專利名稱：神經(jīng)保護性膳食補充劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的膳食補充劑，其可用作神經(jīng)保護劑并口服施用。
在世界范圍內(nèi)老年人數(shù)目穩(wěn)步增長。事實上現(xiàn)在老年人活的更長。因此，與年齡相關(guān)的缺陷(例如與年齡相關(guān)的記憶減退、認知下降等)正在成為重要的公共健康問題。
EP1325747A2公開了一種膳食補充劑，其包含平衡量的具有神經(jīng)保護活性的天然物質(zhì)(例如α-硫辛酸和γ-亞油酸或大豆磷脂)、具有抗炎及抗氧化和糖代謝及脂代謝調(diào)節(jié)特性的化合物、以及復合B族維生素。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的膳食補充混合物，該混合物具有增強的神經(jīng)保護活性，并預防、改善或?qū)股窠?jīng)變性，以及預防、對抗和/或改善認知功能下降。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種以口服劑型施用的膳食補充劑。
所述具有神經(jīng)保護活性的新的膳食補充劑包含一種肽配制品，所述配制品包含以序列1NMVPFPR或序列2ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS定義的兩種肽中的至少一種。
所述新的膳食補充混合物可預防或改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)變性、與年齡相關(guān)的認知下降和與年齡相關(guān)的記憶減退。其可用作增強人，優(yōu)選老年人的記憶、注意力和警惕性的配制品。
所述新的膳食補充混合物基本由分子量小于10kDa的分子組成，并包含由下列序列定義的肽中的至少一種序列1NMVPFPR
序列2ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS。
利用普遍已知的技術(shù)進行序列測定，例如質(zhì)譜分析、串聯(lián)質(zhì)譜分析、電泳、色譜分離后的測序等。
所述新的膳食補充混合物可進一步包含額外的分子量小于10kDa的肽。
其可進一步包含氨基酸。
合適的氨基酸例如是天冬酰胺(N)、甲硫氨酸(M)、谷氨酸(E)、纈氨酸(V)、脯氨酸(P)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)、異亮氨酸(I)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、組氨酸(H)、天冬氨酸(D)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)等。這些氨基酸優(yōu)選以其光學活性形式使用，最優(yōu)選使用L-氨基酸。
所述新的膳食補充混合物可進一步包含維生素，例如維生素A、不同的B族維生素、維生素C、維生素D、E和/或K。其還可進一步包含礦物質(zhì)和/或微量元素，例如鈣、鎂、鐵、銅、鈉、鋅、錳、碘、鉀、硒、鉻、鉬、氟、氯、磷。更多成分可以是咖啡因和?；撬?、脂肪酸例如Ω-脂肪酸、α-硫辛酸、磷脂、磷脂酰絲氨酸、植物提取物(例如銀杏葉提取物)、石杉堿，神經(jīng)遞質(zhì)前體如DMAE(二甲氨乙醇)等。
其可進一步包含調(diào)味劑、著色劑(如二氧化鈦、氧化鐵等)和/或防腐劑等。防腐劑可以是-羥苯乙酯(對羥基苯甲酸乙酯)-苯扎氯銨-芐索氯銨-苯甲酸
-尼泊金丁酯(對羥基苯甲酸丁酯)-尼泊金甲酯(對羥基苯甲酸甲酯)-山梨酸鉀-丙酸-尼泊金丙酯(對羥基苯甲酸丙酯)-苯甲酸鈉-丙酸鈉-山梨酸該混合物可進一步包含可接受的添加劑、填充劑和/或賦形劑，例如微晶纖維素、麥芽糊精、硬脂酸鎂、膠體氧化硅、二氧化硅、乳糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉、改性纖維素、植物纖維素、磷酸鈣、磷酸鈉、植物性甘油、淀粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮、羧甲基纖維素、硬脂酸、明膠、甘露醇、抗壞血酸鈉、甘油、米粉、麥芽糊精磷酸二鉀等。
優(yōu)選地，本發(fā)明的膳食補充混合物包含10-30wt％的肽、2-20wt％的氨基酸和達2-76wt％的如上定義的額外的成分、填充劑等。
