專(zhuān)利名稱(chēng)：一種pi3k酶抑制劑的快速篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物篩選方法，尤其涉及PI3K酶抑制劑的篩選的方法。
背景技術(shù)：
癌癥、高血壓和血栓病都是人類(lèi)目前最難克服的幾種頑癥，亦是世界醫(yī)學(xué)的幾大難題。癌癥是世界上奪走生命最多的疾病，每年死亡人數(shù)有七百萬(wàn)左右。我國(guó)癌癥年新發(fā)病例為200萬(wàn)，因癌癥死亡人數(shù)為140萬(wàn)，每死亡5人中，即有1人死于癌癥。癌癥已成為我國(guó)城市的第一殺手，農(nóng)村的第二大死因。高血壓是常見(jiàn)高發(fā)疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)到2025年全世界將有超過(guò)15億高血壓患者，其中四分之三的患者將來(lái)自發(fā)展中國(guó)家。高血壓會(huì)導(dǎo)致心血管、腦血管、腎血管以及大血管等病變。血栓病亦是困擾人們的常見(jiàn)疾病。因此針對(duì)上述幾種疾病的藥物開(kāi)發(fā)與研制已成為近年來(lái)的重要課題。
PI3Ks(磷酯酰肌醇3-激酶)抑制劑作為這幾種疾病治療的潛在價(jià)值引起了廣泛關(guān)注。PI3Ks主要包括PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ四種形態(tài)。其主要功能包括1)激活PI3Ks/Akt通路控制下游的凋亡抑制蛋白來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性；2)控制PI3Ks/Akt通路下游蛋白(GSK3，mTOR，Mdm2等)促進(jìn)細(xì)胞增殖；3)磷酸化并激活鳥(niǎo)嘌呤交換因子(GEFs)，如Vav，Tiaml，SOS，P-Rexl，活化的GEFs進(jìn)一步激活控制細(xì)胞游走的關(guān)鍵蛋白R(shí)ho-GTPases；4)控制細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂。藥理研究表明，PI3Kγ缺失老鼠對(duì)各種炎癥和血栓病表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗性，抑制PI3Ks酶活性有助于改善心血管的收縮性和治療高血壓??；反之，高活性的PI3Ks能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡。因此PI3Ks酶成為一個(gè)重要的疾病治療靶標(biāo)，PI3Ks酶抑制劑成為多種疾病治療的潛在藥物。
然而，常規(guī)的藥物篩選方法需要耗費(fèi)大量昂貴的PI3Ks酶、磷脂酰肌醇以及藥物和使用對(duì)人體有害的放射性同位素進(jìn)行檢測(cè)(Robertson，2001；Sadhu，2001)，同時(shí)又具有很大的盲目性。因此，本領(lǐng)域迫切需要快速、準(zhǔn)確和安全的篩選方法，以滿(mǎn)足PI3Ks酶抑制劑藥物開(kāi)發(fā)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種快速、高效的PI3Ks酶抑制劑篩選方法，已彌補(bǔ)本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的首先運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，建立PI3Ks酶抑制劑的數(shù)學(xué)模型，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行虛擬篩選；再次建立PI3Ks酶抑制劑的體外篩選模型，對(duì)虛擬篩選陽(yáng)性的化合物進(jìn)行第二輪生物活性篩選，得到PI3K酶抑制劑。
本發(fā)明提供的PI3K酶抑制劑的篩選方法，包括下列步驟(1)虛擬篩選A.用Autodock軟件將目標(biāo)化合物和PI3Kγ進(jìn)行分子對(duì)接，獲得目標(biāo)化合物與PI3Kγ的理論結(jié)合自由能；B.用式I計(jì)算目標(biāo)化合物的IC50-LogIC50＝-4.134(±0.825)-0.994(±0.087)×理論結(jié)合自由能……式IC.判斷IC50≤100μM，結(jié)果為陽(yáng)性，IC50＞100μM，結(jié)果為陰性，陽(yáng)性的化合物進(jìn)入生物活性篩選；(2)生物活性篩選A.目標(biāo)化合物處理人前列腺腫瘤細(xì)胞PC-3細(xì)胞，提取處理后PC-3細(xì)胞的總蛋白，用western印跡法顯示總蛋白提取液中的磷酸化AKT酶，再用生物電泳圖像分析系統(tǒng)定量掃描磷酸化AKT酶條帶；目標(biāo)化合物對(duì)PC-3細(xì)胞中PI3K酶的抑制率為 B.用目標(biāo)化合物濃度對(duì)PI3K酶抑制率作圖，計(jì)算目標(biāo)化合物的IC50；C.判斷
