可設(shè)想到的因子有微波、紫外光等。很有可能地，所有這些因子，作用產(chǎn)生廣范圍的DNA,DNA前體，DNA復(fù)制和修復(fù)，以及染色體的組裝和維護(hù)上的損傷。X-射線的照射劑量可從每天50-200倫琴地持續(xù)一段時(shí)間(3到4周)到一次性地照射2000-6000倫琴的劑量。放射性同位素的使用劑量范圍較廣，主要依同位素的半衰期、放射線的種類及強(qiáng)度、及腫瘤細(xì)胞的吸收情況。涉及的技術(shù)可參照“Remington’sPharmaceuticalSciences”，第15版，33章，主要在624-652頁(yè)。使用劑量必須依患者對(duì)象的條件作相應(yīng)的改變。在所有情況中每個(gè)人的服用反應(yīng)容許情況決定了每個(gè)患者的合適劑量。更重要的，應(yīng)用于人體時(shí)，制備物在無菌、熱源性、安全性及純度上要達(dá)到FDA的官方生物標(biāo)準(zhǔn)。向癌癥病人局部導(dǎo)入本發(fā)明的用于治療的表達(dá)構(gòu)建體是導(dǎo)入抗所針對(duì)的臨床疾病的治療有效基因的可優(yōu)先選擇的方法。類似地，化學(xué)和放射治療方法可被導(dǎo)向患者特定的受影響的部位。另外，全身性地導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體及藥劑在某些情況下是合適的，例如當(dāng)已經(jīng)發(fā)生腫瘤的全身擴(kuò)散時(shí)。在基因治療配合化療與放療之外，也可以設(shè)想多基因配合治療的優(yōu)越性。例如，同時(shí)導(dǎo)入p53和p16突變基因能獲得加強(qiáng)的抗癌效果。所有其它腫瘤相關(guān)基因都可設(shè)想用此方式導(dǎo)入，包括有p21,Rb,APC,DCC,NF-1,NF-2,BRCA2,p16,FHIT,WT-1,MEN-1,MEN-Ⅱ,BRCA1,VHL,FCC,MCC,ras,myc,neu,raf,erb,src,fms,jun,trk,ret,gsp,hst,bcl,和abl。8．藥用組合物與攝入路徑本發(fā)明用于治療的組合物可設(shè)想的攝入方式有經(jīng)由體外的，自體內(nèi)的，及體內(nèi)的。因此要依各可能應(yīng)用方式將組合物制備成相應(yīng)合適的藥用組合物。一般地，這要求制備的藥用組合物必須要無熱源物質(zhì)，及其它有可能傷害到人或動(dòng)物的不純物質(zhì)。同樣也會(huì)用到合適的鹽與緩沖液以保持組合物的穩(wěn)定及使目標(biāo)細(xì)胞攝入此組合物。本發(fā)明的組合物包括一定數(shù)量的有效的表達(dá)構(gòu)建體或由病毒載體或脂質(zhì)體攜帶的表達(dá)構(gòu)建體，其溶解或分散于一藥用的可接受的載體或水溶液中。這些組合物也可以通過接種的方式提供。“藥用的”或“藥理上可接受的”是指分子整體及組合物當(dāng)正確地?cái)z入到人或動(dòng)物中時(shí)不會(huì)產(chǎn)生相反有害的、過敏的、或其它不期望的反應(yīng)。本文中“藥理上可接受的載體”包括任何及全部的溶液，分散介質(zhì)，外包衣殼，抗菌及抗真菌藥劑，等滲的和吸收延遲試劑，以及其它類似的載體。本發(fā)明領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都很熟悉這些介質(zhì)及試劑的應(yīng)用。除了那些與活性成分不兼容的常規(guī)介質(zhì)與試劑，將它們用作治療組合物是可預(yù)期的。具有輔助活性的成分也可以加入到組合物中。堿或藥理上可接受的鹽可加入到與表面活性劑，如羥丙基纖維素，適當(dāng)混合的水中以制備活性組合物的溶液。組合物的分散也可在甘油，聚乙二醇液體，其它類似混合物，以及油中進(jìn)行。在常規(guī)條件下保存與使用時(shí)，這些制備物含有抑制劑以抑制微生物的生長(zhǎng)。本發(fā)明所提及的治療組合物還可包括經(jīng)典的主導(dǎo)治療上的藥用制備以及人體攝入。本發(fā)明所提及的治療組合物的攝入可經(jīng)由任何常規(guī)的途徑，只要通過此途徑可到達(dá)目標(biāo)組織或細(xì)胞。這包括經(jīng)由口部，鼻部，頰部，直腸，陰道，和局部的。其它的攝入有同位的、皮內(nèi)的、皮下的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、或靜脈的注射。這些組合物通常以藥用可接受的方式被攝入，包括生理可接受的載體、緩沖液、或其它賦形劑。應(yīng)用于抗腫瘤時(shí)，可設(shè)想直接向腫瘤內(nèi)部注射、或切除過的腫瘤灶、區(qū)域性(例如淋巴的)或全身性地。也可以設(shè)想實(shí)行向病灶，如腫瘤或腫瘤灶，通過導(dǎo)管連續(xù)地灌注上幾小時(shí)到幾天。本發(fā)明的治療組合物利于以水溶液或懸浮液的可注射的方式攝入；也可以制備成適于溶解或懸浮于注射液的固體方式。制備形式也可以為乳濁液。典型地，用于此目的的組合物包括藥用可接受的載體。例如，該組合物可為含大約100mg每毫升的磷酸鹽緩沖液。其它藥用可接受的載體有水溶液，無毒賦形劑，以及鹽，防腐劑，緩沖液，和其它類似物都有可能被用到。非水性的例子有丙二醇，聚乙二醇，蔬菜油，及可注射用的有機(jī)酯如乙基油酸酯。水性載體包括水，乙醇/水溶液，鹽溶液，非腸道用的載體如氯化鈉及林格氏葡萄糖液等。靜脈運(yùn)載載體包括有流質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。防腐劑包括抗生素，抗氧化劑，螯合劑，和隋性氣體。各種藥用組合物的組成的pH值與具體濃度調(diào)整到熟知的常數(shù)。另外也設(shè)想了適合于口部攝入的處方?？诜幏桨私?jīng)典的賦形劑，例如藥用級(jí)的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉鹽，纖維素，碳酸鎂，及其它類似物。組合物的存在形式為溶液、懸溶液、藥片、藥丸、膠囊、持續(xù)釋放的粉劑處方。當(dāng)采取經(jīng)典途徑時(shí)，形式可為乳劑、油膏、藥膏、或噴霧劑。治療藥劑的有效劑量的決定要基于所期望的目標(biāo)，例如(ⅰ)抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增，(ⅱ)除去或殺死腫瘤細(xì)胞，或者(ⅲ)轉(zhuǎn)化一個(gè)短期或長(zhǎng)期表達(dá)的治療基因。術(shù)語(yǔ)“單位劑量”指適于在患者上使用的物理上的分離單位。每一單位含一預(yù)先設(shè)定好的治療組分的數(shù)量，用于計(jì)算產(chǎn)生預(yù)期的反應(yīng)，這些反應(yīng)如上所討論的與攝入方法如合適途徑與主導(dǎo)治療相關(guān)聯(lián)。所需用的量要依據(jù)治療的次數(shù)與單位劑量，也要依據(jù)被治療的患者、患者的狀態(tài)以及期望的結(jié)果。