所述膳食補充混合物以片劑、包衣片劑、膠囊、糊劑、咀嚼片或飲用溶液的形式口服使用。如果使用包衣片劑，該配制品可抵抗胃液，因此可使用腸包衣劑型。所述膳食補充混合物可以以其口服劑型每天使用至少一次。
本發(fā)明的膳食補充混合物產(chǎn)品可用于預防、改善、對抗與衰老過程相關(guān)的缺陷，優(yōu)選是哺乳動物，尤其是人，最優(yōu)選老年人中與衰老過程相關(guān)的缺陷。
其可用作保護神經(jīng)元對抗與衰老過程相關(guān)的代謝缺陷和應激的配制品以預防、對抗和/或改善由于缺氧或缺血導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果、由于細胞內(nèi)鈣過載導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果、由如L-谷氨酸導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果和由于氧化應激導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果。
特別地，其也用以預防、對抗和/或改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)變性的后果，預防由于細胞應激、神經(jīng)變性病變和中毒導致的神經(jīng)元細胞死亡，維持和保持衰老過程中正常的神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)，支持和/或改善突觸功能和突觸密度，預防、對抗和/或改善與年齡相關(guān)的突觸可塑性和突觸密度、作用下降的后果，激活與注意力和記憶力相關(guān)的大腦機制，預防、對抗和/或改善認知功能下降，預防、對抗和/或改善記憶功能下降，預防、對抗和/或改善注意力不足，預防、對抗和/或改善與衰老過程相關(guān)的警惕性下降，以及支持、維持和/或改善長期記憶力和程序性記憶力以及學習表現(xiàn)、注意力和警惕性，并且用以在衰老過程中保持/支持健康的精神功能。
實施例1粉末混合物的制備用1.2mm篩網(wǎng)將-49.490kg粉末，包含6.7％的肽、17.5％的氨基酸和75.8％的乳糖-6.738kg羧甲基纖維素-9.607kg微晶纖維素-0.525kg無水膠體氧化硅篩選到不銹鋼筒中，并用翻滾型混合器以6rpm的混合速度混合10分鐘(混合物1)。
用1.2nm篩網(wǎng)將1.015kg硬脂酸鎂篩選到含混合物1的不銹鋼筒中。隨后，用翻滾型混合器以4rpm的混合速度將所有的顆粒混合5分鐘(最終混合物)。
粉末混合物的壓制(壓片)用約40,000片/小時的壓片速度壓片機壓制混合物。使用圓形、雙凸面沖頭，其直徑11mm。
以這種方式，得到具有以下特性的片劑-平均重量 385.0+/-7.7mg-硬度 40-70N-崩解 不超過15.00分鐘-脆性 不超過1.00％(所有的測試方法都依據(jù)歐洲藥典)實施例2片劑的包衣在實施例1中獲得的片劑可被包衣。
將以下成分用推進式混合器進行混合以形成薄膜包衣懸浮液-23.810kg醋酞纖維素(30％水性溶液)-0.595kg滑石粉-0.833kg二氧化鈦-1.429kg檸檬酸三乙酯在轉(zhuǎn)鼓式包衣機(drum coater)中，用薄膜包衣懸浮液包衣片劑至終重量為428.0mg/膜片。
包衣片可用蜂蠟或石蠟打光。
以這種方式，得到具有以下參數(shù)的薄膜包衣的白色片劑-平均重量428.0+/-8.6mg-崩解不超過30.00分鐘-脆性不超過1.00％
(所有的測試方法都依據(jù)歐洲藥典)實施例3或者，可將用于壓片的粉末混合物(參見實施例1)裝填到硬明膠膠囊中。
用385mg的粉末混合物裝填0號或1號硬明膠膠囊。從而獲得具有以下參數(shù)的膠囊-平均重量462.0+/-28.8mg(1號)-平均重量481.0+/-28.8mg(0號)-崩解不超過15.00分鐘或者，相當量的顆粒可使用2號和3號硬明膠膠囊。
實施例4飲用溶液的制備將-70.72g粉末(包含6.7％的肽、17.5％的氨基酸和75.8％的乳糖)-400.00g蔗糖-5.00g苯甲酸溶于盛有1500g水的玻璃燒瓶中，該燒瓶裝有推進式混合器。形成幾乎澄清的溶液(溶液1)將-85.00mg核黃素(riboflavine)-17.00g草莓香精-10.00g Aroma Milk-caramel或2.6g Aroma Orange溶于盛有溶液1的玻璃燒瓶中，該燒瓶裝有推進式混合器。形成幾乎澄清的溶液(溶液2)。
