專利名稱：N－哌啶衍生物用于治療神經(jīng)變性疾病的應用的制作方法
眾所周知，在細胞呼吸和正常代謝過程中有規(guī)律地產生氧中心自由基(ROS)和氮中心自由基(RNS)，發(fā)揮重要的生理功能，如作為誘導細胞進程的第二信使(Suzuki H.J.Free Rad.Biol.Med.22，269-285，1977；Clement M.V.& Pervaiz S.Free Rad.Res.30，247-2525，1999)。
目前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大量的并且越來越多的病理過程與活性自由基的產生增加有關，所述自由基如超氧陰離子(O2·-)，過羥基自由基(HO2·-)，羥基自由基(HO·)，單個氧(1ΔO2)，過氧化氫(H2O2)，一氧化氮(NO·)，二氧化氮(NO2-)，過(氧化)亞硝酸鹽和其它(R·)自由基(烷基-L·，烷氧基-LO·，過氧基-LOO·自由基，等)。
過量生成的自由基，飽合了由酶系統(tǒng)(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶)和親水親脂非酶系統(tǒng)(輔酶Q、泛醇、維生素E、維生素C、維生素A、還原型谷胱甘肽、尿酸、類胡蘿卜素等)共同構成的抗氧化機制，產生了導致細胞死亡與組織損傷的氧化應激狀態(tài)(OSS)自由基發(fā)作導致產生更多的ROS，RNS和R·，即在OSS狀態(tài)下，最初的氧化損傷會隨之加重。(DiazM.D.等，New Engl.J.Med.331，408-416，1997；Cerutti P.A.，TheLancet 344，862-863，1994；Giacosa A.&Filiberti R.Eur.J.CancerPrev.5，307-312，1996；Bruce N.A.等Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90，1915-1922，1993；Albens L.等J.Neural Transm.(Suppl.)59，133-154，2000；Foley M.等J.Neurol(Suppl.2)247，II82-94，2000；Huang Z.等.Can J.Neurol.SCl.(Suppl.1)30，S10～18，2003；He Y.等.J.Neurochem.86，1338-1345，2003；Gao H.M.等TrendsPharmacol.Sci.24，395-401，2003；Sekhon B.等Brain Res.971，1-8，2003；Nedelovic Z.S.等Postgrad.Med.J.79，195-198，2003；Arbiser J.L.Nat.Med.9，1103-1104，2003；也可參見Medline和Toxline)此外，目前已經(jīng)知道，多種試圖減弱導致OSS級聯(lián)反應的治療手段因其自身無法避免的問題妨礙或限制了它們在人和動物體內的應用。以螯合劑為例，它能夠在細胞內催化不必要的氧化還原反應，與多種細胞成份結合從而很容易分解或喪失活性(Ikeda Y.等Neurosurgery 24820-824，1989；White B.C.&Krause G.S.Ann.Emerg.Med.22，970-979，1993)除了與酶飽合(＜＝酶變率)相關的限制因素，以及與在更加復雜和動態(tài)的OSS過程中存在的個別歧化反應性種類(O2·-)相關的限制因素外，超氧化劑物歧化酶的應用也面臨著穩(wěn)定性方面的問題(即便在脂質體內時)，根據(jù)其種類不同，半衰期從幾分鐘到數(shù)小時不等；它不能通過細胞膜，更少通過血腦屏障，并且是免疫原性的(盡管近來采用重組人r-h-MnSOD的結果令人鼓舞)(Mikawa S.等J.Neurosurg.85，885-891，1996；Kontos H.A.&Wei E.P.J.Neurosurg.64，803-807，1986；Chan P.H.等Ann，Neur.21，540-547，1987)；最近采用乙二醇結合超氧化物物歧化酶(Pegorgotein)治療閉合顱內損傷的多中心隨機臨床試驗明顯不可避免的沒有得到所希望的結果(Young B.等276，538-543，1996)。
