專利名稱：一種抗雞新城疫病毒的基因工程抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗雞新城疫病毒的基因工程抗體，特別是與雞新城疫病毒有關(guān)，能與雞新城疫病毒特異性結(jié)合。
背景技術(shù)：
雞新城疫是新城疫病毒引起的禽類急性、高度接觸性和致死性的傳染病，對(duì)我國乃至世界養(yǎng)禽業(yè)的危害極其嚴(yán)重，被國際獸醫(yī)局確定為A類傳染病，也是我國禽肉出口檢疫的重要疾病之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗雞新城疫病毒的雞源基因工程抗體-單鏈抗體，該單鏈抗體能夠與雞新城疫病毒特異性結(jié)合，能夠用于雞新城疫的診斷和治療。
本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的技術(shù)原理是利用噬菌體抗體展示系統(tǒng)篩選特異性噬菌體單鏈抗體。該系統(tǒng)是將單鏈抗體可變區(qū)基因插入噬菌體外殼蛋白基因中，使單鏈抗體以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體表面，然后通過反復(fù)免疫篩選-感染-擴(kuò)增-再篩選過程，獲得特異性的重組噬菌體抗體。本發(fā)明應(yīng)用該原理，以雞新城疫病毒為靶抗原，通過免疫親和篩選法對(duì)重組雞源單鏈抗體庫進(jìn)行篩選，分離并克隆抗雞新城疫病毒的特異性雞單鏈抗體基因A，A基因是由732個(gè)核苷酸組成，當(dāng)把A基因克隆到pCANTAB5 E表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151時(shí)，由于HB2151不含supE基因，因此能夠表達(dá)產(chǎn)生出可溶性抗體，表達(dá)量大約在10-20μg/mL，經(jīng)過濃縮與純化后進(jìn)行免疫活性實(shí)驗(yàn)，ELISA與Western blot均證明單鏈抗體A與其它病毒抗原不發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，如法氏囊病毒、禽流感病毒、腺病毒、馬立克氏病毒，表明單鏈抗體A與雞新城疫病毒的結(jié)合是特異性的。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是抗雞新城疫病毒的基因工程抗體能與雞新城疫病毒特異性結(jié)合，能夠用于雞新城疫的診斷和治療。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1培養(yǎng)擴(kuò)增雞源噬菌體單鏈文庫取100μL雞源噬菌體單鏈文庫，經(jīng)過培養(yǎng)擴(kuò)增后，用M13K07輔助噬菌體感染(輔助噬菌體與細(xì)菌的比例為20∶1)過夜培養(yǎng)，離心收集上清，備用。
實(shí)施例2抗雞新城疫病毒的雞源基因工程噬菌體單鏈抗體的篩選采用固相淘選法對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選。淘選過程中使用酶標(biāo)板包被抗原(每孔5μg雞新城疫病毒)，用30g/L BSA做封閉液，1011～1012個(gè)待淘選的噬菌體抗體與包被抗原在酶標(biāo)板孔中37℃孵育2小時(shí)，吸取噬菌體抗體，用含5ml/L Tween-20 PBS將孔加滿，用吸管吹打洗滌1次。在第2輪篩選時(shí)，將此洗滌過程重復(fù)4次，第3輪10次，第4輪20次，用100μL洗脫液(0.1mol/L HCl-甘氨酸)洗脫吸附在酶標(biāo)板孔中的產(chǎn)物，然后用6μL 2mol/L Tris中和，將洗脫液加到2mL新鮮E.coli TG1細(xì)菌懸液(A600＝0.3～0.8)中，37℃，15分鐘培養(yǎng)，然后在輔助噬菌體M13K07的作用下產(chǎn)生大量噬菌體，即可以制備出第1輪篩選后的噬菌體抗體庫，取一定量進(jìn)行滴度測(cè)定，剩余的分裝-70℃貯存，進(jìn)行下一輪篩選。經(jīng)過4輪免疫篩選-感染-擴(kuò)增-再篩選過程，使抗雞新城疫病毒重組噬菌體抗體得到富集。用第四輪篩選的重組噬菌體感染TG1細(xì)胞，取100μL細(xì)胞懸液涂于2×YT培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。次日從平板上隨意挑選20個(gè)單菌落，分別接種于3mL含100μg/mL氨芐和2％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)液中，于30℃培養(yǎng)過夜在相同培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接1次，長(zhǎng)至A600為0.5，再用M13K07輔助噬菌體分別感染轉(zhuǎn)化細(xì)胞，于37℃靜止半小時(shí)，培養(yǎng)1小時(shí)，離心，將細(xì)胞沉淀分別重懸于含100μg/mL氨芐和50μg/mL卡拉霉素培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物離心后取上清用于ELISA測(cè)定。
