專利名稱：抑制鐵調素調節(jié)蛋白的siRNA、重組慢病毒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學、生物醫(yī)藥及基因工程技術領域，具體涉及利 用慢病毒(Lentivirus)介導的RNA干擾技術，構建針對鐵調素調節(jié)蛋白 (HJV)基因的慢病毒干擾體系(PLT-HJVi)，并將其運用到鐵代謝相關疾 病的藥物開發(fā)制備當中。
背景技術：
RNAi指的是當細胞中導入與內源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA 時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現象。
RNA干擾過程主要有2個步驟(1)長雙鏈RNA被細胞源性的雙鏈 RNA特異的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA (small interfering RNA， siRNA)。 (2)小干擾性RNA與細胞源性的某些 酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，該復合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的 mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。
1998年，安德魯'法厄(Andrew Z. Fire)等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans) 中進行反義RNA抑制實驗時發(fā)現，作為對照加入的雙鏈RNA相比正鏈或 反鏈RNA顯示出了更強的抑制效果(Fire etal.， 1998)。從與靶mRNA的 摩爾比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強于理論上1:1配對時的抑制 效果，因此推測在雙鏈RNA引導的抑制過程中存在某種擴增效應并且有 某種酶活性參與其中。隨后，又相繼發(fā)現具有RNase III活性的Dicer可將 長的雙鏈RNA加工成稱之為siRNA (small interfering RNA)的21 23nt 及3 '端突出的短的雙鏈RNA， siRNA與若干個蛋白組成稱之為RISC復合 物(RNA-induced silencing complex)的RNA蛋白復合物，并由該復合物 主導RNAi效應。2001年，Tuschl等將短的siRNA導入到哺乳動物細胞 中并由此解決了在哺乳細胞內導入長的雙鏈RNA時引發(fā)的干擾素效應， 由此拓展了RNAi在基因治療上應用前景。RNAi機制普遍存在于生物種 中，因此被認為是進化上相對保守的基因表達調控機制。一種假說為，RNAi 機制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機制而存在的。目前發(fā)現，RNAi機制中的相關一些因子如內源性
雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調控，其范 圍已經超越了PTGS (post transcriptional gene silencing),如RNAi機制同 樣參與了轉錄水平上的基因表達調控過程中。2006年，安德魯々去厄與克 雷格.梅洛(Craig C. Mello)由于在RNAi機制研究中的貢獻獲得諾貝爾生 理及醫(yī)學獎。
由外界導入的長的雙鏈RNA首先被稱作Dicer并具有RNaseIII活性的 RNA酶切割成21~23堿基對的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱作small interfering RNA(siRNA)，其特征是3'端相對于互補鏈突出兩個堿基。完成 上述過程后，siRNA上結合RNAi蛋白因子，并形成稱為RISC(RNA-induced silencing complex)的RNA-蛋白復合物。在RISC復合物中，siRNA 依賴于ATP/或ATP非依賴性的轉換為單鏈，進而RISC被活化。活化型 RISC受已成單鏈的siRNA引導(guide strand),序列特異性地結合在標靶 mRNA上并切斷標耙mRNA，引發(fā)耙mRNA的特異性分解。迄今為止已 鑒定出包括Dicer在內的若干個與RNAi有關的蛋白因子。在果蠅 (Drosophila melanogaster) RISC中，已知存在著稱為Argonaute2(AG02) 的因子，AG02蛋白的表達受到抑制時，RNAi效應缺失，也就是說AG02 是果蠅RNAi機制的必須因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切 割酶活性(slicer activity), RNAi機制正是由Argonaute家族蛋白的RNA 切割酶活性主導。