通過采用具有歧化酶催化活性，例如具有超氧化物歧化酶活性的(模仿SOD)小分子量有機化合物(如M40401或M40403)(見美國專利Nos.5 874 421，US 5 637 578和US 5 696 109；國際專利申請WO 02/28390和WO 02/058686，Samilowski W.E.等Nat.Med.9，750-755，2003)，或者采用分離的酶活性部位(US 6 117 454)，均能克服運用天然酶所帶來的限制，如細胞滲透性，特別是血腦屏障，以及給藥。
然而，即使采取這些策略，收效依然有限，因為它們只是在分子水平再現(xiàn)天然酶的活性；事實上，它們也對單個自由基種類(O2·-)起作用，因此與整體導致OSS的其它基團ROS、RNS和R·沒有催化活性。這時，需要通過血腦屏障、而難于或不能通過血腦屏障的藥物只能通過直接輸注進入CNS或通過控釋聚合植入物進行給藥，其問題是很容易想象的(如參見US 4 883 666)。
其它考慮使用的分子被稱為“自旋阱(spin-trapping)清除劑”，如甘菊環(huán)烴亞硝酮、NXY-059，特別是在多種病理學過程中取得滿意效果的a-苯基-叔-丁基硝酮(PBN)(Rachnilewitz D.等Gut 35，1181-1188，1994；Krishna M.C.等，J.Biol.Chem.271，26018-26025，1996；Gilgun-Sherki Y.等Pharmacol.Rev.54，271-284，2002)。然而，盡管它對碳中心自由基(C·)的作用導致了相對穩(wěn)定的加合反應，但它與氧中心自由基的結合仍不能完全滿意，這使它的作用也僅限于少數(shù)自由基種類；如果要滿足其要求，非期望的羥基自由基(HO·)與PBN之間加合反應的半衰期要剛好為40秒(Jansen F.G.等Free Rad.Biol.Med.12，169-173，1992)。
即使在斷裂后，這些非持續(xù)性的一氧化二氮也能產生更多能引發(fā)或起始自動氧化反應的自由基類型。此外，PBN不能與氮中心自由基(RNS)結合((Hensley K.等Int.Rev.Neurobiol.40，299-317，1997)。制備了自旋阱，它在體外穩(wěn)定性更高(Tempo.Tempol)，能與超氧自由基(O2·-)和羥基自由基(HO·)結合，能夠自我再生(即沒有其它普通抗氧化劑的自殺作用)同時阻斷Fenton’s反應，即終止自由基反應)(Samuni等Biochemistry 30，555-561，1991；Samuni等J.Clin.Invest..87，1562-1530，.1991；Li H.等Free Rad.Biol.Med.32.712-719，2002；Krishna M.C.等J.Biol.Chem.271，26026-26031，1996)。然而，這些分子在體內的保護作用由于其毒性和半衰期小于3分鐘受到了很大限制(Laight D.等Br.J.Pharmacol.124，238-244，1988)。
為了克服上述不足，這些自旋阱(Spin-traps)在體內實際上是與多硝氧化的大分子(多硝氧化人血清白蛋白，PNA)一起使用，這種大分子能夠降低其毒性，允許其“再循環(huán)”，如果保持低劑量，還能防止血管舒張作用(Kupposomi P.et al. Biochemistry 35 7051-7057，1996；Kupposomi P.et al.，Magn.Res.Med.40；806-811，1998)。當然，由于其大小，這些大分子僅能在細胞外間隙發(fā)揮其功能。
US 5 981 548描述了含有N-哌啶衍生的環(huán)-羥胺的藥物組合物治療與自由基過量生成相關的疾病。
