專利名稱：抗腫瘤劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到以1，5-D-脫水果糖和/或子囊吡喃酮(ascopyrone)作為有效成分的抗腫瘤劑。
背景技術(shù)：
1，5-D-脫水果糖(以下有時略為1，5-AF)可以利用某種子囊菌和紅藻含有的酶α-1，4-葡聚糖裂合酶以淀粉或淀粉分解物作為底物生產(chǎn)。1，5-D-脫水果糖是具有由葡萄糖脫去一個水分子的特異結(jié)構(gòu)的糖。到目前為止，已有報道稱該物質(zhì)具有抗氧化活性(參照特表平9-505988號公報)和抗菌活性(參照特開2001-89377號公報)。另外，在最近的研究中，也有報道稱還具有抑制高血糖作用(參照特表2003-519660號公報)，作為具有生理活性的新的糖引人注目。
據(jù)報道子囊吡喃酮可以通過酶反應(yīng)由1，5-D-脫水果糖制備(參照WO 03/38084、WO 03/38085和WO 03/38107)。已知原來子囊吡喃酮是一種子囊菌生物合成的(參照M.A.Baute.，phytochemistry，33，(1991)41-45)，也有報道說可以使盤菌目(Pezizales)，例如Picaria leiocarpa和Anthracobia melaloma以及塊菌目(Tuberales)，例如Tuber melanosporum的菌體提取液作用于1，5-D-脫水果糖制備。
子囊吡喃酮P(2-羥甲基-5-羥基-2，3-二氫-4H-吡喃-4-酮)于1978和1981年，被美國的科學研究小組通過對支鏈淀粉、直鏈淀粉和纖維素進行熱分解制備出，其目的是將子囊吡喃酮P作為有機合成的起始物質(zhì)使用(參照Shafizadeh，F(xiàn).，et al.，Carbohydr.Res.，67，(1978)433-447和Stevenson，F(xiàn).，et al.，Carbohydr.Res.，90，(1981)319-325)。
據(jù)報道子囊吡喃酮P(以下有時略為APP)與1，5-D-脫水果糖同樣具有抗氧化活性、抗菌活性(參照WO 02/26060、WO 02/26061和WO 00/56838)。
現(xiàn)在，臨床使用的很多抗腫瘤劑在化學性質(zhì)上具有促進氧化作用，并發(fā)副作用，例如肝損傷、腎損傷、骨髓抑制、肺損傷等的危險性高。與此相反，1，5-D-脫水果糖和子囊吡喃酮由于具有抗氧化活性、還抑制炎癥細胞的活化(活性氧產(chǎn)生)，認為可以使博萊霉素、順鉑等抗腫瘤劑中看到的那樣的炎癥性組織損傷減弱。因此，可以預(yù)期在與其它抗腫瘤劑并用中，可應(yīng)用于不僅能期待增強抗腫瘤效果，而且會減輕副作用的化療法輔助藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供1，5-D-脫水果糖和/或子囊吡喃酮在為了抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中的使用。
本發(fā)明的其他目的在于提供以1，5-D-脫水果糖和/或子囊吡喃酮作為活性成分，預(yù)期可抑制炎癥的預(yù)后好的抗腫瘤劑。
本發(fā)明的另外的其他目的和優(yōu)點可通過以下的說明來理解。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點通過特征為含有1，5-D-脫水果糖和/或子囊吡喃酮的抗腫瘤劑可以達到。
在本發(fā)明中，所謂“抗腫瘤”是包含抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移作用的概念。
即，通過將適量的本發(fā)明藥劑以適當?shù)姆椒ńo予生物體內(nèi)保有腫瘤細胞的個體，可以有意義地抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。
作為本發(fā)明的子囊吡喃酮，可舉出如通過來自子囊菌(Ascomycetes)的1，5-D-脫水果糖脫水酶生成的1，5-D-脫水果糖的脫水產(chǎn)物、或通過對1，5-D-脫水果糖在堿性條件下進行處理，或?qū)嵤┘訜崽幚砩傻哪菢油ㄟ^化學或物理操作得到的1，5-D-脫水果糖的脫水生成物。作為子囊吡喃酮的例子，

圖1給出了幾個結(jié)構(gòu)式。
