專利名稱：包含促胰島素釋放肽綴合物的治療肥胖相關疾病的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含促胰島素釋放肽綴合物的治療肥胖相關疾病的組合物，特別涉及 包含通過非肽基接頭共價連接促胰島素釋放肽與載體物質制備的綴合物的治療肥胖相關 疾病的組合物，以及使用所述組合物治療肥胖相關疾病的方法。
背景技術：
肥胖癥是與高發(fā)病率和死亡率相關的慢性疾病，是由于能量平衡失調或者營養(yǎng)過 度引起的脂肪組織積聚所致。在美國和全世界，肥胖和肥胖相關疾病是非常嚴重的健康問 題。在過去的7年里，在美國的一般人群中，肥胖的流行從22.9%增加至30.6%。根據美國 疾病控制和預防中心進行的1999-2002全國健康和營養(yǎng)調查(NHANES)的結果，29. 8%的20 歲以上的成年人超重，其中30. 4%肥胖。在成年人中極度肥胖的流行性為4. 9% (Hedleyet al.，JAMA 2004 ；291 :2847_50)。肥胖不僅在美國顯著增加，而且在采用西方飲食和文化習 慣的每一國家中均如此。目前世界上有250百萬肥胖人口，據估計到2025年世界范圍有大 約300百萬人肥胖。肥胖具有其自身健康問題，且與許多其它并發(fā)癥如高血壓、高脂血癥、 心血管疾病以及糖尿病相關。大約80%的肥胖患者具有一或多種上述疾病(Mantzoros et al.，J ClinEndocrinol Metab 2000 ；85 :4000_2)，每天有大約 300，000 人死于肥胖并發(fā)癥 (Allison et al. ,JAMA 1999 ；282 1530-8) 已經揭示了體重僅增加lkg，則心血管疾病危 險增加3. 以及糖尿病危險增加4. 5-9% ；且已經揭示體重減輕大約11%則發(fā)病率降低 25%。因此，急迫需要開發(fā)肥胖的治療策略(Arbeenyet al.，Obes Res 2004 ；12 1191-6)。 在1893，為了治療肥胖，甲狀腺激素藥物用于通過去甲腎上腺素和腎上腺素促進生熱作用。 然而，這些藥物加速瘦組織量(lean tissue mass)減少，導致負氮平衡，誘導心臟毒性副作 用而不是呈現出希望的減少脂肪組織的作用。因此，目前其有限地用于甲狀腺功能低下患 者中。在二十世紀三十年代，苯丙胺用作食欲抑制劑，但是由于藥物依賴性而禁止長期使 用。芬特明、安非拉酮和芬氟拉明不誘導藥物依賴性，已經用于治療肥胖癥。然而，由于大多 數這些藥物可導致心血管疾病、高血壓、心律失常、肺動脈高壓和精神障礙如記憶力下降等 疾病，因此也禁止使用。目前肥胖的治療策略包括刺激中樞腎上腺素能受體或者阻止5-羥 色胺再吸收的食欲抑制劑、生熱的3 3-腎上腺素能激動劑、消化性脂肪酶抑制劑以及激素 調節(jié)齊U如瘦素(leptin)禾口PYY(Dunstan et al. ,Nature reviewsdrug discovery 2006 ；5 919-931)。在這些藥物中，僅阻止5-羥色胺再吸收的脂肪酶抑制劑、奧利司他(orlistat) 和西布曲明(sibutramine)是FDA許可的藥物，但是也導致包括脂肪瀉、頭痛以及血壓升高 等副作用。因此，在開發(fā)即安全又有效的藥物中仍存在許多困難。GLP-1，由小腸分泌的一種激素，通常促進胰島素的生物合成與分泌，以及抑制胰 高血糖素分泌，從而調節(jié)血糖濃度。據報道在將GLP-1給予小鼠時，其具有抑制食物攝取和 降低體重的作用(Meeran et al，Endorinologyl999 ； 140 :244_50)，而且在正常和肥胖小鼠 中均呈現這些作用，表明其作為抗肥胖制劑的潛力。然而，GLP-1由二肽肽酶IV(DPPIV)快
5速降解，因此其作為藥物的潛力非常有限。另一方面，exendin是在亞利桑那州和墨西哥常 見的大毒蜥蜴(Gila-monster)的毒液中發(fā)現的一種肽。其具有與GLP-I相似的生理學活 性，但是對DPP IV具有抗性，示出其作為糖尿病和肥胖癥的治療劑的可能性。Exendin是 商業(yè)化糖尿病的治療劑，一天注射兩次。在美國專利US6956026、US6989366和US7115569 中，揭示了使用exendin及其衍生物抑制食物攝取的方法，其中證實了抑制食物攝取的效 力，但是在最大量給予之后，該效力維持6小時。對于治療慢性疾病如肥胖癥，患者需要一 天注射多次該藥物，這對于患者而言仍有困難。此外，所述專利中描述的exendin衍生物在 個體中呈現不同的效力、劑量依賴性以及持續(xù)時間，在抑制食物攝取方面未示出優(yōu)于天然 exendin的效力。

發(fā)明內容
