專利名稱：棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽和在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)
背景技術(shù)：
糖尿病是多遺傳基因和環(huán)境因素引起的以糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，而導(dǎo)致多系統(tǒng)，多臟器功能損害的一種多發(fā)的內(nèi)分泌、代謝性疾病。統(tǒng)計顯示，我國80年代＜1％，目前升到3.6-5％，其中90％以上(約3800萬人)屬II型糖尿病。截至2000年，全球共有糖尿病患者1.35億人，預(yù)計2025年將增加到2.99億。糖尿病本身不可怕，可怕的是并發(fā)癥，糖尿病并發(fā)癥包括癌、睡眠呼吸暫停、抑郁、心肌梗死、外周血管病、高血壓和最常見的II型糖尿病。II型糖尿病又稱“非胰島素依賴型糖尿病”，主要病理表現(xiàn)為胰島素抵抗和由胰島細(xì)胞功能失調(diào)所致的胰島素分泌相對不足，形成持久的高血糖，并可產(chǎn)生多種致命性并發(fā)癥。其臨床表現(xiàn)癥狀大多與機(jī)體產(chǎn)生胰島素抗性、自身分泌的胰島素少或滯后等有關(guān)。至今為止，該病尚無根治的辦法，它不僅會加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可使患者致殘、早亡。
目前，世界上治療II型糖尿病以磺酰脲類藥物為主，輔以雙胍類、a-糖苷酶抑制劑等藥物。但是，由于磺酰脲類藥物的副作用大，長期使用會因為胰島素過度分泌而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭，服用此類藥物的糖尿病人中，每年有10％的病人會因治療失效而改用胰島素等其他類藥物。而且目前的藥理研究和治療方法尚不能涵蓋該疾病所涉及的所有代謝性缺陷。自1984年美國波士頓總醫(yī)院發(fā)現(xiàn)人的腸道內(nèi)存在一類促進(jìn)胰島素分泌的多肽(統(tǒng)稱GLP-1)以來，為糖尿病的治療提供新的方向。與目前的糖尿病治療藥物，尤其是磺酰脲類藥物相比，GLP-1類似物具有一些新的作用靶點，如延緩胃排空，抑制胰高血糖素產(chǎn)生，增加胰島素的生物合成及β細(xì)胞數(shù)量等，已成為治療II型糖尿病的新亮點。相信在不久的將來，隨著GLP-1用藥劑量的確定及給藥方式的進(jìn)一步完善，無疑將成為II型糖尿病治療的新手段。
現(xiàn)階段產(chǎn)生先導(dǎo)化合物的主要方法還是依賴于對大量化合物進(jìn)行隨機(jī)篩選。而中國博大的多物種天然生物資源是結(jié)構(gòu)多樣性小分子有機(jī)化合物的重要來源，其中一些生物活性物質(zhì)早已被中醫(yī)記載和采用。很多兩棲類動物在中國屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombinamaxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromacula)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。
我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，除了具有生物堿等一系列有機(jī)藥用小分子外，兩棲類皮膚還含有大量的活性肽類物質(zhì)，這是新藥發(fā)現(xiàn)的一個重要來源。
發(fā)明人將本發(fā)明的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有促進(jìn)胰島素釋放的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽和在制藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽采用常規(guī)方法制備，即乙醚刺激棕點湍蛙，收集的皮膚分泌液離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)一系列的生物化學(xué)手段分離純化得到該多肽，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)，根據(jù)所得到的氨基酸序列合成該多肽。采用飛行時間質(zhì)譜法測定分子量，等電聚焦測定等電點，自動氨基酸測序儀確認(rèn)氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽為從中國兩棲類動物棕點湍蛙皮膚分泌液中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1627.04道爾頓，等電點8.75，多肽一級結(jié)構(gòu)全序列為Phe-Leu-Pro-Ile-Val-Gly-Lys-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-Ser-Gly-Leu-Leu(FLPIVGKLLSGLSGLL-NH2).
本發(fā)明的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽是從天然生物資源得到的產(chǎn)物，具有很好的促進(jìn)胰島素釋放的作用，同時還具有無溶血活性、無血漿凝固活性等優(yōu)點，可作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。


附圖顯示本發(fā)明棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽促進(jìn)胰島素釋放的作用。圖中對照為含葡萄糖16.7mM的平衡鹽緩沖溶液(HBSS)；Amolopin濃度為125ug/ul。
具體實施例方式下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽的制備將活體棕點湍蛙用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從棕點湍蛙皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥后保存。
第一步，Sephadex G-50凝膠過濾柱層析，按上述方法獲得的原材料棕點湍蛙皮膚分泌液凍干粉300mg溶解于5ml純凈水，10000rpm 4℃離心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝膠過濾柱(長1000mm，直徑26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液平衡，充分后將樣品上于該柱。用同樣緩沖液洗脫，收集活性峰。
第二步，反相高壓液相色譜為Sephadex G-50凝膠過濾得到的活性成分的峰上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(長300mm，直徑5mm)用含1‰三氟乙酸的乙腈緩沖液從0％至80％的梯度洗脫。收集具有促進(jìn)胰島素釋放的活性峰。
第三步，純化的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用飛行時間質(zhì)譜法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過上述方法制備的棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽是從中國兩棲類動物棕點湍蛙皮膚分泌液中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1627.04道爾頓，等電點8.75，多肽一級結(jié)構(gòu)全序列為Phe-Leu-Pro-Ile-Val-Gly-Lys-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-Ser-Gly-Leu-Leu(COOH-FLPIVGKLLSGLSGLL-NH2).
棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽促進(jìn)胰島素釋放的作用
棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽的胰島素釋放促進(jìn)活性采用葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放活性檢測方法(GSIS，Glucose-stimulated insulin secretion)。
一.胰島細(xì)胞的分離與培養(yǎng)(Islet isolation and culturing)1.取胰腺取禁食一日的SD大鼠5-6只，體重200-250g/只，雌雄不限，過量乙醚麻醉后，斷頸處死。將上述處死的大鼠以70％酒精全身消毒，在超凈工作臺上無菌條件下取出胰腺，置于于HBSS(購自JRH)平衡鹽溶液中，漂洗血跡，并剪去多余的組織和脂肪。
2.消化將胰腺在20ml膠原酶IV(購自sigma)消化液(濃度為0.167％)中37℃震蕩消化30分鐘，至組織塊被消化成細(xì)沙狀，4℃或冰冷的HBSS平衡鹽溶液終止消化。1000r/min離心5分鐘，去上清液中的膠原酶，同樣方法再洗滌2次。
3.純化以Ficoll400(分子量40,000，購自Pharmacia)不連續(xù)密度梯度離心法純化胰島細(xì)胞。在15ml離心管加入25％Ficoll400 2ml同消化后的胰島細(xì)胞混勻，在其上輕輕加入23％Ficoll400 2ml，20％Ficoll400 1ml，11％Ficoll400 1ml，3000r/min離心20分鐘，吸出11％-20％，20％-23％兩層界面的細(xì)胞，以RPMI1640培養(yǎng)液(購自HYCLONE)洗滌兩次。取少量胰島細(xì)胞懸液，以雙硫腙(DTZ，dithizone)染色，并拍照。
4.手工挑選將純化并洗滌后的胰島置于培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下手工挑選胰島。接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種10個胰島，加入200ul RPMI1640培養(yǎng)液(含有10％胎牛血清，青霉素，100單位/ml鏈霉素)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)12小時以上，使所分離的胰島恢復(fù)正常的生理狀態(tài)，以便于胰島素釋放檢測。
二.葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放活性檢測(GSIS)1.在超凈工作臺上，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出。
2.加入混有PBS(陰性對照)或生物活性肽樣品(實驗組)的HBSS平衡鹽溶液(葡萄糖濃度為16.7mM的高糖條件)200ul，在37℃，5％CO2條件下繼續(xù)孵育1小時。每個樣品都做3個重復(fù)。
3.取上清液，1000r/min離心5分鐘，-20℃凍存。胰島素含量由南京軍區(qū)總醫(yī)院臨床檢驗科放免室檢測。結(jié)果見說明書附圖。
由說明書附圖可見，棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽具有顯著的促進(jìn)胰島素釋放的作用，胰島細(xì)胞所釋放出的胰島素隨著棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢。
上述試驗表明棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽可作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽，其特征在于該棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽是從棕點湍蛙中分離得到的一種單鏈多肽，分子量1627.04道爾頓，等電8.75，多肽一級結(jié)構(gòu)全序列為Phe-Leu-Pro-Ile-Val-Gly-Lys-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-Ser-Gly-Leu-Leu(FLPIVGKLLSGLSGLL-NH2)。
2.權(quán)利要求1所述棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽的應(yīng)用，其特征在于該棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過常規(guī)的生物化學(xué)手段，從棕點湍蛙皮膚分泌液中分離純化得到胰島素釋放促進(jìn)肽并測定其序列，按照所得的序列合成該多肽。棕點湍蛙胰島素釋放促進(jìn)肽是一種單鏈多肽，分子量1627.04道爾頓，等電點8.75，多肽一級結(jié)構(gòu)全序列為Phe－Leu－Pro－Ile－Val－Gly－Lys－Leu－Leu－Ser－Gly－Leu－Ser－Gly－Leu－Leu(FLPIVGKLLSGLSGLL－NH2)。本發(fā)明具有很好的促進(jìn)胰島素釋放的作用，同時還具有無溶血活性、無血漿凝固活性等優(yōu)點，可作為制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。
文檔編號A61P3/00GK1900109SQ20061001093
公開日2007年1月24日 申請日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者賴仞, 梁建國, 李宗杰, 徐春花, 李東升, 呂毅 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所