專利名稱：一種內(nèi)酯單體化合物及其在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物，具體地說是以番荔枝種子為原料提取的一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物及其在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是危害人類健康的大敵。我國每年新發(fā)癌癥病例約有160萬人，每年死于癌癥的約有130萬人，全國因癌癥而死亡的人數(shù)逐年上升，我國為肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌癥的高發(fā)區(qū)域，癌癥死亡率居高不下。
目前尚無有效的藥物治愈大多數(shù)癌癥患者?；熕幬飳Π┌Y雖有一定療效，但毒副作用大，中成藥對癌癥的療效普遍較低，如參蓮膠曩對肺、胃癌的癌灶緩解率僅為3.5％，療效均不理想。
本發(fā)明人研究了番荔枝(Annona squamosa Linn)的樹皮、枝葉、種子的抗癌有效物質(zhì)和化學(xué)成分，從中提取出多種抗癌單體化合物(活性成分)，經(jīng)抗癌實(shí)驗(yàn)研究表明，對人肝癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞、人食管癌細(xì)胞和動(dòng)物移植性腫瘤(如S180、H22和Heps)均有顯著的體外和體內(nèi)抗癌治療效果，并已申請獲得3項(xiàng)抗癌產(chǎn)品發(fā)明專利證書(專利號分別為ZL02148474.0、ZL02148475.9、ZL03112707.X)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人繼續(xù)提取分離、篩選番荔枝(Annona squamosa Linn)種子的抗癌有效化學(xué)成分，從中又發(fā)明了4種內(nèi)酯單體成分具有特別顯著抗癌活性的抗癌用途(其抗癌活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶)。

發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種抗癌活性高、抗癌譜廣的抗癌單體化合物，具體地說是以番荔枝種子為原料提取的一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)在制備抗癌藥物方面的應(yīng)用。
2、技術(shù)方案本發(fā)明從番荔枝(Annona squamosa Linn)種子提取分離到一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(經(jīng)資料查閱目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道該化合物有抗癌活性)，其特征是白色粉末狀物質(zhì)，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑。其鑒定為annonareticin，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風(fēng)干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室溫)，每次2天；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經(jīng)多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)。經(jīng)體內(nèi)外抗癌藥理實(shí)驗(yàn)，其對人肝癌細(xì)胞、小鼠移植性肝癌的生長有明顯的抑制作用，其抗癌活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶。
本發(fā)明涉及一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
采用MTT顯色法，取2×104/ml活細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞SMMC-7721或HepG2)接種于96孔板，每孔90ul，設(shè)四復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物10ul，對照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間，每孔加濃度為1mg/ml的MTT50ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振蕩器振蕩5min使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)儀，于570nm波長處測定吸光度值(OD)，調(diào)零孔只含有培養(yǎng)液。細(xì)胞活力用加藥細(xì)胞平均吸光度值/對照細(xì)胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加藥細(xì)胞平均吸光度值/對照細(xì)胞平均吸光度值)×100％。
結(jié)果顯示，抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)對人肝癌細(xì)胞的抑制活性非常高，其對人肝癌細(xì)胞的抑制活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
3、有益效果本發(fā)明的一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物?？拱?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)對癌中之王——肝癌的抑制活性非常高，其對肝癌的體內(nèi)抑制活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。這為提高抗癌臨床療效提供了非常有前景的高效預(yù)選藥物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)提取方法一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風(fēng)干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室溫)，每次2天；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經(jīng)多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)。
實(shí)施例2一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，其特征是白色粉末狀物質(zhì)，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑。其鑒定為annonareticin，分子式為C37H66O7，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 實(shí)施例3一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)對人肝癌細(xì)胞的抑制作用1、細(xì)胞培養(yǎng)SMMC-7721或HepG2細(xì)胞株接種于培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％小牛血清、青霉素100u/ml、鏈霉素100ug/ml)，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長，每3～5天傳代一次，傳代時(shí)用0.25％胰酶消化3min，以培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液后接種。
2、藥物處理取對數(shù)生長期的細(xì)胞按2×105/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞完全貼壁(約4小時(shí))后，再換加含藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間。實(shí)驗(yàn)藥物是經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定的一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)；對照藥物是5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
2、實(shí)驗(yàn)方法采用MTT顯色法，取2×104/ml活細(xì)胞接種于96孔板，每孔90ul，設(shè)四復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的藥物10ul，對照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間，每孔加濃度為1mg/ml的MTT 50ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振蕩器振蕩5min使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)儀，于570nm波長處測定吸光度值(OD)，調(diào)零孔只含有培養(yǎng)液。細(xì)胞活力用加藥細(xì)胞平均吸光度值/對照細(xì)胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加藥細(xì)胞平均吸光度值/對照細(xì)胞平均吸光度值)×100％。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如表1、表2顯示，隨著內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)濃度的升高，對人肝癌細(xì)胞的抑制率也升高，其對人肝癌細(xì)胞的抑制活性數(shù)倍高于化療藥5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
表1 annonareticin對SMMC-7721肝癌細(xì)胞生長的抑制作用(n＝9)