本發(fā)明也設(shè)想了多基因治療的影響。在一實(shí)施例中，一個(gè)編碼一治療基因的載體被用來治療癌癥病人。用于治療癌癥的病毒載體的典型數(shù)量為106-1015PFU/劑(如，106,107,108,109,1010,1011,1012,1013,1014,和1015)，此劑量被分成幾份向固性腫瘤內(nèi)的不同部位注射。治療方式也涉及若干周期地?cái)z入轉(zhuǎn)化基因，間隔期間為3-10周。為得到連續(xù)性治療的益處，更長(zhǎng)時(shí)間地?cái)z入載體也是需要的，持續(xù)時(shí)間可為幾個(gè)月到幾年。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)編碼一治療基因的病毒載體可被用來給人或哺乳動(dòng)物接種。典型地，在本接種實(shí)施例中，人或哺乳動(dòng)物要攝入用于產(chǎn)生預(yù)期效果的一定數(shù)量病毒粒子，以保持轉(zhuǎn)化基因的一長(zhǎng)期表達(dá)，使得宿主能產(chǎn)生免疫反應(yīng)?？深A(yù)期需一系列的注射，例如，用一初級(jí)免疫注射，接著兩次加強(qiáng)免疫注射以使得能足夠誘導(dǎo)一長(zhǎng)期的免疫反應(yīng)。典型的劑量依所期望的結(jié)果可為106到1015PFU/注射。低劑量的抗原通常誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)，而高劑量抗原通常誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。治療組分的精確量也依每個(gè)特定實(shí)踐者進(jìn)行判斷。9．例子以下各具體例子只是用于闡述本發(fā)明，而不是對(duì)權(quán)利要求范圍的限制。例一熱激啟動(dòng)子誘導(dǎo)報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)為研究HSP70啟動(dòng)子誘導(dǎo)基因表達(dá)的能力，將一最小化的HS啟動(dòng)子(熱激，heatshock,HS)或一最小化的CMV啟動(dòng)子插入到一報(bào)導(dǎo)基因的上游區(qū)，報(bào)導(dǎo)基因位于一帶新霉素和青霉素選擇標(biāo)記的質(zhì)粒上。質(zhì)粒M5的堿基設(shè)計(jì)如圖1所示，其在由HSP70所得的啟動(dòng)子的操作位點(diǎn)上含一多克隆位點(diǎn)。M5的構(gòu)建是將pcDNA3.0質(zhì)粒(Invitrogen,Inc.)上的CMV啟動(dòng)子用一最小化的HSP70B啟動(dòng)子(SEQIDNO:1，圖10)替代，是一由人的熱激蛋白70B(HSP70B)啟動(dòng)子得到的長(zhǎng)0.4kb片段(HindⅢ-BamHⅠ)，自StressGen,Inc.處得到。HS和CMV啟動(dòng)子的活性通過其隨S8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人的癌細(xì)胞，人乳腺癌細(xì)胞MCF7與前列腺癌細(xì)胞DU145來判定。S8質(zhì)粒由M5載體(見圖1)衍生得，含有連接到編碼加強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EnhancedGreenFluorescenceProtein,EGFP)的HSP70B最小化啟動(dòng)子。S8的構(gòu)建是將pEGFP-1質(zhì)粒(Clonetech,Inc.)上的EGFP基因插入到M5上的多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite,MCS)。細(xì)胞培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染用如上所述的S8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人的DU-145前列腺癌衍生細(xì)胞與MCF-7乳腺癌衍生細(xì)胞。為分離到S8轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)基用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染。含有整合質(zhì)粒的細(xì)胞以其能在新霉素存在下生長(zhǎng)的能力被篩選出來。熱激通過將培養(yǎng)瓶完全浸沒到水浴控制器中(±0.1℃)中來實(shí)現(xiàn)。用遺傳霉素自MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染中篩選得一陽(yáng)性克隆，克隆4，和一多克隆系。自DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染中篩選得一多克隆系。(每一例中，細(xì)胞用遺傳霉素篩選2周)篩選得的細(xì)胞系用FACS分析與篩選。陽(yáng)性細(xì)胞系的分離在熱激反應(yīng)下表達(dá)高水平EGFP的細(xì)胞通過用傳統(tǒng)的系列稀釋法與熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)得到。用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)定量EGFP的表達(dá)。強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)在490nm處被激活，使得其能在熒光顯微鏡下被觀察或用FACS分析。表達(dá)EGFP的細(xì)胞與不表達(dá)EGFP的細(xì)胞用FACS法分選。這步驟是對(duì)遺傳霉素篩選得的細(xì)胞系進(jìn)行。必須這樣做的理由是，在一多克隆細(xì)胞系中，有一部分是S8質(zhì)粒會(huì)以一種干擾報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的方式被整合。排除這部分經(jīng)分選的細(xì)胞，只留下純的陽(yáng)性部分用于進(jìn)一步分析。如圖2所示，用含最小化熱激啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP質(zhì)粒(S8)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的DU-145細(xì)胞在37℃中生長(zhǎng)時(shí)，平均熒光量為近似10相對(duì)熒光單位。當(dāng)細(xì)胞暴露于42℃熱激1小時(shí)的4小時(shí)后，平均相對(duì)熒光有7-9倍的提高。