非肽基聚合物-胰島素多聚體和生產(chǎn)其的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中該綴合物與鈷離子絡(luò)合以形成多聚體；制備該多聚體的方法和試劑盒；包括該多聚體作為有效成分用于預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物；和通過給對象施用該組合物預(yù)防或治療糖尿病的方法。
【專利說明】非肽基聚合物-胰島素多聚體和生產(chǎn)其的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中綴合物與鈷離子絡(luò)合以形成多聚體；制備該多聚體的方法和試劑盒；包括該多聚體作為有效成分預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物；和通過給對象施用該組合物預(yù)防或治療糖尿病的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素由51個氨基酸組成，并且分子量為5808道爾頓(Da)。胰島素在胰腺中胰島的β細(xì)胞中產(chǎn)生，并且儲存為六聚體(六個胰島素分子的單元)，然后以生物活性單體形式吸收入血管。通過鋅離子的配位和三個二聚體之間的疏水相互作用促進(jìn)六聚體形成。六聚體中，存在兩個金屬離子結(jié)合位點(diǎn)并且源自三個二聚體的三個組氨酸殘基涉及每個位點(diǎn)。根據(jù)胰島素六聚體的結(jié)構(gòu)狀態(tài)(Τ或R狀態(tài))，結(jié)合位點(diǎn)位于六聚體的兩端或自表面穿過中心的通道結(jié)構(gòu)(tunnel structure)的底部。
[0003]目前，大部分商業(yè)重組體胰島素和胰島素類似物作為六聚體制劑存在。即，它們通過在包含六聚體-穩(wěn)定化合物、鋅和苯酚(或甲酚)的緩沖液中包括3mg/mL或更多的胰島素進(jìn)行配制。與單體形式相比，六聚體制劑提供卓越的原纖維形成和脫氨抗性，從而提高胰島素的穩(wěn)定性并且延長有效期。而且，皮下注入之后，六聚體制劑顯示比單體形式更緩慢從注入位點(diǎn)吸收入血液，并且因此它們具有持續(xù)作用的優(yōu)勢。根據(jù)之前的研究，分子大小和在貯留(cbpot)處毛細(xì)管滲透性之間的反比關(guān)系解釋該緩慢吸收速率。六聚體的這些性質(zhì)應(yīng)用于近來開發(fā)的長效胰島素類似物，以使得在皮下注入之后延遲或持續(xù)吸收胰島素。代表性例子是地特胰島素(insulin detemir),其通過將脂肪酸鏈附連至在天然胰島素B鏈29位處的賴氨酸制備(Havel und等，2004)。根據(jù)該研究，盡管注入的地特胰島素在體內(nèi)形成雙六聚體(dihexamer),其通過與白蛋白的疏水相互作用形成大的分子絡(luò)合物。因此,皮下半衰期一皮下注入藥物的一半經(jīng)過毛細(xì)管壁所用的時間一比天然胰島素六聚體長4倍。
[0004]但是，六聚體制劑是有劣勢的，因?yàn)樗鼈儾荒鼙粦?yīng)用于在天然胰島素的B鏈上的第一氨基酸苯丙氨酸處具有修飾的胰島素類似物，這是因?yàn)楸奖彼釟埢婕傲垠w的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。根據(jù)之前使用聚乙二醇化胰島素的研究(Hinds等，2000)，當(dāng)通過UV-圓二色性和沉降平衡分析通過將750Da或2，OOODa大小的PEG附連至天然胰島素的B鏈的氨基末端制備的胰島素類似物時，它們的大部分作為單體在0.1-1.0mM的濃度范圍內(nèi)存在。相反，天然胰島素大部分作為六聚體在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)存在。因此，使用配制的聚乙二醇化胰島素六聚體在皮下注入之后難以具有持續(xù)吸收胰島素的優(yōu)勢。胰島素類似物的其他例子是白蛋白-胰島素綴合物、糖基化胰島素或類似物。
[0005]所以，急需開發(fā)誘導(dǎo)胰島素類似物的多聚體形成的制劑，用于提高它們的藥學(xué)性質(zhì)，比如穩(wěn)定性和持續(xù)性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題
[0007]所以，本發(fā)明人使用鈷離子誘導(dǎo)PEG-胰島素六聚體的形成，并且然后分析它們的藥學(xué)性質(zhì)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)根據(jù)從微摩爾(μΜ)至納摩爾(ηΜ)的逐漸濃度變化發(fā)生PEG-胰島素六聚體解離成單體，其流體力學(xué)體積與PEG-胰島素綴合物和胰島素六聚體相比大大增加，并且與商業(yè)長效胰島素相比，PEG-胰島素六聚體保持穩(wěn)定的六聚體形式，從而完成本發(fā)明。
[0008]問題的解決方案
[0009]本發(fā)明的一個目的是提供非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中綴合物與鈷離子絡(luò)合以形成多聚體。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供非肽基聚合物-胰島素多聚體的制備方法，包括使非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應(yīng)以產(chǎn)生非肽基聚合物-胰島素多聚體。
[0011]本發(fā)明的仍另一目的是提供預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括非肽基聚合物-胰島素多聚體作為有效成分。