技術問題因此，本發(fā)明人使用一種制備方法，其中免疫球蛋白Fc區(qū)域、非肽基接頭 和促胰島素釋放肽彼此共價連接，以最大化延長促胰島素釋放肽的血液半衰期的作 用以及維持體內活性。他們發(fā)現綴合物，具體是exendin-4、除去N-末端胺基團的 脫-氨基-組氨酰-exendin-4、通過用羥基基團取代N-末端胺基團制備的β-羥 基-咪唑并-丙酰-exendin-4、通過用兩個甲基基團修飾N-末端胺基團制備的二甲 基-組氨酰-exendin-4，以及除去第一個氨基酸組氨酸的α碳原子制備的咪唑并-乙 酰-exendin-4，具有顯著增強的抑制食物攝取和延長效力體內持續(xù)時間的作用，從而實現 本發(fā)明。技術解決方案本發(fā)明的目的是提供治療肥胖相關疾病、抑制食物攝取和減少體脂的組合物，所 述組合物包含通過非肽基接頭共價連接促胰島素釋放肽與載體物質制備的綴合物。本發(fā)明的另一目的是提供通過使用包含所述綴合物的組合物治療肥胖相關疾病、 抑制食物攝取以及減少體脂的方法。優(yōu)勢效應本發(fā)明提供的包含促胰島素釋放肽綴合物的組合物在抑制食物攝取以減少體脂 以及治療肥胖相關疾病方面呈現出優(yōu)于天然促胰島素釋放肽的作用。因此，所述組合物可 用于最大化肥胖相關疾病的治療作用。附圖描述

圖1示出在ob/ob小鼠中減輕體重的效力；圖2示出ob/ob小鼠體脂的變化；圖3示出在DIO動物模型中減輕體重的效力；圖4示出在ZDF大鼠中減少體脂的效力；以及圖5示出在ZDF大鼠中減少食物攝取的效力。最佳實施方式一方面，本發(fā)明涉及治療肥胖相關疾病、抑制食物攝取或者減少體脂的組合物，所 述組合物包含通過非肽基接頭共價連接促胰島素釋放肽與載體物質制備的綴合物。如本文所用，術語“肥胖相關疾病”可選自如下疾病過食癥(overeating)、暴食癥(binge eating)、易饑癥、高血壓、糖尿病、血漿胰島素濃度升高、胰島素抗性、高脂血癥、 代謝綜合征、胰島素抗性綜合征、肥胖相關的胃食管返流癥、動脈硬化癥、高膽固醇血癥、高 尿酸血癥、下背痛、心臟肥大和左心室肥大、脂肪代謝障礙、非酒精性脂肪性肝炎、心血管疾 病，和多囊性卵巢綜合征，以及具有這些肥胖相關疾病包括希望減輕體重的那些對象。如本文所用，術語“促胰島素釋放肽”是具有促胰島素釋放功能的肽，其促進胰 腺日細胞中胰島素的合成與表達。這些肽包括前體、激動劑、衍生物、片段以及變體，優(yōu)選 GLP (胰高血糖素樣肽)-1、exendin 3和exendin 4或者其衍生物。本發(fā)明的促胰島素釋放肽衍生物是具有化學修飾的N-末端組氨酸殘基的衍生 物，或者是具有化學修飾的N-末端組氨酸殘基的氨基基團的衍生物。此外，exendin-4或者 exendin-3的衍生物是指通過在天然肽中取代、缺失或者插入一或多個氨基酸制備的肽，或 者通過烷化、酰化、酯化或者酰胺化天然肽中的一或多個氨基酸制備的化學修飾的肽，以及 是指具有天然活性的肽。舉例的exendin-3或者exendin-4衍生物包括但不限于具有部分 缺失的C-末端或者用非天然氨基酸正亮氨酸取代的exendin類似物，其在W097/46584中 描述；具有非天然氨基酸如戊基甘氨酸、高脯氨酸和叔丁基甘氨酸(tertbutylglycine)取 代的exendin類似物，其在W099/07404中描述；具有由于部分缺失C-末端氨基酸殘基而比 天然exendin短的氨基酸序列的exendin類似物；以及具有其它氨基酸取代的exendin類 似物，其在US2008/0119390中揭示，所述文獻在此均以其全部內容并入本文作參考。更優(yōu) 選所述促胰島素釋放肽是exendin-4或者其衍生物。具體地，本發(fā)明的促胰島素釋放肽衍生物可包括其除去N-末端胺基團的衍生物 (脫氨_組氨酰_衍生物)、通過用羥基基團取代氨基基團制備的衍生物(0 -羥基咪唑并 丙酰_衍生物)、通過用兩個甲基殘基修飾氨基基團制備的衍生物(二甲基-組氨酰_衍 生物)、通過用羧基基團取代N-末端氨基基團制備的衍生物(0 -羧基咪唑并丙酰-衍生 物)，或者除去氨基基團的正電荷的衍生物，其中除去N-末端組氨酸殘基的a碳原子而僅 剩下咪唑并乙?；鶊F，以及其它N-末端氨基基團修飾的衍生物。在本發(fā)明中，促胰島素釋放肽衍生物更優(yōu)選是具有化學修飾的N-末端氨基基 團和氨基酸殘基的exendin 4衍生物，更優(yōu)選通過除去或者取代exendin-4的N-末 端His1殘基a碳原子中存在的a氨基基團或者通過除去或者取代a碳原子制備的 exendin-4衍生物。更優(yōu)選，如下文<a>至<e>所示，除去N_末端氨基基團的脫氨-組氨 酰-exendin-4(DA-Exendin-4)、通過用羥基基團取代氨基基團制備的0 -羥基咪唑并丙 基-exendin-4 (HY-exendin-4)、通過用羧基基團取代氨基基團制備的0 -羧基咪唑并丙 基-exendin-4(CX-exendin-4)、通過用兩個甲基殘基修飾氨基基團制備的二甲基-組氨 酰-exendin-4(DM-exendin-4)或者除去N_末端組氨酸殘基的a碳原子制備的咪唑并乙 酉先-exendin-4(CA-exendin-4)。