將-125.0mg維生素E
懸浮于盛有200.00g水的玻璃燒瓶中，該燒瓶裝有推進式混合器。將該懸浮液添加到溶液2中(溶液3)。
將-5.00g海藻酸鈉溶于500.00g溫水中，并添加到溶液3中(溶液4)。
用水將溶液4加至5000ml，并在裝備有推進式混合器的玻璃燒瓶中進行混合。形成幾乎澄清的溶液，將其通過0.45μm薄膜濾器進行過濾以進一步澄清。將該溶液裝填于帶有螺旋瓶蓋的20ml玻璃瓶中。
實施例5神經(jīng)保護作用-在培養(yǎng)基中保護皮層神經(jīng)元免遭不同的與年齡相關(guān)的損傷5.1方法在試驗前對所有必需物品進行滅菌。購買無菌儲備溶液，并且在層流櫥(laminar airflow cabinet)中混合終溶液。
用于大批分析的培養(yǎng)基由DMEM(Dulbecco′s Modified EagleMedium)培養(yǎng)基與4.5g葡萄糖/L、5％胎牛血清、0.01％慶大霉素和2mM L-谷氨酰胺組成。培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺是生長和分化所必需的，并且慶大霉素必需加入以防止培養(yǎng)基被支原體或其它有害微生物污染。每次試驗，在無菌條件下，在層流櫥中制備新鮮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。
用于試驗的細胞是羅曼褐(Lohman Brown)雜種雞胚。從當?shù)仞B(yǎng)雞者(Schlierbach Geflügel GmbH，奧地利)購買一日齡受精卵，并在適當條件下(12±0.3℃，80±5％的濕度)保存于實驗室中。在0胚齡時，將卵轉(zhuǎn)移至育種培養(yǎng)箱中，并于38±0.5℃和55±5％的濕度持續(xù)翻轉(zhuǎn)保存至8胚齡。為了分離神經(jīng)元，每次試驗使用3至4枚雞胚。這些胚胎的胚齡非常關(guān)鍵，因為只有在發(fā)育的特定時期腦才會幾乎僅含有神經(jīng)細胞和少于5％的神經(jīng)膠質(zhì)(Pettmann，B.，Louis，J.C.和Sensenbrenner，LM.(1979)Nature281378-380)。
用70％的乙醇擦拭卵，并用大鑷子鈍端擊碎。將胚胎斷頭后，除去覆蓋端腦的組織，并收集腦半球。除去任何lease組織并保留腦膜后，將腦半球轉(zhuǎn)移至含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的皿中。然后，通過使用1ml的吸液管并通過在孔徑100μm的無菌尼龍篩網(wǎng)上擠壓3次，將組織機械分離。
使用標準臺盼藍染料排除試驗(PM實驗室)，可以測定細胞數(shù)目和細胞存活力。為了進行細胞計數(shù)，1份細胞懸浮液必須用9份的臺盼藍溶液(270IJ I PBS和180IJL 0.5％臺盼藍溶液)稀釋。在Bürker-Türk-血細胞計數(shù)器中計數(shù)存活細胞和染藍的死亡細胞。細胞總數(shù)減去染色的死亡細胞得到存活細胞的量。
為了進行損傷分析，將初始組織培養(yǎng)基從細胞中除去并保存起來。加入含有氰化鈉或秋水仙堿(氰化鈉0.01M、0.1mM、1mM；秋水仙堿0.1μM、1μM、10μM)的新培養(yǎng)基，并與細胞一起保持30分鐘。然后，除去該損傷培養(yǎng)基并將其廢棄，重新加入初始培養(yǎng)基，并將該培養(yǎng)物再保持24或48小時的恢復期。此后進行存活力測試。在所描述的實驗中，使用聚D-溶素包被的96孔微量滴定板。將含有6×105細胞/ml的80_1培養(yǎng)基添加到事先制備的微量滴定板的每個孔中，這些滴定板已含有80_1物質(zhì)補充培養(yǎng)基。因此，每孔中最終的細胞數(shù)為3×105/ml營養(yǎng)培養(yǎng)基。受損的和未受損的對照僅在整個試驗期間在營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。當制備平板時，孔外常規(guī)地充滿了營養(yǎng)培養(yǎng)基只為了防止蒸發(fā)。將平板在37℃、95％的濕度和5％的CO2且不更換培養(yǎng)基的條件下保持至試驗結(jié)束。在培養(yǎng)基中幾個小時后，神經(jīng)元開始伸展過程。