*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較表2 annonareticin對HepG2肝癌細(xì)胞生長的抑制作用(n＝9)

*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較實(shí)施例4一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物(annonareticin)對移植性肝癌的抑制作用1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株雄性健康昆明種小鼠體重，18-22g，鼠齡6-8周，來自本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，昆明鼠傳代腹水型鼠肝癌Heps瘤株均購自江蘇省腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。小鼠在南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房飼養(yǎng)，溫度21～25℃，濕度為45％～55％。
2、造模(移植性肝癌Heps)昆明種雄性小白鼠60只，按比例隨機(jī)留10只為陰性對照組，其余50只進(jìn)行造模。無菌抽取接種Heps瘤種8天的小鼠的腹水，以生理鹽水稀釋10倍，0.02％伊紅染色，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)后，調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/ml，迅速地分別將50只小鼠右腋皮膚消毒，

鹽酸水溶液濃度氨水溶液pH值裝柱比例1、0.15％ 1、pH＝81、1∶152、0.20％ 2、pH＝92、1∶203、0.25％ 3、pH＝10 3、1∶25由以上實(shí)驗(yàn)方案得出植物福建馬尾杉中含有一定量的石杉堿甲成份，該工藝符合中藥標(biāo)準(zhǔn)提取物石杉堿甲的提取工藝路線。因此從福建馬尾杉中分離石杉堿甲的收率在4/10萬到11/10萬之間。因此福建馬尾杉也可以作為提取石杉堿甲成份的原料。
因此本發(fā)明采用伸筋草、柳杉、福建馬尾杉三種植物作為提取來源的優(yōu)點(diǎn)在于保護(hù)了石杉堿甲的原有提取物千層塔的有限資源；可節(jié)約資金和成本，降低藥品價(jià)格，能產(chǎn)生較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益；
權(quán)利要求
1.一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，其特征在于該內(nèi)酯單體化合物鑒定為annonareticin，分子式為C37H66O7，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的番荔枝內(nèi)酯單體化合物，其特征在于該化合物是白色粉末狀物質(zhì)，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿。
3.權(quán)利要求1所述的番荔枝內(nèi)酯單體化合物annonareticin在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種抗癌藥物番荔枝內(nèi)酯單體化合物，它是從番荔枝種子中提取得到的抗癌單體化合物。其制備方法是番荔枝種子風(fēng)干后，粉碎成粗粉，先用石油醚冷浸提??；回收石油醚得紅色油狀液體，室溫放置，底部有大量白色沉淀析出，過濾出白色沉淀，白色沉淀經(jīng)多次硅膠柱層析；用石油醚，石油醚－乙酸乙酯，乙酸乙酯－甲醇梯度洗脫，得到一種番荔枝內(nèi)酯單體化合物annonareticin。經(jīng)體內(nèi)外抗癌藥理實(shí)驗(yàn)，其對人肝癌細(xì)胞、小鼠移植性肝癌的生長有明顯的抑制作用，其抗癌活性數(shù)倍高于化療藥5－氟脲嘧啶。
文檔編號A61P35/00GK1861588SQ200610085998
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者章永紅 申請人:南京中醫(yī)藥大學(xué)