實(shí)施例3ELISA檢測(cè)重組噬菌體抗體活性用純化的雞新城疫病毒10μg/mL(包被液為0.05MNaHCO3，pH9.6)包被96孔酶標(biāo)板，于4℃過夜。次日用1％BSA封閉酶標(biāo)板，于37℃保溫1小時(shí)，去封阻液。把封阻液與含重組噬菌體抗體的上清液按1∶1等體積混合15分鐘，然后將混合物加入已封阻好的酶標(biāo)板孔中，每孔100μL，于37℃保溫1小時(shí)，每次用200μL含0.05％的Tween-20的PBS(簡(jiǎn)寫為PBST)洗3次，去PBST后，每孔加入1∶5000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗M13噬菌體抗體100μL，37℃保溫1小時(shí)，用PBST洗板3次后加入底物OPD(聯(lián)苯二胺)，室溫作用15分鐘，加2M H2SO450μL終止反應(yīng)，檢測(cè)A490值，同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照組，從數(shù)十個(gè)克隆中篩選幾個(gè)陽性克隆，重復(fù)ELISA實(shí)驗(yàn)，每個(gè)克隆設(shè)3個(gè)平行孔，最后確定一株活性最高的陽性克隆，命名為A。
實(shí)施例4單鏈抗體A的基因克隆、分析與表達(dá)將含抗體A的菌株培養(yǎng)于3mL含氨芐和葡萄糖的LB培養(yǎng)液中。采用Sanger雙脫氧終止法進(jìn)行DNA雙向測(cè)序，結(jié)果表明A基因是由732個(gè)核苷酸組成，其序列是GCG CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TCA GCA AAC CCA GGA GAA ACC GTC AAGATC ACC TGT TCC GGG AGT AGT GGC AGC TAT GGC TGG TAT CAG CAG AAG TCTCCT GGC AGT GCC CCT GTC ACT GTG ATC TAT GAC AAC GAC AAG AGA CCC TCGGGC ATC CCT TCA CGA TTC TCC GGT TCC AAG TCC GGC TCC ACA GCC ACA CTAACC ATC ACT GGG GTC CAA GCC GAG GAC GAG GCT GTC TAT TAC TGT GGT GGCTAC GAC AGC AGT GCT GGT TAT ACA TTT GGG GCC GGG ACA ACC CTG ACC GTCCTA GGT GGC GGT GGC TCG GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCG GCCGTG ACG TTG GAC GAG TCC GGG GGC GGC CTC CAG ACG CCC GGA GGA GCG CTCAGT CTC GTC TGC AAG GCC TCC GGG TTC TAC TTC CCC AAT CAC GAG ATG GCCTGG GTG CGA CAG GCG CCC GGC AAG GGG CTG GAG TTC GTC GCT GCT ATT GACAAC ACT GAA ATT CAC ACA TTC TAC GGG TCG GCG GTG AAG GGC CGT GCC ACCATC TCG AAG GAC ATC GGA CAG AGC ACA GTG AGG CTG CAG CTG AAC AAC CTCAGG GCT GAG GAC ACC GGC ACC TAC TAC TGC GCC AGA GCT GCT GGT CAC AGTTAC TAT GGG AAT CCT GCG GCT GAT AAT ATC GAC CTA TGG GGC CAC GGG ACCGAA GTC ATC GTC TCC TCC。進(jìn)一步用Sfi I和Not I酶分別消化含抗體A目的質(zhì)粒。把A基因克隆到pCANTAB5 E表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB2151，通過IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生可溶性單鏈抗體，收集培養(yǎng)液上清液中的可溶性單鏈抗體。
實(shí)施例5可溶性單鏈抗體的鑒定培養(yǎng)上清經(jīng)過濃縮與純化后進(jìn)行免疫活性檢測(cè)，Western blot和ELISA均證明單鏈抗體A能夠識(shí)別雞新城疫病毒，但不與法氏囊病毒、禽流感病、馬立克氏病毒、腺病毒發(fā)生免疫交叉免疫反應(yīng)。單鏈抗體由244個(gè)氨基酸組成，其序列如下A L T Q P S S V S A N P G E T V K I T C S G S S G S Y G W Y Q Q KS P G S A P V T V I Y D N D K R P S G I P S R F S G S K S G S T AT L T I T G V Q A E D E A V Y Y C G G Y D S S A G Y T F G A G T TL T V L G G G G S G G G G S G G G G S A V T L D E S G G G L Q T PG G A L S L V C K A S G F Y F P N H D M A W V R Q A P G K G L E FV A A I D N T E I H T F Y G S A V K G R A T I S K D I G Q S T V RL Q L N N L R A E D T G T Y Y C A R A A G H S Y Y G N P A A D N ID L W G H G T E V I V S S。
