專利名稱：：作為抗腫瘤劑nod1的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及Nodl和其在轉(zhuǎn)化的、惡性細胞的細胞凋亡中的功能。
背景技術：
：癌癥是折磨許多人的疾病，并且是人類和非人動物中死亡的主要原因。癌癥一般包括少數(shù)細胞不受控制的分離，其然后產(chǎn)生許多新的細胞。因而，許多抗癌藥物是抑制或停止細胞生長的試劑。雖然這種化學治療劑改善了患有贅生性疾病的患者的存活率，與許多化學治療劑相關的嚴重副作用限制了它們的使用，并破壞了已經(jīng)被癌癥削弱的患者的健康狀態(tài)。因而需要新的試劑，其展現(xiàn)對癌細胞的增強的選擇性，并且能夠控制瘤細胞的增殖。許多抗癌劑的一個主要難題是它們的特異性?？拱┧幬镄枰獏^(qū)分癌性的細胞和非癌性的細胞。然而，在這一點上大量的抗癌藥物是不加選擇的。一般地，抗癌試劑具有陰性的血液學效果(例如，停止骨髓和淋巴組織中成形的元件的有絲分裂和離解)和免疫抑制作用(例如，降低細胞計數(shù))，也可以對上皮組織(例如，腸粘膜)、生殖組織(例如，精子發(fā)生的損傷)以及神經(jīng)系統(tǒng)有嚴重的影響。參見，例如，P.CalabresiandB.A.Chabner,In:GoodmanandGilman,ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(PergamonPress,8thEdition)(pp.1209-1216)。需要的是抗癌試劑，其可以有益地治療選定的腫瘤類型，或優(yōu)選的各種腫瘤類型，并且特別適合于侵入性肺瘤。此外，雖然這種抗癌試劑應當是有效的，它們也應當很少展現(xiàn)或不展現(xiàn)毒性。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于促進在中的細胞凋亡的組合物和方法，其涉及提高Nodl表達或NODI活性。因而，本發(fā)明的一個方面是促進哺乳動物中腫瘤退化的方法，其涉及向所述哺乳動物施用提高Nodl表達或NOD1活性的試劑。可以用本發(fā)明的方法治療的腫瘤的實例包括腦、膀胱、宮頸、結腸、膽嚢、腎臟、肝臟、肺、胰腺、卯巢、前列腺、皮膚、胃或曱狀腺腫瘤。在某些實施方式中，所述肺瘤是雌激素敏感性腫瘤或乳腺腫瘤。提高NOD1活性的試劑的實例包括具有以下序列的肽D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(/TriDAP)、y-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(氾-DAP)、Y-D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(Y丁riDAP),和其組合。這些肽可以活化NOD1蛋白，由此Nodl依賴性途徑引起細胞凋亡?？梢蕴岣逳OD1活性的試劑的另一個實例是NOD1多肽。在某些實施方式中，所述NODl多肽可以是人類NODl多肽，例如，具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的人類NODI多肽。可以提高Nodl表達的試劑的一個實例是包含編碼NODI多肽的片段的核酸。NODI多肽的序列的實例包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:3。編碼NODl多肽的核酸片段的一個實例包括SEQIDNO:2。所述核酸可以進一步包括調(diào)節(jié)元件，例如，啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止信號，或其組合。所述核酸可以是表達盒或表達載體或基因遞送載體的一部分?？梢耘c提高Nodl表達或NODI活性的試劑聯(lián)合施用其他活性成分。例如，可以與這些試劑聯(lián)合施用有效量的腫瘤壞死因子。在某些實施方式中，腫瘤壞死因子oc可以增強Nod依賴性細胞凋亡途徑。此外，可以與所述試劑一起施用有效量的放線菌酮，以提高Nodl表達或NODI活性。此外，可以與所述試劑聯(lián)合施用一種或多種化學治療化合物?？梢杂糜诒景l(fā)明的組合物和方法的化學治療化合物的實例包括六曱密胺、博來霉素、馬利蘭、亞葉酸鈣、卡培他濱、卡鉑、卡氮芥、苯丁酸氦芥、順鉑、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、放線菌素、紅比霉素、多西他賽、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體阿霉素、環(huán)己亞硝脲、苯丙氨酸氮芥、巰基。票呤、氨曱蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、噴司他丁、甲基芐肼、雷替曲塞、鏈脲霉素、優(yōu)福定、泰莫佐羅、硫替派、巰基鳥噪呤/硫鳥噤呤、拓樸替康、蘇消安、長春花堿、長春新堿、去乙酰長春酰胺、長春烯堿和其組合。所述試劑可以局部地施用到肺瘤的位點，和/或被配制用于持續(xù)釋放。本發(fā)明的另一個方面是一種組合物，其包括載體、包含編碼N0D1多肽的片段的核酸，以及有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(Y丁riDAP)、y-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、y-D-Gln曙DAP(iQ-DAP)或D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(丫TriDAP)，其中所述組合物;故配制用于向肺瘤的局部施用。所述N0D1多肽可以，例如，包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:3。編碼NODI多肽的核酸片段的實例是SEQIDNO:2。在所述組合物中采用的核酸可以進一步包括調(diào)節(jié)元件，例如，啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止信號，或其組合。所述核酸可以是表達盒或表達載體。所述核酸包含基因遞送載體。本發(fā)明的組合物也可以包括其他活性成分，例如，有效量的肺瘤壞死因子oc或化學治療化合物。所述組合物可以被配制用于局部地施用到肺瘤的位點，和/或被配制用于持續(xù)釋放。本發(fā)明的另一個方面是促進乳腺肺瘤細胞中細胞凋亡的方法，包括用有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(/TriDAP)接觸乳腺腫瘤細胞。本發(fā)明的另一個方面是促進雌激素敏感性腫瘤細胞中細胞凋亡的方法，包括用有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(/TriDAP)接觸乳腺胂瘤細胞。附圖lA-C說明了在TNF誘導的細胞凋亡中涉及的Nodl。附圖1A提供了突變基因的示意圖，其產(chǎn)生了TNFa抗性表型，后來被鑒定為帶有blasticidine(blast)基因插入的Nodl突變。帶有這種Nodi突變的細胞系是MCF7-C20細胞系。來自pDisrup逆轉(zhuǎn)錄病毒構建體的插入被繪制到Nodl基因上。與Nodl基因融合的blasticidine的接點出現(xiàn)在富亮氨酸區(qū)域8(LRR8)和富亮氨酸區(qū)域9(LRR9)之間Nodl基因的3'末端。因此LRR9和LRR10區(qū)域是blasticidine插入的3'。附圖IB顯示了在MCF-7C20細胞中NODI蛋白不以可檢測數(shù)量存在。制備來自MCF-7親本(稱為"wt")和MCF-7C20細胞的細胞提取物，用單克隆抗NODI抗體免疫沉淀(上畫面)或直接加載到SDS-PAGE凝膠上(下畫面)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用相同的單克隆抗膜抗體通過免疫印跡來分析印跡。附圖IC顯示了與MCF-7C20細胞相比，MCF-7細胞對于TNF誘導的細胞凋亡更有抗性。用升高濃度的TNF(0-40ng/ml)處理MCF-7和MCF-7C20細胞20h。通過碘化丙錠(PI)排出分析和流式細胞計來測定細胞生存力。圖表顯示，MCF-7C20細胞顯著更可能經(jīng)歷細胞凋亡。附圖2A-D顯示了在yTnDAP處理時MCF-7細胞經(jīng)歷細胞凋亡。附圖2A說明了NODI是丫TriDAP誘導的細胞死亡所需的。在存在(陰影柱)或缺少(空心柱)放線菌酮(CHX)(3yg/ml)的情況下，用/TriDAP或aTriDAP(各50ng/ml)處理表達正常水平的NODI的MCF-7Blasto細胞、表達很少或不表達NODI的MCF-7C20細胞、或過量表達NODI的MCF-7Nodl細胞48h。對照分析接受培養(yǎng)基(Med)代替yTriDAP或cxTriDAP。在48h孵育之后，收獲細胞，并與碘化丙錠(PI)孵育(4yg/ml)。通過流式細胞計分析來測定細胞生存力。數(shù)據(jù)顯示的是至少四個獨立實驗的代表性實驗。附圖2B顯示了在用單獨的載體轉(zhuǎn)染的MCF-7Blasto細胞中、具有內(nèi)源Nodl基因石皮壞的MCF-7C20細胞中、或被工程化以過量表達NODl的MCF-7Nodl細胞中的NODI表達水平。在MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7Nodl細胞中NODI的表達通過使用單克隆抗Nodl抗體的western印跡來分析。附圖2C說明了在丫TriDAP處理的MCF-7Nodl細胞中的形態(tài)變化。將細胞播種到4孔室載玻片上，并用/TriDAP/放線菌酮(CHX)(畫面b、d、f)或單獨的CHX(畫面a、c、e)處理。細胞用DAPI(畫面c、d)或TUNEL(畫面e、f)染色，固定并在相差(畫面a、b)或熒光(畫面c-f)顯微鏡下觀察。附圖2D顯示了，通過兩種廣譜的caspase抑制劑，z-VAD-FMK和Boc-D-FMK,在MCF-7Nodl細胞中的yTriDAP誘導的細胞凋亡減少或消除。用z-VAD或Boc-D-FMKcaspase抑制劑(各50juM)預處理MCF-7Nodl細胞30分鐘，之后添力口Y丁riDAP/CHX48h。用硤化丙錠(PI)孵育細胞，通過流式細胞計測量凋亡'I"生細胞死亡。附圖3通過western分析說明了，向MCF-7細胞添力口Y丁riDAP，而不是無效的對照物三肽ocTriDAP，引起了聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白水解裂解和capases6、7、8和9的蛋白水解裂解。在存在或缺少CHX(0.5yg/ml)的情況下用yTriDAP、aTriDAP或培養(yǎng)基(對照)刺激之后，通過MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7Nodl細胞的Western印跡分析所檢測的PARP和各種caspases的裂解。收獲細胞，經(jīng)歷western印跡，使用與其反應的抗體檢測PARP、caspases、p20、p41/43和p35。附圖4A-C顯示了N0D1突變體V41Q對/TriDAP起反應，并且保持了細胞凋亡途徑中的功能，而N0D1突變體K208R對于Y丁riDAP不敏感，并且在細胞凋亡途徑中是沒有活性的。附圖4A圖示說明了在用培養(yǎng)基(Med.,對照)或yTriDAP處理后不同的細胞系中細胞凋亡細胞的百分比。NODIV41Q和K208R突變體通過定點誘變來構建。V41Q突變處于NOD1的CARD結構域中，而K208R突變被認為阻斷由Nod/NBD結構域介導的寡聚反應所需的構象變化。編碼這些NODIV41Q和K208R突變多肽的構建體轉(zhuǎn)染到MCF-7C20細胞中，進行細胞凋亡分析。如所示，V41Q突變體保持了N0D1活性，但K208R突變體沒有。附圖4B顯示了，N0D1突變體和野生型多肽的表達水平基本上是相同的。附圖4C通過western分析說明了，在MCF-7細胞中的N0D1表達是PARP的蛋白水解裂解和capases6、7、8和9的蛋白水解裂解所需的。PARP和各種caspases的裂解通過不表達NOD1的MCF-7C20細胞、以及已經(jīng)將Nodl構建體重組導入MCF-7C20細胞中的MCF-7C20Nodl細胞的Western印跡分析來檢測。在存在或缺少放線菌酮(chx)(0.5mg/ml)的情況下用/TriDAP或培養(yǎng)基(對照)刺激細胞24h。然后收獲細胞，進行western印跡。使用與之反應的抗體檢測PARP、caspases、p20、p41/43和p35。附圖5A-C說明了在MCF-7細胞中Nod2不誘導細胞凋亡。在附圖5A中，在存在或缺少CHX的情況下用NOD1配體Y丁riDAP或Nod2配體胞壁酰二肽(MDP)(各20jug/ml)處理MCF-7Blasto、MCF隱7Nodl和MCF-7Nod248h。然后用PI孵育細胞，通過流式細胞計測量細胞凋亡性細胞死亡。如所示，yTriDAP刺激細胞凋亡，但Nod2配體不。在附圖5B中，NOD1和NOD2的表達通過Western印跡分析來確認，使用用于重組蛋白的檢測的抗Myc抗體。附圖5C顯示了MCF-7Nod2細胞響應MDP，如通過白細胞介素-8(IL-8)分泌所檢測的。在存在或缺少CHX(0.5jug/ml)的情況下用/TriDAP或MDP刺激MCF-7Blasto、MCF-7Nodl和MCF-7Nod2細胞24h。然后收獲細胞上清液，分析IL-8分泌。附圖6A-Di兌明了，caspase8和caspase9是丫TriDAP誘導的細月包凋亡所需的。附圖6A顯示了不同caspase抑制劑對yTriDAP誘導的細胞凋亡的影響。在用/TnDAP/CHX刺激48h之前，用沿著附圖6A的x軸列出的caspase的抑制劑預處理MCF-7Nodl細胞30分鐘。然后用碘化丙錠孵育細胞，通過流式細胞計測量細胞生存力。所有抑制劑在100iuM的濃度使用。附圖6B顯示了，當Nodl與caspase9共表達時，檢測到NOD1的高分子量形式，表明NOD1與caspase9相互作用。在這個實驗中，在存在空載體、Myc-Nodl或Myc-NOD2的情況下，293細胞用編碼FLAG-caspase9的載體共轉(zhuǎn)染。用抗-FLAG抗體免疫沉淀(IP)細胞提取物，使用多克隆抗-Myc抗體通過免疫印跡(WB)來揭示共沉淀的蛋白質(zhì)。附圖6C顯示了，CLARP完全地阻止yTriDAP誘導的細胞凋亡，而Bcl2僅僅部分地抑制yTriDAP誘導的細胞凋亡。在存在或缺少CHX(3ng/ml)的情況下用丫TriDAP不處理或處理MCF-7CLARP、MCF-7CLARP/Nodl、MCF-7Bc12和MCF國7Bcl2/Nodl細胞。然后用碘化丙錠孵育細胞，通過流式細胞計測量細胞凋亡性細胞死亡。附圖6D顯示了Western印跡，說明了在MCF-7細胞中表達CLARP、Bcl2和NODl，表明在附圖6C中觀察到的結果是由于CLARP和Bcl2之間的功能差異，而不是這兩種蛋白質(zhì)的表達水平中的差異。附圖7A-C說明了，野生型RIP2和RIP2的激酶缺陷的(KD)突變在NODl細胞凋亡途徑中是功能性的。然而，缺少CARD結構域的RIP2作為NODI信號轉(zhuǎn)導的顯性陰性抑制劑起作用。附圖7A圖形地說明了在野生型RIP2、RIP2KD和RIP2ACARD細胞中細胞凋亡的細胞的百分比。用野生型Myc-RIP2、Myc-RIP2KD和Myc-RIP2△CARD穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，在存在或缺少CHX(3yg/ml)的情況下，用yTriDAP不處理或處理48h。用PI將育細胞，通過流式細胞計測量細胞凋亡性細胞死亡。附圖7B顯示了RIP2多肽被表達，如通過用多克隆抗Myc抗體對細胞提取物的免疫沉淀以及使用單克隆抗Myc9E10抗體的免疫印跡所確認的。附圖7C說明了在RIP2野生型、MCF-7RIP2KD和RIP2ACARD細胞中JNK的磷酸化的丫TriDAP誘導。如所示，在存在放線菌酮的情況下，表達野生型RIP2或RIP2KD的MCF-7細胞對fTriDAP的暴露2h誘導JNK的磷酸化。然而，在同樣方式處理的RIP2ACARD細胞中沒有觀察到JNK的這種磷酸化。附圖8A-D說明了，在NODl和TNFoc之間存在協(xié)同的相互關系。附圖8A圖形地說明了，當NOD1的濃度從0.0提高到100yg/ml以及TNFoc的濃度從0.5ng/ml提高到1ng/ml時，細胞凋亡細胞的百分比以劑量特異性方式提高。附圖8B圖形地說明了，當放線菌酮的濃度從0.0提高到3mg/ml以及tnfcc的濃度從0.5ng/ml提高到1ng/ml時，細胞凋亡細胞的百分比以劑量特異性方式提高。附圖8C圖形地說明了，雖然yTriDAP在存在TNFoc的情況下提高細胞凋亡，無效對照三肽ocTnDAP實際上可以抑制細胞凋亡，甚至在更高的TNFi劑量下。附圖8D說明了在MCF-7細胞對TNFoc的暴露之后在各個時點的N0D1表達。附圖9A-C說明了在另一個人類乳腺癌細胞系、SKBR3癌細胞系中的N0D1表達。附圖9A(上部)圖形地說明了作為TNFot濃度的函數(shù)的、細胞凋亡的SKBR3野生型和SKBR3Nodl細胞的百分比。附圖9A(底部)底部說明了作為丫TriDAP濃度的函數(shù)的細胞凋亡的SKBR3野生型和SKBR3Nodl細胞的百分比。附圖9B(頂部)圖形地說明了通過硤化丙錠(PI)或Dioc6在不同條件下觀察到的細胞凋亡的SKBR3細^^的百分比。采用的條件在以下的Western印跡中指示。使用的縮寫如下CHX(放線菌酮)、TNF(TNFoc)、yTri(丫TriDAP)、ccTri(ccTriDAP)。