將本發(fā)明的混合物進行安瓿包裝用作即可使用(ready-to-use)的溶液。為了得到濃度為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μl/ml的培養(yǎng)基，在DIV 1以合適的濃度向孔中添加所述混合物一次，并與神經(jīng)元保持至試驗結(jié)束。在DIV 8開始發(fā)生損傷，在DIV 9和DIV 10分別進行細胞存活力的評估。在保持培養(yǎng)基期間，損傷發(fā)生后，沒有進一步添加物質(zhì)。
在損傷檢測中，在不同的兩天、相同的條件下對本發(fā)明的混合物進行測試。在每次試驗中，對損傷組和損傷對照組生成至少6個特定值，對每一濃度生成2個特定值(總共n＝12)。將本發(fā)明的混合物補充到濃度為1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μl/ml的培養(yǎng)基中。對具有不同損傷的不同試驗組進行了研究。
在每次試驗結(jié)束，用MTT還原比色分析法測量剩余神經(jīng)細胞的存活力。該分析基于黃色MTT(3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯四唑溴)被線粒體脫氫酶(琥珀酸脫氫酶)還原為深藍色甲 晶體。由于所描述的反應僅在活細胞中被催化，該分析可用于定量細胞存活力。為了測定細胞存活力，向每一孔中加入MTT溶液至終濃度0.5mg/ml。2小時后，可期望獲得含MTT的培養(yǎng)基。用3％的SDS裂解細胞，將甲 晶體溶于異丙醇/鹽酸中。使用平板讀數(shù)器(Anthos II)(570nm)以評估光密度。神經(jīng)元存活力用光密度(OD)表示。
使用描述性統(tǒng)計分析方法。MTT值(OD)用平均值±標準差表示。
5.2結(jié)果首先，使用不同濃度的損傷化合物(氰化鈉和秋水仙堿)獲得相對于未損傷的神經(jīng)元為約50％的神經(jīng)元損傷。以總體損傷是明顯但仍允許神經(jīng)元存活和恢復的方式來選擇合適的損傷劑量和損傷時間。過高的劑量將導致快速的神經(jīng)元死亡，限制了神經(jīng)保護性物質(zhì)挽救(rescue)它們的可能性；過低的劑量也不能獲得對保護性化合物的可信賴的評估，因為在損傷和未損傷對照之間的差異太小了。
以氰化鈉造成中毒30分鐘后，對48小時細胞存活力的評估顯示本發(fā)明仍有顯著的神經(jīng)保護作用，但與24小時后的觀察結(jié)果相比略低一些(

圖1和2)。由秋水仙堿引起的細胞骨架破裂也導致了嚴重的神經(jīng)變性。24小時后，本發(fā)明的0.4mg的低劑量不能呈現(xiàn)顯著的挽救，但所有其它劑量以高于損傷對照組約50％的水平提高了神經(jīng)元存活力。損傷開始后48小時，所有的劑量具有明顯的神經(jīng)保護作用，則在3.2mg的高劑量組中存活力已經(jīng)比未損傷對照高出100％，這表明多數(shù)的神經(jīng)元可以被挽救(圖3和4)。
圖1-4表示相對于未處理的損傷對照(＝100％)，由于使用本發(fā)明的混合物導致的存活力的相對變化 圖1通過暴露于氰化鈉誘導細胞毒性缺氧后24小時，本發(fā)明不同劑量對神經(jīng)元存活力的影響。
圖2通過暴露于氰化鈉誘導細胞毒性缺氧后48小時，本發(fā)明不同劑量對神經(jīng)元存活力的影響。
圖3通過暴露于秋水仙堿誘導細胞骨架破裂后24小時，本發(fā)明不同劑量對神經(jīng)元存活力的影響。
圖4通過暴露于秋水仙堿誘導細胞骨架破裂后48小時，本發(fā)明不同劑量對神經(jīng)元存活力的影響。
從這些試驗得到的總的結(jié)論清晰地表明本發(fā)明能夠保持神經(jīng)細胞存活，保護它們免受代謝應激和代謝衰竭的損傷，并刺激細胞存活、軸突及其分支的生長。如果由體外的不同毒素誘導的神經(jīng)元損傷太嚴重，只能獲得輕微的保護，在輕度至中度損傷情況下，可評估顯著的劑量依賴效應。
然而，本發(fā)明的復合組合物表明所述肽以協(xié)同方式發(fā)揮作用，結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)性刺激，增加抗凋亡因子和結(jié)構(gòu)蛋白的合成，抑制蛋白酶和代謝調(diào)節(jié)的異常上調(diào)。這些作用的總和表明了這一膳食補充劑在體外保護高度易損的細胞的引人關(guān)注的潛力。
實施例6老齡大鼠的長期處理(與口服施用生理鹽水相比，每天經(jīng)口管飼處理，進行3個月)