7 可用于本發(fā)明中的載體物質是這樣的物質，其通過非肽基接頭與促胰島素釋放肽 共價連接，及顯著延長所述肽的血液半衰期，且可以選自免疫球蛋白Fc區(qū)域、血清白蛋白、 運鐵蛋白、膠原蛋白及其片段、纖連蛋白及其片段以及PEG，優(yōu)選免疫球蛋白Fc區(qū)域。如本 文所用，術語“免疫球蛋白Fc區(qū)域”是指這樣的蛋白質，其含有免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū) 2(Ch2)和重鏈恒定區(qū)3(Ch3)，排除了免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)1(Ch1) 和輕鏈恒定區(qū)1(Q1)。其在重鏈恒定區(qū)可進一步包含鉸鏈區(qū)。本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū) 也可含有部分或者全部Fc區(qū)域，包括重鏈恒定區(qū)1 (CH1)和/或輕鏈恒定區(qū)1 (Q1)，排除了 重鏈和輕鏈的可變區(qū)，只要其具有與天然免疫球蛋白基本相似或者優(yōu)于其的生理學功能即 可。所述免疫球蛋白Fc區(qū)域也可以是缺失CH2和/或Ch3的氨基酸序列的相對較長部分的 片段。也就是說，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)域可包含1)CH1結構域，CH2結構域，CH3結構域 和Ch4結構域；2) CH1結構域和Ch2結構域；3) CH1結構域和Ch3結構域；4) CH2結構域和CH3結 構域；5) —或多個結構域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)(或者鉸鏈區(qū)的一部分)的組合；以及6)重 鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的每個結構域的二聚體。本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)域包括天然氨 基酸序列及其序列衍生物(突變體)。氨基酸序列衍生物是與天然氨基酸序列由于缺失、插 入、非保守或者保守取代一或多個氨基酸殘基或者這些方法的組合而不同的序列。例如，在IgG Fc中，已知在結合中起重要作用的在214-238、297-299、318-322或者327-331位置的 氨基酸殘基，可以用作修飾的合適靶位。其它各種衍生物也是可能的，包括其中缺失能形成 二硫鍵的區(qū)域的衍生物，或者在天然Fc形式的N-末端消除一些氨基酸殘基或者在此加入 甲硫氨酸殘基的衍生物。此外，為了除去效應物功能，缺失可以在補體結合位點如Clq-結 合位點和ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)位點發(fā)生。制備免疫球蛋白Fc區(qū)域的 這種序列衍生物的技術在W097/34631和W0 96/32478中揭示。本領域已知通常不改變蛋 白質或者肽活性的所述蛋白質和肽中的氨基酸置換(H. Neurath,R. L. Hill,The Proteins, Academic Press,New York，1979)。最常見的置換是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、 Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/ lie、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly雙方置換。此外，如果需要，可以通過磷酸化、硫酸化、 ?；?acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙?；?、酰胺化等方式修 飾Fc區(qū)域。前述Fc衍生物是具有與本發(fā)明的Fc區(qū)域相同生物學活性或者改良的穩(wěn)定性 如對于熱、PH等的穩(wěn)定性的衍生物。此外，這些Fc區(qū)域可以得自分離自人及其它動物包括 牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠的天然形式，或者可以是得自轉化的動物細胞或者 微生物的其重組或者衍生形式。在此，其可以得自天然免疫球蛋白，通過從人或者動物生物 體中分離總免疫球蛋白以及用蛋白酶解酶處理其而獲得。用木瓜蛋白酶將天然免疫球蛋白 消化為Fab和Fc區(qū)域以及用胃蛋白酶處理導致pF' c和F(ab)2片段產生。對這些片段可 以進行例如大小排阻層析以分離Fc或者pF' c。優(yōu)選地，人衍生的Fc區(qū)域是得自微生物 的重組免疫球蛋白Fc區(qū)域。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)域可以是具有天然糖鏈形式、 與天然形式相比糖鏈增多或者與天然形式相比糖鏈減少，或者可以是去糖基化形式。增多、 減少或者除去免疫球蛋白FC糖鏈可以通過本領域常用方法實現，例如化學方法、酶方法以 及使用微生物的遺傳工程方法。從Fc區(qū)域中除去糖鏈導致與第一個補體成分C1的Clq部 分的結合親和性顯著降低，以及抗體依賴性細胞介導的細胞毒性或者補體依賴性細胞毒性 降低或喪失，從而在體內不誘導不希望的免疫應答。在這方面，去糖基化(deglycosylated) 或者非糖基化(aglycosylated)形式的免疫球蛋白Fc區(qū)域作為藥物載體可以更適于本發(fā) 明目的。如本文所用，術語“去糖基化”是指通過酶從Fc區(qū)域中除去糖部分，術語“非糖基 化”是指Fc區(qū)域由原核生物優(yōu)選大腸桿菌以非糖基化形式產生。