附圖9B2提供了western分析，說明了聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的蛋白水解裂解和caspase3、7和8的蛋白水解裂解。在以下的Western印跡指定的條件下刺激之后，通過MCF-7細胞的Western印跡細胞分析來檢測PARP和各種caspases的裂解。收獲細J包，經(jīng)歷western印跡，^f吏用其反應性抗體才企測PARP、caspases、p20、p41/43和p35。附圖9C圖形地說明了在以下柱形圖指定的條件下觀察到的野生型、表達NODI的、和表達CLARP的SKBR3細胞的細胞凋亡百分比。使用的縮寫CHX(放線菌酮)、TNF(TNFoc)、gTri(/TriDAP)、gTC(yTriDAP+CHX)、aTC(ocTriDAP+CHX)。附圖10A、B和C提供了用野生型MCF-7乳腺癌細胞、NODI敲除的MCF-7細胞和Nodl-轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞分別接種的小鼠的圖像。用3x106人類乳腺癌細胞皮下地接種小鼠。箭頭指示皮下的腫瘤，其在附圖10B的放大圖像中示出。附圖11A-D說明了在SCID小鼠中Nodi的存在阻止腫瘤生長。附圖11A圖形地說明了，在用MCF-7C20(左側)和MCF-7C20/Nodl(右側)細胞注射的小時中，作為時間的函數(shù)的腫瘤體積。將細胞(3乂106個細胞/小鼠)注射到雌性SCID小鼠的肋部。每周測量腫瘤大小，根據(jù)公式f『2xZ^/2來確定體積。每條線代表在一個小鼠中觀察到的肺瘤(n=4)。如所說明的，在接受表達Nodi的腫瘤細胞(C20/Nodl)的小鼠中腫瘤體積減少。相比之下，在接受不表達Nodl的腫瘤細胞(C20細胞)的小鼠中腫瘤體積增加。附圖11B圖形地說明了在注射MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20/Nodl細胞(3乂106個細胞/小鼠)之前植入雌激素彈丸到小鼠中，除了腫瘤細胞表達Nodi時(C20/Nodl細胞)，都提高腫瘤生長。陰影柱代表接受雌激素彈丸的小鼠獲得的結果，而空心柱代表從未接受雌激素彈丸的小鼠獲得的結果。如上所述測定腫瘤體積。附圖11C圖形地說明了在用MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7RIP2ACARD細胞注射的小鼠中隨著時間的腫瘤體積。如所示，在接受MCF-7RIP2ACARD細胞(*)的小鼠中的腫瘤體積大約表達一定Nodl的小鼠中的(Blasto,實心菱形)，但小于不表達Nodl的小鼠中的(C20,實心正方形)。附圖11D圖形地說明了作為雌激素濃度的函數(shù)的肺瘤細胞生長。如所示，不表達Nodl的胂瘤細胞9MCF-7C20細胞)和表達突變的RIP2的腫瘤細胞(MCF-7RIP2ACARD細胞)對于雌激素更敏感，并展現(xiàn)了提高的腫瘤生長。MCF畫7Blasto、MCF畫7C20、MCF-7C20/Nodl和MCF-7RIP2△CARD細胞暴露于提高濃度的17|3-雌二醇，用3H-胸腺嘧啶脈沖，通過液體閃爍來測定細胞生長。數(shù)據(jù)是至少3個獨立實驗的代表。附圖12A-C說明了在各種MCF-7腫瘤細胞系中雌激素提高yTriDAP誘導的細胞凋亡，它莫西芬抑制丫TriDAP誘導的細胞凋亡。附圖12A圖形地說明了在升高數(shù)量的雌激素以及放線菌酮(CHX)或CHX加/TriDAP(yTri)中培養(yǎng)的MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7CM/Nodl細胞中的細胞凋亡百分比。附圖12B圖形地說明了在升高數(shù)量的它莫西芬以及放線菌酮(CHX)或CHX力口Y丁riDAP(Y丁ri)中培養(yǎng)的MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20/Nodl細胞中的細胞凋亡百分比。對于雌激素研究，在活性炭處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)MCF-7細胞，并在存在升高濃度的雌激素(E2)的情況下用Y丁riDAP/CHX刺激，通過碘化丙錠(PI)排出來測量細胞生存力。對于它莫西芬研究，在添加Y丁riDAP/CHX之前用它莫西芬處理細胞，通過PI排出來測量細胞生存力。附圖12C顯示了來自體外培養(yǎng)的細胞(左側)和體內(nèi)腫瘤細胞(右側)的細胞溶胞產(chǎn)物的免疫印跡，說明了雌激素受體的表達在表達Nod1的細胞中降低。來自MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20/Nodl細胞，以及來自從肺瘤分離的細胞的總蛋白提取物，使用針對雌激素受體(ERoc)的抗體的免疫印跡來分析，ERK2作為加載對照。附圖13A-D說明了RIP2是Nodl細胞凋亡途徑的重要成分。附圖13A顯示了，在腫瘤細胞系中激酶缺陷性RIP2(RIP2KD)的穩(wěn)定表達壽t化了這些細胞對Nodl或Nod2活化劑誘導的細胞凋亡性細胞死亡。用Myc-Nodl、Myc-RIP2(野生型)、Myc國RIP2KD和Myc誦RIP2△CARD穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細胞。然后在存在或缺少CHX(3ng/ml)的情況下用Y丁riDAP、ocTriDAP和MDP(各20jug/ml)處理測試細胞，而對照細胞不用這些試劑處理。然后用碘化丙錠(PI)孵育細胞，通過流式細胞計測量細胞凋亡性細胞死亡。附圖13B說明了在附圖13A中描述的相同MCF-7細胞系中細胞凋亡時TNF的影響。用TNF(10ng/ml)處理這些細胞系18小時，如附圖13A描述的評定細胞凋亡性細胞死亡。在所有測試的細胞系中TNF提高細胞凋亡。附圖13C顯示了，與MCF-7Nodl細胞相比，MCF-7RIP2KD細胞展現(xiàn)了提高的yTriDAP誘導的細胞凋亡。在存在CHX、存在升高濃度的Y丁riDAP或MDP的情況下孵育細胞48hr,如附圖13A描述的評定細胞凋亡性細胞死亡。附圖13D說明了在存在CHX(0.5mg/ml)或TNF的情況下在yTriDAP刺激后MCF-7Blasto、MCF-7Nodl和MCF-7RIP2野生型細胞的IL-8分泌。孵育之后，收獲細胞上清液，分析IL-8分泌。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提高的Nodl表達或N0D1活性引起腫瘤退化。因而本發(fā)明涉及向受試者施用提高Nodl表達或NOD1活性的N0D1多肽、Nodl核酸和試劑作為抗腫瘤治療。在某些實施方式中，提高Nodl表達或活性的試劑包括N0D1的肽活化劑，例如y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE畫DAP)、y-D畫Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala畫L-Glu國二氨基庚二酸(Y丁riDAP)，和其組合。雖然本發(fā)明預期治療任何類型的腫瘤，本發(fā)明的組合物和方法對于治療雌激素敏感的肺瘤和/或乳腺癌腫瘤也具有特別的實用性。N0D1先天的免疫系統(tǒng)由識別微生物、病毒、異常/損傷的宿主細胞等等成分的受體家族組成，啟動宿主反應來消除和殺死侵入的有機體或除去不正常的宿主細胞。近來，稱為Nod/Caterpillar家族的細胞內(nèi)、細胞胞漿蛋白家族已經(jīng)與先天免疫反應相聯(lián)系。這個家族的所有成員具有兩個保守的結構域；核苦酸結合寡聚反應結構域(NBD/NOD)和羧基末端富亮氨酸重復(LRR)區(qū)域。家族成員的氨基終端區(qū)域，稱為效應物結構域，含有可變的結構，其包括caspase募集結構域(CARD)、pyrin、BIR和其他結構域。Nod/Caterpillar家族的兩個成員已經(jīng)特別地與針對感染的天生免疫反應相聯(lián)系。這些成員被稱為NODl(CARD4)和NOD2(CARD15)。NOD1和NOD2的效應物結構域分別由一個和兩個CARD結構域組成。NODI和NOD2最先被提示是作為細菌脂多糖受體(LPS)的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。隨后，發(fā)現(xiàn)的是，NOD配體來自細菌肽聚糖(PGN)而不是來自LPS。因而NOD1和NOD2可能作為感染期間細菌或細菌產(chǎn)物的細胞內(nèi)感受器起作用。然而，迄今為止進行的研究表明，NOD1或NOD2缺陷的小鼠不是與免疫缺陷或提高的感染敏感性相關的明顯的顯性表型。NODI和NOD/Caterpillar家族的其他成員的核酸和氨基酸序列可以在本領域中，例如在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到。參見網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov。例如，人類NODI的一個氨基酸序列在以下提供以便參考，為SEQIDNO:1(NCBI登記號碼Q9Y239;gi:20137579)。1MEEQGHSEME工工PSESHPHIQIAKSNREIiVTH工RNTQCIi41VDNIiKNDYFSAEDAEIVCACPTQPDKVRKIIiD闊SKGE81EVSEFFIiYHRP脇EIGFS121vntdpvsrytQQ固HIjGRDSKFVIjCYAQKeekl:lee;iym161DTI肌VGFSNESLGS愿IiAC副HTTGILNEQGETIFI201LGDAGVGKSMTGRLDAGVKFFFHFRCRMFS241CFKESDRIiCIjQDKLFKHYCYPERDPEEVFAFLLRFPHVAIi281FTFDGLDEIiHSDLDIjSRVPDSSCPWEPAHP321窗TG工EVPRGFSPSHIjRAY361PiFCWIIFRC401,FRAAFEGSPQLPDCTMTLTDVFLLVTEV訓RMGPSS441LVQRNTRSPVET!L腦RDTIiCS卿VA訓MEKSLFVFTQ481eevqasg]lqe:lpe:lgpggdq521IiDDRVGTQE!LLRFFQEWMPPAGAATTSCYP561PFliPFQCLQGSGPAREDLFKNKDHFQF狐FIiCGIiLSKAK601qkllrh:lvpaAMiRRKRKAIjWAHLFSSIiRGylkslprvqv641tf層:lrciyETQSQKVGQIi681KLTYCNACSADCSALSFVLHHFPKRJLALDIi畫n:lndygv721re:lqpcfsrlTVLRLSVNQITDGGVKVIiSEE薦YKIVTY761IiGIiYNNQ工TDVGARYVTKILDECKGIjTHIjKIjGKNK工TSEG801GKY跳AVKNSKSISEVGMWGNQVGDEGAKA腦ALR,841sijTtlslasngisteggks:la亂qqnts:l881NDE菌SLAEMIiKVNQTLKHLW.L3CQNQITAKGTAQLADAIi921IiNG肌IKPEEAKVYEDEKRIICF人類Nodi的核苷酸序列也是可獲得的，NCBI登記號碼BC040339(gi:25955660),以下列出為SEQIDNO:2以便參考。1CCCGGCCCCGGCGTCCCCGGACCATGGCGCTCTCCGGGCT41CTTCTCTAGCTCTCAGCGGCTGCGAAGTCTGTAAACCTGG8工TGGCCAAGTGATTGTAAGTCAGGAGACTTTCCTTCGOTT121CTGCCTTTGATGGCAAGAGGTGGAGATTGTGGCGGCGATT161ACAGMMCGTCTGGGAAGACAAGTTGCTGTTTTTATGGG201AATCGCAGGCTTGGAAGAGACAGAAGCAATTCCAGAAATA241薦TGGAAATTG馬ATTTAAACAATGTTGTTTTAAAACA281TTCTAACTTCAAAGAATGATGCCAGAAACTTAAAAAGGGG321CTGCGCAGAGTAGCAGGGGCCCTGGAGGGCGCGGCCTGM361TCCTGATTGCCCTTCTGCTGAGAGGACACACGCAGCTGAA401GATGAATTTGGGAAAAGTAGCCGCTTGCTACTTTAACTAT441GGAAGAGCAGGGCCACAGTGAGATGGAAATAATCCCATCA481GAGTCTCACCCCCACATTCAATTACTGAAAAGCAATCGGG521AACTTCTGGTCACTCACATCCGCAATACTCAGTGTCTGGT561GGACAACTTGCTGMGMTGACTACTTCTCGGCCGMGAT601GCGGAGATTGTGTGTGCCTGCCCCACCCAGCCTGACAAGG641TCCGCAAAM1TCTGGACCTGGTACAGAGCAAGGGCGAGGA681GGTGTCCGAGTTCTTCCTCTACTTGCTCCAGCAACTCGCA721GATGCCTACGTGGACCTCAGGCCTTGGCT'GCTGGAGATCG761GCTTCTCCCCTTCCCTGCTCACTCAGAGCAAAGTCGTGGT801CAACACTGACCCAGTGAGCAGGTATACCCAGCAGCTGCGA841CACCATCTGGGCCGTGACTCCAAGTTCGTGCTGTGCTM"G881CCCAGAAGGAGGAGCTGCTGCTGGAGGAGATCTACATGGA921CACCATCA1GGAGCTGGTTGGCTTCAGCAATGAGAGCCTG961GGCAGCCTGAACAGCCTGGCCTGCCTCCTGGACCACACCA1001CCGGCATCCTCAATGAGCAGGGTGAGACCATCTTCATCCT1041GGGTGATGCTGGGGTGGGCAAGTCCATGCTGCTACAGCGG1081CTGC脇GCCTCTGGGCCACGGGCCGGCTAGACGCAGGGG1121TCAAMTCTTCTTCCACTTTCGCTGCCGCATGTTCAGCTG1161CTTCAAGGAAAGTGACAGGCTGTGTCTGCAGGACCTGCTC1201TTCAAGCACTACTGCTACCCAGAGCGGGACCCCGAGGAGG1241TGTTTGCCTTCCTGCTGCGCTTCCCCCACGTGGCCCTCTT1281CACCTTCGATGGCCTGGACGAGCTGCACTCGGACTTGGAC1321CTGAGCCGTGTGCCTGACAGCTCCTGCCCCTGGGAGCCTG1361CCCACCCCCTGGTCTTGCTGGCCAACCTGCTCAGTGGGM1401GCTGCTCAAGGGGGCTAGCAAGCTGCTCACAGCCCGCACA1441GGCATCGAGGTCCCGCGCCAGTTCCTGCGGAAGAAGGTGC1481TTCTCCGGGGCTTCTCCCCCAGCCACCTGCGCGCCTATGC1521CAGGAGGATGTTCCCCGAGCGGGCCCTGCAGGACCGCCTG1561CTGAGCCAGCTGGAGGCCAACCCCAACCTCTGCAGCCTGT1601GCTCTGTGCCCCTCTTCTGCTGGATCATCTTCCGGTGCTT1641CCAGCACTTCCGTGCTGCCTTTGMGGCTCACCACAGCTG1681CCCGACTGCACGATGACCCTGACAGATGTCTTCCTCCTGG1721TCACTGAGGTCCATCTGAACAGGATGCAGCCCAGCAGCCT1761GGTGCAGCGGAACACACACAGCCCAGTGGAGACCCTCCAC1801GCCGGCCGGGACACTCTGTGCTCGCTGGGGCAGGTGGCCC18"ACCGGGGCATGGAGAAGAGCCTCTTTGTCTTCACCCAGGA1881GGAGGTGCAGGCCTCCGGGCTGCAGGAGAGAGACATGCAG1921CTGGGCTTCCTGCGGGCTTTGCCGGAGCTGGGCCCCGGGG1961GTGACCAGCAGTCC潔GAGTTTTTCCACCTCACCCTCCA2001GGCCTTCTTTACAGCCTTCTTCCTCGTGCTGGACGACAGG2041GTGGGCACTCAGGAGCrGCTCAGGITCTTCCAGGAGTGGA2081TGCCCCCTGCGGGGGCAGCGACCACGTCCTGCTATCCTCC2121CTTCCTCCCGTTCCAGTGCCTGCAGGGCAGTGGTCCGGCG2161CGGGAAGACCTCTTCAAGAACAAGGATCACTTCCAGTTCA2201CCAACCTCTTCCTGTGCGGGCTGTTGTCCAAAGCCAAACA2241GAAACTCCTGCGGCATCTGGTGCCCGCGGCAGCCCTGAGG2281AGAAAGCGCAAGGCCCTGTGGGCACACCTGTTTTCCAGC,C2321TGCGGGGCTACCTGAAGAGCCTGCCCCGCGTTCAGGTCGA2361AAGCTTCAACCAGGTGCAGGCC腦CCCACGTTCATCTGG2401ATGCTGCGCTGCATCTACGAGACACAGAGCCAGAAGGTGG2441GGCAGCTGGCGGCCAGGGGCATCTGCGCCAACTACCTCAA2481GCTGACCTACTGCAACGCCTGCTCGGCCGACTGCAGCGCC2521CTCTCCTTCGTCCTGCATCACTTCCCCAAGCGGCTGGCCC2561TAGACCTAGACAACAACAATCTCAACGACTACGGCGTGCG2601GGAGCTGCAGCCCTGCTTCAGCCGCCTCACTGTTCTCAGA2641CTCAGCGTAAACCAGATCACTGACGGTGGGGTAAAGGTGC2681TAAGCGAAGAGCTGACCAAATACAAAATTGTGACCTATTT2721GGGTT窗ACAACAACCAGATCACCGATGTCGGAGCCAGG2761TACGTCACCAAAATCCTGGATGMTGCAAAGGCCTCACGC2801ATCTTAAACTGGGAAAAAACAAAATAACAAGTGAAGGAGG2841GAAGTATCTCGCCCTGGCTGTGAAGAACAGCAAATCAATC2881TCTGAGGTTGGGATGTGGGGCAATCAAGTTGGGGATGAAG2921GAGCAAAAGCCTTCGC織GGCTCTGCGGAACCACCCCAG2961CTTGACCACCCTGAGTCTTGCGTCCAACGGCATCTCCACA3001GAAGGAGGAAAGAGCCTTGCGAGGGCCCTGCAGCAGAACA3041CGTCTCTAGAAATACTGTGGCTGACCCAAAATGAACTCAA3081CGATGAAGTGGCAGAGAGTTTGGCAGAAATGTTGAAAGTC3121AACCAGACGTTAAAGCATTTATGGCTTATCCAGAATCAGA3161TCACAGCTAAGGGGACTGCCCAGCTGGCAGATGCGTTACA3201GAGCAACACTGGCATAACAGAGATTTGCCTAAATGGAAAC3241CTGATAAAACCAGAGGAGGCCAAAGTCTATGMGATGAGA3281AGCGGMTATCTGTTTCTGAGAGGATGCTTTCCTGTTCAT3321GGGGTTTTTGCCCTGGAGCCTCAGCAGCAAATGCCACTCr3361GGGCAGTCTTTTGTGTCAGTGTCTTAAAGGGGCCTGCGCA3401GGCGGGACTATCAGGAGTCCACTGCCTCCATGATGCAAGC3441CAGCTTCCTGTGCAGAAGGTCTGGTCGGCAAACTCCCTM3術GTACCCGCTACAATTCTGCAGAAAAAGAATGTGTCTTGCG3521AGCTGTTGTAGTTACAGTAAATACACTGTGAAGAGACTTT3561ATTGCCTATTATAATTMTTTTATCTGAAGCTAGAGGMT3601AAAGCTGTGAGCAAACAGAGGAGGCCAGCC3641CCAACACCTGCCATAGGGACCAACGGGAGCGAGTTGGTCA3681CCGCTCTTTTCATTGAAGAGTTGAGGATGTGGCACAAAGT3721TGGTGCCAAGCTTCTTGAATAAAACGTGTTTGATGGATTA3761GTATTATACCTGAAATATTTTCTTCCTTCTCAGCACTTTC3801CCATGTATTGATACTGGTCCCACTTCACAGCTGGAGACAC3841CGGAGTATGTGCAGTGTGGGATTTGACTCCTCCAAGGTTT3881TGTGGAAAGrrAATGTCAAGGAAAGGATGCACCACGGGCT3921TTTAATTTTAATCCTGGAGTCTCACTGTCTGCTGGCAAAG3961ATAGAG層GCCCTCAGCTCTTAGCTGGTCTAAGAATGAC4001GATGCCTTCAAMTGCTGCTTCCACTCAGGGCTTCTCCTC4041TGCTAGGCTACCCTCCTCTAGAAGGCTGAGTACCATGGGC■1TACAGTGTCTGGCCTTGGGAAGAAGTGATTCTGTCCCTCC4121纖GAAATAGGGCATGGCTTGCCCCTGTGGCCCTGGCATC4161CAAATGGCTGCTTTTGTCTCCCTTACCTCG4201AAGTCTCTTCCTGCCTCCCAAGCAGCTGAAGGGTGACTAA4241ACGGGCGCCAAGACTCAGGGGATCGGCTGGGAACTGGGCC4281AGCAGAGCATGTTGGACACCCCCCACCATGGTGGGCTTGT4321GGTGGCTGCTCCATGAGGGTGGGGGTGATACTACTAGATC4361ACTTGTCCTCTTGCCAGCTCATTTGTTAATAAAATACTGA4401AAACACTAAAAAAAAAAAAAAANODI蛋白看起來在細菌識別中具有重要作用，可以作為細胞區(qū)室內(nèi)的特異性宿主模式識別受體起作用。近來的研究顯示，NODI是在含有二氨基庚二酸的細菌肽聚糖的宿主識別中所必需的(Chamaillard等人.，淑匿/畫畫/ogy，DOI:10.1038/ni945，June8，2003)。NODI識別的核心組織是二肽，y-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(也稱為iE-DAP)。這種二肽已知僅存在于有限數(shù)量的細菌中(￡^c/en'c/zz'<2co//矛口幾種革蘭氏P日'1"生纟田菌，j列^口Sac"/wssi/6n7^和發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，NODI使細胞對TNFa誘導的細胞凋亡敏感化，并且在缺少任何其他已知的細胞凋亡觸發(fā)的情況下，NODI特異性配體誘導腫瘤細胞中的細胞凋亡。炎^^參,^W傳力^f《說效和強源:rM9Z)/4,*遂化哞^^的#^7。特別地，如此處所示，置入SCID小鼠的MCF-7乳腺腫瘤細胞的異種移植物一般形成肺瘤。然而，稍后，這些肺瘤一般會退化，即使沒有抗肺瘤治療。但是，當NODrAMCF-7腫瘤細胞移植到小鼠中時，腫瘤不會退化，反而繼續(xù)生長(參見附圖10)。當將NOD1功能添加回NodrAMCF-7胂瘤細胞時(通過適合的遺傳構建體的轉(zhuǎn)染)，通過移植這些NODI表達細胞產(chǎn)生的腫瘤現(xiàn)在將會退化。因此，NODI表達可以幫助控制腫瘤細胞生長，并且可以引起腫瘤細胞的細胞凋亡。本發(fā)明還提供了保持了細胞凋亡活性的NODI突變(V41Q)多肽。這種V41Q突變NODI多肽的序列以下作為SEQIDNO:3提供，V41Q突變是粗體和下劃線的。1MEEQGHSEMEI工PSESHPHIQKLKSNRELIiVTHIRNTQCL41gDNLLKNDYFSAEDAEIVCACPTQPDKVRKILDLVQSKGE81EVSEFFLYMiQQIADAYVDLRPWIiE工GFSPSIiTQSKVV121VNTDPVSRYTQQ適腦RDSK昆CYAQKEEliLEElYM161DTIME跳FSNESliGSLNSLac:l:ld證gi函QGETIF工201IjGDAGVGKSM則RLQS腿TGRLDAGVKFFFHFRCRMFS241CFKESDRLCL卿:lfkhycyP:ERDPEEVFAFKLRFTHVAIi281FTFDGIiDELHSD區(qū)srvpdSSCPWEPAHPlv:l;lan:llsg321KliLKGASKIiTARTGIEVPRQFLRKKVIiliRGFSPSHL證361ARRMFPERALQDRLIiSQLEAnpn:lcs:lcsvPLFCWII潔術FGHFRAAFEGSPGLPDC雷IjTDVFLLVTEvh:lnrmqpss441環(huán)麗RSPVETLHAGRDTIiCSLGQVAHRGMEKSLFVFTQ481eevqasglqe畫q:lgf:lraIiPELGPGGDGqsyeff歸:l521QAFFTAFFIjVLDDRVGTQEIi;lrftqewmppAGAATTSCYP561pf:lpfqclqgsgparedlfknkdhfqft肌flcgllskak601aalrrkrkalwah:lfss:lrgYIiKS!lprvgv641esfnqvqamptfiwmlrciyetqsqkvgq:laarg工ca肌681kltycnacsadcsalsfvlhhfpkrla區(qū)d麵lndygv721REIiQPCFSRIjtvlrlsvnqitdggv跳see:ltkykivty761vg廳vtkildeckglthlkLGKNiaTSEG801gky:l磁vknsksisevgmwgnqvgdegakafaea確hp841SliTTLSlASNGISTEGGKSIjARAIiQQNTSIjEILWIjTQNEIi881NDEVAESLAEMLKVNQT躍IiW;LIQNQ工TAKGTAQLADAL921qsntg工te工cl訓likpeeakvyedekriicf突變VWQ存在于Nodi的CARD結構域中，早先被報道破壞Caspase9與Nodi的結合。然而，與表明V41Q突變抑制Nodi依賴性細胞凋亡的早先的結果相反，發(fā)明人進行的實驗顯示V41Q突變多肽在細胞凋亡途徑中是活性的(附圖4)。腫瘤本發(fā)明的組合物和方法在各種癌癥和腫瘤的治療中是有用的，包括但不限于雌激素敏感性腫瘤，以及乳腺、膀胱、宮頸、結腸、膽嚢、腎臟、肝臟、肺、胰腺、卵巢、前列腺、皮膚、胃、曱狀腺等等的胂瘤。在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物可以用于治療或預防癌癥，例如膀胱、乳腺、結腸、腎臟、肝臟、肺，包括小細胞肺癌、食道、膽嚢、卵巢、胰腺、胃、宮頸、曱狀腺、前列腺和皮膚，包括鱗狀細胞癌的癌癥；淋巴系統(tǒng)的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、Hodgkin's淋巴瘤、非Hodgkin's淋巴瘤、毛纟田胞淋巴瘤和Burkett's淋巴瘤；骨髓系統(tǒng)的造血腫瘤，包括急性和慢性粒性白血病、脊髓發(fā)育不良綜合征和早幼粒細胞性白血?。婚g質(zhì)起源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；中央和外周神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、膠質(zhì)瘤和許旺氏細胞瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、著色性干皮病、keratoxanthoma、曱狀腺濾泡癌癥和Kaposi's肉瘤。在某些實施方式中，本發(fā)明可以用于治療或預防乳腺癌癥和肺瘤。例如，N0D1多肽、Nodl核酸、可以提高NOD1表達或活性試劑，或其組合，可以單獨地、與其他因子例如TNF組合地至少到腫瘤內(nèi)或鄰近腫瘤，來引起胂瘤細胞經(jīng)歷細胞凋亡。因而，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療癌癥。調(diào)節(jié)NOD1表達和活性根據(jù)本發(fā)明的，提高的N0D1表達和/或N0D1活性促進了腫瘤的退化。因此，本發(fā)明提供了治療和防止哺乳動物中腫瘤生長的方法，通過向所述哺乳動物施用N0D1多肽、Nodl核酸、提高N0D1表達和/或活性的試劑、或其組合。提高N0D1表達或活性的試劑包括可以提高N0D1的轉(zhuǎn)錄、翻譯或活性的任何試劑。因而，通過施用NOD1多肽(例如，SEQIDNO:1)、編碼N0D1多肽的核酸(例如，包含SEQIDNO:2的核酸)，腫瘤退化的發(fā)生率可以被提高或促進。編碼N0D1的核酸可以置于表達盒中，和/或在載體中維持，以便操作、表達和復制。以下更詳細地說明了產(chǎn)生編碼N0D1并且可以表達NODl多肽的核酸的方法。提高N0D1表達或活性的試劑包括增強N0D1活性的小的肽基配體。例如，y-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、"D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D誦Ala-L畫Glu-二氨基庚二酸(fTriDAP)和其組合，可以提高N0D1表達或活性。在某些實施方式中，僅Y-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)或僅Y-D-Gln-DAP(iQ-DAP)，或僅D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(Y丁riDAP)被使用或施用。在其他實施方式中，y-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、Y-D-Gln-DAP(iQ-DAP)和/或D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(fTriDAP)的組合被使用或施用。本發(fā)明進一步提供了在受試者中調(diào)節(jié)NODI活性的方法，包括提供能夠改變受試者的NODI活性的試劑；在一定條件下向受試者施用所述試劑，從而改變受試者的NODI活性。在某些實施方式中，向受試者施用所述試劑引起受試者內(nèi)腫瘤的退化。本發(fā)明不局限于特定的化合物。實際上，各種化合物是期待的，包括但不限于，包含D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(yTriDAP)的肽、谷氨酰胺-二氨基庚二酸二肽和包含谷氨酸-二氨基庚二酸二肽(例如，iE-DAP、iQ-DAP、iE-DAP或iQ-DAP的類似物、正-DAP或iQ-DAP的小分子模擬物)的肽。聯(lián)合治療本發(fā)明預期采用NOD1促進劑和其他可用的抗腫瘤治療劑的組合的組合物和方法。常規(guī)的抗腫瘤劑的劑量通常保持盡可能低，因為在較高的劑量可能觀察到副作用。根據(jù)本發(fā)明，NOD1和/或提高NOD1表達或活性的試劑與可用的抗腫瘤劑的組合，可以改善所述抗腫瘤劑有效的癌癥的范圍(spectrum),并且降低所需的所述抗腫瘤劑的劑量。因而，本發(fā)明預期當前的NOD1相關試劑與一種或多種抗腫瘤或制癌試劑的組合。本領域技術人員可獲得的任何抗腫瘤和制癌試劑可以與當前的NOD1相關試劑一起使用。然而，在某些實施方式中，選擇的抗肺瘤或抗癌試劑具有不同的作用機制，或針對多少不同類型的癌癥或腫瘤起作用。例如，本發(fā)明的NODl相關試劑可以與制癌試劑或免疫活化劑組合，來組合NOD1的前細胞凋亡效果以及所述制癌試劑的抗贅生效果，和/或由所述免疫活化劑誘導的前免疫反應。進一步的，在某些情況下，除了這些方法之外進行放療或外科治療來改善治療的效果?？梢耘c本發(fā)明的NOD1相關試劑一同使用的其他化學治療劑的實例包括六曱密胺、博來霉素、馬利蘭、亞葉酸鈣、卡培他濱、卡鉑、卡氮芥、苯丁酸氦芥、順鉑、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、放線菌素、紅比霉素、多西他賽、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體阿霉素、環(huán)己亞硝脲、苯丙氨酸氮芥、巰基嘌呤、氨曱蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、噴司他丁、曱基千肼、雷替曲塞、鏈脲霉素、優(yōu)福定、泰莫佐羅、硫替派、巰基鳥噪呤/硫鳥嘌呤、拓樸替康、蘇消安、長春花堿、長春新石成、去乙酰長春酰胺、長春烯石咸和其組合。在某些實施方式中，與一種或多種激素聯(lián)合施用NOD1相關試劑。例如，可以與一種或多種雄激素、黃體酮、雌激素或抗雌激素聯(lián)合施用NOD1相關試劑。通過向?qū)Υ萍に仄鸱磻募毎蚪M織發(fā)揮對抗效應，或通過與雌激素竟爭位于細胞表面的受體位點，抗雌激素起作用。例如，藥物它莫西芬(商品名Nolvadex)或Arimidex(Anastrozole)是可以使用的抗雌激素。它莫西芬已經(jīng)用于乳腺癌的治療，并用以降低高風險婦女中的乳腺癌發(fā)病率。如在此所示的，添加它莫西芬部分地阻斷了丫TriDAP-Nodl誘導的細胞死亡。因此，在某些情況下，它莫西芬可以不用于本發(fā)明的NOD1組合物中。然而，在其他例子中，當被包括在包含了NOD1試劑施用的治療方案中時，它莫西芬可能是有用的。在另一個實施方式中，本發(fā)明的NOD1相關試劑與腫瘤壞死因子cc(TNFa)聯(lián)合施用。TNFcc是商業(yè)上可獲得的，例如，來自Pro-SpecTanyTechnoGeneLtd.(Israel)。腫瘤壞死因子的序列可以在ncbi.nlm.mh.gov的NCBI數(shù)據(jù)庫中找到。人類TNFoc的序列的一個實例以下在SEQIDNO:4中提供。1MSTESMIRDVEL應ALPKKTGGPQGS訓LFLSLFSFU41VAGATTLFCIiLHFGVIGPQREESPRDLSUSPLAQAVRSS81S證SDKPVAHWANPQAEGQLQWLNRRANAIAANGVEiLR121DNQIjWPSEGLYIilYSQVLFKGQGCPSTHVIi!L窗ISR工a161VSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVF201OLEKGDRLSAE皿PDYLDFAESGQVYFGIIAL細胞凋亡如在此描述的，NODI可以促進肺瘤細胞的細胞凋亡。為了治療或防止腫瘤生長，本領域技術人員可以選擇采用抗腫瘤劑與在此描述的NODI相關試劑的組合。含有各種抗腫瘤劑以及本發(fā)明的NODI相關試劑的組合物，可以在本領域技術人員可用的各種方法中測試，來確定這些組合物是否最佳地促進腫瘤退化和/或肺瘤細胞的細胞凋亡。例如，通過檢測細胞凋亡期間產(chǎn)生的DNA片段的3'-OH游離末端的TUNEL(TdT介導的dUTP斷口-末端標記)標記，可以分析細胞凋亡(Gavneli等人.