IC50≤150μM，結(jié)果為陽(yáng)性，IC50＞150μM，結(jié)果為陰性，陽(yáng)性的化合物即為有效的PI3K抑制劑。
式I代表虛擬篩選的數(shù)學(xué)模型，是通過(guò)如下步驟建立的(1)使用Autodock軟件將已知19種PI3Kγ抑制劑和PI3Kγ進(jìn)行分子對(duì)接，獲得抑制劑與PI3Kγ的理論結(jié)合自由能。所選擇的19種PI3Kγ抑制劑分別是

上述19種PI3Kγ抑制劑同位素測(cè)活的IC50值見(jiàn)文獻(xiàn)(William，1992；Chris，1994；Robertson，2001；Sadhu，2001；Lazaros，2002)，三維結(jié)構(gòu)由軟件Cerius2建立，PI3Kγ分子三維結(jié)構(gòu)來(lái)自Protein Data Bank庫(kù)。19種PI3Kγ抑制劑的IC50值以及與PI3Kγ分子進(jìn)行對(duì)接的理論結(jié)合自由能總結(jié)見(jiàn)表1表1、19種PI3Kγ抑制劑的理論結(jié)合自由能和IC50


(2)抑制劑與PI3Kγ的理論結(jié)合自由能與它們對(duì)PI3Kγ的生物活性(IC50)的關(guān)系，見(jiàn)圖1。采用偏最小二乘線(xiàn)性回歸統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(Fornell，1982)得到兩者之間的線(xiàn)性關(guān)系方程，由式I表示-LogIC50＝4.134(±0.825)-0.994(±0.087)×理論結(jié)合自由能……式In＝19，R＝0.94，F(xiàn)＝129.95，SD＝0.087n代表用于建立該模型的已知抑制劑的數(shù)量，R為兩變量之間的相關(guān)系數(shù)，F(xiàn)代表該線(xiàn)性方程的可行度，SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差。
本發(fā)明所建立得PI3Ks抑制劑篩選方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)進(jìn)行western-blot測(cè)活前，通過(guò)虛擬篩選獲得更可靠的潛在抑制劑，從而避免了實(shí)驗(yàn)的盲目性，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。2)該方法采用虛擬篩選，因此能在短時(shí)間內(nèi)篩選大量的化合物。3)與傳統(tǒng)PI3Ks活性測(cè)定法不同，該方法不涉及到同位素檢測(cè)，因此安全可靠。4)該方法除用于篩選目的也可用于指導(dǎo)先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)改造。


圖1、已知抑制劑LogIC50值同它們與PI3Kγ的理論結(jié)合自由能之間的相互關(guān)系。
圖2、EGCG對(duì)PI3Ks酶活性的影響。
具體實(shí)施例方式
分子對(duì)接分子對(duì)接是分子模擬的重要方法之一，其本質(zhì)是兩個(gè)或多個(gè)分子之間的識(shí)別過(guò)程，其過(guò)程涉及分子之間的空間匹配和能量匹配。分子對(duì)接方法在藥物設(shè)計(jì)、材料設(shè)計(jì)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。Autodock是應(yīng)用廣泛的分子對(duì)接程序，由Olson科研組開(kāi)發(fā)。AutoDock應(yīng)用半柔性對(duì)接方法，允許小分子的構(gòu)像發(fā)生變化，以結(jié)合自由能作為評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果的依據(jù)。
PI3K酶抑制劑細(xì)胞篩選模型PI3Ks(磷酯酰肌醇3-激酶)是細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要成員，PI3K激酶能間接催化下游信號(hào)分子Akt激酶的磷酸化，生成磷酸化Akt激酶。通常，可以用酶促反應(yīng)終點(diǎn)的產(chǎn)物濃度來(lái)反映酶活性，即可以用磷酸化Akt激酶產(chǎn)生的多少，反映PI3K酶的活性。