6.1方法6.1.1處理和行為測試所有試驗在18月齡(±1月齡)的Long Evans大鼠中進行。將大鼠隨機分配至不同組中，或用本發(fā)明的混合物處理或用生理鹽水處理作為對照。每組的動物數(shù)為12-15只。用如實施例5中定義的本發(fā)明的混合物或生理鹽水經(jīng)口管飼每天1次，對兩組試驗組的動物都處理3個月。在每月最后4個處理日里(第27-30個處理日＝第1-4個試驗日；第56-60個處理日＝第5-8個試驗日以及第87-90個處理日＝第9-12個試驗日)，在MWM中進行行為學測試以評估動物的學習和記憶功能。
所使用的MWM由圓形游泳池組成，該游泳池直徑170厘米，高45厘米。附加的內(nèi)置鋁環(huán)用于隱藏所有將電腦系統(tǒng)與隱藏的平臺相連的電纜。這不必給動物提供迷宮內(nèi)標記，標記可能影響正常的學習行為。該池子的內(nèi)表面涂成黑色，這樣從外面不能檢測到透明的耐熱有機玻璃(Plexiglas)平臺。淹沒在水中的平臺(直徑15厘米)總是位于池中完全相同的位置，東南象限。使用發(fā)光二極管檢測每只大鼠的游泳路徑，二極管的信號可被連接到個人電腦上的攝像機檢測到，使得能夠持續(xù)跟蹤游泳路徑。特別設(shè)計的軟件(ART3)可以計算游泳路徑的長度、到達隱藏平臺的潛伏期、在象限中花費的時間、經(jīng)過目標區(qū)域的情況和所有其它適于評估學習和記憶功能的參數(shù)。將發(fā)現(xiàn)所述平臺的逃逸潛伏期(Eescape Latency)以及游泳路徑的長度用于統(tǒng)計計算本發(fā)明的混合物對學習功能的影響。在每個跟蹤(訓練)天，每只大鼠進行4次游泳試驗。根據(jù)Kruskal和Wallis應用h-檢驗，或在正態(tài)分布值下應用方差分析(ANOVA)和用于post hoc分析的Scheffe檢測進行統(tǒng)計分析。
6.1.2組織學檢查在MWM中完成行為學試驗后，利用超劑量的戊巴比妥(Nembutal)立即處死每組4-6只大鼠。為了得到合適的組織學標本，用生理鹽水和福爾馬林進行穿心灌注。為了完成固定，將腦轉(zhuǎn)移至10％福爾馬林中，然后包埋在石蠟中。在切片機上切成厚度為3μm(Bregma水平～-4.00mm)的切片，并與抗囊狀蛋白突觸泡蛋白的抗體一起溫育。利用酶反應(APC法，過氧化物酶綴合的二抗、二氨基聯(lián)苯胺用作底物)可顯示出免疫反應。
由于事實上在突觸密度和突觸泡蛋白免疫反應性之間存在良好相關(guān)性，因此使用成像分析系統(tǒng)(LUCIA-Nikon Photo Systems，奧地利)進行突觸數(shù)的光學顯微定量。在清楚定義的海馬分區(qū)(CA1輻射層、CA2輻射層、CA3輻射層、CA3透明層、齒狀回側(cè)切面(dentate gyrus lateral blade)和齒狀回中切面(dentate gyrusmedial blade))以及內(nèi)嗅皮層(第2和3層)進行成像分析。出于該目的，對突觸泡蛋白免疫反應斑點的數(shù)目和這些點的全部面積進行測量和統(tǒng)計計算(Kruskal-Wallis ANOVA)。
6.2結(jié)果6.2.1在MWM中的行為學測試6.2.1.1逃逸潛伏期逃逸潛伏期被定義為將動物置于游泳池中到成功找到MWM中的隱藏平臺之間的時間。如上述，動物必需利用額外的迷宮標記獲得定向。逃逸潛伏期是對學習和記憶的測量。
在第1個訓練期，施用1個月后，在兩組試驗組之間不能檢測到明顯差異。然而，存在這樣一個明顯的趨勢，即用本發(fā)明的混合物處理的動物完成任務(wù)更快，但訓練4天后結(jié)果是相同的。
在第二個月結(jié)束時，本發(fā)明的混合物組和生理鹽水處理對照組在訓練的第一天存在統(tǒng)計學上的顯著差異(p＝0.0049)。這表明了長期記憶力的穩(wěn)定性，最可能也是改善的過程學習。用本發(fā)明的混合物處理的大鼠從第一個試驗起記住了最初的平臺位置，換句化說，在一個月的時期內(nèi)它們沒有忘記該位置，并且由于它們已經(jīng)知道任務(wù)的程序，它們比對照組完成得更好。由于在訓練的第一天它們顯示出極低的逃逸潛伏期，在第二月末進一步提高是不可能的，這是由游泳速度的限制導致的天花板效應所致。對照組動物在訓練期間顯示出持續(xù)的提高，但在最后一天它們?nèi)粤佑诮?jīng)本發(fā)明的混合物處理的動物。在3個月處理期末，以本發(fā)明的混合物處理的大鼠開始仍具有比對照組更低的潛伏期。然而，兩組之間都顯示非常好的表現(xiàn)并且沒有進一步提升的空間。