本發(fā)明的第一個方面是基于對以下事實的認識上述US 5 981 548中闡述了N-哌啶衍生的環(huán)-羥胺可以通過血腦屏障，因此能夠用于治療和預防神經(jīng)變性疾病。
在本發(fā)明的范疇內，鑒別了N-哌啶衍生的其它化合物，具有治療下述多種病理過程的藥理學活性，且到目前為止尚未用于這些藥理學領域。
關于這些更多的化合物，對其獨特性質進行了鑒定，例如特別是，能夠與多種類型自由基反應的高容量，終止自由基反應，易于通過細胞膜的脂質雙層(特別指血腦屏障)，在組織中的高容量分布，從而使體內需要抗氧化劑保護的區(qū)域的活性物質達到高濃度，以及自我再生的能力(自我補充抗氧化劑)，和防止由金屬離子的氧化作用引起的Fenton’s反應等，本發(fā)明由此提出了它們的治療與預防方面的新用途。
本發(fā)明的另一個目標是優(yōu)先提出一類化合物的新治療用途，所述化合物除具有上述所有優(yōu)點，而且無毒，無免疫原性，穩(wěn)定并易于低成本大量生產。
本發(fā)明的新治療用途和藥物組合物在所附的權利要求中給予定義。
具體的，涉及式(I)的化合物在藥物領域的新用途，在下文中詳細討論 其中R6為氧(oxyl)、氫或羥基，R1，R2，R3和R4彼此獨立選自-氫-含1-12個碳原子的烷基，優(yōu)選1-6個碳原子，更優(yōu)選1-3個碳原子；-含2-12個碳原子的烯基，優(yōu)選2-6個碳原子，更優(yōu)選2-3個碳原子；-含2-12個碳原子的炔基，優(yōu)選2-6個碳原子，更優(yōu)選2-3個碳原子；或-R1與R2都是環(huán)丁烷或環(huán)戊烷基團；-R5為-氫，-含1-12個碳原子的烷基，優(yōu)選1-6個碳原子，更優(yōu)選1-3個碳原子；
-含3-8個碳原子的環(huán)烷基，-含2-12個碳原子的烯基，優(yōu)選2-6個碳原子，更優(yōu)選2-3個碳原子；-含2-12個碳原子的炔基，優(yōu)選2-6個碳原子，更優(yōu)選2-3個碳原子，或 其中R1，R2，R3和R4同前面所定義，n為從1到30的整數(shù)，更優(yōu)選2-14，甚至更優(yōu)選6-10，R7為氫、氧或羥基。
優(yōu)選的并且為本發(fā)明例示的一組化合物是具有如下式的化合物 其中R1，R2，R3和R4是含1-3個碳原子的烷基，R5為式(II) 其中R1，R2，R3和R4為含1-3個碳原子的烷基，n為從1到10的整數(shù)，R6和R7中至少一個為氧，另一個為氧或者羥基；具體的，特別優(yōu)選使用如下式的化合物 叫做雙(1-氧-2，2，6，6-四甲基-4-二乙哌啶基)癸二酸酯。
術語“含1-12個碳原子的烷基”指由飽和烴去除一個氫原子得到的取代基。包括甲基，乙基，正丙基，正丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基和戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基和十二烷基的各種異構體。
術語“含有2-12個碳原子的烯基”和“含2-12個碳原子的炔基”指分別由鏈烯烴和炔烴去除一個氫原子得到的取代基。包括乙烯基，乙炔基，丙烯基，丙炔基和類似的含至多12個碳原子的支鏈和非支鏈不飽和烴基團。
術語“含3-8個碳原子的環(huán)烷基”是指飽和碳環(huán)，如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊烯基，環(huán)己基，以及由含有至多8個碳原子的烷基，如甲基、二甲基、乙基和環(huán)己基取代的碳環(huán)。
N-氧和N-羥基衍生化合物可依照US 4691015和US 5981548所述的方法由N-H衍生物制備而得。
具體的，N-氧衍生物可由相應的N-H衍生物與m-氯代過苯甲酸反應而得。通過催化氫化作用，如采用PtO2作為催化劑，N-氧衍生物可生成相應的N-羥基衍生物。