PC-3細(xì)胞是PI3K酶處于活躍狀態(tài)的人前列腺腫瘤細(xì)胞株，在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下，Akt激酶磷酸化程度較高。而在PC-3腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中加入PI3K酶抑制劑，可顯著降低Akt激酶磷酸化水平。因此，通過(guò)檢測(cè)PC-3腫瘤細(xì)胞中Akt激酶磷酸化水平，可以反映PC-3腫瘤細(xì)胞中PI3K酶活性，進(jìn)而反映PI3K酶抑制劑的抑制活性。
本發(fā)明建立了用于PI3K抑制劑的——PC-3細(xì)胞/磷酸化Akt激酶——評(píng)價(jià)模型。在PC-3細(xì)胞培養(yǎng)基中加入目標(biāo)化合物(實(shí)驗(yàn)組)，陽(yáng)性對(duì)照藥物，同時(shí)設(shè)置不加藥物的陰性對(duì)照；培養(yǎng)結(jié)束后用western-blot法顯示磷酸化Akt激酶條帶；用生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以陰性對(duì)照為基準(zhǔn)，計(jì)算各個(gè)組別的磷酸化Akt激酶相對(duì)含量，進(jìn)而算出各個(gè)實(shí)驗(yàn)組別PI3K酶的抑制率。
通過(guò)對(duì)目標(biāo)化合物濃度和相應(yīng)的抑制率作圖，可求得每種化合物的IC50，反映目標(biāo)化合物作為PI3K酶抑制劑的生物活性。
本發(fā)明采用的PI3Kγ三維結(jié)構(gòu)來(lái)自Protein Data Bank庫(kù)，采用文本編輯軟件將水和配體除去，目標(biāo)化合物的三維結(jié)構(gòu)用Cerius2軟件建立，AutoDock 3.0版本來(lái)源于the Scripps Research Institute Office of Thechology Development。
PC-3腫瘤細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)研究院；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和槲皮素購(gòu)于Sigma公司、磷酸化AKT抗體購(gòu)于Biosourc公司；western-blot印跡法結(jié)果采用復(fù)日Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說(shuō)明，但本發(fā)明并不受限于下述實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1、n個(gè)目標(biāo)化合物的虛擬篩選目標(biāo)化合物三維結(jié)構(gòu)用Cerius2軟件建立，在Linux操作系統(tǒng)下用軟件AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接，測(cè)定的理論結(jié)合自由能以及根據(jù)數(shù)學(xué)模型(式I)換算的IC50值。
結(jié)果顯示表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)的IC50≤150μM，結(jié)果為陽(yáng)性，其他化合物結(jié)果為陰性。
實(shí)施例2、EGCG對(duì)PI3Ks酶活性的抑制m×10n個(gè)PC-3腫瘤細(xì)胞接種到35mm的培養(yǎng)皿上，加細(xì)胞培養(yǎng)液1ml。加入20μM、40μM和80μM濃度的EGCG作為實(shí)驗(yàn)組，加入槲皮素100μM作為陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，處理腫瘤細(xì)胞株6小時(shí)。
藥物處理后的細(xì)胞用PH＝7.4的冰浴PBS緩沖液洗滌兩次。用細(xì)胞刮片收集細(xì)胞，4000轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清液，加1ml冰浴PBS(含蛋白酶抑制劑)，洗滌沉淀，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至Ep管，4℃，14000g離心15秒。細(xì)胞沉淀重新懸浮于RIPA細(xì)胞裂解液(150mM NaCl、pH 8.0 100mM Tris、1％ Triton X-100、1％ deoxycholic acid、0.1％ SDS和5mM EDTA)中，靜置20分鐘，12000g離心7分鐘，收集上清液于Ep管中備用。