6.2.1.2對長期記憶力的研究對試驗4第4天和試驗1第5天之間以及試驗4第8天和試驗1第9天之間，在逃逸潛伏期上的差異的分析對長期記憶力(第一個月末的最后測試日的最后試驗和第2個月末的第一個訓練日的第一次試驗之間潛伏期的差異；第二個月末的訓練日的最后試驗和3個月處理期末的第一個訓練日的第一次試驗之間潛伏期的差異)的評估顯示用本發(fā)明的混合物處理的大鼠在提高長期記憶力上具有明顯趨勢。如果第一個月的最后訓練日的最后試驗的逃逸潛伏期與第2個月期間的第一個訓練日的第一次試驗的潛伏期相比，本發(fā)明的混合物處理的動物在表現(xiàn)上提高了差不多10秒。相反，對照組動物略低。將2個月期間的最后訓練日末的最后試驗與該處理結(jié)束后的第一個訓練日的第一次試驗之間的表現(xiàn)進行比較，結(jié)果再次顯示本發(fā)明的混合物組的表現(xiàn)提高了超過10秒。生理鹽水處理對照組幾乎沒有顯示出變化，這表明在本發(fā)明的混合物處理的大鼠中長期記憶力得到提高。
分別對一個月后的第一個訓練日、處理2個月后的第一個訓練日和處理3個月后的第一個訓練日之間的逃逸潛伏期進行分析作為用于長期記憶力的第二種測量方法，將真正的第一個學習天與處理2個月和3個月后的第一個訓練日之間的差異進行評估。這將用作測量逃逸潛伏期總提高的方法，比較首次用于試驗的大鼠與重復訓練的大鼠進行比較。差異越大反映出長期記憶力越好；小的差異表明在不進行訓練的處理期間，動物忘記了所述平臺的位置。
圖5(訓練第1天(1個月處理)和第5天(2個月處理)之間逃逸潛伏期的差異；數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。**＝P＜0.01)證明在真正的第一個訓練日(首次用于實驗的大鼠首次置于MWM中)和處理2個月后的重復訓練之間存在差異。與第一個處理日相比，本發(fā)明的混合物處理的動物與第一個訓練日相比，提高了差不多25秒或近50％，而生理鹽水處理的對照僅顯示大約12秒或低于25％的提高。將第一個訓練日和處理期(3個月)結(jié)束后的第一個訓練日的重復訓練之間的逃逸潛伏期進行比較，兩組之間沒有顯示出顯著的差異。仍然存在趨勢支持本發(fā)明的混合物的處理，但數(shù)據(jù)清楚地表明重復訓練最終導致在所有處理組中的成功。必須考慮到所有的試驗都是在老齡，但在其它方面健康且沒有任何明顯神經(jīng)紊亂的動物中進行的。因此，可預期延長訓練將持續(xù)增加兩個處理組的認知力。
圖5第1天和第5天之間逃逸潛伏期的差異6.2.1.3游泳路徑長度的評估由于運動差異可以使得逃逸潛伏期發(fā)生偏差，并因此也計算了游泳路徑長度。增加游泳速度或降低游泳速度將模擬學習和記憶方面的其它變化。游泳路徑的長度是學習和記憶力獨立的測量方法，不依賴于游泳速度。
數(shù)據(jù)證實了在2個月處理期結(jié)束后的第一個訓練日，本發(fā)明的混合物處理的大鼠和對照之間統(tǒng)計學上的顯著差異(p＝0.0133)。這表明先前分析的數(shù)據(jù)是可靠的，且本發(fā)明的混合物處理不依賴于任何運動行為的改變提高認知力(圖6)。
圖6在測試第1-4、5-8和9-12天在Morris水迷宮中游泳路徑長度。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。*＝P＜0.01[MO＝本發(fā)明混合物；con＝對照]對試驗4第4天和試驗1第5天之間以及試驗4第8天和試驗1第9天之間，在游泳路徑長度上的差異進行分析第一組訓練期間的最后試驗與處理2個月后的第二次訓練期間的第一次試驗的游泳路徑長度的比較，精確地反映出了在評估逃逸潛伏期時所觀察到的情況。在本發(fā)明的混合物處理組中，游泳路徑長度縮短了約2.1米，這意味著甚至在沒有訓練4周后他們?nèi)阅茌^更精確地通過。對照組需要多出1.4米來找到所述平臺，這反映出在最初地恢復中存在某種程度的困難，或者換句化說，它們需要重新學習到達靶的精確的和最短方向。
如果將第二期(處理2個月后)的最后測試日的最后訓練的表現(xiàn)與在3個月末的第一個訓練日的第一次試驗的表現(xiàn)進行比較，游泳路徑長度差不多短了2米。這再次表明本發(fā)明的混合物在長期記憶力功能上的強烈影響。對照組動物沒有顯示任何進一步的提高。