另外，幾個RNA解旋酶(RNAhelicase)也被鑒定為參與 RNAi機制的因子。在秀麗隱桿線蟲(C. elegans)的RNAi中必須的因子 有EGOl ，這是一種RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase),植物中也存 在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標耙mRNA作為模板，以導入的 dsRNA(或siRNA)作為引物合成RNA，在細胞內針對于標耙mRNA合成 新siRNA的酶。這一反應在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在 人和果蠅的RNAi中是非必須的，這說明在不同物種之間RNAi機制的基 本框架雖然相同，但存在著微妙差異。
RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究 的重要工具。大多數藥物屬于靶標基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi 模擬了藥物的作用，這功能丟失(LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得(GOF) 方法更具優(yōu)勢。因此,RNAi在今天的制藥產業(yè)中是藥物耙標確認的一個重要工具。同時，那些在耙標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以 被進一步開發(fā)成為RNAi藥物。
在藥物耙標發(fā)現和確認方面，RNAi技術已獲得了廣泛的應用。生物 技術公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫來引入細胞，然后通過 觀察細胞的表型變化來發(fā)現具有功能的基因。如可通過RNAi文庫介導的 腫瘤細胞生長來發(fā)現能抑制腫瘤的基因。 一旦所發(fā)現的基
因屬于可用藥的靶標(如表達的蛋白在細胞膜上或被分泌出細胞外)， 就可以針對此靶標進行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現的靶標還可用 RNAi技術在細胞水平或動物體內進一步確認。
在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用于臨床測試用于 幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。
然而要將RNA干擾技術運用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表 達持續(xù)以及表達效率等重要問題。
shRNA即短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA)。在RNAi感染過程中，產 生dsRNA的一個有效方法就是在體內表達一個短發(fā)夾RNA，這種shRNA 包含兩個短反向重復序列(其中一個與目的基因互補)，中間由一個loop 序列分隔，組成發(fā)夾結構。在體內shRNA可以被加工成siRNA，從而降 解目的基因抑制其表達。
鐵調素(hepcidin)是一個近年新發(fā)現的小分子多肽，主要由肝臟合成。 它是肝臟、小腸和網狀內皮系統(tǒng)之間鐵代謝調節(jié)信號的傳遞者，是機體鐵 平衡的中心調節(jié)者。當任何原因引起循環(huán)鐵增加時，肝細胞增加合成和分 泌鐵調素進入血液，鐵調素經血流運輸到鐵的吸收部位十二指腸及鐵儲存 的主要部位巨噬細胞，與細胞膜上的膜鐵轉運蛋白l (Ferroportinl)結合， 并降解膜鐵轉運蛋白l，從而抑制鐵從腸腔進入血液，同時減少巨噬細胞分 泌鐵進入血液，使血液鐵水平降低。當循環(huán)鐵較低時，肝臟合成與分泌的 鐵調素減少。腸吸收上皮相關蛋白降解減少，腸鐵吸收量增加，使鐵水平 回復到正常。
我們最近的研究發(fā)現并在國際上首先報導了腦有能力表達鐵調素。我 們的實驗也己初步顯示腦室內注射鐵調素可降低腦內鐵水平，說明鐵調素 能調節(jié)腦鐵代謝，參與腦鐵平衡的維持。早在1991年，我們已經發(fā)現腦鐵 的失調以及鐵誘導的氧化應激，是促進神經退行性變的重要誘因。實驗數據顯示，腦鐵的失調至少是某些神經退行性疾病(例如帕金森氏病PD以 及老年性癡呆AD)的起病的始發(fā)原因之一。
鐵調素調節(jié)蛋白(Hemojuvelin,HJV)是最近發(fā)現的一種重要的鐵代 謝調節(jié)蛋白。2004年，Papanikolaou等首次在1號染色體短臂分離鑒定出 這一新的基因。兩年多來的研究顯示，Hemojuvelin是一種極為重要的調節(jié) 鐵調素(hepcidin)表達的蛋白，通過參與調節(jié)和控制鐵調素的表達從而在 鐵代謝中發(fā)揮重要作用。綜合其他研究結果與我們自己的研究顯示，HJV 的表達與鐵調素(hepcidin)的表達水平呈負相關關系，通過抑制鐵調素調 節(jié)蛋白的表達，能夠上調體內鐵調素的水平，降低體內的血清鐵水平，從 而達到治療鐵代謝相關疾病的目的。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是針對現有技術的上述問題，提供一種能夠有效抑制 體內鐵調素調節(jié)蛋白表達、從而調節(jié)體內鐵水平的小干擾性RNA (siRNA)。