(1992)J.CellBiol.119:493)。TUNEL分析一般包括向180-bp(堿基對)的寡聚DNA片段添加催化地添加核苷酸以檢測所述片段，所述核苷酸以及與發(fā)色團系統(tǒng)結合或與熒光標簽結合。180-bp寡聚體的DNA階梯的存在是細胞凋亡的指示。根據(jù)TUNEL方法檢測細胞死亡的步驟是商業(yè)上可獲得的，例如，來自BoehringerMannheim(CellDeathi式齊寸盒)和Oncor(apoptagPlus)。當前可獲得的另一個細胞凋亡標志物是annexin，以商標APOPTESTTM銷售。annexin標志物被用于"細胞凋亡檢測試劑盒，，中，其也是商業(yè)上可獲得的，例如，來自R&DSystems。在細胞凋亡期間，細胞膜的磷脂不對稱性改變，從而磷脂被暴露在外膜上。Annexins是在存在鈣的情況下結合磷脂的蛋白質(zhì)的同源物組。第二試劑可以用于與檢測annexin的試劑碘化丙錠(PI)連接，其是DNA結合焚光染料。當細胞群體暴露于兩種試劑時，細胞凋亡的細胞對于annexin陽性地染色，對于PI陰性地染色，壞死的細胞對于兩者都是染色陽性的，而活細胞對于兩者是染色陰性的。測試細胞凋亡的其他方法是本領域已知的，可以用于本發(fā)明的方法中。腫瘤退化可以通過使用動物模型來評定，例如，本領域技術人員可獲得的任何動物模型，或在此描述和說明的異種移植模型。異種移植模型本發(fā)明還提供了異種移植模型，其包括能夠在小鼠中形成腫瘤的細胞系。當用這些異種移植細胞接種小鼠時，腫瘤出現(xiàn)。本發(fā)明的異種移植細胞系缺少Nodi功能，在此有時稱為Nod卜細胞。令人驚訝地，具有相同遺傳背景、除了存在與零Nodl等位基因相對的野生型之外的細胞，形成很快退化的紳瘤。僅缺乏Nodi功能的Nod卜細胞形成繼續(xù)生長的腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的，這些分離的Nodl;細胞對于研究腫瘤和胂瘤退化是有用的。本發(fā)明的Nodl^細胞因而可以用于開發(fā)化學治療劑，和用于研究肺瘤發(fā)生的機制。26本發(fā)明的分離的Nod1,細胞系的一個實例是MCF-7C20細胞系。當C20克隆被移植到雄性小鼠中時，發(fā)明人觀察到了更健壯的腫瘤生長。聚合酶鏈式反應擴增研究確定了，在MCF-7C20細胞中，和在重組導入了功能性的N0D1等位基因的MCF-7C20細胞(即，C20Nodl細胞)中，沒有孕激素受體。進一步的PCR研究揭示了，雌激素受體oc存在于所有三種MCF7細胞類型(野生型MCF-7細胞、MCF-7C20細胞和MCF-7C20Nodl細胞)的每一種中。Nodl表達盒和載體根據(jù)本發(fā)明的，NOD1多肽可以重組地產(chǎn)生，然后純化，用于作為抗胂瘤劑向受試者施用。在另一個實施方式中，編碼NOD1的核酸可以置于表達盒和/或表達載體中。這些NOD1表達盒和表達載體也可以作為抗胂瘤劑向受試者施用。因此，本發(fā)明提供了Nodl表達盒和Nodl表達載體。NOD1多肽的哺乳動物表達可以如Dijkema等人.，EMBOJ.(1985)4:761,Go謹n等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777,Boshart等人.,Cell(1985)41:521和美國專利No.4,399,216中描述的實現(xiàn)。哺乳動物表達的其他特征可以如HamandWallace,Meth.Enz.(1979)58:44，BarnesandSato,Anal.Biochem.(1980)102:255，美國專利Nos.4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655，WO90/103430、WO87/00195和美國專利No.RE30,985中描述的來便利化。使用這種Nodl核酸可以增加或替換內(nèi)源Nodl基因的表達。Nodl核酸可以置于線性或環(huán)形分子內(nèi)。它們可以置于自主復制的分子內(nèi)，或沒有復制序列的分子內(nèi)。它們可以通過它們自身，或通過其他調(diào)節(jié)序列來調(diào)節(jié)，這是本領域已知的。編碼NODI的核酸構建體可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，例如，啟動子元件、增強子或UAS元件，和轉(zhuǎn)錄終止子信號，用于控制Nodl序列在細胞中的轉(zhuǎn)錄。Nodl核酸可以用于表達盒或基因遞送載體中，以向細胞、優(yōu)選的真核細胞中遞送NodlmRNA、全長NODl蛋白、NODI融合蛋白、NODI多肽，或NODI多肽的片段。根據(jù)本發(fā)明，基因遞送載體可以是，例如，棵質(zhì)粒DNA，病毒表達載體，或連同脂質(zhì)體或凝聚劑的本發(fā)明的Nodl核酸。胞中，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白聚陽離子介導的DNA轉(zhuǎn)移，用棵的或密封的核酸轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導的DNA轉(zhuǎn)移、DNA包被的乳液珠子細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、原生質(zhì)體融合、病毒感染、電穿孔、核酸微注射步驟的使用和磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述基因遞送載體包含啟動子和NOD1編碼核酸?？梢允褂玫膯幼拥膶嵗ńM織特異性啟動子和通過細胞增殖激活的啟動子，例如胸苷激酶和胸苷酸合成酶啟動子。其他優(yōu)選的啟動子包括通過病毒的感染激活的啟動子，例如oc-和(3-干擾素啟動子，和可以被激素例如雌激素激活的啟動子?？梢允褂玫钠渌麊幼影∕oloney病毒LTR、CMV啟動子和小鼠白蛋白啟動子。基因遞送載體可以包含病毒序列，例如病毒復制起點或包裝信號。這些病毒序列可以選自例如星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、畐ij粘病毒、纟田小病毒、孩i小RNA病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、togavirus或腺病毒的病毒。在某些實施方式中，所述基因遞送載體是重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和其各種用途以及在許多參考文獻中描述了，包括，例如Mann等人.，Cell33:153,1983，CaneandMulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6349，1984,Miller等人.，HumanGeneTherapy1:5-14，1990，美國專利Nos.4,405,712、4,861,719和4,980,289以及PCT申請Nos.WO8衡,468、WO89/05,349和WO90/02,806?？梢栽诒景l(fā)明中使用許多逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體，包括例如在EP0,415,731;WO90/07936;WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;美國專利No.5,219,740;WO9311230;WO9310218;VileandHart，CancerRes.53:3860-3864,1993;VileandHart，CancerRes.53:962-967,1993;Ram等人，CancerRes.53:83-88，1993;Takamiya等人.，J.Neurosd.Res.33:493-503,1992;Baba等人.，J.Neurosurg.79:729-735，1993(美國專利No.4,777,127、GB2,200,651、EP0,345,242和W091102805中描述的那些。可以利用的逆轉(zhuǎn)錄病毒的實例包括禽白血病病毒(ATCCNos.VR-535和VR-247)、牛白血病毒(VR-1315)、鼠白血病毒(MLV)、貂細胞灶誘導病毒(KocheUl.，J.Vir.49:828,1984;和Oliff等人.，J.Vir.48:542，1983)、鼠肉瘤病毒(ATCCNos.VR-844,45010和45016)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(ATCCNos.VR-994、VR-770和45011)、勞氏肉瘤病毒、Mason-Pfizer猴病毒、狒狒內(nèi)生病毒、內(nèi)源的貓科逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，RD114)和用作逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的小鼠或大鼠gL30序列。從中可以產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的MLV毒抹包括4070A和1504A(HartleyandRowe,J.Vir.19:19,1976)、Abelson(ATCCNo.VR-999)、Friend(ATCCNo.VR-245)、Graffi(Ru等人.，J.Vir.67:4722，1993;和YantchevNeopksma26:397,1979)、Gross(ATCCNo.VR-590)、Kirsten(Albino等人.,J.Exp.Med.164:1710，1986)、Harvey肉瘤病毒(Manly等人，J.Vir.62:3540,1988;和Albino等人，J.Exp.Med.164:1710，1986)和Rauscher(ATCCNo.VR-998)以及MoloneyMLV(ATCCNo.VR-190)?？梢允褂玫姆切∈竽孓D(zhuǎn)錄病毒是勞氏肉瘤病毒，例如Bratislava(Manly等人.，J.Vir.62:3540,1988;和Albino等人.，J.Exp.Med.164:1710,1986)、Bryan高滴度(例如，ATCCNos.VR-334,VR-657,VR-726,VR-659和VR曙728)、Bryan標準(ATCCNo.VR國140)、Carr-Zilber(Adgighitov等人.，Neoplasma27:159,1980)、Engelbreth-Holm(Laurent等人.，BiochemBiophysActa908:241，1987)、Harris、Prague(例如，ATCCNos.VR-772,和45033)或Schmidt-Ruppin(例如ATCCNos.VR-724、VR-725、VR-354)病毒。根據(jù)在此提供的公開和標準的重組技術(例如，Sambrook等人.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，2ndEdition(1989),Sambrook等人.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition(2001)以及Kunkle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:488，1985)，可以容易地使用上述逆轉(zhuǎn)錄病毒的任一種來組合或構建逆表達基因遞送載體。逆表達表達載體的部分可以來自不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR可以衍生自鼠肉瘤病毒，來自勞氏肉瘤病毒的tRNA結合位點，來自鼠白血病毒的包裝信號，以及來自禽白血病病毒的第二鏈合成起點。通過導入合適的包裝細胞系，這些重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)導感受態(tài)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒(參見，1991年11月29日體積的系列No.071800,921)。可以產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，其指導重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組向宿主細胞DNA的特定區(qū)域的位點特異性整合。這種位點特異性整合對于突變或替換內(nèi)源NODI基因是有用的。通過摻入到逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中的嵌合的整合酶，可以介導位點特異性整合(參見，1995年5月22日提交的系列No.08/445,466)。優(yōu)選的是，重組病毒基因遞送載體是復制缺陷的重組病毒。適合與上述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體使用的包裝細胞系可以容易地制備(參見WO92/05266)，并用于產(chǎn)生生產(chǎn)者細胞系(也稱為載體細胞系或"VCL")用于重組病毒顆粒的生產(chǎn)。在本發(fā)明的某些實施方式中，包裝細胞系由人類(例如HT1080細胞)或貂母細胞系制成，從而容許產(chǎn)生能夠在人類血清的鈍化中存活的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體。這種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體的構建在WO91/02805中詳細描述了。這些重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因遞送載體可以用于通過將它們導入合適的包裝細胞系來產(chǎn)生轉(zhuǎn)導感受態(tài)的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。類似地，根據(jù)在此提供的公開(還參見，Berkner，Biotechniques6:616-627，1988和Rosenfeld等人,Science252:431-434，1991、WO93/07283，WO93/06223和WO93/07282)，可以容易地制備和使用腺病毒基因遞送載體。基因遞送載體也可以是重組腺病毒基因遞送載體。根據(jù)在此提供的公開和本領域可獲得的信息(參見，例如Berkner，Biotechniques6:616,1988以及Rosenfeld等人.，Science252:431,1991,WO93/07283,WO93/06223和WO93/07282)，可以容易地制備和使用這種工具。也可以構建和使用腺相關病毒基因遞送載體來體內(nèi)或體外地遞送本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸到細胞中。在Chatteijee等人.，Science258:1485-1488(1992),Walsh等人.,Pro"Natl.Acad.Sci.89:7257-7261(1992)，Walsh等人.,J.Clin.Invest94:1440-1448(1994)，F(xiàn)lotte等人.，J.Biol.Chem.268:3781-3790(1993)，Ponnzhagan等人.，J.Exp.Med.179:733-738(1994)，Miller等人,Proc.NatlAcad.Sci.91:10183-10187(1994),Emerhand等人，GeneTher.2:336-343(1995)，Luo等人，Exp.Hematol.23:1261-1267(1995)和Zhou等人，GeneTherapy3:223-229(1996)中描述了腺相關病毒基因遞送載體的體外使用。這些工具的體內(nèi)使用在Flotte等人.，Proc.NatlAcad.Sci.90:10613-10617(1993)以及Kaplitt等人，NatureGenet.8:148-153(1994)中描述了。在本發(fā)明的另一個實施方式中，基因遞送載體來自被膜病毒。這種被膜病毒包括甲病毒，例如在1995年3月15日添加的美國系列號No.08/405,627，WO95/07994中描述的。曱病毒，包括Sindbis和ELVS病毒，可以是用于本發(fā)明的核酸的基因遞送載體。在WO94/21792、WO92/10578和WO95/07994中描述了曱病毒?？梢詷嫿ê褪褂脦追N不同的甲病毒屬基因遞送載體來根據(jù)本發(fā)明將核酸遞送到細胞中。這種系統(tǒng)的代表性實例包括在美國專利NO.5,091,309和5,217,879中描述的那些。在某些實施方式中，用于本發(fā)明的甲病毒屬基因遞送載體包括在WO95/07994中描述的那些。重組病毒載體也可以是基于Sindbis病毒的重組曱病毒屬病毒載體?？梢匀菀椎刂苽銼indbis構建體，以及許多類似的構建體。Sindbis病毒基因遞送載體一般包含能夠啟動Sindbis病毒轉(zhuǎn)錄的5'序列、編碼Sindbis非結構蛋白的核苦酸序列、被鈍化以防止片段轉(zhuǎn)錄的病毒連接區(qū)，以及SindbisRNA聚合酶識別序列。任選的，病毒連接區(qū)可以被修改，從而核酸轉(zhuǎn)錄被降低、提高或維持。本領域的普通技術人員將理解的是，來自其他甲病毒的相應區(qū)域可以在上述那些中使用。曱病毒衍生的基因遞送載體的病毒連接區(qū)可以包含第一病毒連接區(qū)，其已經(jīng)被鈍化以阻止核酸的轉(zhuǎn)錄，和第二病毒連接區(qū)，其已經(jīng)被修飾從而核酸轉(zhuǎn)錄被降低。