另一方面，免疫球蛋白Fc 區(qū)域可以衍生自人或者其它動物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠和豚鼠，優(yōu)選人。此 外，所述免疫球蛋白Fc區(qū)域可以是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc區(qū)域，或者可以由 其組合或者雜交體制成。優(yōu)選地，衍生自IgG或者IgM，其是人血液中最豐富的蛋白質，最優(yōu) 選衍生自IgG，已知其提高配體結合蛋白的半衰期。另一方面，如本文所用，術語“組合”是 指編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白Fc區(qū)域的多肽與不同來源的單鏈多肽連接，形成二聚 體或者多聚體。也就是說，二聚體和多聚體可以從選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和 IgE Fc片段的兩或多個片段中形成。如本文所用，術語“雜交體”是指編碼不同來源的兩或 多個免疫球蛋白Fc區(qū)域的序列存在于一個單鏈免疫球蛋白Fc區(qū)域中。在本發(fā)明中，各種 類型的雜交體均是可能的。也就是說，結構域雜交體可以由選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、 IgE Fc和IgD Fc的CH1、Ch2、Ch3和CH4的1_4個結構域組成，以及可包含鉸鏈區(qū)。另一方 面，將IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類，且本發(fā)明包括其組合和雜交體。優(yōu)選IgG2 和IgG4亞類，最優(yōu)選很少具有效應功能如CDC(補體依賴性細胞毒性)的IgG4的Fc區(qū)域。也就是說，作為本發(fā)明的藥物載體，最優(yōu)選的免疫球蛋白Fc區(qū)域是人IgG4_衍生的非糖基 化Fc區(qū)域。人衍生的Fc區(qū)域比非人衍生的Fc區(qū)域更優(yōu)選，所述非人衍生的Fc區(qū)域在人 體內可以作為抗原，導致不希望的免疫應答如產生所述抗原的新抗體。在本發(fā)明的組合物包含的綴合物中，促胰島素釋放肽通過非肽基接頭與載體物質 連接。如本文所用，術語“非肽基接頭”是指單一(singe)化合物或者包含彼此連接的兩或 多個重復單位的生物相容的聚合物?？捎糜诒景l(fā)明中的非肽基接頭可具有任何化學結構， 主要功能是作為接頭通過共價鍵連接促胰島素釋放肽與載體物質。因此，非肽基接頭特征 在于其是在兩端具有能共價結合肽/載體物質的反應性基團的化合物，其中在兩端的末端 反應性基團彼此相同或者不同。在非肽基接頭兩端的反應性基團可以相同或不同。例如， 非肽基接頭在一端可具有馬來酰亞胺基團，在另一端可具有醛基團、丙醛基團或者丁醛基 團。在非肽基接頭兩端的反應性基團優(yōu)選選自反應性醛基團、丙醛基團、丁醛基團、馬來酰 亞胺基團和琥珀酰亞胺衍生物。所述琥珀酰亞胺衍生物可以是琥珀酰亞胺丙酯、羥基琥珀 酰亞胺、琥珀酰亞胺羧基甲酯或者琥珀酰亞胺碳酸鹽。特別地，當非肽基接頭在其兩端均具 有反應性醛基團時，在這兩端可以通過最小的非特異性反應有效地連接生理學活性多肽和 免疫球蛋白Fc區(qū)域。通過醛鍵的還原性烷化產生的終產物與通過酰胺鍵連接相比更穩(wěn)定。 醛反應性基團在低PH選擇性結合N-末端，且在高pH如pH 9. 0可以結合賴氨酸殘基形成 共價鍵。當使用其兩端均具有反應性羥基基團的聚乙二醇作為非肽基聚合物時，所述羥基 可以通過已知的化學反應有各種反應基團激活，或者可以使用具有可商購修飾的反應基團 的聚乙二醇以制備本發(fā)明的促胰島素釋放肽綴合物。可用于本發(fā)明中的非肽基聚合物可以 是SMCC(琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)或者SFB(琥珀酰亞 胺4-甲?；郊姿?，其可以與肽的胺和巰基(sulfydryl)共價連接，但非限于此。所述非 肽基聚合物可選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧 乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA(聚(乳酸) 和PLGA(聚乳酸乙醇酸)、脂質聚合物、殼多糖、透明質酸，及這些聚合物的組合，優(yōu)選聚乙 二醇。本領域熟知的且本領域技術人員易于制備的其衍生物也包含在本發(fā)明范圍內。用以治療肥胖相關疾病的本發(fā)明組合物中包含的綴合物優(yōu)選通過非肽基接頭共 價連接促胰島素釋放肽與載體物質制備，其在W008/082274中揭示，如式1所示式 1Ri"X-R2-L-F其中禮選自脫(des)-氨基-組氨酰、二甲基-組氨酰、羥基咪唑并丙酰、4-咪 唑并乙酰和羧基咪唑并丙酰， R2 選自-NH2、-OH 和-Ly s，X 選自Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va 1-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val -Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly 禾口Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va1-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser,Y 選自 Lys、Ser 和 Arg，Z 選自 Lys、Ser 和 Arg，L是非肽基接頭，F是免疫球蛋白Fc。