本發(fā)明的另一 目的在于提供編碼含有上述小干擾性RNA的shRNA(短 發(fā)夾RNA)的DNA。
本發(fā)明的再一目的在于提供具有優(yōu)良的靶向性、安全性以及持續(xù)表達 上述shRNA、進而抑制鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)表達的重組慢病毒。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述DNA以及重組慢病毒在制備藥物方 面的應用。
為實現上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案
本發(fā)明公開了一種抑制鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)表達的小干擾性RNA (siRNA)，所述小干擾性RNA與鐵調素調節(jié)蛋白基因mRNA反向互補，
其長度為19-27bp。
優(yōu)選的，所述小干擾性RNA含有以下序列
Seq ID No. 1: 5 ，-CAAUCUUCCUGCAGCCUUUGA-3'
Seq ID No.2: 3'國GUUAGAAGGACGUCGGAAACU國5，
本發(fā)明進一步公開了一種編碼含有上述小干擾性RNA的正義鏈及反
義鏈的shRNA的DNA。
優(yōu)選的，所述DNA還含有啟動子及PolyA終止信息序列，啟動子優(yōu)
選為U6啟動子。優(yōu)選的，所述DNA含有序列表中Seq ID No.3和/或Seq ID No.4所示
的序列。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述DNA為雙鏈DNA，模板鏈為序列 表中Seq ID No.3所示的序列，編碼鏈為序列表中Seq ID No.4所示的序列。
本發(fā)明還公開了一種抑制鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)表達的重組慢病毒， 所述重組慢病毒含有上述DNA以及慢病毒載體。
優(yōu)選的，所述慢病毒載體為自身失活慢病毒載體(SIN)。
本發(fā)明進一步公開了上述小干擾性RNA、上述DNA以及上述重組慢 病毒在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。
所述鐵代謝紊亂疾病如老年性癡呆、帕金森綜合癥、神經退行性疾病等。
由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備了以下有益效果-
本發(fā)明的小干擾性RNA、編碼shRNA的DNA以及重組慢病毒能夠 有效抑制體內鐵調素調節(jié)蛋白表達、上調體內鐵調素的水平并降低體內的 血清鐵水平，從而達到治療鐵代謝相關疾病的目的。
特別地，本發(fā)明的重組慢病毒通過選擇第三代慢病毒載體…-自身滅活 慢病毒載體(SIN)，大大的提高了載體的安全性以及靶向性。慢病毒載體 可以選擇性插入染色體中，不會出現插入失活的情況。慢病毒攜帶shRNA 進入靶細胞，可以整合入細胞的基因組，持續(xù)長期的表達相關shRNA，而 不會引起對細胞的毒害作用。本發(fā)明的慢病毒干擾體系具有優(yōu)良的靶向性、 安全性以及表達持續(xù)性，能夠有效的提升鐵調素(hepcidin)表達量，降低 血清鐵的濃度，并且對正常細胞無任何毒副作用。本發(fā)明的重組慢病毒將 U6啟動子插入到自身滅活慢病毒系統(tǒng)中，利用人源性的U6啟動子啟動插 入片段的轉錄，具有高效、準確等優(yōu)點。通過多次實驗，均證明本發(fā)明的 慢病毒干擾體系能有效的調節(jié)鐵調素的表達。
本發(fā)明設計的shRNA經過體內以及體外實驗證明，能有效的抑制HJV 表達95%以上，并能相應的升高鐵調素的水平，有效的調節(jié)血清鐵的水平。
圖l是PLT慢病毒載體的多克隆位點圖2是本發(fā)明干擾片段連接上人源U6啟動子示意圖3是PLT-HJVi系統(tǒng)構建流程圖；圖4是PLT-HJVi系統(tǒng)感染體細胞后，HJV蛋白的表達情況圖； 圖5是PLT-HJVi系統(tǒng)感染體細胞后，繼發(fā)引起鐵調素蛋白(Hepcidin) 表達上調圖6是通過高鐵伺料詞養(yǎng)SD大鼠，構建高血清鐵動物模型，然后利 用PLT-HJVi系統(tǒng)進行體內實驗，降低血清鐵水平結果圖。
具體實施例方式