曱病毒衍生的載體也可以包括能夠從cDNA啟動病毒RNA的合成的5'啟動子，以及控制轉(zhuǎn)錄終止的3'序列?？梢栽诒景l(fā)明中使用的其他重組被膜病毒基因遞送載體包括來自SemlikiForest病毒(ATCCVR國67;ATCCVR-1247)、Middleberg病毒(ATCCVR-370)、羅斯河病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)、委內(nèi)端拉馬腦炎病毒(ATCCVR923;ATCCVR-1250;ATCCVR-1249;ATCCVR-532)的那些，以及在美國專利5,091，309和5,217,879中，和在WO92/10578中描述的那些。適用于本發(fā)明的其他病毒基因遞送載體包括，例如，來自脊髓灰質(zhì)炎病毒(Evans等人.，Nature339:385,1989,和Sabin等人，J.Biol.Standardization1:115，1973)(ATCCVR-58);鼻病毒(Arnold等人.,J.Cell.Biochem.L401,1990)(ATCCVR-1110);疽病毒，例如金絲雀痘病毒或牛痘病毒(Fisher-Hoch等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.86:317,1989;Flexner等人.,Ann.N.Y.Acad.Sci.569:86，1989;Flexner等人，Vaccine8:17,1990;美國專利Nos.4，603，112和4,769,330;WO89/01973)(ATCCVR-111;ATCCVR-2010);SV40(Mulligan等人.,Nature277:108，1979)(ATCCVR-305)，(Madzak等人，J.Gen.Vir.73:1533,1992);流感病毒(Luytjes等人.，Cell59:1107,1989;McMicheal等人.，TheNewEnglandJournalofMedicine309:13,1983;和Yap等人.，Nature273:238,1978)(ATCCVR-797);細小病毒，例如腺病毒相關病毒(Samulski等人.，J.Vir.63:3822，1989,和Mendelson等人，Virology166:154，1988)(ATCCVR-645);單純性皰滲病毒(Kit等人.，Adv.Exp.Med.Biol.215:219，1989)(ATCCVR-977;ATCCVR-260);Nature277:108，1979);人類免疫缺陷性病毒(EPO386,882，Buchschacher等人.,J.Vir.66:2731，1992);麻滲病毒(EPO440,219)(ATCCVR-24);A(ATCCVR-67;ATCCVR-1247),Aura(ATCCVR-368)，Bebaru病毒(ATCCVR-600;ATCCVR-1240),Cabassou(ATCCVR-922),Chikimgunya病毒(ATCCVR-64;ATCCVR-1241)，F(xiàn)ortMorgan(ATCCVR-924),Getah病毒(ATCCVR-369;ATCCVR-1243)，Kyzylagach(ATCCVR-927)，Mayaro(ATCCVR-66)，Mucambo病毒(ATCCVR-580;ATCCVR-1244)，Ndumu(ATCCVR-371),Pixuna病毒(ATCCVR-372;ATCCVR-1245),Tonate(ATCCVR-925),Triniti(ATCCVR-469),Una(ATCCVR-374),Whataroa(ATCCVR-926),Y-62誦33(ATCCVR陽375)，O'Nyong病毒，東方腦炎病(ATCCVR-65;ATCCVR-1242),西方腦炎病毒(ATCCVR-70;ATCCVR-1251;ATCCVR-622;ATCCVR-1252),和冠狀病毒(Hamre等人.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.121:190,1966)(ATCCVR-740)。本發(fā)明的核酸也可以與凝聚劑組合來形成基因遞送載體。在某些實施方式中，所述凝聚劑是聚陽離子，例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、魚精蛋白、精胺、亞精胺和腐肉胺。在凝聚劑和核酸之間產(chǎn)生連接的許多適合的方法是本領域已知的(參見，例如，1994年12月30日提交的系列號No.08/366,787)。在選擇性的實施方式中，Nodi核酸或Nodi多肽與脂質(zhì)體締合來形成基因遞送載體。脂質(zhì)體是小的、脂質(zhì)泡嚢，由被脂雙分子層封閉的含水區(qū)室組成，一般是球形或稍微長形的結構，直徑數(shù)百埃。在適合的條件下，脂質(zhì)體可以與細胞的質(zhì)膜融合，或與內(nèi)在化了脂質(zhì)體的細胞內(nèi)的內(nèi)吞泡嚢的膜融合，從而釋放它的內(nèi)容物到細胞質(zhì)中。然而，在與細胞的表明相互作用之前，脂質(zhì)體膜作為相對不可滲透的層起作用，其隔離并保護了它的內(nèi)含物，例如，遠離降解性酶。此外，由于脂質(zhì)體是合成的結構，可以產(chǎn)生包含期望的特征的特別設計的脂質(zhì)體。參見Stryer,Biochemistry,pp.236-240，1975(W.H.Freeman,SanFrancisco,Calif);Szoka等人.，Biochim.Biophys.Acta600:1，1980;Bayer等人.，Biochim.Biophys.Acta.550:464,1979;Ri窗y等人.，Meth.Enzymol.149:119，1987;Wang等人.，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.84:7851,1987,Plant等人.，Anal.Biochem.176:420,1989,以及美國專利No.4,762,915。脂質(zhì)體可以密封各種核酸和多肽分子，包括DNA、RNA、質(zhì)粒、包含在本發(fā)明中公開的那些核酸的表達構建體，和Nodi多肽。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制品包括陽離子的(帶正電的)、陰離子的(帶負電的)和中性的制品。陽離子脂質(zhì)體已經(jīng)顯示了介導質(zhì)粒DNA(Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7416,1987)、mRNA(Malone等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6077-6081,1989)和純化的轉(zhuǎn)錄因子(Debs等人，J.Biol.Chem,265:10189-10192,1990)以功能形式的細胞內(nèi)遞送，陽離子脂質(zhì)體是容易獲得的。例如，N[l-2，3-dioleyIoxy)丙基]-N,N,N-三乙基胺(DOTMA)脂質(zhì)體是以商標LipofectinTM可從GIBCOBRL,GrandIsland,N.Y獲得的。還參見Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US491:5148-5152.87，1994。其他商業(yè)上可獲得的脂質(zhì)體包括Transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其他陽離子脂質(zhì)體可以從易于獲得的材料使用本領域可用的技術來制備。對于DOTAP(1,2-二(油?；趸?-3-(三曱基胺)丙烷)脂質(zhì)體的合成，參見，例如Szoka等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:4194-4198，1978;和WO90/11092。類似地，陰離子和中性脂質(zhì)體是容易獲得的，例如從AvantiPolarLipids(Birmingham,Ala.),或可以使用易于獲得的材料容易地制備。這些材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二油?；字８视?DOPG)、二油?；字Ｒ掖及?DOPE)等。這些材料也可以與DOTMA和DOTAP起始材料以適合的比例混合。使用這些材料制造脂質(zhì)體的方法是本領域公知的。脂質(zhì)體可以包括多層泡嚢(MLV)、小單層泡嚢(SUV)或大單層泡嚢(LUV)。使用本領域已知的方法制備各種脂質(zhì)體-核酸復合物。參見，例如Stmubinger等人，METHODSOFIMMUNOLOGY(1983),Vol.101，pp.512-527;Szoka等人.,Proc.Natl.Acad.Sd.USA87:3410-3414，1990;Papahadjopoulos等人，Biochim.Biophys.Acta394:483，1975;Wilson等人.，Cell17:77,1979;DeamerandBangham,Biochim.Biophys.Acta443:629，1976;Ostro等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.76:836，1977;Fraley等人.，Proc.Natl.AcadSci.USA76:3348，1979;EnochandStrittmatter,Proc.Natl.AcadSci.USA76:145,1979;Fraley等人.，J.Biol.Chem.255:10431，1980;SzokaandPapahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:145,1979;以及Schaefer-Ridder等人.，Science215:166，1982。此外，可以包括脂蛋白與本發(fā)明的核酸一同用于向細胞遞送。這種脂蛋白的實例包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。也可以使用這些蛋白的突變體、片段或融合物。也可以使用天然發(fā)生的脂蛋白的修飾體，例如乙?；腖DL。這些脂蛋白可以將核酸的遞送把向表達脂蛋白受體的細胞。在某些實施方式中，如果脂蛋白與核酸一同包括，在組合物不包括其他耙向配體。也可以使用Nodi核酸向特定組織的受體介導的靶向遞送。在例如Findeis等人.(1993)，TrendsinBiotechnol.11,202-05;Chiou等人.(1994),GeneTherapeutics:MethodsandApplicationsofDirectGeneTransfer(J.A.Wolff,ed.);Wu&Wu(1988),J.Biol.Chem.263,621-24;Wu等人.(1994)，J.Biol.Chem.269,542-46;Zenke等人.(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，3655-59;Wu等人.(1991),J.Biol.Chem.266，338-42中描述了受體介導的DNA遞送技術。在另一個實施方式中，棵露核酸分子被用作基因遞送載體，例如，如WO90/11092和美國專利No.5,580,859中描述的。這種基因遞送載體可以是DNA或RNA,在某些實施方式中，與滅活的腺病毒連接。Curiel等人.，Hum.Gene.Ther.3:147-154,1992。其他適合的載體包括DNA-配體(Wu等人.，J.Biol.Chem.264:16985-16987,1989)、脂質(zhì)國DNA組合物(Feigner等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:74137417,1989)、脂質(zhì)體(Wang等人，Proc.Natl.AcadSd.84:7851-7855，1987)和微注射(Williams等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.88:2726-2730，1991)。通過將核酸包被在生物可降解的乳液珠子上，可以提高棵露的核酸攝取入細胞的效力。這種方法利用了觀察結果，當在培養(yǎng)中與細胞孵育時，乳液珠子被有效地轉(zhuǎn)運和濃縮在細胞的核周區(qū)域。當注射到肌肉中時，然后珠子將被轉(zhuǎn)運到細胞中。在由乳液珠子啟動的內(nèi)吞作用之后，核酸包被的乳液珠子將被有效地轉(zhuǎn)運到細胞中，因而提高基因轉(zhuǎn)移和表達效力。這種方法可以通過處理珠子來提高它們的疏水性，從而促進內(nèi)涵體的破壞和核酸向細胞質(zhì)中的釋力欠來進一步改善。編碼NODI的核酸可以按類似方式導入細胞中。機械方法，例如顯微注射、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔或磷酸4丐沉淀，可以用于將NODI核酸構建體導入細胞中，促進細胞凋亡和/或腫瘤細胞死亡。做為選擇，如果希望細胞穩(wěn)定地保持DNA構建體，DNA構建體可以在質(zhì)粒上提供，并作為獨立的元件維持，或整合到細胞的基因組中，這是本領域已知的。內(nèi)源NODI基因在細胞中的表達也可以通過同源重組與內(nèi)源NODI基因按讀碼框地導入DNA構建體來改變，所述DNA構建體包含NODI目標序列、調(diào)節(jié)序列、外顯子和未配對的剪接供體部位，從而形成包含所述DNA構建體的同源重組細胞。新的轉(zhuǎn)錄單位可以用于如希望的打開或關閉NODI基因。影響內(nèi)源基因表達的這種方法美國專利No.5,641,670中教導了。釋放的NODI核酸向細胞系或組織的基因組中的整合可以通過本領域已知的方法來監(jiān)視。例如，可以進行遞送的NOD1核酸的Southern印跡。遞送的核酸的片段的大小方面的改變指示整合。遞送的核酸的復制可以特別通過檢測標記的核苷酸的摻入、結合與NODI探針雜交來;f全測。NODI核酸的表達可以通過^r測與遞送的核酸雜交的NODImRNA的產(chǎn)生，或通過檢測NODI蛋白來監(jiān)視。NODI蛋白可以免疫檢測。RIP2調(diào)節(jié)劑根據(jù)本發(fā)明的，當"激酶缺陷的"RIP2在細胞中表達時，細胞對于細胞凋亡被敏化。如在此使用的，"激酶缺陷的"RIP2是指基本上沒有激酶功能的RIP2多肽。因此，本發(fā)明提供了沒有激酶功能的RIP2多肽，RIP2激酶抑制劑以及用于表達激酶缺陷的RIP2的表達盒和表達載體。RIP2是絲氨酸/蘇氨酸激酶，其在它的羧基末端含有CARD結構域，并且顯示了在過量表達系統(tǒng)中誘導NF-kB活化。RIP2還顯示了在調(diào)節(jié)先天和適應性免疫反應中起到作用。Rip2缺陷的小鼠僅僅具有針對Toll樣受體激動劑，例如脂多糖(LPS)的減弱的免疫反應。RIP2的序列可以在例如NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得。參見網(wǎng)站ncbi.nlm.mh.gov。例如，人類RIP2的一個氨基酸序列在以下提供以便參考，為SEQIDNO:5(NCBI登記號碼AAC27722;gi:3342910)。1MNGEAICSALPT工PYHKLAD面IiSRGASGTVSSARHADW41ihtphdserkdvlreaeilHKARFSYIIjP81工lg工cnepee1lgivteympngs:lneujHrkteypdvawp;l121RFR工LHEIALGVNY函MTPP:LI)HHDIiKTGNIL副EFHV161KIADFGLSKWRMMSLS卿SSKSAPEGGTIIYMPPENYEP201gqksras而diysyavitwEVIiSRKQPFEdvtnp;lqimy241svsgghrpvinees:lpydiphrarmisuesgwaqnpder281psf:lkc;l工e;lepv;lrtfee工tfleaviq:lkktklqsvssa321ih:lcdkkkme:ls:ln:ipvnhgpqeescgssqlhensgspet361SRSLPAPQDNDETiSR,DCYFMKLHHCPGNHSWDST工SG401SQRAAFCDHKTTPCSSMINPESTAGNSERLQPG工AQQW工441QSKREDIVNQmteac,sldaklsrd;l工mkedyelvstk481P潔SKV,LDTTDIGGEEFAKVIVQKLKDNKQMGLQPY521PEIIjWSRSPSIiNKLQNKSM如上所指出的，以及在實施例中更詳細地說明的，當RIP2的另一個結構域和功能(例如，CARD結構域)主要是功能性的時，表達激酶缺陷的RIP2的細胞對于細胞凋亡被敏化。因此，本發(fā)明涉及通過用可以抑制RIP2激酶的試劑接觸細胞使細胞對細胞凋亡敏化的方法。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過向哺乳動物施用治療有效量的RIP2激酶抑制劑來在動物中治療癌癥的方法。RIP2激酶抑制劑也可以與N0D1多肽或Nodl核酸，或調(diào)節(jié)N0D1活性的試劑聯(lián)合施用。任何可用的RIP2抑制劑可以在本發(fā)明的組合物和方法中使用，在某些實施方式中，可以使用p38抑制劑來抑制RIP2激酶功能。例如，可以用于抑制RIP2的p38抑制劑包括2-(4-氯苯基)-4-(4-氟苯基)-5-嘧啶-4-基-1,2-二氫-吡唑啉酮-3、SC68376、SB203580(Iodo)、SB202190、SB203580、SB203580(砜)、PD169316、SB220025、SKF-86002、SB239063或ML3163。