相應(yīng)的基因表達(dá)同時(shí)可由測(cè)量穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相對(duì)熒光變化所定量。用FACS法分選S8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞如圖3所示。動(dòng)力學(xué)研究高溫暴露存活研究被用來得到加熱MCF7細(xì)胞而不引起細(xì)胞大量死亡的最適的時(shí)間/溫度。在40℃與42℃下，長(zhǎng)到1小時(shí)時(shí)細(xì)胞死亡僅為可忽略的小于3％。在44℃時(shí)，僅需30分幾乎50％的細(xì)胞就已經(jīng)死亡。使用如上的最適存活時(shí)間，進(jìn)行了初步的動(dòng)力學(xué)研究。用FACS法檢測(cè)，在40℃和42℃下熱激轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞1小時(shí)，熱激1小時(shí)比僅30分可產(chǎn)生更多的EGFP。細(xì)胞熱激后的最適的恢復(fù)時(shí)間為4小時(shí)。增加任意的恢復(fù)時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致EGFP表達(dá)水平的提高。在44℃熱激30分后，要更長(zhǎng)的8小時(shí)以達(dá)最高的恢復(fù)。不同細(xì)胞系在37℃-44℃下EGFP的表達(dá)以下所用的熱激/恢復(fù)時(shí)間與動(dòng)力學(xué)研究中的相同，用以檢測(cè)在所有由發(fā)明組轉(zhuǎn)染得的細(xì)胞系中HSP70-衍生啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP的可誘導(dǎo)性。40℃-1小時(shí)熱激，4小時(shí)恢復(fù)42℃-1小時(shí)熱激，4小時(shí)恢復(fù)44℃-30分熱激，8小時(shí)恢復(fù)應(yīng)用這些溫度與時(shí)間，檢測(cè)了以下細(xì)胞系的EGFP的表達(dá)。MCF7源自乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞系。DU145源自前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞系。MCF7-S8-PS8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞，多克隆細(xì)胞系。MCF7-S8-PS1經(jīng)FACS分選EGFP表達(dá)一次的MCF7-S8-P細(xì)胞系。MCF7-S8-PS2經(jīng)FACS再分選EGFP表達(dá)的MCF7-S8-P1細(xì)胞系。MCF7-S8-4MCF7S8轉(zhuǎn)染的克隆4。MCF7-S8-4S1分選一次用于EGFP表達(dá)的MCF7-S8-4細(xì)胞系。DU145-S8-PS8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DU145細(xì)胞，多克隆細(xì)胞系。用HSP70衍生啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的表達(dá)數(shù)據(jù)如圖4所示。當(dāng)溫度提高時(shí)相應(yīng)的EGFP含量也得到提高。這些數(shù)據(jù)表明發(fā)明組的熱激啟動(dòng)子的確對(duì)熱激有反應(yīng)。雖然，在37℃時(shí)也仍有EGFP的表達(dá)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DU-145細(xì)胞熱激后EGFP的表達(dá)內(nèi)源熱激啟動(dòng)子的誘導(dǎo)是暫時(shí)性的而且是溫度相關(guān)的。當(dāng)用最小化熱激啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的并經(jīng)FACS兩次篩選的DU-145細(xì)胞(DU-145-PS2細(xì)胞)用一系列不同時(shí)間和溫度熱激后，報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)是溫度依賴的，并只是暫時(shí)性地在誘導(dǎo)壓后維持15-24小時(shí)的最大表達(dá)(圖5)。這些結(jié)果表明，此啟動(dòng)子只是在此處用到的條件下短暫地保持激活，而且EGFP是不穩(wěn)定的，細(xì)胞中的熒光在15-24小時(shí)后開始降低。在40℃熱激1小時(shí)或2小時(shí)后最小化的熱激啟動(dòng)子的活性暫時(shí)性地增加了近似3倍。在42℃熱激1或2小時(shí)后啟動(dòng)子活性分別增加了13和25倍。HS啟動(dòng)子與CMV啟動(dòng)子控制下的EGFP表達(dá)比較圖6的數(shù)據(jù)表明在DU-S8-PS2細(xì)胞中最小化的熱激啟動(dòng)子的活性在37-43℃范圍內(nèi)是依溫度變化而變化的。相比較下，用V9質(zhì)粒，用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)的載體(圖7)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DU-145細(xì)胞，具有比用最小化熱激啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染并在43℃下熱激誘導(dǎo)的相同細(xì)胞高出50％的啟動(dòng)子活性。CMV啟動(dòng)子的活性在這些細(xì)胞中顯然不受溫度的影響。最小化的HS啟動(dòng)子的溫度依賴性并不是對(duì)DU-145細(xì)胞所特有的。例二用一構(gòu)建體中的HIV啟動(dòng)子與tat擴(kuò)增IL-2的表達(dá)初始化擴(kuò)增研究此處進(jìn)行了涉及新的能擴(kuò)增治療基因表達(dá)的構(gòu)建體的研究。為闡明擴(kuò)增子的原理，構(gòu)建了幾個(gè)構(gòu)建體。構(gòu)建體在熱激可誘導(dǎo)啟動(dòng)子外還包含一組成性啟動(dòng)子，一CMV啟動(dòng)子。這些構(gòu)建體被記為質(zhì)粒L-27,X14,RR13,Y15與SS10。下表3顯示了每一質(zhì)粒所帶的啟動(dòng)子/基因以及IL-2的表達(dá)量。其中的四個(gè)質(zhì)粒是由一個(gè)含有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒衍生得到。