此外，本發(fā)明的包含綴合物的藥物組合物可包含藥物可接受的載體。對于口服 給予，所述藥物可接受的載體可包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn) 定劑、懸浮劑、著色劑和香味劑。對于可注射制品，所述藥物可接受的載體可包括緩沖劑、 防腐劑、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩(wěn)定劑。對于局部給予制品，所述藥物可接受的載體可 包括基質、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。本發(fā)明的藥物組合物可以組合前述藥物可接受的載 體配制成各種劑量形式。例如，對于口服給予，所述藥物組合物可以配制為片劑、錠劑、膠 囊、酏劑、懸浮液、糖漿或者包藥干糊片(wafer)。對于可注射制品，所述藥物組合物可以 配制為單位劑量形式，如以單一劑量形式置于多劑量容器或者安瓿中。所述藥物組合物也 可以配制為溶液、懸浮液、片劑、藥丸、膠囊和長效制品形式。另一方面，舉例的適于藥物配 制的載體、賦形劑和稀釋劑包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、 麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、凝膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖 維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、羥基苯甲酸丙酯 (propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。此外，所述藥物配制物可進一步包含 充填劑、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、香味劑以及抗菌劑。本發(fā)明的藥物組合物的給予劑量可以 通過一些相關因素確定，包括治療疾病的類型、給予途徑、患者年齡、性別、體重和疾病嚴重 性。由于本發(fā)明的藥物組合物具有極佳的體內效力和效價持續(xù)時間，因此可以顯著減少包 含本發(fā)明組合物的藥物的給予頻率和劑量。本發(fā)明組合物中包含的促胰島素釋放肽綴合物以明顯低于天然促胰島素釋放肽 的量即可呈現出持續(xù)抑制食物攝取的作用，從而可用于治療如肥胖癥和急性冠狀動脈綜合 征等疾病。此外，由于抑制食物攝取的作用(抑制食欲)，所述促胰島素釋放肽綴合物可用 于減少體脂如膽固醇和脂肪組織。為了治療肥胖癥和肥胖相關疾病，需要減少體脂，但是減 輕瘦體重(leantissue)-即喪失蛋白質-是不可取的。由于瘦體重由肌肉、生命器官、骨、 結締組織及其它非脂肪組織組成，因此確信瘦體重的喪失對于人體健康有害。因此，由于本 發(fā)明的組合物抑制食欲引起的體重減輕不導致瘦體重減輕，而是脂肪組織減輕，因此是治 療肥胖相關疾病的非常重要的因素。由于促胰島素釋放肽如GLP-1、amylin、CCK和exendin在給予后1_6小時的短 時間內維持其抑制食欲的效力，因此必須重復給予以治療慢性疾病如肥胖癥和肥胖相關疾 病。本發(fā)明的組合物中包含的促胰島素釋放肽綴合物在低劑量即可維持其效力達到一周以 上的時間，從而呈現出最大治療效力。再一方面，本發(fā)明提供了通過使用所述組合物治療肥胖相關疾病的方法、抑制食 物攝取的方法以及減輕體重的方法。特別地，本發(fā)明的方法可包括給予治療可接受量的所 述組合物的步驟。如本文所用，術語“給予”是指通過某一合適方法將預定量的物質導入患者體內。包含所述綴合物的組合物可以通過任何常用模式給予，只要其可以到達希望的組織即可。 可以通過各種給予模式給予，包括腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內 以及直腸內給予，但是本發(fā)明不限于這些舉例的給予模式。然而，由于肽在經口服給予時被 消化，因此口服給予的組合物的活性成分應加以包膜或者配制為在胃中抗降解形式。優(yōu)選 地，本發(fā)明的組合物可以可注射形式給予。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以通過使用能將活 性成分轉運至靶細胞的某一裝置給予。在這方面，所述組合物的治療可接受劑量可以根據 前述各個因素確定。根據本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了單獨使用促胰島素釋放肽綴合物或者與一或 多種抗肥胖藥物組合治療肥胖相關疾病的藥物組合物。