6.2.2.突觸密度的組織學評估突觸泡蛋白免疫反應“斑點”的數(shù)目用本發(fā)明的混合物進行3個月的處理期導致在所研究區(qū)域中的4個區(qū)域的突觸密度有統(tǒng)計學上的顯著增長。在CA3輻射層和齒狀回側(cè)切面，至少存在在本發(fā)明的混合物處理的動物中增加突觸素密度的強烈趨勢，且僅在CA3輻射層中所述處理沒有導致突觸密度增加。
突觸泡蛋白免疫活性區(qū)域的評估前面的評估計數(shù)了每個單獨的免疫反應斑點，與此不同，現(xiàn)在測量所有被突觸泡蛋白免疫反應活性覆蓋的區(qū)域，與對血管和組織破裂進行校正后的腦切片的所有區(qū)域進行比較。結(jié)果反映了通過免疫反應斑點計數(shù)獲得的數(shù)據(jù)，僅有的例外是對內(nèi)嗅皮層的影響略低于顯著水平(p＝0.0550)。所有其它的差異仍保持顯著，并且可以對在本發(fā)明的混合處理的大鼠中突觸密度增加的總趨勢進行確認。
圖7海馬結(jié)構(gòu)的不同區(qū)域中突觸泡蛋白免疫活性的面積占對照值的百分比。100％＝在生理鹽水對照組中計數(shù)的免疫反應斑點數(shù)。豎棒表示平均數(shù)±標準差。*＝P＜0.05[MOI＝本發(fā)明混合物；CON＝對照]在Morris水迷宮中進行的行為學測試結(jié)果顯示自第二個月末在本發(fā)明的混合物處理組和對照組之間存在統(tǒng)計學上的顯著差異。用本發(fā)明的混合物處理的動物發(fā)現(xiàn)Morris水迷宮中隱藏的平臺比對照組要快。這表明本發(fā)明的混合物提高了健康老齡大鼠的長期記憶力。數(shù)據(jù)表明長期攝食生長因子樣肽耐受良好，并能給腦提供神經(jīng)營養(yǎng)刺激。在本試驗中顯示出的用本發(fā)明的混合物提高的認知力與海馬中形態(tài)學變化相關(guān)?？傊?，本發(fā)明提供了一種新的補充劑，其可幫助在衰老過程中維持記憶和學習能力，并可能減少與衰老過程相關(guān)的認知功能下降的危險。
實施例7在健康老年人中認知功能的增強
7.1方法本研究中包括6名健康成年人(4女、2男)，年齡63.03.6年(范圍51-76歲)。記錄樣本的體重、身高、體重指數(shù)(BMI)和其它生物學特征。
在選入之前，在所有受試者中進行醫(yī)學和心理測驗評估、定量EEG和ECG以及實驗室分析。沒有受試驗者達到老年性癡呆的DSM-IV和/或NINCDS-ADRDA標準(American PsychiatricAssociation，1994；McKhann et al.，1984)。在研究前和研究期間，所有受試驗者完全沒有使用藥物。從所有的研究參與者獲得書面通知同意書。該研究由Institutional Review Board主持，并根據(jù)Good Clinical Practice guidelines進行。
該試驗是開放標簽、探索性試驗，其目的在于評估本發(fā)明的混合物以單劑量口服施用對健康老年人腦機能的影響。共包括6名均大于50歲的受試者。每個參與者的研究持續(xù)時間為2天。在第1天、施用本發(fā)明的混合物前24小時對參與者進行認知評估，并在第2天、施用本發(fā)明的混合物后6小時進行第二次、處理后評估。所有研究參與者都接受本發(fā)明的混合物單口服劑量(180mg)。
7.2結(jié)果對于接受研究的受試驗者在基線處的平均MMSE得分為28.4±0.4分。用本發(fā)明的混合物處理后觀察到在ADAS-記憶得分上的顯著提高(基線處6.9±1.0的遺漏對處理后4.9±1.0的遺漏；p＜0.01)。這一記憶改善對于單詞識別項目上也具有統(tǒng)計學顯著性(2.8±0.6遺漏對1.5±0.7遺漏；p＜0.05)-圖8
圖8通過在健康老年受試者中利用ADAS的記憶項目評估本發(fā)明對記憶力的影響。ADAS記憶得分(遺漏)表示單詞回憶和單詞識別項的總和。
根據(jù)該研究的結(jié)果，經(jīng)過單劑量施用后，本發(fā)明的混合物支持和提高健康老年受試驗者的記憶力。本發(fā)明的混合物誘導的提高在單詞識別任務(wù)和ADAS的總記憶單項分值(subscore)上達到顯著值，但在單詞回憶項上沒有達到顯著值。本發(fā)明的混合物還以非顯著的方式增強在SKT的認知任務(wù)中的表現(xiàn)(涉及注意力和記憶功力兩方面)。單獨的SKT任務(wù)包括搭積木、計數(shù)標志和識別記憶等項目，在用本發(fā)明的混合物處理后可觀察到最佳效果。這些效果表明本發(fā)明可在成年老齡人中增強注意力和記憶功能而沒有認知力損害。