如上所述，本發(fā)明的一個主題是上述化合物在制備治療(抑制，防止，預防和治療)神經(jīng)變性綜合征和病變的藥用或獸用組合物中的應用，所述疾病如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、猝發(fā)性腦損傷(encephalic lesions due to ictus)、創(chuàng)傷性腦損傷、HIV引起的神經(jīng)病變、唐氏綜合征、糖尿病性多神經(jīng)病變、肌肉萎縮癥、多發(fā)性硬化癥、亨延頓氏病、朊病毒病(prion disease)、遲發(fā)性運動障礙、tauopathy，脫髓鞘病和LouGherig′s綜合征。
本發(fā)明還涉及所述化合物在制備治療、防止和/或預防致命疾病的藥用或獸用組合物或藥物中的應用，所述致病疾病如心/腎/肺/肝/腸缺血再灌注損傷、高血壓、糖尿病、癌癥、和休克、囊性纖維病、病毒感染、藥物和放射(例如放療或更具體是放射防護)所致毒性作用、炎癥、動脈粥樣硬化、衰老、類風濕性關節(jié)炎、癲癇、高膽固醇血癥、高脂血癥，以及疼痛和膿毒癥的治療，以及與自由基過量產生相關的疾病。
本發(fā)明化合物用于藥學或獸醫(yī)學領域時，給予患者的劑量是0.01-1g/kg體重，優(yōu)選0.1-200mg/kg，更優(yōu)選0.5-20mg/kg體重，每日一次或多次給藥。
但是，所使用的具體劑量可以根據(jù)患者或動物的需要，根據(jù)所治療疾病的嚴重程度而變化(根據(jù)年齡、性別、飲食，給藥方法和藥理學考量，如所用化合物的活性，預選化合物的效能、藥物代謝動力學和毒理學性質以及與其它藥物的任何組合等)。最優(yōu)劑量的確定在本領域技術人員可能選擇的范圍內。
固態(tài)和液態(tài)藥學可接受賦形劑均可用于制備包含至少一種本發(fā)明化合物的藥用或獸用藥物組合物。
給藥方法除了包括口服和腸胃外給藥，還包括吸入給藥和皮膚(局部)途徑給藥。
固體制劑包括，如粉劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、扁囊劑和栓劑。
固態(tài)賦形劑可由一種或多種物質構成，這些物質還可用作稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、混懸劑、片劑的粘合劑或崩解劑；還可以使用被囊材料。
在粉劑中，賦形劑由與至少一種活性化合物混合的精細粉碎的固體構成。在片劑中，活性成分與有必要粘合性質的賦形劑以恰當比例混合，壓制成所需形狀和大小。粉劑和片劑優(yōu)選含7％-70％重量的活性成份。
合適的賦形劑主要代表有碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、乳糖、蔗糖、果膠、糊精、玉米淀粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點蠟、椰子油等。
片劑、粉劑、扁囊劑和膠囊劑均可作為適宜劑型進行口服給藥。
液態(tài)制劑包括適用于腸胃外給藥(皮下、靜脈、肌內、胸骨內注射或輸注技術)或口服給藥(即適于口服給藥的混懸液和乳濁液)的溶液。適用于腸胃外給藥的液態(tài)制劑的例子包括，活性成分的無菌水溶液和溶于包括水、乙醇或丙二醇的溶劑的活性成份的無菌溶液。
將活性成份溶于所需溶劑系統(tǒng)，然后使所得溶液通過膜濾器使其滅菌，或者在無菌條件下將滅菌的化合物溶于事先滅菌的溶劑中，可制備滅菌溶液。
將活性成份溶于水，再加入適宜的、所需量的著色劑、調味劑、穩(wěn)定劑和凝結劑，制備得到用于口服給藥的水溶液。
將精細粉碎的活性成份，與粘稠物質，如天然或合成膠質、樹脂、甲基纖維素、羧甲纖維素鈉和其它藥用或獸用制劑領域已知的混懸劑，分散于水中制備得到用于口服給藥的液態(tài)混懸液。
藥用或獸用制劑優(yōu)選是含1-300mg的單劑量單位形式。在此劑型下，制劑分成含有適量活性成份的劑量單元。單劑量單位由包含片劑、膠囊、或裝于藥瓶或安瓿的粉劑的包裝制劑構成。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選用于人類。然而由于能用于人，也可用于獸醫(yī)領域，如寵物、外來動物和農業(yè)動物，包括哺乳動物，鳥類，嚙齒類等，更優(yōu)選動物如狗、貓和牛、綿羊和豬。