在這四個(gè)質(zhì)粒中，CMV啟動(dòng)子被插入到tat基因或一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)的上游區(qū)，以及將HIV1與HIV2其一的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTRs)插入到鼠干擾素-2基因(IL-2)的上游區(qū)。質(zhì)粒X14與Y15的結(jié)構(gòu)如圖9A與9B所示。L-27質(zhì)粒用作參照物。用IL-2EASIA試劑盒(MedgenixDiagnostics,Fleurus,Belgium)通過用ELISA檢測(cè)組織培養(yǎng)上清的方法來測(cè)量IL-2含量。試劑盒的靈敏度預(yù)估為0.1IUIL-2/ml。在本研究中，用Dosper脂來轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞(參見例三中的轉(zhuǎn)染方案，見后)。表3從本研究可以看出完整的擴(kuò)增構(gòu)建體能夠提高CMV啟動(dòng)子后基因的表達(dá)。同時(shí)反式激活因子TAT蛋白的表達(dá)也是提高表達(dá)所必需的。例三可熱激誘導(dǎo)的擴(kuò)增子載體構(gòu)建為判斷第二個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)用是否能提高最小化的熱激啟動(dòng)子的活性，用一系列不同的載體暫時(shí)性地轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，載體包括pC8,pf12，與p007(圖8與圖9)。通過應(yīng)用一含兩個(gè)多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒，最小化的熱激啟動(dòng)子被插入到tat基因或一多克隆細(xì)胞位點(diǎn)的上游區(qū)，及將HIV1或HIV2的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTRs)插入到鼠干擾素-2(IL-2)基因的上游區(qū)。每個(gè)質(zhì)粒同時(shí)帶有新霉素與氨芐青霉素選擇標(biāo)記。首先將自質(zhì)粒C5上切出的含干擾素-2(IL-2)編碼區(qū)(見GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)文件，no.577834)的長(zhǎng)0.5kb的EcoRⅠ片段插入到M5載體(參見上文例一所述之例)的EcoRⅠ位點(diǎn)中得質(zhì)粒f11。質(zhì)粒C8的構(gòu)建是將自質(zhì)粒B4527(參見Tsang等，Biotechniques20:51-52,1996與Tsang等，Biotechniques22:68,1997，二者在本文中列于參考文獻(xiàn)中)MCS位點(diǎn)上游區(qū)切出的一含0.4kb長(zhǎng)的HSP70B片段的長(zhǎng)為1kb的BamHⅠ片段插入到質(zhì)粒DNP-1(Tsang等,1996,與Tsang等,1997)上的BamHⅠ位點(diǎn)中，DNP-1上的IL-2編碼區(qū)上游含有HIV1的LTR序列。接著將含HIVtat基因的0.4kb長(zhǎng)NotⅠ片段播入到C8上的NotⅠ位點(diǎn)得載體fl2(圖9)。中介載體D10的構(gòu)建是將一含最小化HSP70B啟動(dòng)子的1kb長(zhǎng)的BamHⅠ片段插入到質(zhì)粒MNP-7(Tsang等，1996與Tsang等，1997)，MNP-7上IL-2編碼區(qū)的上游帶有HIV2的LTR序列。質(zhì)粒007(圖9)的構(gòu)建是將一編碼tat基因的0.4kb長(zhǎng)的NotⅠ片段插入到D10的NotⅠ位點(diǎn)中。轉(zhuǎn)染方案轉(zhuǎn)染過程依照一已發(fā)表的方案(Stopeck等，CancerGeneTherapy,5:119-126,1998)。MCF-7細(xì)胞被放于一6孔或12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。第二天，細(xì)胞用Hanks鹽緩沖溶液漂洗后加入1ml轉(zhuǎn)染液。轉(zhuǎn)染液為含質(zhì)量比為4∶1的脂與DNA的無血清OptiMEM(來自GibcoBRL)，脂為Dosper(1,3-雙-油羧基-2-(6-羧基-精團(tuán)基)-丙基酰胺，來自BoehringerMannheim)或DmrieC(1,2-雙十四烷氧基丙基-3-雙甲基-羥基溴化乙基銨，來自GibcoBRL)，質(zhì)粒DNA為1.25μg或2.5μg。立即向每孔中加入牛胎盤血清(FBS)到終濃度10％(體積/體積)。經(jīng)檢測(cè)DmrieC要優(yōu)于Dosper。細(xì)胞在檢測(cè)IL-2含量之前要在熱激前培養(yǎng)24小時(shí)與熱激后24小時(shí)。熱誘導(dǎo)的擴(kuò)增研究在一套實(shí)驗(yàn)中，分析了pC8,pf12，或p007質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的IL-2表達(dá)活性。IL-2的量通過使用IL-2EASIA試劑盒(MedgenixDiagnostics,Belgium)用ELISA法檢測(cè)組織培養(yǎng)上清得到。試劑盒的靈敏度預(yù)估為0.1IUIL-2/ml。從此套實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)如下表四所示。此表顯示了MCF7細(xì)胞中IL-2的表達(dá)水平，MCF7細(xì)胞用Dosper轉(zhuǎn)染后加熱24小時(shí)，在轉(zhuǎn)染的49小時(shí)后再用ELISA分析。質(zhì)粒L-27(用于作為CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的IL-2表達(dá)的參照質(zhì)粒)，007,f12，和C8都被檢測(cè)了。表4從此研究中可以看出pf12對(duì)熱激有反應(yīng)，并且產(chǎn)生的熱激擴(kuò)增子構(gòu)建的IL-2比pC8或pL-27產(chǎn)生的多得多。在37℃下，pf12比CMV驅(qū)動(dòng)的參照質(zhì)粒，L-27，多產(chǎn)生5倍的IL-2。當(dāng)細(xì)胞在39℃下熱激過夜，pf12比37℃的CMV驅(qū)動(dòng)對(duì)照多表達(dá)7倍的IL-2。在41℃或42℃下熱激處理1小時(shí)，能使擴(kuò)增子構(gòu)建體的表達(dá)相較CMV驅(qū)動(dòng)載體在37℃下的表達(dá)有多達(dá)26倍的提高。(p007質(zhì)粒在37℃時(shí)已幾乎達(dá)其最大的活性，因此熱激并不能顯著地提高表達(dá)量)。pf12在37℃時(shí)也處于一個(gè)高水平的活性狀態(tài)。