組成本發(fā)明藥物組合物的用以與所 述促胰島素釋放肽綴合物組合治療肥胖相關疾病的物質例如包括示出抑制食欲或者增強 能量代謝活性的物質、抑制脂質降解活性的物質、延遲胃排空活性的物質、示出蛋白質酪氨 酸磷酸酶(PTP)lb-抑制活性及DPPIV-抑制活性的物質，如GLP-1及其衍生物(Patricia.， Trends in endocrinology and metabolism 2007 ; 18 :240-245)、糊精、PYY(肽 YY) (Lynn et al. , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters2007 ; 17 :1916-1919)、瘦素、縮膽 促胰素(cholecytokinin) (CCK)、胃泌酸調節(jié)素(oxyntomodulin)、ghrelin 拮抗劑、NPY 拮抗劑(Elena et al. , Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease 2008 ； 18 158-168)，Sarika et al. Neuropeptides 2006 ；40 :375_401)、利莫那班(rimonabant)、西 布曲明和奧利司他(Alan Dove.，Nature biotechnology 2001 ；19 :25_28)，但不限于這些 物質。
實施例在下文中，通過如下實施例可以獲得對于本發(fā)明更好的理解，所述實施例只是例 證本發(fā)明，而無限制本發(fā)明之意。實施例1 制備促胰島素釋放肽綴合物(CA-Exendin)將3. 4K PropionALD(2)PEG(具有兩個丙醛基團的 PEG，IDB Inc.，Korea)和咪唑 并-乙酰Exendin-4的賴氨酸殘基(Bachem，Swiss)進行聚乙二醇化(pegylation)，通過將 所述肽與PEG以1 15摩爾比率在4°C反應過夜，肽濃度為5mg/ml。在此期間，在pH 7. 5 緩沖劑中進行反應，向其中加入作為還原劑的20mM SCB(NaCNBH3)以進行反應。在如下條 件下使用 SOURCE S(XK 16ml, Amersham Biosciences)分離單聚乙二醇化的 exendin 和異 構體。柱SOURCE S(XK 16ml, Amersham Biosciences)流速2.0ml/ 分鐘梯度:A0 — 100% 45 分鐘 B(A :20mM 檸檬酸 pH 3. 0 ；B :A+0. 5MKC1)將分離的單聚乙二醇化的CA-Exendin-4與免疫球蛋白Fc結合。反應在肽免 疫球蛋白Fc = 1 4的比率在4°C進行16小時，總蛋白質濃度為50mg/ml。反應在100mM K-P(pH 6.0)溶液中進行，向其中加入作為還原劑的20mM SCB。在結合反應之后，使用 SOURCE Phe(16ml)和 SOURCE Q(16ml)進行兩次純化步驟。ft SOURCE Phe(HR16ml, Amersham Biosciences)流速2.0ml/ 分鐘
12
梯度:B100 — 0% 30 分鐘 B(A :20mM Tris pH7. 5 ；B :A+1. 5M NaCl)柱SOURCE Q(XK16ml, Amersham Biosciences)流速2.0ml/ 分鐘梯度A0 — 25% 60 分鐘 B(A :20mM Tris pH7. 5 ；B :A+1M NaCl)實施例2 促胰島素釋放肽綴合物在ob/ob小鼠中的減輕體重作用將熟知的肥胖癥動物模型ob/ob小鼠(C57BL/6JHamSlc-0b/b0，雌性，8_9周齡) 分為4組(每組5只小鼠)，然后給予載體和Byetta(Amylin-Lily, exendin_4，45 u g/kg， 每天皮下注射)以及在實施例1中制備的促胰島素釋放肽綴合物(45 u g或者100 u g/kg, 每周皮下注射一次)。然后，測量28天體重改變情況，在完成給予后測量血液脂質代謝參數 如膽固醇和游離脂肪酸水平。在完成檢驗后，切離肝和脂肪組織，并稱重。促胰島素釋放肽 綴合物在ob/ob小鼠中的減輕體重作用示于表1。表 1 如表1和圖1和圖2所示，所述促胰島素釋放肽綴合物示出在1/7劑量優(yōu)于Byetta 的減輕體重和降低膽固醇水平的作用，且該作用是劑量依賴性的。此外，每周給予一次所述 促胰島素釋放肽綴合物的效力維持時間比每天給予exendin-4的效力維持時間長。實施例3 促胰島素釋放肽綴合物在DI0小鼠中的減輕體重作用將熟知的肥胖癥動物模型DI0 (飲食誘導的肥胖癥)小鼠mice (C57BL/6Ncr jBgi, 雄性，25周齡)分為5組(每組5只小鼠)，然后給予載體和ByettadOOyg/kg，每天皮下 注射)以及在實施例1中制備的促胰島素釋放肽綴合物(20、50、100i!g/kg，每周皮下注射 一次)。然后，測量2周體重改變情況。促胰島素釋放肽綴合物在DI0小鼠中的減輕體重作 用示于表2。表 2 如表2和圖3所示，所述促胰島素釋放肽綴合物示出在1/17. 