本發(fā)明利用鐵代謝相關疾病的發(fā)病機理，有針對性的調節(jié)HJV的表 達，設計特定的小干擾性RNA以及編碼shRNA的DNA，從而降低血清 鐵對于細胞的損害。本發(fā)明的小干擾性RNA以及DNA所編碼的shRNA， 能特異性的識別序列CAATCTTCCTGCAGCCTTTGA，該序列位于HJV (AK098165)第953-973堿基處。
本發(fā)明的編碼shRNA的DNA為雙鏈DNA，其模板鏈為序列表中Seq IDNo.3所示的序列，編碼鏈為序列表中SeqlDNo.4所示的序列。其通過 慢病毒載體介導后，在體內能夠有效持續(xù)表達shRNA，該shRNA能特異 性的識別序列CAATCTTCCTGCAGCCTTTGA,該序列位于HJV
(AK098165)第953-973堿基處。在本發(fā)明的序列Seq ID No.3及Seq ID No.4中，已設計包含了 polyA尾信號。
要將RNA干擾技術運用于臨床治療，就需要解決RNA干擾片段表達 持續(xù)以及表達效率等重要問題。我們利用失活慢病毒載體攜帶RNA干擾 片段的DNA模板，其在體內轉錄成shRNA，完美的解決了RNA干擾基 因治療的靶向性、安全性以及表達持續(xù)性的問題。
本發(fā)明通過合成干擾片段，并將U6啟動子定向連接在干擾片段5'端， 測序后證實其序列的正確性，再將U6+shRNA的DNA模板連接至慢病毒 載體當中。轉染重組體入293T細胞，獲取病毒上清，體外以及體內實驗 證明能夠有效抑制HJV。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，構建了鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)的慢病 毒干擾體系(PLT-HJVi)，并取得了良好的抑制效果。
下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。實施例l
根據鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)序列(AK098165),并根據人源性U6 序列加上20bpU6序列接頭以及PolyA終止信息序列。3'端加上Xhol酶切 位點，送Invitrogen公司合成序列。經過篩選，獲得干擾效果最為顯著的 本發(fā)明的HJV干擾片斷序列如下
模板鏈(SeqlDNo,3): 5'-GTGGAAAGGACGAAACACCGTCAAAGGCTGCAGGAAGATTGTT GATATCCGCAATCTTCCTGCAGCCTTTGACTTTTTCTCGAGCTGGA-3'
編碼鏈(SeqlDNo.4): 5'-TCCAGCTCGAGAAAAAGTCAAAGGCTGCAGGAAGATTGTTGAT ATCCGCAATCTTCCTGCAGCCTTTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3，
實施例2
PLT-HJVi系統(tǒng)構建
構建重組PLT-HJVi質粒如附圖2， 3所示。構建過程共分為三大步驟: 一、獲取人U6啟動子；
a) 室溫下加入lmlSNET溶液裂解1X1(^個人源性細胞株HEK293;
b) 從研缽中吸取細胞裂解液至一個2ml的EP管中，加入40ul蛋白酶 K以及2ulRNA酶；
c) 密封EP管，水平放置離心管于55度水浴鍋中，緩慢振蕩消化至少 3小時；
d) 取出EP管，加入lml苯酚一氯仿混合液，輕柔顛倒3次。至搖床 上緩慢振蕩30min。 (<60rpm);
e) 室溫下臺式離心機最高速(13000rpm)離心5min;
f) 小心分離水相至新EP管，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻；
g) 4。C，離心(14000rpm—20000g) 15min;
h) 輕柔去除異丙醇；
i) 加入lml75。/。乙醇(不需吹打重懸，浸泡即可)； j)室溫離心10000rpm， 3min; k)小心清除乙醇，吸盡殘余液滴；
1)通風櫥晾干10min;m)50ul，預熱至60。C的ddH2O溶解，置60。C， 30min; n)4'C保存。
o)取上述基因組DNAlul作為模板，利用U6啟動子引物PCR擴增 出U6啟動子，純化后保存與-2(TC。
二、將合成的HJV干擾片段(SeqlDNo.3及SeqlDNo.4)利用多次 PCR的方式進行退火，PAGE膠純化退火產物。再利用純化產物與預先獲 得的人U6啟動子進行PCR反應，獲得U6+HJVi片斷，膠純化產物，具 體步驟如下
1. 建立rtpCR系統(tǒng) 5ul 10xbuffer 6ul2.5mM dNTP lul50mM MgS04 0.05nM模板鏈Seq ID No.3 0.05nM編碼鏈Seq ID No.4 0.5ul 高保真聚合酶
用三蒸水補足至50nl，置冰上5分鐘后，放入PCR儀，擴增35個循環(huán)。
2. 制12% 1 x TAE聚丙烯酰胺膠，取10ul上述PCR產物跑膠200V lh。 EB染色后切下80bp左右的條帶，置50ul三蒸水中煮沸5分鐘。