這些結(jié)果表明擴(kuò)增子的方案在大約37℃與大約42℃間能提高基因表達(dá)的水平。在另一套不同的實(shí)驗(yàn)中，通過用一攜帶上游為CMV啟動(dòng)子的β-半乳糖苷酶基因的控制質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法，闡明了轉(zhuǎn)染有效體中的變化。這些實(shí)驗(yàn)的一般方案為，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再培養(yǎng)24小時(shí)后熱激培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基并培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)量IL-2的表達(dá)水平。如下表5所示，CMV啟動(dòng)的活性僅受到熱激的很小影響。最小化的熱激啟動(dòng)子在細(xì)胞保持在37℃時(shí)僅有非常低的活性，42℃熱激后能誘導(dǎo)到20倍的提高。如在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中所見，最小化的熱激啟動(dòng)子的活性僅有CMV啟動(dòng)子的一半。表5干擾素-2(IL-2)表達(dá)量*載體啟動(dòng)子37℃42℃**提高倍數(shù)(42/37)相對(duì)比率***L27CMV-IL282.693.41.11.0C8HSP-MCS84.770.60.81.9HIV1-IL2f11HSP-IL22.354.023.70.4(1)f12HSP-TAT107.6347.43.26.9(17)HIV1-IL2007HSP-TAT747.51642.92.283.3(208)HIV2-IL2*數(shù)值表示24小時(shí)中產(chǎn)生的每mg細(xì)胞蛋白中IL-2量，以IU為單位**熱激1小時(shí)***基于42℃的數(shù)值，CMV-β-gal共轉(zhuǎn)染HIV1啟動(dòng)子在無tat表達(dá)時(shí)，類似于CMV啟動(dòng)子并且?guī)缀醪皇軣峒び绊?。但是?dāng)最小化的熱激啟動(dòng)子被用來表達(dá)tat時(shí)，報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)在42℃熱激后急劇地提高。當(dāng)暫時(shí)性地用熱激啟動(dòng)子/tat與HIV1/IL-2轉(zhuǎn)染時(shí)，IL-2的表達(dá)與用熱激啟動(dòng)子/MCS與HIV1/IL-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在37℃培養(yǎng)時(shí)類似。這個(gè)活性在42℃熱激后，相對(duì)自身提高了超過3倍并且?guī)缀踹_(dá)到CMV啟動(dòng)子的7倍多。HS啟動(dòng)子/tat與HIV/IL-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞維持在37℃時(shí)或42℃熱激后都顯示了實(shí)質(zhì)性的報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)。以IL-2作度量的相對(duì)啟動(dòng)子活性比CMV啟動(dòng)單獨(dú)存在時(shí)高出80多倍。溫度調(diào)控有所降低，42℃熱后報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)是同一細(xì)胞維持37℃培養(yǎng)表達(dá)量的近似2倍。溫度依賴的報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)不受第二個(gè)啟動(dòng)子存在的影響。如下表六所示，在用含最小化熱激啟動(dòng)子/tat與HIV2/IL-2的質(zhì)粒暫時(shí)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)，在37℃到44℃間以一種溫度依賴型的方式提高。這些結(jié)果在數(shù)值上與在圖4與圖6中所見的僅用最小化熱激啟動(dòng)子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的數(shù)值相似。表6IL-2表達(dá)量(IU/ml)*載體啟動(dòng)子37℃39℃40℃41℃42℃44℃C8HSP-MCS7.29.36.04.85.37.0HIV1-IL2f12HSP-TAT40.6------133.1--HIV1-IL2007HSP-TAT224222230250375470HIV2-IL2用所示載體暫時(shí)性轉(zhuǎn)染MCF7乳腺癌細(xì)胞；24小時(shí)后熱激1小時(shí)；熱激后24小時(shí)收集培養(yǎng)基并檢測(cè)IL2例四動(dòng)物體研究在組織學(xué)上的特征與轉(zhuǎn)移潛能上類似于人腫瘤的人類癌癥的鼠模型，可以用本發(fā)明所提供的治療組合物來治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用報(bào)導(dǎo)構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人腫瘤細(xì)胞注射SCID小鼠，報(bào)導(dǎo)構(gòu)建體含HSP70B啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的TAT以及HIV-1或HIV-2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的EGFP或IL-2。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到合適的可檢測(cè)的大小時(shí)，如直徑1cm，用超聲加熱腫瘤到溫度42℃。在熱激后的不同時(shí)間定量基因的表達(dá)，方法為切除腫瘤制備組織切片，檢測(cè)來自EGFP的熒光，或者用ELISA法檢測(cè)腫瘤組織中的IL-2水平。應(yīng)用本發(fā)明的另一實(shí)施例，人腫瘤細(xì)胞被注射到SCID小鼠中。腫瘤生長(zhǎng)到合適的可檢測(cè)的大小時(shí)注射DNA-脂復(fù)合物。用超聲熱激腫瘤，熱激后檢測(cè)基因表達(dá)。治療的有效性由腫瘤尺寸的減小，轉(zhuǎn)移活性的降低，細(xì)胞擴(kuò)增的降低以及腫瘤生長(zhǎng)的中止表明，作為攝入本發(fā)明治療組合物的效果。在不違背本發(fā)明范圍與精神的情況下，本發(fā)明領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可得到本發(fā)明的各種修飾體與變體。