本發(fā)明的結(jié)果表明本發(fā)明的混合物支持了健康老年志愿者的腦功能，在認知力(記憶力和注意力)上具有明顯的積極作用。因此，本發(fā)明的混合物似乎構(gòu)成了一種有用的膳食補充劑以支持和提高老年受試驗者的認知力。
權(quán)利要求
1.具有神經(jīng)保護活性的膳食補充混合物，其包含一種肽配制品，該配制品包含以序列1NMVPFPR或序列2ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS定義的兩種肽中的至少一種。
2.權(quán)利要求1的膳食補充混合物，進一步包含額外的氨基酸。
3.權(quán)利要求1的膳食補充混合物，包含分子量低于10kDa的另外的肽。
4.權(quán)利要求1的膳食補充混合物，包含微量元素和/或礦物質(zhì)和/或維生素和/或咖啡因和/或?；撬岷?或脂肪酸和/或磷脂和/或磷脂酰絲氨酸和/或植物提取物。
5.權(quán)利要求1的膳食補充混合物，進一步包含可接受的添加劑和/或賦形劑和/或填充劑和/或著色劑和/或調(diào)味劑。
6.一種口服劑型，其包含權(quán)利要求1-5中任一項的膳食補充混合物和可接受的添加劑和/或賦形劑和/或填充劑和/或著色劑和/或調(diào)味劑和/或溶劑。
7.包含權(quán)利要求1的膳食補充混合物的口服劑型，其包含2-20wt％的肽。
8.權(quán)利要求7的口服劑型，進一步包含10-30wt％的氨基酸。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的膳食補充混合物在預防、改善與年齡相關(guān)的記憶損傷和/或與年齡相關(guān)的認知力下降和/或良性老年性遺忘中的應用。
10.權(quán)利要求1-5中任一項的膳食補充混合物在保護神經(jīng)元對抗與衰老過程相關(guān)的代謝缺陷和應激中的應用。
11.權(quán)利要求1-5中任一項的膳食補充混合物在預防、對抗和/或改善由于缺氧或缺血導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果、由于細胞內(nèi)鈣過載導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果、由L-谷氨酸和興奮性中毒事件導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果和由于氧化應激導致的與年齡相關(guān)的神經(jīng)元損傷后果中的應用。
12.權(quán)利要求1-5中任一項的膳食補充混合物在預防、對抗和/或改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)變性的后果；預防由于細胞應激、神經(jīng)變性病變和中毒導致的神經(jīng)元細胞死亡；維持和保持衰老過程中正常的神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)；支持和/或改善突觸功能和突觸密度；預防、對抗和/或改善與年齡相關(guān)的突觸可塑性和突觸密度下降的后果中的應用。
13.權(quán)利要求1-5中任一項的膳食補充混合物在激活與注意力和記憶力相關(guān)的大腦機制中的應用。
14.權(quán)利要求1-5中任一項的膳食補充混合物在預防、對抗和/或改善認知功能下降；預防、對抗和/或改善記憶功能下降；預防、對抗和/或改善注意力不足；預防、對抗和/或改善與衰老過程相關(guān)的警惕性下降；以及支持、維持和/或改善長期記憶力和程序記憶力以及學習表現(xiàn)、注意力和警惕性中的應用。
15.權(quán)利要求1-5中任一項的膳食補充混合物在衰老過程中保持/支持健康的精神功能中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有神經(jīng)保護活性的新的膳食補充混合物，其包含一種肽配制品，所述配制品包含以序列1NMVPFPR或序列2ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS定義的兩種肽中的至少一種。
文檔編號A61P25/00GK1929853SQ200580007675
公開日2007年3月14日 申請日期2005年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月29日
發(fā)明者赫伯特·莫斯勒, 赫麗斯塔·里德爾, 沃爾夫?qū)な┟状呢惛駹? 海因茨·施奈特 申請人:奧地利依比威藥品有限公司