下列實施例使本領域技術人員能夠實現(xiàn)本發(fā)明。它們只是用來說明本發(fā)明，僅作為例子而不是限制本發(fā)明。以帕金森氏病模型作為神經(jīng)變性疾病的例子，以心肌缺血再灌注模型作為危及生命的疾病的例子，說明了本發(fā)明的用途。
實施例1盡管James Parkinson于1817年首次將帕金森氏綜合癥描述為原因不明的“震顫麻痹”(然而帕金森氏綜合癥的證據(jù)可追溯到甚至幾千年前)，其病因學仍然不明。
除了年齡因素，遺傳與環(huán)境因素在帕金森氏綜合癥起固中的作用在國際上也引起廣泛爭論(Huang z等Can.J.Neur.Sci.30Suppl.1，510-518，2003；Daner W.等Proc.Natl.Acad.Scie.(USA)99，14524-14529，2002；Vaughan J.R.等Am.Hum.Gen.65，111-126，2001；ThiruchelvamM.等Neurotoxicology 23，621-633，2002；Scott W.K.等JAMA286，2239-2244，2001；Warner T.T.& Schapira A.H.Am.Neurol.53Suppl.3，516-523，2003).在20世紀80年代中早期，發(fā)現(xiàn)特定神經(jīng)毒素如n-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MTPT)能夠引起人和動物的帕金森氏綜合征，這給環(huán)境領域的研究帶來相當大的推動。從那以后，又發(fā)現(xiàn)有多種殺蟲劑能夠在動物模型中再現(xiàn)PS(Betarbert R.等Nat.Neurosci.3，1301-1306，2000；Kirbi M.L.等，Toxicol.Sci.61，100-106，2001；Yumino K.等J.Biochem.(Tokyo)131，565-570，2002；Gao等J.Neurosci.23，6181-6187，2003)。通過對已有的研究進行病例-對照薈萃分析，提示暴露于殺蟲劑與PS發(fā)生存在關聯(lián)，且有顯著性意義(Priyadarshi A.等Neurotoxicology 21，435-440，2000；Priyadarshi A.等Environ.Res.86，123-127，2001)。
許多實驗證據(jù)表明，除草劑百草枯(paraquat)(化學結構類似于MPTP)與PS發(fā)病相關；動物黑質內微輸注百草枯，或者系統(tǒng)或腹膜內給予百草枯均導致多巴胺能神經(jīng)元選擇性變性，并伴隨嚴重的非選擇性神經(jīng)毒引起的行為和神經(jīng)病理表現(xiàn)(Brooks A.I.等.BrainRes.823，1-10，1999；；Thiruchelvam M.等.Neurotoxicology 23，621-633，2002；McCornack A.L.等.Neurobiol Dis.10，119-127，2002)，這是由OSS-反應性自由基的過量引起的(Jannone N.等.Neuropharmacology30，893-898，1991；Klivenyi G.等，Neurobiol.Dis.5，253-258，1998；FoleyM.等，J.Neurol.247 Suppl.2，II82-94，2000)。
選擇百草枯/大鼠/帕金森綜合癥實驗模型作為驗證本發(fā)明化合物有效性的最合適模型。在試驗中使用了兩種抗氧化劑，分別命名為MP1002和MP1001
實驗前，雄性Sprague Dawley大鼠(重210-220g)采用標準實驗室飲食并補充“Nossan片”圈養(yǎng)3周(動物和飼料來自Nossan Company，Milan，Italy)(相對濕度50％±10％，溫度22℃±1，光照/黑暗循環(huán)為12小時/12小時，第一次光照在早上7:30)，食物與水均不限制攝入。