[0012]本發(fā)明的仍另一目的是提供預(yù)防或治療糖尿病的方法，其包括向患有糖尿病或懷疑患有糖尿病的對象施用所述藥物組合物的步驟。
[0013]本發(fā)明的仍另一目的是提供制備非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒，其包括通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物；和包含鈷離子的溶液，其中所述溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑，或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽，或其水合物。
[0014]本發(fā)明的有利效果
[0015]本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體是有優(yōu)勢的，因?yàn)槠渑c非肽基聚合物-胰島素綴合物和胰島素多聚體相比具有顯著大的流體力學(xué)體積和高的穩(wěn)定性。所以，皮下注入之后，本發(fā)明的多聚體在通過自然稀釋解離成單體之前具有大的體積，并且因此不發(fā)生其快速吸收入血流。所以，可一次給予大量的藥物。另外，因?yàn)槠渚哂芯徛怆x成單體的性質(zhì)，所以其可用于開發(fā)長效胰島素制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1(A)顯示陽離子交換層析(CEC)分離胰島素的結(jié)果，其中PEG(5k)連接至其B鏈的氨基末端，和圖1(B)顯示陽離子交換層析分離胰島素的結(jié)果，其中PEG(20k)連接至其B鏈的氨基末端；
[0017]圖2顯示通過Glu-C肽作圖比較人天然胰島素片段(上)和PEG-胰島素綴合物(下)的色譜圖檢查PEG附連位點(diǎn)的結(jié)果；
[0018]圖3顯示體積排阻色譜(SEC)測量PEG-胰島素綴合物和鈷PEG-胰島素六聚體的流體力學(xué)體積的結(jié)果，其中回歸線由標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫時間計(jì)算(從左上方6個白圈中的每一個:抑酶肽，6.5kDa ;核糖核酸酶，13.7kDa ;伴清蛋白，75kDa ;免疫球蛋白G, 150kDa ;鐵蛋白，443kDa ;甲狀腺球蛋白，669kDa);和
[0019]圖4顯示通過Dulbecoo’ s磷酸緩沖鹽水(DPBS)稀釋純化以檢查其解離成單體的鈷PEG (5K)-胰島素六聚體(▲)、鈷PEG (20k)-胰島素六聚體(實(shí)心)和鈷胰島素六聚體(.)的體積排阻色譜的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0020]一個方面中，本發(fā)明提供非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中綴合物與鈷離子絡(luò)合以形成多聚體。
[0021]如本文所使用，術(shù)語“非肽基聚合物-胰島素綴合物”指其中非肽基聚合物和胰島素經(jīng)共價鍵連接的綴合物。在本發(fā)明中，非肽基聚合物-胰島素綴合物用作組成非肽基聚合物-胰島素多聚體的單體。
[0022]優(yōu)選地，非肽基聚合物-胰島素綴合物可以是經(jīng)共價鍵通過連接非肽基聚合物與胰島素A鏈的氨基末端、胰島素B鏈的氨基末端或胰島素B鏈29位處的賴氨酸制備的綴合物，和更優(yōu)選地，是經(jīng)共價鍵通過連接非肽基聚合物與胰島素B鏈的氨基末端制備的綴合物。
[0023]如在本文中使用，術(shù)語“胰島素”是指響應(yīng)于血液中升高的葡萄糖水平由胰腺分泌的肽，以攝取肝臟、肌肉或脂肪組織中的葡萄糖并且將其轉(zhuǎn)變成糖原，和停止利用脂肪作為能量來源，并且因此控制血糖水平。該肽包括天然胰島素、天然胰島素激動劑、天然胰島素前體、胰島素衍生物、其片段及其變體。
[0024]術(shù)語“天然胰島素”是由胰腺分泌以促進(jìn)葡萄糖吸收并抑制脂肪分解并且因此起控制血糖水平作用的激素。在加工期間由稱為胰島素原的不參與調(diào)節(jié)血糖水平的前體形成胰島素。胰島素的氨基酸序列如下:
[0025]α 鏈:
[0026]Gly-1le-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-1le-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID N0.1)
[0027]β 鏈:
[0028]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID N0.2)
[0029]天然胰島素是通過經(jīng)兩個間-二硫鍵(inter-disulfide bond)連接A鏈和B鏈形成的異源二聚體，其中在A鏈6位處的半胱氨酸和在B鏈7位處的半胱氨酸，以及在A鏈20位處的半胱氨酸和在B鏈19位處的半胱氨酸分別形成二硫鍵。
[0030]術(shù)語“胰島素激動劑”是指結(jié)合至胰島素受體以顯示與胰島素相等的生物活性的化合物，其與胰島素的結(jié)構(gòu)不相關(guān)。
[0031]術(shù)語“胰島素變體”是與天然胰島素具有一個或更多個氨基酸序列不同的肽，并且指保持控制體內(nèi)血糖水平功能的肽。胰島素變體可通過在天然胰島素氨基酸序列一部分中取代、加成、缺失和修飾的任何一種或通過其組合制備。
[0032]術(shù)語“胰島素衍生物”是指與天然胰島素具有至少80%氨基酸序列同源性的肽，其氨基酸殘基上可具有一些被化學(xué)取代(例如，α -甲基化、α -羥基化)、缺失(例如，脫氨)或修飾(例如，N-甲基化)的基團(tuán)，并且具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能。