盡管本發(fā)明在描述時(shí)與一些特定的參考實(shí)施例相聯(lián)系，應(yīng)該理解本發(fā)明的權(quán)利要求不應(yīng)被限制于這些特定的實(shí)施例中。實(shí)際上，所描述的實(shí)現(xiàn)此發(fā)明的各種方式顯然囊括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。序列表&lt;110&gt;Tsang,TomGerner,EugeneW.Harris,DavidT.Hersh,Evan&lt;120&gt;用于基因治療的高溫誘導(dǎo)表達(dá)載體及其使用方法&lt;130&gt;15907-0016&lt;140&gt;&lt;141&gt;&lt;150&gt;US60/064,088&lt;151&gt;1997-11-03&lt;160&gt;1&lt;170&gt;PatentInVer.2.0&lt;210&gt;1&lt;211&gt;469&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;Homosapiens&lt;400&gt;1ggatcctccacagccccggggagaccttgcctctaaagttgctgcttttgcagctctgcc60acaaccgcgcgtcctcagagccagccggcaggagctagaaccttccccgcgtttctttca120gcagccctgagtcagaggcgggctggccttgcaagtagccccccagccttcttcggtctc180acggaccgatccgcccgaaccttctcccggggtcagcgccgcgctgcgccgcccggctga240ctcagcccgggcgggcgggcgggaggctctcgactgggcgggaaggtgcgggaaggttcg300cggcggcggggtcggggagagaaaccgcagggagagcctcactgctgagcgcccctcgac420gcgggcggcagcagcctccgtggcctccagcatccgacaagaagcttac469權(quán)利要求1．一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效表達(dá)所選多聚核苷酸的方法，其特征在于所述方法包括(a)提供一種表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體包括(ⅰ)適當(dāng)?shù)剡B接到編碼反式激活因子的基因的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；以及(ⅱ)適當(dāng)?shù)剡B接到所述所選多聚核苷酸的第二個(gè)啟動(dòng)子，其中，該第二啟動(dòng)子由所述反式激活因子激活；(b)導(dǎo)入所述表達(dá)構(gòu)建體到所述細(xì)胞中；以及(c)將該細(xì)胞放置于能激活所述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的條件中，其中，所述條件導(dǎo)致所述所選多聚核苷酸的表達(dá)。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子為熱激啟動(dòng)子，并且激活該啟動(dòng)的條件為高溫條件。3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征還在于所述高溫條件包括所述細(xì)胞的大約的基礎(chǔ)溫度到大約42℃之間的溫度。4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征還在于所述高溫條件包含大約37℃與大約42℃間的溫度。5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征還在于所述高溫條件包含大約38℃與大約41℃間的溫度。6．根據(jù)權(quán)利要求5所進(jìn)的方法，其特征還在于所連高溫條件包含大約39℃與大約40℃間的溫度。7．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征還在于所述的熱激啟動(dòng)子由HSP70,HSP90,HSP60,HSP27,HSP72,HSP73,HSP25，泛素，與HSP28啟動(dòng)子之一所衍生得到。8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括低氧反應(yīng)元素。9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述的第二啟動(dòng)子選自HIV-1啟動(dòng)子與HIV-2啟動(dòng)子之一，并且所述的反式作用因子為tat。10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于其中所述的多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生一多肽、蛋白質(zhì)、核酶，或是一段反義核苷酸。11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述所選多聚核苷酸對(duì)蛋白編碼，該蛋白選自含鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白，p53,p16,neu,IL1,IL2,IL4,IL7,IL12,IL15,FLT-3配體,GM-CSF,G-CSF,IFNγ,IFNα,TNF,HSV-TK,I-CAM1,HLA-B7，與TIMP-3之一。12．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述的表達(dá)構(gòu)建體還包括編碼選擇標(biāo)記的基因。13．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述的表達(dá)構(gòu)建體還包括(ⅰ)適當(dāng)?shù)剡B接到所述第二啟動(dòng)子上的第二個(gè)所選多聚核苷酸；以及(ⅱ)位于所述第一所選多聚核苷酸與第二所選多聚核苷酸間的內(nèi)部核糖體識(shí)別位點(diǎn)。14．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。15．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于，其中，將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到所述細(xì)胞中是由以下傳輸載體之一所介導(dǎo)脂質(zhì)體，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，雀痘病毒，單純皰疹病毒，和牛痘病毒。