實驗前，腹腔注射380mg/kg重量水合氯醛麻醉大鼠，然后在立體定向指引下將一根不銹鋼導管(25號)植入一側的黑質中，用牙科丙烯酸材料將其固定在顱骨上。
動物(每試驗組20只)在實驗前給予七天的恢復期；在這期間，未觀察到運動活動或姿態(tài)的變化。用10μl的Hamilton注射器經(jīng)特氟龍管與注射導管相連進行微輸注，化合物或賦形劑(0.8％NaCl)以總容量1μl/min注入腦內。
將50μg百草枯微輸注入黑質(n＝20只老鼠)，約24分鐘后可以引起老鼠的運動活動增加，表現(xiàn)為跳躍和相對注射位置的對側轉圈；所有老鼠均在注射24±2.5h后死亡。對另外20只老鼠注射百草枯，20只老鼠注射百草枯加賦形劑；每組有約10只老鼠在治療20小時后存活，并用于測定黑質中脂質過氧化作用的進展。
當50μg百草枯與1μgMP002或MP1001同時微輸注進入動物的黑質內時，所有動物均又存活24小時，在持續(xù)監(jiān)測期間沒有觀察到變化(見表1).腹膜內給予抗氧化劑也得到類似結果，證明MP1002和MP1001具有令人意外的穿過血腦屏障的能力，而這是傳統(tǒng)抗氧化劑治療神經(jīng)變性疾病的最主要的限制因素(及其對特定自由基種類的選擇性)。
特別的是，在下述情況下，無一只大鼠死亡(1)微輸注50μg百草枯前5分鐘，預先以120mg/kg體重的MP1002或MP1001腹膜內注射處理；(2)微輸注50μg百草枯，同時以120mg/kg體重的MP1002或MP1001腹膜內注射處理；和(3)微輸注50μg百草枯5min后，以120mg/kg體重的MP1002或MP1001腹膜內注射。(見表1)以Buege J.A.&Aust S.D.Meth.Enzymol.52，302-310，1978所述的丙二酰硫脲-TAC-HCL試劑，定量作為生物標記的丙二醛(MDA)的釋放，從而確定黑質內的脂質過氧化反應。表1清楚地顯示，輸注50μg百草枯或百草枯和鹽水20h后存活下來的一組老鼠(約10只)黑質中，脂質過氧化反應明顯增加。各種方式給予MP1001或MP1002(在輸注百草枯之前，同時，之后)顯著的(P＜0.01)的降低黑質中的脂質過氧化反應，這也清楚表明這些化合物具有高的抗氧化劑潛能。
在這些實驗中，腦內和周圍給予這里所說的MP1002或MP1001兩種抗氧化劑，能夠完全預防由百草枯引起的老鼠行為和神經(jīng)病理效應。這些結果顯示本發(fā)明所述的化合物能夠容易地穿透血腦屏障，從而保護黑質多巴胺神經(jīng)元免受由除草劑如百草枯引起的變性損傷(如OSS)。這顯示了一種治療多種神經(jīng)變性疾病，包括帕金森氏綜合征的有用的策略。
實施例2選擇缺血再灌注導致的心肌損傷體內模型作為檢驗本發(fā)明化合物MP1002和MP1001的有效性的最適模型。
實驗前，雄性Sprague Dawley大鼠(重220-230g)采用標準實驗室飲食并補充“Nossan片”圈養(yǎng)3周(Nossan Company，Milan，Italy)(相對濕度50％±10，溫度22℃±1，光照/黑暗循環(huán)為12小時/12小時，第一次光照在早上7:30)，食物與水均不限制攝入。
腹腔注射380mg/kg水合氯醛麻醉老鼠(每組20只)，然后切開氣管，插管，用合適的通氣機通入環(huán)境空氣；體溫保持在38℃±1，在右頸動脈插管，連接一個壓力傳感器監(jiān)測平均動脈壓(MAP)。
在右頸靜脈插管給藥，行胸廓切開術，將心臟懸于臨時的心包支架內，在左下冠狀動脈(LAD)上放置一環(huán)狀閉合器；LAD結扎前允許動物穩(wěn)定40分鐘。
通過拉緊閉合器閉塞冠狀動脈，引起與典型心肌缺血的心電圖和血液動力學變化(MAP下降)相關的病理過程。在心肌缺血25分鐘后，重新打開閉合器，使血液再灌注2小時。持續(xù)監(jiān)測心率(HR)和MAP。
再灌注2小時后，再次阻塞冠狀動脈，通過右頸動脈插管將染料伊文氏藍(4.5ml 2％p/v)注入左心室，用來區(qū)分心臟的灌注區(qū)與非灌注區(qū)(AAR)。伊文氏藍溶液使灌注的心肌染色，而被阻塞的血管床則不染色。