本發(fā)明的制劑可以使用該領(lǐng)域眾所周知的各種方法給予，給予量、給予部位、給予的間隔、期間等可以考慮了患者的年齡或體重、病狀或與其它制劑或治療法并用時的情況之后決定。
作為給予方法，例如可以通過注射或點滴等經(jīng)靜脈內(nèi)或皮下、腹腔內(nèi)、或口服給予，沒有特別限制。
另外，將本發(fā)明的制劑可以做成添加到食品，經(jīng)攝取該食品后進入體內(nèi)的形態(tài)。
給予量根據(jù)給予方法、給予間隔、腫瘤的種類和患者的病危程度不同而有所不同，例如，子囊吡喃酮一次的給予量可以為0.000001μg/kg～1,000mg/kg、優(yōu)選0.001μg/kg～500mg/kg，另外，1，5-D-脫水果糖一次的給予量可以為0.001μg/kg～10,000mg/kg、優(yōu)選0.01mg/kg～1,000mg/kg。
另外，也可以將一次的給予量分數(shù)次給予。
作為本發(fā)明的制劑的形態(tài)，可舉出如錠劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、栓劑、注射劑、透皮吸收劑等，沒有特別限制。另外，本發(fā)明的制劑在調(diào)制制劑時也可以含有例如制劑載體或賦形劑、穩(wěn)定劑等必要成分。另外，只要促進本發(fā)明的效果，也可以含有其它的抗腫瘤劑或其它的藥理成分或葡萄糖等營養(yǎng)成分。
以下，對于本發(fā)明的研究結(jié)果進行詳細敘述。而在以下的試驗中，1，5-D-脫水果糖和子囊吡喃酮使用根據(jù)眾所周知的方法制備的產(chǎn)品。
試驗例細胞株和培養(yǎng)方法將附著性癌細胞株C57 BL/6小鼠黑色素瘤細胞株(B16melanoma)、人肺腺癌細胞株(A549)、來自人角化細胞的腫瘤樣細胞株(HaCaT)、人子宮頸部癌細胞株(HeLa)于添加了10％FCS(胎牛血清)和2％盤尼西林/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、CO2濃度5％的條件下進行培養(yǎng)。懸浮系腫瘤細胞THP-1(前骨髓性白血病細胞株)于含有10％FCS(胎牛血清)和2％盤尼西林/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、CO2濃度5％的條件下進行培養(yǎng)。
活細胞數(shù)的測定方法將在6孔板上增殖的B16黑色素瘤(melanoma)細胞用2％戊二醛固定后，用4％結(jié)晶紫染色，將具有染色性的細胞判定為活細胞。
死細胞的比例以及處于各個細胞周期的細胞比例的測定方法用各種濃度的子囊吡喃酮P溶液(將子囊吡喃酮P溶解在二甲基亞砜(DMSO)后的溶液)刺激細胞培養(yǎng)液，在所定時間培養(yǎng)后，使用胰蛋白酶以使細胞懸浮的狀態(tài)回收。然后，于4℃下用70％乙醇固定30分鐘后，用50μg/ml的碘化丙啶(PI)溶液染色。30分鐘后，使用FACS，做成DNA直方圖，研究死細胞的比例以及細胞周期。
附著細胞數(shù)的測定方法向THP-1細胞培養(yǎng)液中添加1，5-D-脫水果糖溶液(在DMSO中溶解了1，5-D-脫水果糖的溶液)，然后用佛波酯(PMAphorbolmyristate acetate)刺激。在37℃、CO2濃度5％的條件下培養(yǎng)1小時后，用Giemsa染色法對附著的細胞進行染色。
結(jié)果與考察1)子囊吡喃酮P對細胞增殖的抑制效果將5×103個/ml的B16黑色素瘤(細胞(C57 BL/6小鼠黑色素瘤細胞)接種到6孔板中，細胞附著底面后(24小時)，各孔等量添加培養(yǎng)液中的最終濃度達到0～0.70mM那樣的子囊吡喃酮P溶液(作為溶劑使用DMSO)。在37℃、CO2濃度5％的條件下培養(yǎng)一周后，測定活細胞。
結(jié)果如圖2所示。當以對照(只添加DMSO)的活細胞作為100％時，通過添加子囊吡喃酮P，活細胞數(shù)隨著子囊吡喃酮P濃度增加顯著減少，在最終濃度(0.70mM)下，其比例下降到50％或更低。由這些結(jié)果可以認為子囊吡喃酮P具有抑制腫瘤細胞增殖的能力。