5劑量優(yōu)于Byetta 的減輕體重的作用，且該作用是劑量依賴性的。此外，每周給予一次所述促胰島素釋放肽綴合物的效力維持時間比每天給予exendin-4的效力維持時間長。實施例4 促胰島素釋放肽綴合物在ZDF(Zucker糖尿病大鼠)大鼠中的減輕體重 作用ZDF通常用于糖尿病研究中，且具有與ob/ob小鼠相似的特征(ZDF/Gmi-fa/fa，雄 性，7周齡)，將其分為5組(每組5只小鼠)，然后給予載體和Byetta (100 u g/kg，每天皮 下注射)以及在實施例1中制備的促胰島素釋放肽綴合物(20、50、100i!g/kg，每周一次皮 下注射)。然后，測量8周的體重和食物攝取情況中的改變，在完成給予之后測量血液脂質 代謝參數如膽固醇水平。在完成檢驗之后，切離脂肪組織并稱重。所述促胰島素釋放肽綴 合物在ZDF大鼠中的減輕體重作用在表3中示出。表3 如表3和圖4和圖5所示，所述促胰島素釋放肽綴合物示出在1/35劑量優(yōu)于 Byetta的減輕體重和體脂以及抑制食物攝取的作用，且該作用是劑量依賴性的。此外，每周 給予一次所述促胰島素釋放肽綴合物的效力維持時間比每天給予exendin-4的效力維持 時間長。
權利要求
包含促胰島素釋放肽綴合物的治療肥胖相關疾病的組合物，其通過經由選自下組的非肽基接頭連接促胰島素釋放肽與免疫球蛋白Fc區(qū)域而制備SMCC(琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)、SFB(琥珀酰亞胺4-甲?；郊姿?、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸乙醇酸)、脂質聚合物、殼多糖、透明質酸，及其組合。
2.權利要求1的治療肥胖相關疾病的組合物，其中所述促胰島素釋放肽選自GLP-1、 exendin-3, exendin-4或者其激動劑，其衍生物、其片段、其變體，以及其組合組成的組。
3.權利要求2的治療肥胖相關疾病的組合物，其中所述衍生物通過選自取代、缺失和 修飾天然促胰島素釋放肽的N-末端胺基團的任一種方法制備，以及選自促胰島素釋放肽、 其片段及其變體組成的組。
4.權利要求3的治療肥胖相關疾病的組合物，其中所述衍生物是exendin-4衍生物，選 自除去N-末端胺基團的衍生物、通過用羥基基團取代N-末端胺基團制備的衍生物、通過用 二甲基基團修飾N-末端胺基團制備的衍生物、通過缺失第一個氨基酸(組氨酸)的a碳 原子制備的衍生物、通過用絲氨酸取代第12個氨基酸(賴氨酸)制備的衍生物，以及通過 用精氨酸取代第12個氨基酸(賴氨酸)制備的衍生物組成的組。
5.治療肥胖相關疾病的組合物，其包含如下式1所示促胰島素釋放肽綴合物 r「x-r2-l-f< 式 1>其中禮選自脫-氨基-組氨酰、二甲基-組氨酰、0 -羥基咪唑并丙酰、4-咪唑并乙酰 和日-羧基咪唑并丙酰組成的組，R2選自_NH2、-OH和-Lys組成的組，X 選自 Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-V al-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg -Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly 及 Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z-Asn-Gly-Gly-P ro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser 組成的組，Y選自Lys、Ser和Arg組成的組，Z選自Lys、Ser和Arg組成的組，L是非肽基接頭，F是免疫球蛋白Fc。
6.權利要求5的治療肥胖相關疾病的組合物，其中L選自SMCC(琥珀酰亞胺4-(N-馬 來酰亞胺-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)、SFB(琥珀酰亞胺4-甲?；郊姿?、聚乙二醇、聚 丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡 聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸乙醇酸)、脂質聚 合物、殼多糖、透明質酸，及其組合組成的組。
7.權利要求6的治療肥胖相關疾病的組合物，其中L是聚乙二醇。
8.權利要求5的治療肥胖相關疾病的組合物，其中隊是4-咪唑并乙酰，Y是Lys或者 561~，2是1^8，1 2是-冊2。
9.權利要求1的治療肥胖相關疾病的組合物，其中所述肥胖相關疾病選自肥胖癥、高 脂血癥、胰島素抗性綜合征、肥胖相關的胃食管返流癥、脂肪性肝炎、心血管疾病和代謝綜 合征組成的組。
10.包含促胰島素釋放肽綴合物的抑制食物攝取的組合物，其通過經由選自下組的非 肽基接頭連接促胰島素釋放肽與免疫球蛋白Fc區(qū)域而制備SMCC(琥珀酰亞胺4-(N-馬來 酰亞胺_甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)、SFB(琥珀酰亞胺4-甲?；郊姿?、聚乙二醇、聚丙 二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚 糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA(聚(乳酸)和PLGA(聚乳酸乙醇酸)、脂質聚 合物、殼多糖、透明質酸，及其組合。