用過量麻醉劑殺死老鼠，取出心臟切成薄片(3-4mm)，取出右心室壁和危險區(qū)(粉紅色)，與非缺血區(qū)(藍色)分開。危險區(qū)切成小片，用硝唑藍(NBT，0.48mg/ml)于37℃孵育20分鐘；在完整脫氫酶存在的情況下(活的心肌內)，NBT形成深藍色的甲月替，而沒有脫氫酶活性的壞死區(qū)域，則不被染色。這些小片依據(jù)其顏色分離，稱重，確定梗死的大小占AAR重量的百分比。
進行以下實驗組a)LAD阻斷(25分鐘)，再灌注(2小時)，再灌注開始5分鐘后給予賦形劑，并在再灌注期間持續(xù)給予(鹽水溶液，3ml/kg靜脈推注，1.8ml/kg/h)；b)LAD阻斷再灌注，再灌注前5分鐘給予MP1002或MP1001(10mg/kg快速推注)，然后在再灌注期間以2mg/kg/h輸注；c)假手術(無LAD阻斷)，輸注賦形劑；d)假手術，如上所述輸注MP1002或MP1001。
丙二醛(MDA)作為心臟組織內細胞膜脂類的最終過氧化產物如上所述進行測定。
表2顯示了在實驗期間測得的多個MAP和HR數(shù)值。在研究的多個分組中，基本血液動力學結果基本相似。
在接受了假手術(無LAD阻斷)的動物中，輸注賦形劑或賦形劑加MP1002或MP1001均不引起實際的血液動力學效應。
在接受了冠狀動脈阻斷與再灌注的動物中，在實驗期間平均MAP輕微降低，但HR不變。而且，接受I/R(缺血/再灌注)加MP1002或MP1001處理的大鼠與單獨用賦形劑處理的I/R組動物，平均MAP和HR值上沒有顯著差異。
與對照組相比(

圖1)，輸入MP1002或MP1001能夠顯著減小(P＜0.01)梗死的大小(分別為80％和78％)。假手術不能引起明顯的梗阻，與假手術相比(加上賦形劑或抗氧化劑)，I/R處置能引起脂質過氧化反應明顯與顯著(P＜0.01)的增加，給予MP1002或MP1001能夠顯著降低(P＜0.01)過氧化作用的發(fā)展，其過氧化作用的水平與實施了假手術(圖2)的動物相似，證明了這些化合物具有很高的抗氧化能力。
這些實驗顯示MP1001和MP1002能夠顯著降低心肌缺血再灌注后心肌梗塞的范圍，這些結論說明本發(fā)明化合物對缺血再灌注引起的心肌損傷具有良好的保護效應。
這也提示本發(fā)明化合物為治療包括缺血性心臟病在內的危及生命的疾病提供了一個新的治療途徑。
表1.大鼠黑質中注射百草枯后，雙(1-氧-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶)癸二酸酯(MP1002)或雙(1-羥基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶)癸二酸酯(MP1001)對癲癇潛伏期、癲癇持續(xù)期、死亡率和脂質過氧化進程的影響
在表1中，每個數(shù)值表示在20只不同大鼠中進行的20個不同實驗的平均值±SD；a)為黑質中微輸注50μg百草枯，同時接受1μgMP1002或MP1001的動物；b)腹腔內注射120mg/kg體重的MP1001或MP1002，5分鐘后黑質內微輸注50μg百草枯的動物；c)微輸注50μg百草枯，同時腹腔內注射120mg/kg MP1001或MP1002的動物；d)微輸注50μg百草枯，5分鐘后腹腔內注射100mg/kg MP1001或MP1002的動物。
在輸注百草枯的相同位點輸注賦形劑對與百草枯相關的行為改變或死亡沒有任何效果。
本表還以治療后24h或20h(*)后丙二醛(MDA)的水平說明了黑質區(qū)脂質過氧化反應的變化情況。具體細節(jié)和實驗步驟參考正文。
**p＜0.01百草枯或百草枯+賦形劑/對照組和百草枯+賦形劑/MP1002或MP1001治療組(Wilcoxon分類法)。
表2.抗氧化劑MP1001和MP1002對大鼠心肌缺血再灌注(I/R)中平均動脈壓(MAP)和心率(HR)變化的影響作用
每個數(shù)值表示至少15個不同實驗的平均值±SD.
動物接受了MP1002，MP1001或等體積賦形劑.
具體細節(jié)和實驗步驟參考正文.