以下才是供了SB220025、SB203580和PD169316的結構。這些抑制劑可以在與用丁開刷pJ6的,厭?！贡饶恋腶在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了通過觀察測試試劑是否可以抑制RIP2激酶活性來鑒定RIP2抑制劑的方法。這種方法可以在體外或體內(nèi)進行。在缺乏測試試劑的情況下進行RIP2分析時，可以包括對照物。在存在測試試劑的情況下RIP2活性降低表明所述測試試劑是RIP2抑制劑。組合物施用N0D1多肽和NODl配體，包括它們的鹽以及N0D1核酸和/或RIP2激酶抑制劑來促進細胞凋亡和腫瘤退化、調(diào)節(jié)NOD1活性，SB220025<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>一種癥狀。如在此描述的，可以包括其他試劑，例如，抗肺瘤劑、化學治療劑、TNF、RIP2激酶抑制劑、RIP2激酶缺陷多肽、編碼RIP2激酶缺陷多肽的核酸，等等。為了實現(xiàn)期望的效果，可以作為單獨的或分開的劑量施用N0D1多肽、配體、核酸和與其他試劑的組合。例如，N0D1多肽、配體和核酸可以以至少約0.01mg/kg到約500至750mg/kg、至少約0.01mg/kg到約300至500mg/kg、至少約0.1mg/kg到約100至300mg/kg或至少約1mg/kg到約50至100mg/kg體重的劑量施用，盡管其他劑量可以提供有益的結果。施用的數(shù)量將取決于各種因素變化，包括但不限于，選擇的多肽、配體或核酸、哺乳動物的疾病、體重、身體狀況、健康、年齡，要實現(xiàn)預防還是治療、以及所述多肽、配體或核酸是否被化學上修飾。這些因素可以由臨床醫(yī)師采用動物模型或本領域可用的其他測試系統(tǒng)容易地確定。根據(jù)本發(fā)明的治療試劑的使用可以是以單劑量、以多劑量、以連續(xù)或間歇方式，取決于，例如，接受者的身體條件、施用的目的是治療性還是預防性，以及熟練醫(yī)師已知的其他因素。本發(fā)明的多肽、配體、核酸和其他試劑的施用可以在預定的時段是基本上連續(xù)的，或可以是一系列間隔的劑量。局部和全身性施用都是預期的。為了制備組合物，合成或荻得多肽、配體、核酸和試劑，根據(jù)需要或期望來純化，然后凍干并穩(wěn)定化。然后可以調(diào)節(jié)所述多肽、配體或核酸到合適的濃度，并任選的與其他試劑組合。包括在單位劑量中的纟合定多肽、配體或核酸的絕對重量可以廣泛地變化。例如，可以施用約0.01到約2g、或約0.1到約500mg的至少一種本發(fā)明的多肽、核酸或抗體，或多種多肽、配體和核酸。做為選擇，單位劑量可以從約0.01g到約50g、從約0.01g到約35g、從約0.1g到約25g、從約0.5g到約12g、從約0.5g到約8g、約0.5g到約4g，或從約0.5g到約2g變動。本發(fā)明的多肽、配體或核酸的日劑量也可以變化。這種日劑量可以在例如約0.1g/天到約50g/天、從約0.1g/天到約25g/天、從約0.1g/天到約12g/天、從約0.5g/天到約8g/天、從約0.5g/天到約4g/天、和從約0.5g/天到約2g/天的范圍內(nèi)。因而，包含本發(fā)明的治療性多肽、配體或核酸的一種或多種適合的單位劑型可以通過各種途徑施用，包括口服、胃腸外的(包括皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的和腹膜內(nèi)的)、直腸、皮膚、穿表皮的、胸內(nèi)的、非營養(yǎng)膜和鼻內(nèi)的(呼吸性)途徑。在某些實施方式中，N0D1多肽、配體或核酸局部地向腫瘤或癌癥位點施用。治療試劑也可以配制用于持續(xù)釋放(例如，使用微嚢化作用，參見WO94/07529和美國專利No.4,962,091)。當合適時，所述制劑可以方便地以分散的單位劑型呈現(xiàn)，可以通過藥物領域/>知的任何方法來制備。這些方法可以包括將治療試劑與液體載體、固體基質(zhì)、半固體載體、細分散的固體載體或其組合混合，然后，如果需要，將產(chǎn)物導入或成形為期望的遞送系統(tǒng)。當本發(fā)明的治療試劑準備用于口服施用時，它們一般與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合來形成藥物制劑或單位劑型。對于口服施用，所述治療試劑可以呈現(xiàn)為粉未、顆粒制劑、溶液、懸浮液、乳劑，或處于天然的或合成的聚合物或樹脂中用于從咀嚼用膠攝取活性成分。治療試劑也可以作為彈丸、舔劑或糊劑存在?？诜┯玫谋景l(fā)明的治療試劑也可以被配制用于持續(xù)釋放，例如，治療試劑可以被包被、微嚢密封，或置于持續(xù)遞送裝置中。這種制劑中的總活性成分包括制劑重量的0.001到99.9%。"藥學上可接受的"是指載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽與制劑的其他成分相容，并且對于其接受者無害。含有本發(fā)明的治療試劑的藥物制劑可以使用公知的和易于獲得的成分通過本領域已知的步驟來制備。例如，可以與常見的賦形劑、稀釋劑或載體配制治療試劑，并形成片劑、膠嚢、溶液、懸浮液、粉末、氣霧劑等等。適合于這些制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實例包括緩沖液，以及填料和膨脹劑，例如淀粉、纖維素、糖類、甘露醇和硅衍生物。也可以包括結合試劑，例如羧曱基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基曱基纖維素和其他纖維素衍生物，藻酸鹽、明膠和聚乙烯-吡咯烷酮?？梢园ㄔ鰸裨噭?，例如甘油，崩解劑例如碳酸輛和碳酸氫鈉。也可以包括用于延緩溶解的試劑，例如石蠟。還可以包括重吸收加速劑，例如季銨化合物。可以包括表面活性劑，例如十六醇和單石更脂酸甘油酯?？梢蕴砑游叫暂d體，例如高嶺土和斑脫土。還可以包括潤滑劑，例如滑石粉、鈣和硬脂酸鎂，和固體聚乙二醇。還可以添加防腐劑。本發(fā)明的組合物還可以含有增稠劑，例如纖維素和/或纖維素衍生物。它們也可以含有樹膠，例如黃原膠、瓜耳膠或碳樹膠或阿拉伯樹膠，或作為選擇，聚乙二醇、有機皂土和蒙脫土，等等。例如，含有本發(fā)明的治療試劑的片劑或錠劑可以包括緩沖試劑，例如碳酸鈣、氧化鎂和碳酸鎂。錠劑和片劑也可以包括無活性成分，例如纖維素、預膠化淀粉、二氧化硅、羥基丙基曱基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、淀粉、滑石粉、二氧化鈦、苯曱酸、檸檬酸、玉米淀粉、礦物油、聚丙二醇、磷酸鈉、硬脂酸鋅，等等。含有至少一種本發(fā)明的治療試劑的硬或軟膠膠嚢可以含有無活性成分，例如明膠、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、淀粉、滑石粉和二氧化鈦等等，以及液體載體例如聚乙二醇(PEG)和植物油。此外，含有本發(fā)明的一種或多種治療試劑的腸包被的錠劑或片劑被設計以在胃中抵抗離解，并溶于十二指腸的更為中性和堿性的環(huán)境。本發(fā)明的治療試劑也可以配制為酏劑或溶液，用于方便的口力良施用，或配制為適合于腸胃外施用，例如通過肌肉內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的或靜脈途徑施用的溶液。本發(fā)明的治療試劑的藥物制劑也可以采用含水或無水溶液或分散體的形式，或作為選擇，采用乳劑或懸浮液或油膏劑的形式。因而，治療試劑可以被配制用于腸胃外施用(例如，通過注射，例如，彈丸注射或連續(xù)輸注)并可以以安瓿^f瓦中、預填充的注射器、小體積的輸注容器或在多劑量容器中的單位劑量形式呈現(xiàn)。如上所述，可以添加防腐劑來幫助維持劑型的擱置期。活性多肽、核酸或抗體和其他成分可以形成在油或水載體中的懸浮液、溶液或乳劑，可以含有配方試劑，例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散試劑。做為選擇，活動多肽、核酸或抗體和其他成分可以以粉未的形成，通過無菌分離無菌的固體，或通過從溶液凍干，用于在使用前與合適的載體，例如無菌無熱原的水構造。這些制劑可以含有本領域公知的藥學上可接受的載體、賦形劑和佐劑。例如，可能的是使用一種或多種生理學觀點上可接受的有機溶劑來制備溶液，除了水之外，所述有機溶劑選自溶劑，例如丙酮、乙醇、異丙醇、乙二醇醚例如以名稱"Dowanol"聚二醇和聚乙二醇銷售的產(chǎn)品，短鏈酸的C廣C4烷基酯，乙基或異丙基乳酸，脂肪酸甘油三酯例如以名稱"Miglyol"銷售的產(chǎn)品，十四烷酸異丙酯，動物、礦物和植物油以及聚硅氧烷。如果希望，有可能添加選擇抗氧化劑、表面活性劑、其他防腐劑、成膜劑、角質(zhì)層分離劑或抗阻塞(comedolytic)試劑、芳香劑、調(diào)味劑以及著色劑?？梢蕴砑涌寡趸瘎?，例如叔丁基對苯二酚、丁基羥基苯曱醚、丁基化羥基甲苯以及oc-生育酚和其衍生物。此外，多肽、配體和核酸很好地適合于制劑為持續(xù)釋放的劑型等。所述制劑可以這樣組成，從而它們可能在一定時期內(nèi)，例如在腸道或呼吸道的特定部分釋放治療試劑?？梢詮木酆衔?，例如聚交酯-羥乙酸鹽、脂質(zhì)體、微乳劑、微粒、納粒或蠟來制成包被、包膜和保護性基質(zhì)。這些包被、包膜和保護性基質(zhì)對于包被內(nèi)在設備，例如展幅、導管、腹膜透析桶、泄液裝置等等是有用的。對于表面施用，治療試劑可以按本領域已知的配制，用于直4妻向目標區(qū)域應用。主要為局部施用而調(diào)節(jié)的形式采取例如乳膏劑、奶、凝膠劑、分散體或微乳劑、增稠到更大或較低程度的洗液、浸透板、軟膏劑或棒、氣霧制劑(例如，噴霧或泡沫)、肥皂、洗滌劑、洗液或肥皂塊的形式。用于這個目的的其他常規(guī)形式包括傷口敷料、包被的繃帶或其他聚合物覆蓋物、軟膏劑、乳膏劑、洗液、糊劑、膠狀物、噴霧和氣霧劑。因而，本發(fā)明的治療試劑可以經(jīng)由用于皮膚施用的貼片或繃帶來遞送。做為選擇，多肽、配體和/或核酸可以配制成粘附性聚合物，例如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙烯基醋酸酯共聚物的一部分。對于長期應用，可能期望的是使用微孔的和/或可吸入的襯墊疊層，從而皮膚的水化或浸漬可以被最小化。襯墊層可以是將提供期望的保護和支持功能的任何適合的厚度。適合的厚度一般是從約10到約200微米。例如，軟膏劑和乳膏劑可以與水性或油性基質(zhì)配制，添加適合的增稠劑和/或膠凝劑。洗液可以與水性或油性基質(zhì)配制，一般也將含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。治療試劑也可以經(jīng)由離子電滲來遞送，例如，如美國專利NO.4,140,122;4,383,529;或4,051,842中公開的。在表面制劑中存在的本發(fā)明的治療試劑的重量百分數(shù)將取決于各種因素，一般是制劑總重量的0.001%到95%,一般是按重量的0.01-85%。滴劑，例如滴眼劑或滴鼻劑，可以在含水或無水基質(zhì)中用一種或多種治療試劑來配制，還含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。方便地從密封的包裝遞送液體噴霧。滴劑可以經(jīng)由有蓋的簡單眼滴瓶、或經(jīng)由適合于滴狀遞送液體內(nèi)容物的塑料瓶、經(jīng)由特定形狀的閉合物來遞送。治療試劑可以進一步配制用于在口腔或咽喉中表面施用。例如，活性成分可以配制為進一步包含調(diào)味的基質(zhì)、通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠的錠劑；在惰性基質(zhì)例如明膠和甘油、或者蔗糖和阿拉伯樹膠中包含組合物的錠劑；以及在適合的液體載體中包含本發(fā)明的組合物的p軟口7K。本發(fā)明的藥物制劑可以包括，作為任選的成分，藥學上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑、以及在本領域中可用的鹽類型。這些物質(zhì)的實例包括生理鹽水溶液，例如生理學緩沖的鹽水溶液和水。括水和生理^可接受的緩沖鹽水溶液,例:口pH7.0-8.0的磷酸2緩沖鹽水溶液。本發(fā)明的治療試劑也可以向呼吸道施用。因而，本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的方法中的氣霧劑藥物制劑和劑型。一般地，這些劑型包含有效治療或預防特定癌癥、胂瘤、癥候或相關疾病的臨床癥狀的數(shù)量的、至少一種本發(fā)明的試劑。按照本發(fā)明的方法治療的癌癥的一種或多種癥狀的任何統(tǒng)計學上顯著的減弱被認為是本發(fā)明的范圍內(nèi)的這種癌癥的治療。做為選擇，對于通過吸入或吹入的施用，組合物可以采取干粉的形式，例如治療試劑與適合的粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉未組合物可以以單位劑型存在于，例如膠嚢或盒，或例如明膠或泡罩包裝中，從中粉末可以借助吸入器、吹入器或計量的吸入器來施用(參見,例長口,在Newman,S.P.inAerosolsandtheLung,Clarke,S.W.andDavia，D.eds.,pp.197-224，Butterworths,London,England,1984中公開的密封的計量吸入器(MDI)和干粉吸入器)。當以氣霧劑或吸入的形式施用時，本發(fā)明的治療試劑還可以在水溶液中施用。因而，其他氣霧劑藥物制劑可以包含，例如，生理學可接受的緩沖鹽水溶液，含有約0.1mg/ml和約100mg/ml之間的、特異于要治療的癥候或疾病的一種或多種本發(fā)明的治療試劑。不溶或懸浮在液體中的細分散的固體多肽、配體或核酸顆粒形式的干燥氣溶膠，在本發(fā)明的實踐中也是有用的。本發(fā)明的多肽、配體或核酸可以配制為樸粉，并包含具有約1和5jum之間，作為選擇2和3ium之間的平均粒子大小的細散顆粒。細散顆?？梢酝ㄟ^使用本領域的已知技術的粉碎和篩濾來制備。所述顆?？梢酝ㄟ^吸入預定量的細分散的材料來施用，所述材料可以是粉末的形式。要理解的是，在每種劑型的單個氣霧劑劑量中含有的活性成分的單位含量，本身不必構成用于治療特定感染、癥候或疾病的有效量，因為必需的劑量可以通過施用多個劑量單位來達到。此外，單獨地、或在一系列施用中使用低于劑型中的劑量，可以達到有效量。對于通過吸入向上呼吸道(鼻子)或下呼吸道施用，本發(fā)明的治療試劑方便地從噴霧器、或密封的包裝、或遞送氣溶膠噴射的其他方便的裝置來釋放。密封的包裝可以包括適合的推進劑，例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他適合的氣體。對于加壓的氣霧劑來說，劑量單位可以通過提供閥門來遞送計量的數(shù)量來確定。噴霧器包括但不限于在美國專利NO.4,624,251;3,703,173;3,561,444和4,635,627中描述的那些。在此公開的氣霧劑遞送系統(tǒng)類型可以從許多商業(yè)的來源獲得，包括FisonsCorporation(Bedford,Mass.)、ScheringCorp.(Kenilworth,NJ)和AmericanPharmosealCo.(Valencia,CA)。對于鼻內(nèi)施用，治療試劑也可以經(jīng)由滴鼻劑、液體噴霧來施用，例如經(jīng)由塑料瓶噴霧器或計量吸入器。典型的噴霧器是Mistometer(Wintrop)禾口Medihaler(Riker)。此外，活性成分也可以與其他治療試劑組合使用，例如，止痛藥、抗炎癥試劑、抗組胺劑、抗微生物劑、支氣管擴張劑等等，無論用于描述的條件還是某些其他條件。本發(fā)明進一步涉及用于調(diào)節(jié)Nodi表達的包裝的藥物組合物，例如試劑盒或其他容器。所述試劑盒或容器容納了用于調(diào)節(jié)Nodi基因表達的治療有效量的藥物組合物，和用于使用所述藥物組合物來調(diào)節(jié)Nodi基因表達的說明書。所述藥物組合物包括至少一種本發(fā)明的Nodi核酸，為治療有效量從而Nodi基因表達被調(diào)節(jié)。所述組合物也可以含有抗腫瘤劑或化學治療劑。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)NODI活性的包裝的藥物組合物。所述試劑盒或容器容納了用于調(diào)節(jié)NODI活性的治療有效量的藥物組合物，和用于使用所述藥物組合物來調(diào)節(jié)NODI活性的說明書。所述藥物組合物包括至少一種本發(fā)明的NOD1多肽或NOD1配體，為治療有效量從而NODI活性被調(diào)節(jié)。將參考以下詳細的實例進一步說明本發(fā)明，所述實施例為了例示本發(fā)明而給出，而不意圖受限于此。實施例l:NODl誘導引起肺瘤退化該實施例說明了，Nodi使細胞對TNFoc誘導的細胞凋亡敏感化，并且在缺少任何其他已知的細胞凋亡觸發(fā)的情況下，NODI特異性配體誘導MCF-7乳腺癌細胞中的細胞凋亡。采用體內(nèi)動物模型來證明NODI在腫瘤退化中的作用，其涉及用SCID小鼠進行異種移植。這些數(shù)據(jù)表明，Nodi在控制肺瘤細胞生長中起到關鍵作用。材料和方法勿應潛養(yǎng)人類乳腺癌細胞系MCF-7和SKBR3維持在補充有10%胎兒牛血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和10mg/ml鏈霉素的、Dulbecco的修改的Eagle's培養(yǎng)基中。嘑#乙動參43游建#和定^謬史.