2)子囊吡喃酮P對腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)效果就子囊吡喃酮P對于B16黑色素瘤(細胞的腫瘤細胞增殖抑制效果的機制是否是由于在其它的抗腫瘤劑中看到的那樣的殺細胞效果引起的進行了研究。在本研究項目中，研究了對于B16黑色素瘤(細胞以及其它4種人癌細胞株(THP-1前骨髓性白血病、HeLa子宮頸癌、A549肺泡上皮癌、HaCaT皮膚癌模型細胞)由于子囊吡喃酮P刺激誘導(dǎo)的死細胞的比例。對于各個癌細胞培養(yǎng)液添加達到1.4mM的子囊吡喃酮P，測定48小時后的死細胞的比例。結(jié)果如表1所示。
表1

由表1可知，子囊吡喃酮P表現(xiàn)出不管來自各個癌細胞的癌的種類如何，都具有廣譜的殺細胞效果。另外，在使用HaCaT細胞的實驗系中，添加子囊吡喃酮P后(1.4mM)，確認了48小時內(nèi)細胞調(diào)亡特異的DNA的斷片化(圖3)。由此確認由子囊吡喃酮P導(dǎo)致的死細胞是細胞凋亡，同樣結(jié)果在使用A549細胞的體系也可獲得。另外在使用THP-1細胞的體系中，子囊吡喃酮P為0.35mM，確認48小時以內(nèi)誘導(dǎo)細胞死亡(圖4)。
3)子囊吡喃酮P的特異的細胞死亡誘導(dǎo)作用已知HaCaT細胞在10％FCS存在下具有作為腫瘤細胞的特征，但在低濃度的FCS存在下(1％或更低)，具有接近正常細胞的性格。利用這一性質(zhì)，研究子囊吡喃酮P對正常細胞的影響。結(jié)果如圖5所示。在腫瘤樣增殖的FCS10％的條件下，添加子囊吡喃酮P(1.4mM)，48小時以內(nèi)誘導(dǎo)約30％細胞死亡(圖5(c))，而與此相反，在具有正常細胞的特征FCS1％條件下，即使有1.4mM子囊吡喃酮P存在，也幾乎看不到死細胞(圖5(b))。由此表明子囊吡喃酮P特異作用于增殖性高的細胞(腫瘤細胞)，而對增殖慢的細胞(正常細胞)幾乎沒有影響。
另外，在FCS10％的條件下，在腫瘤樣增殖的HeLa細胞中，添加子囊吡喃酮P(1.4mM)后24小時，觀察到顯著的S期細胞團的增加和G2/M期的細胞團的減少(圖6)，然后在48小時內(nèi)，象先前那樣誘導(dǎo)約10％的細胞死亡。由此暗示了子囊吡喃酮P的細胞周期上的作用點為DNA合成期間的S期，抑制向G2/M期的過渡，結(jié)果誘導(dǎo)細胞死亡。因此，當子囊吡喃酮P作為抗腫瘤劑給予生物體時，預(yù)期對于認為大半處于細胞周期上的G0/1期的正常細胞沒有損傷，而只對腫瘤細胞發(fā)揮特異的殺細胞效果。
4)1，5-D-脫水果糖對于整聯(lián)蛋白的功能抑制作用如果用佛波酯(PMA)刺激白血病細胞株，可看到附著分子整聯(lián)蛋白的活化，結(jié)果可知作為細胞現(xiàn)象的活性氧生成、細胞附著亢進、細胞浸潤被誘導(dǎo)。因此，在1，5-D-脫水果糖存在下，培養(yǎng)THP-1細胞株，以用佛波酯刺激后的附著細胞數(shù)作為指標評價整聯(lián)蛋白功能。
結(jié)果如圖7所示。12.3mM的1，5-D-脫水果糖將因佛波酯導(dǎo)致的細胞附著性抑制到約25％。因此，推測1，5-D-脫水果糖可以抑制認為在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移中起著重要作用的整聯(lián)蛋白(integrin)分子的功能。
通過使用1，5-D-脫水果糖和/或子囊吡喃酮能夠抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，而且?guī)缀鯖]有副作用。
附圖的簡單說明圖1表示子囊吡喃酮的結(jié)構(gòu)式例子圖2表示通過結(jié)晶紫染色法進行的子囊吡喃酮P的細胞增殖抑制能力評價圖3表示通過瓊脂糖凝膠電泳進行DNA片段化解析圖4表示利用流式細胞計數(shù)儀(FACS)進行死細胞的定量評價圖5表示利用流式細胞計數(shù)儀(FACS)進行死細胞的定量評價圖6表示利用流式細胞計數(shù)儀(FACS)得出的細胞周期圖7表示白血病細胞株的整聯(lián)蛋白的功能評價圖8表示(實施例1)給予子囊吡喃酮P后的小鼠存活率圖9表示(實施例2)給予1，5-D-脫水果糖后的小鼠存活率圖10表示(實施例3)給予子囊吡喃酮P后的小鼠腫瘤容積的評價圖11表示(實施例4)給予子囊吡喃酮P和順鉑的細胞增殖抑制能力評價具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明進行更詳細說明。本發(fā)明并不受這些實施例的限制。