權利要求
1.如下式的化合物在制備治療或預防神經(jīng)變性疾病的獸用或人用藥物組合物中的應用 其中R6為氧、氫或羥基，R1，R2，R3和R4彼此獨立選自-氫-含1-12個碳原子的烷基，-含2-12個碳原子的烯基，-含2-12個碳原子的炔基，或-R1和R2一起為環(huán)丁烷或環(huán)戊烷；-R5為氫，-含1-12個碳原子的烷基，-含3-8個碳原子的環(huán)烷基，-含2-12個碳原子的烯基，-含2-12個碳原子的炔基，或 其中R1，R2，R3和R4同前面所定義，R7與R6可以相同或不同，選自氫、氧或羥基，和n是從1到30的整數(shù)。
2.如權利要求1所述的應用，其中式(I)中，R1，R2，R3和R4彼此獨立選自含1-6個碳原子的烷基，R6為氫、氧或羥基，并且R5是 其中R1，R2，R3和R4彼此獨立選自含1-6個碳原子的烷基，R7為氧、氫或羥基，n是從2到14的整數(shù)。
3.如權利要求1或2所述的應用，其中R1，R2，R3和R4彼此獨立選自含1-3個碳原子的烷基，R5是 其中R1，R2，R3和R4彼此獨立選自含1-3個碳原子的烷基，R7為氧、氫或羥基，n為從6到10的整數(shù)。
4.權利要求1-3任一項所述的應用，其中化合物的式如下 其中R6與R7可以相同或不同，選自氧、氫和羥基。
5.權利要求1-4任一項所述的應用，其中神經(jīng)變性疾病選自帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、缺血再灌注性腦損傷、創(chuàng)傷性腦損傷、HIV引起的神經(jīng)病變、唐氏綜合征、糖尿病性多神經(jīng)病變、肌肉萎縮癥、多發(fā)性硬化癥、亨延頓氏病、朊病毒病、遲發(fā)性運動障礙、tauopathy、脫髓鞘病和Lou Gherig′s綜合征。
6.權利要求1-4任一項所述化合物用于治療疾病的用途，所述疾病選自缺血再灌注引起的心/腎/肺/肝/腸損傷、高血壓、糖尿病、癌癥、休克、囊性纖維病、病毒感染、藥物和放射(放療或放射防護)所致毒性作用、炎癥、癲癇、動脈粥樣硬化、衰老、高脂血癥、高膽固醇血癥、類風濕性關節(jié)炎，和疼痛或膿毒癥的治療。
7.前述任意一項權利要求所述的應用，其中藥學或獸醫(yī)學組合物或藥物適用于口服、腸胃外、吸入或局部給藥。
8.前述任意一項權利要求的應用，其中藥學或獸醫(yī)學組合物或藥物，其劑型適合于以0.01-200mg/kg體重給藥，優(yōu)選0.5-20mg/kg體重。
9.藥物組合物，其含有抗氧化有效量的、如權利要求1-4任一項中式(I)的化合物，其中R6為氫或氧，R7如果存在，則與R6相同或不同并選自氧、氫和羥基，還含有適合于給予人或動物的生理學可接受賦形劑。
10.藥物組合物，含有抗氧化有效量的、如權利要求1中式(I)的化合物，其中R5是式(II)中的基團，且其中R6和R7彼此獨立選自氫、氧和羥基，條件是R6和R7不能同時為羥基，還含有適合于給予人或動物的生理學可接受賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物、藥用和獸用組合物，以及所述組合物在治療或預防神經(jīng)變性疾病和癥狀的應用，如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、缺血再灌注損傷、創(chuàng)傷性腦損傷、HIV引起的神經(jīng)病變、唐氏綜合征、糖尿病性多神經(jīng)病變、肌肉萎縮癥、多發(fā)性硬化癥、亨延頓氏病、朊病毒病、遲發(fā)性運動障礙、tauopathy和脫髓鞘病，以及其它危及生命的疾病，如心/腎/肺/肝/腸缺血再灌注損傷、高血壓、糖尿病、腫瘤、休克、藥物和放射(放療和放射防護)所致毒性作用、炎癥、動脈粥樣硬化、衰老、高脂血癥、高膽固醇血癥、癲癇和類風濕性關節(jié)炎。上述所有疾病均與活性自由基過度產生有關。更具體的，本發(fā)明涉及含有來源于N－哌啶的抗氧化劑環(huán)(雙)－羥胺的藥物組合物用于預防和治療人和動物的疾病。
文檔編號A61P25/28GK1946400SQ200580006633
公開日2007年4月11日 申請日期2005年2月22日 優(yōu)先權日2004年3月1日
發(fā)明者G·梅里茲 申請人:梅迪斯蒂研究及生產股份有限公司