人類FLAG-Nodl、FLAG-Nod2cDNAs獲自DrGabrielNuez,并在Y.Ogura等人，J.Biol.Chem.276，4812(2001)中描述了。人類Myc-RIP2wt和Myc畫RIP2(K47A)是來自Dr.C.Vincenz(UniversityofMichiganMedicalSchool)的惠贈。通過定點誘變構建Nodl突變體(V41Q和K208R)。通過刪除羧基末端CARD結構域并克隆到pcDNA4/Myc/His質(zhì)粒(Invitrogen，Carlsbad,CA)中來產(chǎn)生Myc-RIP2ACARD。核苷酸序列全部通過DNA測序來確認。逆脊z夷4^脊^.這項研究中使用的各種基因克隆到pMSCV-Blasto、pBabe-Puro或pBabe-Neo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。使用可獲得的步驟穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF-7細胞。簡要地，用編碼選定的Nodl、Nodi和其他蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染兼嗜性293細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，在32。C將細胞孵育過夜來產(chǎn)生病毒顆粒。第二天用含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的含病毒293細胞上清液感染目標細胞。用10pg/ml稻瘟散-S(CalbiochemEMDBiosciencesInc.,SanDiego，CA)、500jag/ml慶大霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)或5)tig/ml噤呤霉素(Calbiochem)來選擇細胞。通過Western印跡分析確認所有構建體的表達。為了確定17|3-雌二醇(Calbiochem)的效果，在補充有5%活性炭脫去的FCS的無酚紅DMEM中培養(yǎng)細胞。將細胞播種到具有各種濃度的17|3-雌二醇(E2)的96孔平板中24h,并用31"1-胸腺嘧啶(1iuCi/孔，MPBiomedicals,Irvine，CA)脈沖。在玻璃纖維過濾器上收獲細胞，通過液體閃爍來測量放射性。,eW^7伊逐^^f弄i瘦沉淀.廣泛地洗滌細胞，并使用含有50mMHepes、100mMNaCl、2mMEDTA、10%甘油、1%NonidetP-40、14juM抑胃肽A、100yM亮抑酶肽、3mM苯曱脒、1mMPMSF、1mM焦石岸酸鈉、10mM原釩酸鈉、100U/ml抑蛋白酶肽和100mM氟化鈉的裂解緩沖液裂解。在水上孵育30分鐘之后，細胞溶胞產(chǎn)物進行離心(14000rpm,10分鐘，4°C)，回收上清液。為了免疫沉淀，細胞溶胞產(chǎn)物與5pg抗體在恒定攪動下在4。C混合3小時。容許免疫復合物結合20jal蛋白A-Sepharose珠子過夜，用裂解緩沖液洗滌珠子三次。在SDS-PAGE上分離免疫沉淀物，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。勿應^存力》浙.碘化丙鍵撐A為Vf.'如所指出的刺激細胞2天。隨后，收獲細胞，在FACS緩沖液(含有1。/。FCS和0.1。/oNaN3的PBS)中洗滌兩次，重懸浮在含有硤化丙錠(PI)的FACS緩沖液(4pg/ml)中。使用FACSCalibur流式細胞計(BectonDickinson,MountainView,CA)分析細胞死亡的程度。DJ尸/染逸,MCF-7細胞置于室載玻片中，刺激2天。用PBS洗滌細胞，細胞凋亡的核用1mg/mlDAPI(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)染色。在4%多聚曱醛中固定細胞，通過熒光顯微術檢查。T/A^丄用Y丁riDAP處理細胞，根據(jù)廠家的說明書(ROCHE，Indianapolis,IN)通過TUNEL(TdT介導的UTP斷口-末端標記)分析來監(jiān)視細胞凋亡的核。/丄-S￡丄/&4.轉(zhuǎn)染的HeLa細胞的培養(yǎng)上清液中IL-8的濃度使用96孑L免疫平才反(DynatechLaboratories,Chantilly，VA)通過ELISA來測量。使用用于捕獲的mAbMAB208和生物素化的多克隆兔抗人IL-8Ab(R&DSystems,Minneapolis,MN)，隨后是用于4企測的鏈霉抗生物素蛋白HRP，來進行ELISA。嫌篇哞W乂類7f神移潛.將MCF誦7Blasto、MCF陽7C20和MCF畫7C20/Nodl細胞胰蛋白酶化，用PBS洗滌一次，重懸浮到1.5xl07/ml的濃度。將200微升的每種懸浮液皮下地接種到無胸腺SCID/SCID或SCID/Nod(非肥胖性糖尿病性)雌性小鼠的肋部。每周評定肺瘤大小。計算肺瘤體積。結果Mc//^7WF"和A^//^傳謬爭的勿y敏源亡哞^^V斧^。乳腺癌上皮細胞系MCF-7已經(jīng)廣泛地用于研究由生物學信號例如TNFoc或由細胞毒性藥物誘導的細胞凋亡。MCF-7細胞系也被用作模型來研究雌激素陽性乳腺癌(Simstein等人，Exp.Biol.Med.228:995-1003(2003))。MCF-7細胞起初在采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的誘變的遺傳篩選中使用，來鑒定TNFcc誘導的細胞死亡所需的基因。在MCF-7細胞暴露于逆轉(zhuǎn)錄病毒構建體之后，選擇TNFoc抗性的克隆，然后在TNFoc抗性克隆中鑒定突變基因。抗性克隆之一含有破壞的Nodl基因；這個TNFcc抗性克隆的細胞系被稱為MCF7-C20。來自逆轉(zhuǎn)錄病毒構建體的pDisrup插入被定位到Nodl基因的3'部分，在富亮氨酸區(qū)域9和10的區(qū)域內(nèi)(LRR9-10;參見附圖1A)。這個插入位于Nodl編碼區(qū)域中的blasticidine開放閱讀框中。blasticidine-Nodl融合mRNA的示意圖在附圖1A中示意地顯示。進行使用抗人Nodl單克隆抗體的Western印跡分析來測試NODI蛋白是否在MCF7-C20細胞中表達。在親本MCF-7細胞溶胞產(chǎn)物(標記為"wt")中檢測到內(nèi)源的NOD1蛋白，但是MCF-7C20細胞溶胞產(chǎn)物的Western印跡未能揭示Nodl的可檢測表達，表明在MCF-7C20中功能性的Nodl等位基因被破壞(附圖1B)。MCF-7C20細胞系根據(jù)布達佩斯條約的條款在2006年2月23日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏所(10801UniversityBlvd.,Manassas，Va.，20110-2209USA(ATCC)),ATCC登記號No.ATCCNumber。Nodl功能的損失在細胞凋亡中具有顯著的影響。特別地，與表達Nodl的親本MCF-7細胞相比，MCF-7C20細胞(沒有Nodi表達)對于TNFoc誘導的細胞凋亡顯著更有抗性(附圖1C)。這些數(shù)據(jù)表明，Nodl是MCF-7細胞內(nèi)TNFoc途徑中的敏化劑，Nodl促進了MCF-7乳腺癌細胞中的細胞凋亡。為了進一步研究Nodl在細胞凋亡中的作用，各種細胞類型與特異性活化Nodl的Nodl配體D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(yTriDAP)孵育。測試的細胞類型包括親本MCF-7細胞系、Nodl缺陷的MCF-7C20克隆、和工程化以含有其他人類Nodl等位基因從而Nodl被過量表達的細胞系(MCF-7Nodl)。為了確定C20細胞對/TriDAP誘導的細胞凋亡的抗性是否由缺少Nodl引起，在MCF-7C20細胞中穩(wěn)定表達人類Nodl來產(chǎn)生Nodl充足的C20細胞(C20/Nodl)。作為另一個對照，用空的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染親本MCF-7細胞系來產(chǎn)生MCF-7Blasto細胞。在存在或缺少放線菌酮(CHX)的情況下用Y丁riDAP處理細胞，然后通過硤化丙染色和流式細胞計來測定細胞死亡。在存在放線菌酮的情況下，野生型MCF-7細胞對fTriDAP的暴露誘導了約25%的細胞死亡(附圖2A，左上畫面，陰影柱)。在用單獨的放線菌酮(空心柱)或單獨的/TriDAP處理的野生型細胞中，沒有觀察到細胞死亡。相比之下，MCF-7C20(沒有Nodl表達)細胞對丫TriDAP加放線菌酮的影響有完全的抗性，在這些細胞中基本上沒有觀察到細胞凋亡提高(附圖2A，右上畫面)。Nodl向MCF-7C20細胞中的重新導入修復了這些細胞對丫TriDAP誘導的細胞凋亡的完全每文感性(附圖2A，右下畫面)。放線菌酮和YTriDAP的組合在穩(wěn)定過量表達Nodl的MCF-7細胞中誘導了擴大的細胞死亡，48h處理后這些MCF-7Nodl細胞中細胞死亡幾乎達到60%(附圖2A,右下畫面)。Nodl配體丫TriDAP是細胞凋亡的最佳的誘導所需的。當存在放線菌酮的情況下與MCF-7細胞孵育時，稱為cxTriDAP的無活性對照三肽不誘導細胞死亡(附圖2A中的ocTri),ocTriDAP中mesoDAP結合與a位置中的Glu,而不是如/TriDAP中的y位置。作為對照，使用培養(yǎng)基("Med")代替yTriDAP或ocTriDAP。添加培養(yǎng)基對于細胞凋亡基本上沒有效果。在MCF-7Blasto和MCF-7Nodl細胞中內(nèi)源Nodl的表達、Nodl的過量表達通過免疫沉淀和Western印跡分析來確認(附圖2B)。在MCF-7C20細胞中沒有看到這種表達(附圖2B)。這些數(shù)據(jù)顯示了，在存在yTriDAP的情況下Nodl使得MCF-7乳腺癌細胞對細胞凋亡敏感化。反而，添加yTriDAP和放線菌酮是觀察到細胞凋亡之前必需的。前細胞凋亡試劑例如放線菌酮是觀察到細胞凋亡之前經(jīng)常需要的。然而，使用MCF-7細胞注意到的對/TriDAP或TNFoc的敏感性的改變，使用其他的細胞凋亡刺激，包括doxirubicin和喜樹堿沒有發(fā)現(xiàn)，其中親本和C20細胞對于細胞死亡是相等地敏感的(數(shù)據(jù)未顯示)。用Y丁riDAP處理的MCF-7細胞的亮顯微鏡觀察揭示了細胞凋亡和非壞死的形態(tài)變化特征(附圖2C，畫面a-b)。然而，為了確認/TriDAP誘導的細胞死亡實際上是細胞凋亡，進行DAPI和TUNEL染色。如附圖2C所示，在用yTriDAP處理之后MCF-7細胞核含有濃縮的染色質(zhì)，如DAPI染色所示(畫面c-d),通過TUNEL染色觀察到核碎裂(畫面e-f)。在未處理的細胞中沒有檢測到核染色。進一步確認了，使用兩種廣譜的caspase抑制劑，z-VAD-FMK和Boc-D-FMK,獲得了/TriDAPi秀導的細胞凋亡。z-VAD-FMK和Boc畫D-FMK都取消/TriDAP誘導的細胞死亡(附圖2D)。最后，向MCF-7細胞添加丫TriDAP,而不是無效的對照三肽ocTriDAP,引起了聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和capases6、7、8和9的蛋白水解裂解(附圖3，9B)。MCF-7細胞已知缺乏caspase3，在親本MCF-7細胞或MCF-7C20細胞中caspase3的表達沒有改變對丫TriDAP的反應模式(數(shù)據(jù)未顯示)。因而，多個細胞系的增加表明，在MCF-7細胞中存在由Nodl的同源配體Y丁riDAP誘導的特異性細胞凋亡途徑，這種途徑需要Nodl蛋白的存在。為了進一步確定MCF-7C20細胞對/TriDAP誘導的細胞凋亡的抗性來自Nodl的缺乏，人類Nodl在MCF-7C20細胞中穩(wěn)定表達，來產(chǎn)生表達Nodl的MCF-7C20細胞(MCF-7C20/Nodl)。Nodl向這些Nodl缺陷細胞中的重導入修復了這些細胞對丫TriDAP的完全敏感性(附圖2A),并引起caspase和PARP裂解(附圖3)。為了確定在其他人類細胞系中是否存在Nodl依賴性細胞凋亡，檢查了一系列上皮細胞系，其中Nodl被穩(wěn)定表達以增強對于Nodl途徑活化的敏感性。在存在或缺少CHX(C)的情況下用TNFoc(T)和yTriDAP(y)處理細胞，通過PI染色作為細胞凋亡的度量來監(jiān)視生存力(表l)。表l:在TNFcc和yTriDAP處理之后的細胞生存力<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>在測試的細胞系中，SK-BR3和A431細胞都揭示了Nodl依賴性細胞凋亡途徑。然而，與MCF-7系相比，這些細胞僅當yTriDAP與TNFoc和CHX同時添加時經(jīng)歷細胞凋亡。CaCo2和HT29響應于TNFoc和CHX經(jīng)歷細胞凋亡，但當同時通過/TriDAP活化Nodl途徑時沒有觀察到協(xié)同效應。其他系例如293細胞對/TriDAPi秀導的細胞死亡有抗性，即使在添加TNFoc和CHX時。Nodl依賴性細胞凋亡的缺乏不是丫TriDAP不能活化NOD1的結果，因為表達Nodl的293細胞不響應于Nodl配體釋放IL-8。盡管存在No蛋白，HT29和CaCo2細胞在細胞凋亡和IL-8釋放分析中對Y丁riDAP很少起反應，表明缺少一種或多種正調(diào)節(jié)劑，或存在強的負調(diào)節(jié)途徑。盡管涉及復雜的相互作用，在一些上皮細胞系，包括SK-BR3和A431細胞系中，Nodl依賴性細胞凋亡是可證明的。NOD1在SKBR3人類乳腺癌細胞系中表達，如上所指出，也調(diào)節(jié)那些癌細胞中的細胞凋亡。與過量表達Nodl的SKBR3相比，SKBR3野生型細胞展現(xiàn)了作為TNFoc或fTriDAP濃度的函數(shù)的較少的細胞凋亡(附圖9A)。此外，細胞凋亡的SKBR3細胞的百分比取決于培養(yǎng)條件而改變(附圖9B)。如附圖9B所示，當細胞本領域/TriDAP(YTri)力口TNFoc(TNF)和i文線菌酮(CHX)時，SKBR3細胞的細胞凋亡是最高的。無活性/TriDAP類似物ocTriDAP(ocTri)的替代引起降低的細胞凋亡。已經(jīng)暴露于這些試劑的SKBR3細胞的溶胞產(chǎn)物的western分析顯示了，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)和capases3、7和8經(jīng)歷了蛋白水解裂解。附圖9C圖形地說明了在存在不同試劑的情況下培養(yǎng)SKBR3細胞之后觀察到的野生型、表達N0D1的、和表達CLARP的SKBR3細胞的細胞凋亡百分比。如所指示的，當存在放線菌酮(CHX或C)、TNFoc(TNF或T)勿TriDAP(yTri)時(即，"gTC，，組合)，SKBR3細胞的細胞凋亡是最高的。然而，在各種培養(yǎng)條件下，CLARP表達不提高細胞凋亡。人類Nodl的早先的結構-功能研究表明，P-環(huán)殘基(K208)是短暫地過量表達的Nodl蛋白在293細胞中活化NF-kB所需的。其他研究表明，K208的突變阻斷了由核苷酸結合/寡聚反應(NBD/NOD)結構域介導的寡聚反應所需的構象變化。在Nodl的CARD結構域中的突變V41Q也顯示了石皮壞caspase9對Nodl的結合，在293細胞的短暫轉(zhuǎn)染研究期間產(chǎn)生了Nodl依賴性細胞凋亡的抑制。進行進一步的實驗來確定那個NOD1結構域是細胞凋亡所需的。如附圖4A所示，K208R突變體取消了丫TriDAP加放線菌酮的效果，而V41Q突變體具有很少的或沒有顯著效果。這些突變的Nodl多肽被有效地表達，如通過附圖4B中描繪的Western印跡所顯示的。因而，這些多肽的不同效果不是由于表達水平中的差異。反而，這些數(shù)據(jù)表明了，介導寡聚反應所需的構象變化的核苦酸-結合/寡聚反應(NBD/NOD)結構域，是Nodl細胞凋亡所需的。進一步的實驗顯示，雖然在MCF-7C20細胞中/TriDAP誘導的IL-8產(chǎn)生被抑制(數(shù)據(jù)未顯示)，當野生型Nodl在MCF7-C20Nodl細胞中表達時(附圖5C),或當V41QNodl突變體在MCF-7C20(即，MCF-7C20V41Q)細胞中表達時(數(shù)據(jù)未顯示)，這種IL-8產(chǎn)生被恢復。然而，K208RNodl突變多肽在MCF-7C20(即，MCF-7C20K208R)細胞中的表達不修復yTriDAP誘導的細胞凋亡。MJ2話化^MCF-7勿應哞不資爭勿一敏^亡還進行了實驗來確定Nod2通過其特異性活化劑胞壁酰二肽(MDP)的活化是否將在親本MCF-7細胞中或在過量表達Nod2的MCF-7細胞(MCF-7Nod2)中啟動細胞凋亡。因而，將yTriDAP或MDP添加到這些細胞系的每一種，測量細胞凋亡(附圖5A)和IL-8產(chǎn)生(附圖5C)。用MDP力oCHX處理的MCF-7Nod2細胞不經(jīng)歷才是高的細胞凋亡。相比之下，正如所料，yTriDAP添加產(chǎn)生了細胞死亡。MDP處理確實在MCF-7Nod2細胞中引起IL-8分泌(附圖5C)。Nodl和Nod2在MCF-7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子中的表達通過免疫印跡來確認(附圖2B)。MCF-7C20細胞與Nod2的互補在添加MDP或yTriDAP之后不引起細胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。