實施例實施例1向C57 BL/6小鼠腹腔內(nèi)接種B16黑色素瘤細胞(5×106個)后，從第15天開始，每日向腹腔內(nèi)給予PBS(磷酸緩沖液)以及子囊吡喃酮P溶液(給予量為200mg/kg)，研究存活率(癌性腹膜炎模型)。在該實驗體系中，如果預(yù)先將B16黑色素瘤細胞接種到小鼠腹腔內(nèi)，當沒有給予和給予PBS時，確認從第14天以后個體(小鼠)死亡。圖8給出了對于使用本實驗體系，子囊吡喃酮P對晚期癌模型的延長壽命的效果進行研究的結(jié)果。平均存活天數(shù)在給予子囊吡喃酮P組為8天，而在PBS組為4天，證明即使在生物體內(nèi)也具有抗腫瘤效果。另外在給予子囊吡喃酮P組的40％(n＝2)中，與對照(PBS組)比較，給予子囊吡喃酮P后生存期間延長3倍以上。這意味著子囊吡喃酮P在體內(nèi)的抗腫瘤效果。
實施例2與實施例1同樣，向C57 BL/6小鼠腹腔內(nèi)接種B16黑色素瘤細胞(5×106個)后，從第2天開始，每日向腹腔內(nèi)給予PBS以及1，5-D-脫水果糖(給予量為200mg/kg)。存活率如圖9所示。腫瘤細胞接種后的平均存活天數(shù)在給予1，5-D-脫水果糖組為19天，而在對照的PBS組為14天。該結(jié)果確認1，5-D-脫水果糖對于攜瘤鼠具有延長壽命的效果。
實施例3
接下來，向C57 BL/6小鼠背中皮下接種B16黑色素瘤細胞(1×105個)后，從第3天直至第13天為止，每隔1日向腫瘤局部皮下注射PBS及子囊吡喃酮P(使用溶解于PBS的溶液，給予量為25mg/kg)，通過腫瘤的容積(長徑×短徑2×0.52)評價抗腫瘤效果(圖10)。腫瘤細胞接種后，在第7天之前沒有看到差別，第7天以后，給予子囊吡喃酮P組與給予PBS組相比，可知腫瘤的容積顯著減少。一般來說，在臨床上可以認為腫瘤增大速度越緩慢，預(yù)后越好。即，子囊吡喃酮P在體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤效果。另外，在給予子囊吡喃酮P組處死后的解剖所見中，幾乎沒有觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移。
實施例4對前骨髓性白血病細胞(THP-1細胞)的細胞培養(yǎng)液用各種濃度的子囊吡喃酮P溶液(將子囊吡喃酮P溶解在DMSO中的溶液)、順鉑溶液(同樣用DMSO溶解)以及子囊吡喃酮P與順鉑的混合溶液進行刺激，培養(yǎng)48小時后，用移液管充分進行移液操作，以均一的單一細胞構(gòu)成的浮游液狀態(tài)回收。其中一部分使用血細胞計數(shù)板于顯微鏡下測定細胞數(shù)。剩下的細胞浮游液于4℃下，用70％乙醇固定30分鐘后，最終用50μg/ml碘化丙啶(PI)溶液染色。30分鐘后，使用FACS，做成DNA直方圖，研究死細胞的比例，算出各個活細胞數(shù)(圖11)。當以對照(只添加DMSO)中的活細胞作為100％時，通過添加子囊吡喃酮P，其比例減少到30％左右至約50％，確認了細胞增殖的抑制效果。另一方面，并用子囊吡喃酮P與順鉑組的活細胞的比例在10％左右，確認了子囊吡喃酮P與順鉑的協(xié)同結(jié)果。
權(quán)利要求
1.抗腫瘤劑，其特征是作為抗腫瘤成分含有1，5-D-脫水果糖和/或子囊吡喃酮。
2.權(quán)利要求1所述的抗腫瘤劑，其中子囊吡喃酮是子囊吡喃酮P。
3. 1，5-D-脫水果糖和/或子囊吡喃酮在為了抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中的使用。
4.權(quán)利要求3所述的使用，其中子囊吡喃酮是子囊吡喃酮P。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有1，5－D－脫水果糖 和/或子囊吡喃酮的抗腫瘤劑。預(yù)期該抗腫瘤劑在子囊吡喃酮抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移方面有效，抑制炎癥，在預(yù)后中發(fā)揮很好的效果。
文檔編號A61K31/7004GK1871227SQ20048003154
公開日2006年11月29日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者丸山征郎, 阿邊山和浩, 吉元寧 申請人:日本淀粉工業(yè)株式會社