16．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于，其中，將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到所述細(xì)胞中是在體外進(jìn)行。17．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于，其中，將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到所述細(xì)胞中是在體內(nèi)進(jìn)行。18．一種提供所選多聚核苷酸的具治療有效劑量的表達(dá)產(chǎn)物的方法，包括(a)提供第一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其合適地連接到一個(gè)編碼反式激活因子的基因上；(b)提供第二個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，該第二個(gè)表達(dá)構(gòu)建體包括第二個(gè)啟動(dòng)子，其合適地連接到所述的所選多聚核苷酸，其中，該第二啟動(dòng)子由所述反式激活因子激活；(c)將所述第一與第二表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到被治療對(duì)象中；以及(d)將所述細(xì)胞置于能激活所述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的條件，其中，該條件能誘導(dǎo)所述所選多聚核苷酸的表達(dá)。19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征還在于所述的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子為熱激啟動(dòng)子，并且激活該可誘導(dǎo)啟動(dòng)的條件包括從大約的基礎(chǔ)溫度到大約42℃之間。20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征還在于所述的第一與第二表達(dá)構(gòu)建體位于同一載體上。21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征還在于，其中，采用來自體內(nèi)的方法將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到所述細(xì)胞中。22．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征還在于，其中將所述表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到所述細(xì)胞中是在體內(nèi)進(jìn)行。23．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征還在于，其中所述所選多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)某一病原體有傷害作用，其中，該病原體包括病毒，細(xì)菌，真菌，與寄生蟲。24．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征還在于，其中所述所選多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物能抑制所述細(xì)胞的生長(zhǎng)。25．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征還在于，其中所述所選多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物能替代缺陷蛋白。26．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征還在于，其中所述所選多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生。27．治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，其特征在于包括如下步驟(a)提供表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體包括(ⅰ)合適地連接到編碼反式激活因子的基因的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子上；及(ⅱ)合適地連接到所選多聚核苷酸上的第二啟動(dòng)子，其中，該第二啟動(dòng)子由所述反式激活因子激活；(b)將該表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中；以及(c)將該腫瘤細(xì)胞置于能激活所述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的條件中，此處該條件導(dǎo)致所述所選多聚核苷酸的表達(dá)并且所選多聚核苷酸表達(dá)產(chǎn)物的量足夠有效地抑制該腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征還在于其中所述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子為熱激啟動(dòng)子并且激活該可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的條件為高溫條件，包括大約的基礎(chǔ)溫度到大約42℃之間的溫度。29．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征還在于進(jìn)一步包括用至少一種已建立的治療癌癥的方法來治療所述腫瘤細(xì)胞，所述方法選自外部射線束治療，內(nèi)置放射源，化療，及外科方法之30．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征還在于進(jìn)一步包括(d)在將所述腫瘤細(xì)胞置于高溫條件下后用射線保護(hù)器WR-33278或WR-1065治療該細(xì)胞；以及(e)在最后一步，用放射治療法治療所述腫瘤細(xì)胞，其中所述的所選多聚核苷酸對(duì)鳥氨酸脫羧酶抗酶蛋白進(jìn)行編碼。31．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征還在于其中所述哺乳動(dòng)物包括人類。32．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征還在于所述癌癥選自以下部位的癌癥大腦，肺，肝，膀胱，脾，腎，淋巴結(jié)，小腸，胰，血細(xì)胞，直腸，胃，乳腺，子宮，前列腺，睪丸，卵巢，皮膚，陰門，子宮頸，頭頸部，食道，骨髓，以及血液。