3. 建立2ndpCR系統(tǒng) 5ul 10xbuffer 6ul2.5mM dNTP lul50mM MgS04 0.05nM U6啟動子上游引物 0.05nM編碼鏈Seq ID No.4 0.5ul 高保真聚合酶
2ul 純化的U6啟動子 lul lstpCR擴增產物 用三蒸水補足至50ul，置冰上5分鐘后，放入PCR儀，擴增35個循環(huán)。4. 取5ul 2ndPCR產物跑瓊脂糖電泳，切下420bp的條帶，利用試劑盒 (invitrogen)純化產物。
三、酶切(XbaI與XhoI)上述第二步中的純化產物以及PLT慢病毒 載體(PLT載體系統(tǒng)為SIN病毒類型的一種)，膠純化回收后，用T4連 接酶與室溫連接24小時，經轉化篩選之后，獲得正確克隆。送Invitrogen 公司測序鑒定，命名為PLT-HJVi系統(tǒng)。具體操作步驟如下
1. 構建質粒酶切體系 Xbal 10U Xhol 10U
10 x Buffer 5ul BSA 0.5ul PLT質粒 10ul 用水補足50ul， 37°C， 2h。
2. 構建2ndpCR產物酶切體系 Xbal 10U
Xhol 腦 10 x Buffer 5ul BSA 0.5ul 2nd PCR產物 30ul 用水補足50ul， 37°C， 2h。
3. 分別利用試劑盒(invitrogen)膠純化上述酶切產物。
4. 構建連接系統(tǒng)
10 x Buffer 2ul T4連接酶 lul PLT酶切產物 lul 2ndpCR酶切產物 5ul 用水補足20ul，16°C， 16h。
5. 取5ul連接產物轉化感受態(tài)細胞，涂板后，氨芐青霉素篩選。
6. 挑取陽克隆，小量擴增質粒。
7. 用xbal與XhoI酶切鑒定質粒，選擇陽性結果質粒，測序保存。實施例3
重組慢病毒PLT-HJVi的生產流程
1、 接種293T細胞1.5Xl()7個細胞于9cm培養(yǎng)皿(Corning)中，37°C， 5%0)2培養(yǎng)過夜；
2、 轉染前20分鐘換新鮮培養(yǎng)基；
3、 按照9:8:1的比例將PLT-HJVi質粒與慢病毒包裝質粒P8.2以及 P-VSV (均購自Invitrogen公司)混合；
4、 取20ul上述質?；旌衔锱cDMEM培養(yǎng)基500ul混勻，標記為A管， 另取20ul脂質體與500ulDMEM培養(yǎng)基混勻，標記為B管。將A管與B 管混勻，室溫放置30min，將混合物輕輕加入第l步中的9cm培養(yǎng)皿的培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；
5、 24小時后加7.5ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；
6、 收集細胞上清并用0.45um濾器過濾，細胞可以擴大培養(yǎng)，持續(xù)收 取病毒上清。
7、 測定病毒上清滴度，用PH8.0Tris-HCl調整細胞滴度至1000VP/ml。
8、 包裝入2ml西林瓶中(每瓶含lml)，保存于-8(TC。
9、 對病毒進行熱源檢測、微生物檢測，確保無熱源，無細菌、真菌、 野生病毒污染。
實施例4
重組慢病毒PLT-HJVi體外實驗
復蘇神經元細胞株P12，接種于6孔板，每孔1XW個。取PLT-HJVi 慢病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12 細胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻，以充分感染細胞株，分別處理Oh、 6h、 12h、 24h、 48h，收集細胞，利用real-time PCR技術進行定量測定HJVmRNA 表達情況，以Oh為對照組，可見HJV的表達在12h之后受到明顯的抑制。 如圖4。
復蘇神經元細胞株P12,接種于6孔板，每孔1X106個。利用PLT-HJVi 慢病毒感染細胞株，分別處理Oh、 6h、 12h、 24h、 48h，收集細胞，利用 western-blot技術進行定量測定鐵調素hepcidin的表達情況，以Oh為對照 組，可見hepcidin的表達在12h之后明顯上調。如圖5。實施例5
重組慢病毒PLT-HJVi體內實驗
選擇3月齡SD大鼠雄雌各10只，按性別隨機分為兩組，兩組實驗鼠 均以高鐵飼料(購自SIGMA)喂養(yǎng)3個月，構建高血清鐵大鼠模型，并測 定血清鐵濃度。
之后，實驗組注射PLT-HJVi病毒液，每次劑量為500ul病毒液 (1000VP/ml)，每3天注射一次，3次為一療程；對照組注射PBS等滲 鹽水；
一療程結束后，分別于3、 6、 9、 12、 15、 18天抽取血清，按常規(guī)方 法利用血清生化儀測定血清鐵濃度。
結果發(fā)現，從第6天開始，病毒組血清鐵濃度開始下降，12天達到正 常血清鐵水平。如圖6。