按DC蛋白定量試劑盒(Bio-Rad公司)操作說(shuō)明測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配制試劑A，每毫升試劑A中添加20μl試劑S。配制不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。移取5μl不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和樣品至Ep管，每管添加25μl試劑A’和250μl試劑B，搖均勻。15分鐘后，在波長(zhǎng)750nm下測(cè)定吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
取等量蛋白100μg，用7％SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，而后從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，封閉硝酸纖維素濾膜的免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)。室溫下，將5ml一抗(磷酸化AKT抗體，Biosourc公司)溶液加入至自封袋中。4℃下過(guò)夜。按常規(guī)方法加入二抗，用ECL試劑顯影。結(jié)果見(jiàn)圖2。
western-blot印跡法結(jié)果采用復(fù)日Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，評(píng)價(jià)被篩選化合物的生物活性，EGCG在80μM濃度下能抑制45％的PI3Ks酶活性，體現(xiàn)出量效關(guān)系。
文獻(xiàn)資料顯示，目前世界上還沒(méi)有關(guān)于這種化合物對(duì)PI3Ks酶有抑制作用的報(bào)道。本發(fā)明首次采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法篩選PI3Ks酶抑制劑。該方法可用于篩選化合物單體，也可用于指導(dǎo)先導(dǎo)化合物的改造。
權(quán)利要求
1.一種PI3K酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟(1)虛擬篩選A.用軟件將目標(biāo)化合物和PI3Kγ進(jìn)行分子對(duì)接，獲得目標(biāo)化合物與PI3Kγ的理論結(jié)合自由能；B.用式I計(jì)算目標(biāo)化合物的IC50-LogIC50＝-4.134(±0.825)-0.994(±0.087)×理論結(jié)合自由能……式IC.判斷IC50≤100μM，結(jié)果為陽(yáng)性，IC50＞100μM，結(jié)果為陰性，陽(yáng)性的化合物進(jìn)入生物活性篩選；(2)生物活性篩選A.目標(biāo)化合物處理人前列腺腫瘤細(xì)胞PC-3細(xì)胞，提取處理后PC-3細(xì)胞的總蛋白，用western印跡法顯示總蛋白提取液中的磷酸化AKT酶，再用生物電泳圖像分析系統(tǒng)定量掃描磷酸化AKT酶條帶；目標(biāo)化合物對(duì)PC-3細(xì)胞中PI3K酶的抑制率為 B.用目標(biāo)化合物濃度對(duì)PI3K酶抑制率作圖，計(jì)算目標(biāo)化合物的IC50；C.判斷IC50≤150μM，結(jié)果為陽(yáng)性，IC50＞150μM，結(jié)果為陰性，陽(yáng)性的化合物即為有效的PI3K酶抑制劑。
2.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯作為PI3K酶抑制劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種PI3K酶抑制劑篩選的方法首先運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，使用Autodock軟件將目標(biāo)化合物和PI3Kγ進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行虛擬篩選；再次建立PI3Ks酶抑制劑的篩選模型，用western印跡法測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)PI3K酶抑制率，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行第二輪生物活性篩選，得到PI3K酶抑制劑。本發(fā)明的PI3K酶抑制劑篩選方法快速、經(jīng)濟(jì)，而且不使用同位素，安全性更好。
文檔編號(hào)A61P9/12GK1730665SQ200510028409
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月3日
發(fā)明者魏東芝, 匡榮仁 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)