33．一種在哺乳動(dòng)物中刺激某一免疫反應(yīng)的方法，其特征還在于包括(a)提供表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體包括(ⅰ)合適地連接到編碼反式激活因子基因上的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；與(ⅱ)合適地連接到一所選多聚核苷酸上的第二啟動(dòng)子，其中，該第二啟動(dòng)子由所述反式激活因子激活；(b)將該表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到一哺乳動(dòng)物細(xì)胞中；及(c)將該細(xì)胞放置于能激活所述可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的條件中，所述的條件導(dǎo)致所述所選多聚核苷酸的表達(dá)，并且產(chǎn)物的表達(dá)量足夠有效地在該哺乳動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)選自體液免疫反應(yīng)與細(xì)胞免疫反應(yīng)之一。34．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征還在于所述的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子為熱激啟動(dòng)子并且激活該啟動(dòng)子的條件為高溫條件，包括大約的基礎(chǔ)溫度到大約42℃之間的溫度。35．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征還在于所述的免疫反應(yīng)目的是抗所述細(xì)胞。36．根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征還在于進(jìn)一步包括用至少一種已建立的治療癌癥的方法來治療所述細(xì)胞，方法由選自化療，外部射線束治療，內(nèi)置放射源，及外科方法。37．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征還在于所述的哺乳動(dòng)物為人類。38．一種改變哺乳動(dòng)物基因材料的方法，其特征還在于包括(a)提供表達(dá)構(gòu)建體，該表達(dá)構(gòu)建體含有(ⅰ)合適地連接到編碼反式激活因子基因上的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；與(ⅱ)合適地連接到一所選多聚核苷酸上的第二啟動(dòng)子，其中，該第二啟動(dòng)子由所述反式激活因子激活；(b)將該表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到一哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。39．一種表達(dá)構(gòu)建體包括(a)編碼反式激活因子的基因；(b)合適地連接到該基因上的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子；(c)選出的多聚核苷酸；以及(d)合適地連接到所述所選的多聚核苷酸上的第二啟動(dòng)子，該第二啟動(dòng)子由所述反式激活因子激活。40．根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)構(gòu)建體，其特征還在于所述的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子為熱激啟動(dòng)子并且所述所選的多聚核苷酸的表達(dá)由高溫條件所誘導(dǎo)，該高溫條件包括大約基礎(chǔ)溫度到大約42℃之間的溫度。41．根據(jù)權(quán)利要求40所述的表達(dá)構(gòu)建體，其特征還在于所述的熱激啟動(dòng)子由HSP70,HSP90,HSP60,HSP27,HSP72,HSP73,HSP25，泛素，與HSP28啟動(dòng)子之一所衍生獲得。42．根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)構(gòu)建體，其特征還在于所述的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子包含低氧反應(yīng)元素。43．根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)構(gòu)建體，其特征還在于所述的第二啟動(dòng)子選自HIV-1啟動(dòng)子與HIV-2啟動(dòng)子，并且所述的反式作用因子選自tat。44．根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的多聚核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生多肽、蛋白質(zhì)、核酶，或是一段反義核苷酸。45．根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)構(gòu)建體，其特征還在于所述的表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包括(ⅰ)合適地連接到所述第二啟動(dòng)子上的第二個(gè)選定的多聚核苷酸；以及(ⅱ)位于所述第一與第二所選多聚核苷酸間的內(nèi)部核糖體識(shí)別位點(diǎn)。46．一種包含如權(quán)利要求39所述的表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明提供了在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的方法和組合物。提供了使用可誘導(dǎo)擴(kuò)增系統(tǒng)來驅(qū)動(dòng)治療基因或其它所關(guān)注的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的基因的表達(dá)構(gòu)建體以及相應(yīng)的方法。在生理性條件下的高層次上的轉(zhuǎn)基因的可誘導(dǎo)表達(dá)來自于相對(duì)于宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)溫度的高溫條件下的誘導(dǎo)。文檔編號(hào)A61P35/00GK1299411SQ9881275公開日2001年6月13日申請(qǐng)日期1998年11月3日優(yōu)先權(quán)日1997年11月3日發(fā)明者湯姆·昌,尤金·W·格爾納,大衛(wèi)·T·哈里斯,伊萬·赫什申請(qǐng)人:亞利桑那董事會(huì)(代表亞利桑那大學(xué))