以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說 明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若 干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。能夠與HJV的 mRNA反向互補的所有其他19-27個堿基序列的小干擾性RNA、編碼此類 小干擾性RNA的相應shRNA的DNA模板、以及含有這些DNA模板的重 組慢病毒也同樣可以實施到本發(fā)明中。序列表
〈110〉錢忠明 葛嘯虎 柯亞 汪程遠
〈120〉抑制鐵調素調節(jié)蛋白的RNA干擾、重組慢病毒及其應用 〈130〉 0710199PJE 〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211> 21
〈212〉 RNA 〈213>寡核苷酸
<400> 1
caaucuuccu gcagccuuug a 21
〈210〉 2
<211> 21
〈212> RNA 〈213〉寡核苷酸
<400〉 2
ucaaaggcug caggaagauu g 21
〈210〉 3〈211〉 89 〈212〉 DNA 〈213〉寡核苷酸
〈400> 3
gtggaaagga cgaaacaccg tcaaaggctg caggaagatt gttgatatcc gcaatcttcc 60 tgcagccttt gactttttct cgagctgga 89
<210> 4
〈211〉 89
〈212〉 腿 〈213>寡核苷酸
〈400〉 4
tccagctcga gaaaaagtca aaggctgcag gaagattgtt gatatccgca atcttcctgc 60 agcctttgac ggtgtttcgt cctttccac 89
權利要求
1、一種抑制鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)表達的小干擾性RNA(siRNA)，其特征在于所述小干擾性RNA與鐵調素調節(jié)蛋白基因mRNA反向互補，其長度為19-27bp。
2、 根據權利要求1所述一種抑制鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)表達的小干 擾性RNA,其特征在于所述小干擾性RNA含有以下序列Seq ID No. 1: 5 ，-CAAUCUUCCUGCAGCCUUUGA-3'Seq ID No.2: 3 ，-GUUAGAAGGACGUCGGAAACU-5'
3、 一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所述shRNA是含有權利 要求1或2所述的小干擾性RNA的正義鏈及反義鏈的shRNA。
4、 根據權利要求3所述的一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所 述DNA還含有U6啟動子及PolyA終止信息序列。
5、 根據權利要求3所述的一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所 述DNA含有序列表中Seq ID No.3禾卩/或Seq ID No.4所示的序列。
6、 根據權利要求5所述的一種編碼shRNA的DNA，其特征在于所 述DNA為雙鏈DNA，模板鏈為序列表中Seq ID No.3所示的序列，編碼 鏈為序列表中Seq IDNo.4所示的序列。
7、 一種抑制鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)表達的重組慢病毒，其特征在于 所述重組慢病毒含有權利要求3 6中任意一項所述的DNA以及慢病毒載 體。
8、 根據權利要求7所述的一種抑制鐵調素調節(jié)蛋白表達的重組慢病 毒，其特征在于所述慢病毒載體為自身失活慢病毒載體(SIN)。
9、 權利要求3 6中任意一項所述的DNA在制備用于治療鐵代謝紊 亂疾病的藥物中的應用。
10、 權利要求7或8所述的重組慢病毒在制備用于治療鐵代謝紊亂疾 病的藥物中的應用。
11、 權利要求1或2所述的小干擾性RNA在制備用于治療鐵代謝紊 亂疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制鐵調素調節(jié)蛋白(HJV)表達的小干擾性RNA，所述小干擾性RNA與鐵調素調節(jié)蛋白基因mRNA反向互補，其長度為19-27bp。本發(fā)明進一步公開了編碼所述小干擾性RNA的相應shRNA的DNA以及能表達所述shRNA的重組慢病毒。本發(fā)明的小干擾性RNA、編碼shRNA的DNA以及重組慢病毒能夠有效抑制體內鐵調素調節(jié)蛋白表達、上調體內鐵調素的水平并降低體內的血清鐵水平，從而達到治療鐵代謝相關疾病的目的。
文檔編號A61P7/00GK101307085SQ200710075360
公開日2008年11月19日 申請日期2007年8月1日 優(yōu)先權日2007年8月1日
發(fā)明者亞 柯, 汪程遠, 葛嘯虎, 錢忠明 申請人:錢忠明;葛嘯虎;柯 亞;汪程遠