實(shí)施例6抗體A的純化用SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot分析培養(yǎng)上清，可溶性單鏈抗體的表達(dá)量為2mg/mL左右。經(jīng)Sephdex G-75分子篩層析可獲得純度大于80％的單鏈抗體。本發(fā)明獲得的抗雞新城疫病毒抗體屬于雞源單鏈抗體，它不僅可用于雞新城疫診斷，還可以用于雞新城疫的治療。
序列表A基因是由732個(gè)核苷酸組成，其序列是gcgctgactc agccgtcctc ggtgtcagca aacccaggag aaaccgtcaa gatcacctgt60tccgggagta gtggcagcta tggctggtat cagcagaagt ctcctggcag tgcccctgtc120actgtgatct atgacaacga caagagaccc tcgggcatcc cttcacgatt ctccggttcc180aagtccggct ccacagccac actaaccatc actggggtcc aagccgagga cgaggctgtc240tattactgtg gtggctacga cagcagtgct ggttatacat ttggggccgg gacaaccctg300accgtcctag gtggcggtgg ctcgggtggc ggtggatccg gcggtggcgg ttcggccgtg360acgttggacg agtccggggg cggcctccag acgcccggag gagcgctcag tctcgtctgc420aaggcctccg ggttctactt ccccaatcac gacatggcct gggtgcgaca ggcgcccggc480aaggggctgg agttcgtcgc tgctattgac aacactgaaa ttcacacatt ctacgggtcg540gcggtgaagg gccgtgccac catctcgaag gacatcggac agagcacagt gaggctgcag600ctgaacaacc tcagggctga ggacaccggc acctactact gcgccagagc tgctggtcac660agttactatg ggaatcctgc ggctgataat atcgacctat ggggccacgg gaccgaagtc720atcgtctcct cc單鏈抗體由244個(gè)氨基酸組成，其序列如下Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr1 5 1015Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr20 2530Gln Gln lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp35 4045Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 5560Lys Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala65 7075Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Ala80 8590Gly Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly Gly95 100 105Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val110 115 120
Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly Ala125130 135Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Tyr Phe Pro Asn His140145 150Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe155160 165Val Ala Ala Ile Asp Asn Thr Glu Ile His Thr Phe Tyr Gly Ser170175 180Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Lys Asp Ile Gly Gln Ser185190 195Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly200205 210Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Gly His Ser Tyr Tyr Gly Asn215220 225Pro Ala Ala Asp Asn Ile Asp Leu Trp Gly His Gly Thr Glu Val230235 240Ile Val Ser Ser
權(quán)利要求