/步及油c//勿f源亡的c，,現(xiàn)在要理解的是，細胞凋亡在由特異性caspase啟動的獨特的細胞內(nèi)途徑的活化之后發(fā)生。為了獲得關于Nodl依賴性途徑中的起始caspase的信息，使用具有針對caspase的可變特異性的藥理學和生物學抑制劑。廣譜的抑制劑z-VAD幾乎完全地阻斷YTriDAP誘導的細胞凋亡(附圖6A)。相比之下，caspasel、2、6和7的特異性抑制劑僅對細胞凋亡具有很少的影響(附圖6A)。然而，caspase9抑制劑LEHD和caspase8抑制劑IETD具有顯著的抑制效果，抑制作用水平類似于z-VAD所見的(附圖6A)。這些數(shù)據(jù)表明，caspase8和9在丫TriDAP誘導的細胞凋亡啟動方面可能的作用。已經(jīng)描述了兩種主要的細胞凋亡途徑，內(nèi)在(線粒體、壓力誘導的)和外在(受體介導的)途徑。參與細胞凋亡的caspase似乎被編組成分級的級聯(lián)，caspase9和caspase8分別是內(nèi)在和外在途徑中的上游起始物。為了區(qū)分這些途徑，使用幾種蛋白抑制劑，其通過轉(zhuǎn)染導入細胞。首先，測試了CLARP(Flip)轉(zhuǎn)染子。CLARP被認為是caspase8的特異性抑制劑，具有兩個死亡效應物結構域(DED)并具有無活性的caspase結構域。CLARP已知與caspase8和FADD相互作用，從而特異性地抑制由各種配體-受體對，包括Fas、TNFoc和TRAIL誘導的細胞凋亡。為了確定CLARP對yTriDAP誘導的細胞死亡的影響，建立MCF-7細胞系，其單獨地或在存在Nodl的情況下穩(wěn)定表達CLARP(MCF-7CLARP)。當用yTriDAP/CHX孵育MCF-7CLARP細胞時，細胞死亡被完全抑制，表明Nodl誘導的細胞凋亡途徑與由caspase8啟動的途徑重疊(附圖6C，上部畫面)。另一種抗細胞凋亡蛋白質(zhì)Bcl-2已經(jīng)顯示了組織細胞色素C從線粒體釋放，從而阻斷Apaf1/caspase9復合物的活化。產(chǎn)生過量表達Bcl-2的穩(wěn)定的MCF-7細胞系，在這種表達Bcl-2的MCF-7細胞中評估Nodl活化時的細胞死亡。如附圖6C(底部畫面)所示，Bcl-2的過量表達僅部分地阻止丫TnDAP誘導的細胞死亡。已知MCF-7細胞缺乏CaspaseIII。發(fā)明人的進一步研究確定了，CaspaseIII在親本MCF-7或MCF-7C20細胞中的表達不改變這些細胞對Nodl配體丫TriDAP的反應模式(數(shù)據(jù)未顯示)。這些實驗表明，Caspase8在MCF-7細胞中啟動yTriDAP誘導的細胞凋亡中起到重要作用。另外的支持，雖然是間接的，來自這樣的發(fā)現(xiàn)，未能影響caspase9的Nodl的V41Q突變，在支持yTriDAP誘導的細胞凋亡(附圖4A)和IL-8產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)方面與野生型Nodl等價。C4AD潛*詢'而#邀齊;^/:^€vVoW謬^的勿應源亡摩;T的。RIP2是含有CARD結構域的蛋白激酶。已經(jīng)證明了RIP2在Nodl信號轉(zhuǎn)導中是重要的，其引起NF-kB活化(Kobayashi等人.Nature416:194-99(2002);Chin等人.Nature416:190-94(2002))。RIP2經(jīng)由CARD-CARD相互作用與Nodl的結合被認為對于NF-kB活化是必需的，因為缺少CARD結構域的RIP2作為Nodl信號轉(zhuǎn)導的顯性陰性抑制劑起作用。在MCF-7細胞中表達幾種RIP2突變體來評估RIP2激酶活性在Y丁riDAP誘導的細胞凋亡中的作用。缺少CARD結構域的RIP2的表達完全取消了Nodl誘導的細胞死亡(附圖7A)。相比之下，相對于在表達正常水平Nodl的親本MCF-7Blasto細胞中所見的細胞凋亡水平，野生型RIP2或無催化活性的RIP2(RIP2KD)的表達提高了細胞凋亡的程度(附圖7A，13A)。相比僅表達Nodl的細胞(附圖13C)或親本MCF-7Blasto細胞(數(shù)據(jù)未顯示)，表達野生型RIP2和RIP2KD構建體的細胞對于更低濃度的/TriDAP是敏感的，并且更快死亡。此外，MDP在表達RIP2KD的細胞中誘導高水平的細胞凋亡是有效的，但在表達野生型RIP2或RIP2ACARD的細胞中不是(附圖13A)。與表達Nodl的細胞相比，在RIP2KD細胞中MDP還誘導了更高水平的細胞凋亡(附圖13C)。然而，在表達野生型RIP2、RIP2KD和RIP2ACARD的細胞中，TNFa誘導了類似水平的細胞凋亡(附圖13B)。在表達野生型RIP2的細胞中/TriDAP誘導的IL-8分泌是最高的(附圖13D)。所研究的每種轉(zhuǎn)染的細胞系表達近似相同數(shù)量的或突變RIP2(附圖7B)，表明表達水平不是細胞死亡方面的差異的原因。因而，Nodl依賴性細胞凋亡途徑需要RIP2CARD結構域，但令人驚訝的是，不需要RIP2激酶活性。還檢查了RIP2表達對fTriDAP誘導的JNK磷酸化的影響(附圖7C)。在存在放線菌酮的情況下，表達野生型RIP2或RIP2KD的MCF-7細胞對yTriDAP的暴露2h誘導JNK的磷酸化(附圖7C)。然而，丫TriDAP和方文線菌酮對RIP2ACARD細胞沒有這種影響。因而Nodl需要RIP2(支架蛋白激酶)用于調(diào)節(jié)雌激素敏感性腫瘤生長。然而，雖然雌激素敏感性肺瘤生長的Nodl-RIP2調(diào)節(jié)需要RIP2CARD結構域，它不需要RIP2激酶活性來為Nodl依賴性細胞凋亡和月中瘤生長的抑制提供合適的下游信號。用p38獲得了類似的結果(數(shù)據(jù)未顯示)。在RIP2ACARD細胞中MAPK活化的缺乏不是由于改變的MAPK激酶信號轉(zhuǎn)導，因為在所有轉(zhuǎn)染子中IL-1強烈誘導JNK磷酸化。因而，yTriDAP在MCF-7細胞中的活性需要RIP2而不是它的激酶活性。這些數(shù)據(jù)表明了，Nodl下游的蛋白激酶RIP2/RICK,可能是Nodl前細胞凋亡途徑的關鍵成分，因為RIP2的顯性陰性形式的表達消除了yTriDAP誘導的細胞死亡。Mt//在卞#多4。Nodl依賴性細胞凋亡途徑在許多生物進程中可能是重要的，包括腫瘤細胞生長調(diào)節(jié)和惡性細胞經(jīng)歷細胞死亡的衰減，引起肺瘤發(fā)生。在SCID小鼠中的腫瘤生長異種移植模型被用于檢查Nod在胂瘤生長和腫瘤排斥中起到的作用。MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20Nodl細胞的群體(各自總計約3乂106個細胞)，單獨地皮下注射到雌性小鼠的肋部來在SCID/SCID或SCID/Nodl小鼠中誘導腫瘤生長。在注射后一周直到8周，每周記錄動物的腫瘤形成。在注射后前幾個星期，所有三種細胞群體相等地生長紳瘤，因而到注射后15天，在所有小鼠中存在近似計算出的腫瘤體積10mm3。因而，在導入小鼠后約15天，MCF-7Blasto、MCF-7C20和MCF-7C20Nodl細胞都可以產(chǎn)生腫瘤。然而，從MCF-7Blasto和MCF-7C20Nodl細胞形成的腫瘤在剩余的8周實驗中幾乎消失。由MCF-7Blasto和MCF-7C20Nodl細胞產(chǎn)生的初始胂瘤很快地大小降低，并且退化(附圖10)。僅MCF-7C20細胞的注射在注射位點產(chǎn)生了大的圓形腫瘤，其不退化并持續(xù)生長。這些結果表明，Nodl的缺乏容許腫瘤生長，而Nodl的存在引起胂瘤退化。因為這些研究是在SCID小鼠中進行的，在異種移植的腫瘤生長中免疫系統(tǒng)的作用可以忽略。此外，在4妄受MCF-7Blasto和MCF-7C20Nodl細胞的動物中胂瘤的缺乏不是由于降低的增殖潛力，因為在此研究的每種MCF-7系，包括表達MCF-7Blasto、MCF-7Nodl、MCF-7C20和MCF-7C20Nodl的細胞系，在組織培養(yǎng)條件下和在軟瓊脂菌落形成分析中具有相同的生長特性(數(shù)據(jù)未顯示)。三個獨立實驗的結果的概述在表2中顯示，其中在實驗1和2中使用SCID/SCID小時，在實驗3中使用SCID/Nod小鼠。表2:MCF-7細胞系誘導的腫瘤發(fā)生率<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>這些結果表明，Nodl功能的喪失(當使用MCF-7C20細胞時)提高了腫瘤不退化的可能性。Nodl功能的替換(當使用MCF-7C20Nodl細胞時)，或Nodl表達的誘導，提高了腫瘤退化的可能性。還進行了一個實驗，其中從帶有腫瘤的SCID/SCID小鼠收獲腫瘤，所述小鼠在3.5周前用MCF-7C20和MCF-7C20Nodl細胞注射。然后切碎胂瘤組織，放入組織培養(yǎng)燒瓶中。在約一周后，除去任何剩余的實體腫瘤組織，添加10yg/ml殺稻瘟菌素。然后在存在殺稻瘟菌素的情況下在標準條件下維持播種的細胞6個世代。然后使用這些細胞注射天然SCID小鼠，在60天的時間內(nèi)測量腫瘤體積改變的時間過程。含有腫瘤衍生的MCF-7C20或MCF-7C20Nodl細胞的小鼠都開始生長腫瘤。到注射后15天，兩種細胞類型產(chǎn)生了近似的計算出的腫瘤體積50mm3。在這個實驗的剩余40天期間，從MCF7-C20Nodl細胞形成的腫瘤退化到最低限度可檢測的大小(<10mm3),而由MCF-7C20細胞產(chǎn)生的胂瘤生長到200-270mm3的最大體積(附圖IIA-C)。這些結果進一步證實了，腫瘤細胞中的Nodl表達可以引起腫瘤細胞細胞凋亡和胂瘤退化。由于MCF-7響應于TNFoc經(jīng)歷細胞凋亡，使用中和鼠TNFoc的倉鼠單克隆抗體(Bancroft等人.J.Immunol.143:127-30(1989))來進一步檢查TNFoc在Nodl誘導的細胞凋亡中的作用。這種抗體的存在不抑制細胞凋亡，因為當接種MCF-7Blasto或MCF-7Nodl細胞時沒有形成腫瘤。此外，如在早先的實驗中觀察到的，當將MCF-7C20細胞注射到小鼠中時，胂瘤生長。再一次，在至少表達Nodl的腫瘤細胞之后腫瘤的缺乏不是由于與MCF-7C20細胞相比降低的MCF-7Blasto和MCF-7C20/Nodl細胞增殖速度，因為研究的每種MCF-7系在培養(yǎng)和軟瓊脂菌落形成分析中具有相同的生長特征。此外，通過其他因子的簡單細胞凋亡阻斷可能不是產(chǎn)生腫瘤生長的機制，因為CLARP(c-FLIP)是caspase8的特異性抑制劑，MCF-7c-FLIP/CLARP細胞在棵鼠中不能形成腫瘤(數(shù)據(jù)未顯示)。在初步實驗中，當將C20克隆移植到雄性小鼠中時觀察到更健壯的腫瘤生長，暗示了雌性相關的激素在腫瘤退化中的作用。通過各種遺傳學靶點的聚合酶鏈式反應擴增的進一步研究，產(chǎn)生了觀察結果，在C20細胞系中缺乏孕激素受體，而它存在于野生型細胞中，和更重要地存在于C20Nodl細胞中。此外，PCR分析也揭示了雌激素受體oc存在于三種MCF7細胞類型的每一種中。在大多數(shù)研究中，在棵鼠中MCF-7細胞的腫瘤形成需要雌激素對腫瘤發(fā)生的補充，即使在以高濃度接種細胞時。為了進一步檢查雌激素在腫瘤發(fā)生中的作用，將所有三種細胞系連同雌激素彈丸注射到小鼠中(附圖IIB)。正如所料，當存在雌激素時，在注射MCF-7Blasto細胞的小鼠中腫瘤生長。用MCF-7C20細胞注射的小鼠產(chǎn)生腫瘤，當存在雌激素彈丸時其生長得更大。有趣地，接受MCF-7C20/Nodl的小鼠在存在雌激素彈丸的情況下不生長腫瘤。這些數(shù)據(jù)表明，Nodl抑制雌激素依賴性腫瘤生長。為了進一步證明Nodl途徑在腫瘤生長中的作用，研究了RIP2的顯性陰性等位基因(RIP2ACARD)的表達，來確定這種等位基因是否也可以干擾MCF-7細胞生長胂瘤的能力。附圖IIC顯示了，這些RIP2ACARD細胞生長腫瘤，然而肺瘤小于在MCF-7C20細胞中觀察到的。結合起來，這些數(shù)據(jù)表明了，Nodl在腫瘤生長中具有關鍵作用，Nodl的存在起到了雌激素依賴性肺瘤生長的阻礙物的作用。為了獲得對這種假說的另外的支持，當細胞在缺乏雌激素的培養(yǎng)基中生長的條件下觀察了MCF-7細胞系對雌激素誘導的增殖的敏感性。在這些條件下，響應于添加的雌激素，MCF-C20細胞以及MCF-7RIP2ACARD細胞經(jīng)歷了強的增殖，而親本和MCF-7C20/Nodl細胞系都沒有被刺激增值(附圖IID)。然而，對MCF-7C20細胞觀察到的雌激素誘導的增殖通過在培養(yǎng)基中添加它莫西芬被阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定雌激素的存在是否調(diào)節(jié)Nodl誘導的細胞凋亡途徑，在含有活性炭處理的血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。在C20細胞的細胞凋亡中，雌激素具有很少的或沒有影響，所述C20細胞基本上不表達Nodl，其基本上不展現(xiàn)細胞凋亡(附圖12A,中間畫面)。當在缺乏類固醇的情況下培養(yǎng)時，C20/Nodl和Blasto細胞對于yTriDAP誘導的細胞凋亡更有抗性(沒有類固醇C20/Nodl細胞展現(xiàn)了10%細胞凋亡，相對有類固醇的80%,附圖12A,下部畫面)。因而，針對細胞凋亡的抗性通過添加雌激素被逆轉(zhuǎn)，從而細胞凋亡以雌激素濃度的劑量依賴性方式提高(附圖12A)。相反，添加它莫西芬部分地阻斷了yTriDAP-Nodl誘導的細胞死亡(附圖12B)。最后，Nodl的過量表達顯著地降低了內(nèi)源雌激素受體oc(ERa)的表達而不影響用作加載對照的ERK2的表達(附圖12C)。類似地，在從預培養(yǎng)的腫瘤分離的細胞中觀察到ERoc表達的降低(附圖12C,右側畫面)。這些數(shù)據(jù)表明，Nodl途徑影響ERoc表達水平，并因而影響MCF-7乳腺癌細胞對于發(fā)展胂瘤的敏感性。明尸/'ww術人員技能水平的表現(xiàn)，每種作用的專利或公開物通過引用合并在此，如同單獨完整地或在此列出的完整地通過引用合并在此的程度一物理地合并到本說明書中的權利。在此描述的特定方法和組合物是優(yōu)選的實施方式的代表，是示范性的，而不意圖限制本發(fā)明的范圍。在考慮本說明書時，本領域技術人員將想到其他目的、方面和實施方式，包括在由權利要求的范圍劃定的本發(fā)明的精神之內(nèi)。對于本領域技術人員顯而易見的是，可以對在此公開的方面進行各種替換和修改而不背離本發(fā)明的范圍和精神。在此適當?shù)卣f明性描述的發(fā)明可以在缺少任何元素或元件、或限制或局限的情況下進行，其沒有在此必要性地具體公開。在此適當?shù)卣f明性描述的方法和步驟可以以不同的步驟順序來進行，它們不必局限于在此或在權利要求中指定的順序。如在此使用的和在附隨的權利要求中使用的，單數(shù)形式"一種"、"一個"和"該"包括復數(shù)的內(nèi)容，除非上下文中明顯地另外指示了。因而，例如，引述"抗體"包括多種(例如抗體的溶液，一系列抗體制品)這樣的抗體，等等。在任何情式。在任何情況下二專利也不被解釋為被任何審i員2專利^^局的其他官員或雇員進行的任何聲明所限制，除非這種聲明在申請人撰寫的答復中被具體地和無條件地，或明確保留地采用。已經(jīng)采用的術語和表述被用作說明書的術語，并且不是限制性的，在使用這些術語和表述時不意圖排除所顯示和描述的特征的任何等價物或其部分，但公認的是，各種修改在要求權利的本發(fā)明范圍內(nèi)是可能的。因而，要理解的是，雖然本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選的實施方式和任選的特征具體地公開了，在此公開的概念的修改和變化可以由本定i的本發(fā)明范圍內(nèi)。'、''-',在此已經(jīng)廣泛地和一般地描述了本發(fā)明。落入一般性公開的各種更窄的類別和亞屬分類也構成本發(fā)明的部分。這包括帶有從所述屬中除去的材料是否在此具體地敘述。其他實施方式處于以下的權利要求之內(nèi)。此外，當按馬庫什組群的方式描述本發(fā)明的特征或方面時，本領域的技術人員將認識到，對于馬庫什組群的任何獨立成員或成員的亞組而言，也由此描述了本發(fā)明。權利要求1.一種組合物，所述組合物包含載體和治療有效量的D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)、γ-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)、γ-D-Gln-DAP(iQ-DAP)、D-Ala-L-Glu-二氨基庚二酸(γTriDAP)或其組合，其中所述治療有效量對于腫瘤的退化是有效的。1.<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage88</image>1.<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage90</image><image>imageseeoriginaldocumentpage91</image><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage93</image>全文摘要本發(fā)明提供了用于治療腫瘤的組合物和方法，其涉及提高Nod1的表達和/或NOD1的活性。文檔編號A61K48/00GK101287501SQ200680014083公開日2008年10月15日申請日期2006年2月27日優(yōu)先權日2005年2月25日發(fā)明者J·達西爾瓦,R·J·烏列維奇,韓家淮申請人:斯克里普斯研究學院