11.權利要求10的抑制食物攝取的組合物，其中所述促胰島素釋放肽選自GLP-1、 exendin-3、exendin-4，或者其激動劑、其衍生物、其片段、其變體，及其組合組成的組。
12.權利要求11的抑制食物攝取的組合物，其中所述衍生物通過選自取代、缺失和修 飾天然促胰島素釋放肽的N-末端胺基團的任一種方法制備，以及選自促胰島素釋放肽、其 片段及其變體組成的組。
13.權利要求12的抑制食物攝取的組合物，其中所述衍生物是exendin-4衍生物，選自 除去N-末端胺基團的衍生物、通過用羥基基團取代N-末端胺基團制備的衍生物、通過用二 甲基基團修飾N-末端胺基團制備的衍生物、通過缺失第一個氨基酸(組氨酸)的a碳原 子制備的衍生物、通過用絲氨酸取代第12個氨基酸(賴氨酸)制備的衍生物，以及通過用 精氨酸取代第12個氨基酸(賴氨酸)制備的衍生物組成的組。
14.抑制食物攝取的組合物，其包含如下式1所示促胰島素釋放肽綴合物 r「x-r2-l-f< 式 1>其中R” X、R2、L和F與權利要求5所述相同。
15.包含促胰島素釋放肽綴合物的減少體脂或者血漿膽固醇的組合物，其通過選自 下組的非肽基接頭連接促胰島素釋放肽與免疫球蛋白Fc區(qū)域而制備SMCC(琥珀酰亞胺 4-(N-馬來酰亞胺-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)、SFB (琥珀酰亞胺4-甲?；郊姿?、聚乙 二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、 多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、可生物降解的聚合物如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸乙醇酸)、 脂質聚合物、殼多糖、透明質酸，及其組合。
16.權利要求15的減少體脂或者血漿膽固醇的組合物，其中所述促胰島素釋放肽選自 GLP-1、exendin-3, exendin-4，或者其激動劑、其衍生物、其片段、其變體及其組合組成的 組。
17.權利要求16的減少體脂或者血漿膽固醇的組合物，其中所述衍生物通過選自取 代、缺失和修飾天然促胰島素釋放肽的N-末端胺基團的任一種方法制備，以及選自促胰島 素釋放肽、其片段及其變體組成的組。
18.權利要求17的減少體脂或者血漿膽固醇的組合物，其中所述衍生物是exendin-4 衍生物，選自除去N-末端胺基團的衍生物、通過用羥基基團取代N-末端胺基團制備的衍生 物、通過用二甲基基團修飾N-末端胺基團制備的衍生物、通過缺失第一個氨基酸(組氨酸) 的a碳原子制備的衍生物、通過用絲氨酸取代第12個氨基酸(賴氨酸)制備的衍生物，以 及通過用精氨酸取代第12個氨基酸(賴氨酸)制備的衍生物組成的組。
19.用于降低體脂或者血漿膽固醇的組合物，包含下式1的促胰島素釋放肽綴合物 R1-X-R2-L-F< 式 1>其中禮，X，R2，L和F與權利要求5中的定義相同。
20.使用權利要求1的組合物組合選自下組的一種物質治療肥胖相關疾病的藥物組合 物示出抑制食欲或者增加能量代謝活性、脂質降解抑制活性、延遲胃排空活性、蛋白質酪 氨酸磷酸酶(PTP) lb-抑制活性和DPPIV-抑制活性的物質，包括GLP-1及其衍生物，糊精、 PYY(肽YY)、瘦素(1印tin)、縮膽促胰素(CCK)、胃泌酸調節(jié)素(oxyntomodulin), ghrelin 拮抗劑，NPY拮抗劑，利莫那班，西布曲明以及奧利司他。
21.使用權利要求1-9和20任一項的組合物治療肥胖相關疾病的方法。
22.權利要求21的治療肥胖相關疾病的方法，其中所述肥胖相關疾病選自肥胖癥、高 脂血癥、胰島素抗性綜合征、肥胖相關的胃食管返流癥、脂肪性肝炎、心血管疾病和代謝綜 合征。
23.使用權利要求10-14任一項的組合物抑制食物攝取的方法。
24.使用權利要求15-19任一項的組合物減少體脂或者血漿膽固醇的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含促胰島素釋放肽綴合物的治療肥胖相關疾病的組合物，特別涉及包含通過非肽接頭共價連接促胰島素釋放肽與載體物質制備的綴合物的治療肥胖相關疾病的組合物，本發(fā)明還涉及通過使用所述組合物治療肥胖相關疾病的方法。特別地，本發(fā)明治療肥胖相關疾病的組合物顯著改良抑制食物攝取及在此期間減輕體重和體脂的效力，從而可用于治療肥胖相關疾病。
文檔編號A61K38/16GK101878036SQ200880118353
公開日2010年11月3日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權日2007年11月29日
發(fā)明者姜殷姬, 宋大海, 樸永振, 權世昌, 李寬淳, 鄭圣燁, 金玫永 申請人:韓美藥品工業(yè)株式會社