1.一種抗雞新城疫病毒的基因工程抗體，一種由構(gòu)建基因所表達(dá)的單鏈抗體，其特征在于構(gòu)建的是雞源單鏈抗體基因和由該基因所表達(dá)的一種抗雞新成疫病毒的基因工程抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗雞新城疫病毒的基因工程抗體，其特征在于抗雞新城疫雞源基因工程抗體基因由732個(gè)核苷酸組成，其序列是GCG CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TCA GCA AAC CCA GGA GAA ACC GTC AAGATC ACC TGT TCC GGG AGT AGT GGC AGC TAT GGC TGG TAT CAG CAG AAG TCTCCT GGC AGT GCC CCT GTC ACT GTG ATC TAT GAC AAC GAC AAG AGA CCC TCGGGC ATC CCT TCA CGA TTC TCC GGT TCC AAG TCC GGC TCC ACA GCC ACA CTAACC ATC ACT GGG GTC CAA GCC GAG GAC GAG GCT GTC TAT TAC TGT GGT GGCTAC GAC AGC AGT GCT GGT TAT ACA TTT GGG GCC GGG ACA ACC CTG ACC GTCCTA GGT GGC GGT GGC TCG GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCG GCCGTG ACG TTG GAC GAG TCC GGG GGC GGC CTC CAG ACG CCC GGA GGA GCG CTCAGT CTC GTC TGC AAG GCC TCC GGG TTC TAC TTC CCC AAT CAC GAC ATG GCCTGG GTG CGA CAG GCG CCC GGC AAG GGG CTG GAG TTC GTC GCT GCT ATT GACAAC ACT GAA ATT CAC ACA TTC TAC GGG TCG GCG GTG AAG GGC CGT GCC ACCATC TCG AAG GAC ATC GGA CAG AGC ACA GTG AGG CTG CAG CTG AAC AAC CTCAGG GCT GAG GAC ACC GGC ACC TAC TAC TGC GCC AGA GCT GCT GGT CAC AGTTAC TAT GGG AAT CCT GCG GCT GAT AAT ATC GAC CTA TGG GGC CAC GGG ACCGAA GTC ATC GTC TCC TCC。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗雞新城疫病毒的基因工程抗體，其特征在于雞源單鏈抗體是由244個(gè)氨基酸組成，其序列是A L T Q P S S V S A N P G E T V K I T C S G S S G S Y G W Y Q Q KS P G S A P V T V I Y D N D K R P S G I P S R F S G S K S G S T AT L T I T G V Q A E D E A V Y Y C G G Y D S S A G Y T F G A G T TL T V L G G G G S G G G G S G G G G S A V T L D E S G G G L Q T PG G A L S L V C K A S G F Y F P N H D M A W V R Q A P G K G L E FV A A I D N T E I H T F Y G S A V K G R A T I S K D I G Q S T V RL Q L N N L R A E D T G T Y Y C A R A A G H S Y Y G N P A A D N ID L W G H G T E V I V S S。
4根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗雞新城疫病毒的基因工程抗體，其特征在于該雞源單鏈抗體能夠與雞新城疫病毒結(jié)合，它能夠用于雞新城疫病毒的診斷和治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用分子生物學(xué)手段制備雞源抗雞新城疫病毒的基因工程抗體—單鏈抗體，它由構(gòu)建的732個(gè)核苷酸的單鏈抗體基因所編碼，該基因所表達(dá)的雞源單鏈抗體共包括244個(gè)氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是抗雞新城疫病毒的基因工程抗體能與雞新城疫病毒特異性結(jié)合，能夠用于雞新城疫的診斷和治療。
文檔編號(hào)A61K39/42GK101070541SQ200610125598
公開日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2006年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者陳紅兵, 李欣, 胡純秋, 高金燕, 楊安樹, 吳凌偉 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)