[0033]術(shù)語“胰島素片 段”是指在天然胰島素的N-末端或C-末端處添加或缺失一個或多個氨基酸的片段，其中可以添加非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，并且該片段具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能。
[0034]如在本文中使用，術(shù)語“非肽基聚合物”是指包括通過除肽鍵以外的任何共價鍵彼此連接的兩個或更多個重復(fù)單元的生物相容性聚合物。該非肽基聚合物的分子量可在1-1OOkDa的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選為l_20kDa。
[0035]另外，非肽基聚合物可具有能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合的單末端反應(yīng)基團(tuán)或雙末端反應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選地，反應(yīng)基團(tuán)可選自:乙醛(aldehyde)、丙醛、丁醛、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物。具體地，當(dāng)非肽基聚合物在其兩端均具有反應(yīng)性醛基時，其在兩端與胰島素和免疫球蛋白連接是有效的，其中具有最小的非特異性反應(yīng)。通過醛鍵(aldehyde bond)的還原性烷基化生成的最終產(chǎn)物比通過酰胺鍵連接的產(chǎn)物穩(wěn)定得多。醛反應(yīng)基團(tuán)在低PH下選擇性地結(jié)合至N-末端，并且在高pH諸如pH9.0下結(jié)合至賴氨酸殘基以形成共價鍵。
[0036]優(yōu)選地，在本發(fā)明中有用的非肽基聚合物可以選自:生物可降解聚合物、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸及其組合，并且更優(yōu)選地生物可降解聚合物可以是聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，且還要更優(yōu)選地是聚乙二醇(PEG)。另外，本領(lǐng)域中已知的其衍生物和通過本領(lǐng)域中的已知方法容易制備的衍生物可以包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，當(dāng)使用L- Y -谷氨酸酯-附連的非肽基聚合物時，由于L- Y -谷氨酸酯之間的相互作用可有利地發(fā)生聚合胰島素多聚體形成。
[0037]如本文所使用，術(shù)語“非肽基聚合物-胰島素多聚體”或“鈷非肽基聚合物-胰島素多聚體”是多聚體，其中非肽基聚合物-胰島素綴合物與鈷離子絡(luò)合，并且包括通過鈷離子與一分子的非肽基聚合物-胰島素多聚體配位形成。
[0038]優(yōu)選地，非肽基聚合物-胰島素多聚體可以是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體，和優(yōu)選地是非肽基聚合物-胰島素六聚體。
[0039]優(yōu)選地，非肽基聚合物-胰`島素多聚體可以是由三價鈷陽離子形成的多聚體。非肽基聚合物-胰島素綴合物的非肽基聚合物-胰島素多聚體制劑通過使用三價鈷陽離子(Co(III))作為配位金屬離子形成。更優(yōu)選地，綴合物與三價鈷陽離子絡(luò)合以形成非肽基聚合物-胰島素六聚體，其中三價鈷陽離子形成BlOHis的八面體配位(胰島素B鏈10位處的組氨酸)。
[0040]在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，非肽基聚合物-胰島素多聚體之一——非肽基聚合物-胰島素六聚體包括通過兩個或更多個三價鈷離子與一分子的胰島素多聚體配位形成的化合物。具有環(huán)形橫截面的圓柱狀胰島素六聚體通過二價鋅離子的配位鍵和天然的三個胰島素二聚體之間的疏水相互作用形成。在一個胰島素六聚體中，存在兩個金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，并且源自三個二聚體的三個組氨酸殘基(在B鏈的10位)涉及它們的每一個。非肽基聚合物胰島素六聚體的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的兩個三價鈷離子穩(wěn)定六聚體的結(jié)構(gòu)。
[0041]本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體具有比非肽基聚合物-胰島素綴合物和鈷胰島素多聚體更大的流體力學(xué)體積，并且具有緩慢解離成單體的性質(zhì)。因此，其顯示卓越的體內(nèi)效力持久性和穩(wěn)定性，從而可用于治療糖尿病。
[0042]在本發(fā)明的一種實(shí)例中，通過將PEG附連至胰島素B鏈的氨基末端制備單-聚乙二醇化非肽基聚合物-胰島素綴合物(實(shí)施例1和2)，并且證實(shí)該綴合物的體外活性(實(shí)施例3)。
[0043]進(jìn)一步，當(dāng)使用綴合物和鈷離子制備六聚體(鈷PEG-胰島素六聚體)時，其流體力學(xué)體積大大增加(實(shí)施例4和5)。在0.04 μ M的低濃度下，鈷PEG-胰島素六聚體顯示70%或更高的六聚體比率,而在該低濃度下,鈷胰島素六聚體顯示20%的六聚體比率。因此，鈷PEG-胰島素六聚體是穩(wěn)定的，因?yàn)槠湓诘蜐舛认驴芍苽涑闪垠w制劑(實(shí)施例6)。另外，鈷PEG-胰島素六聚體顯示比商業(yè)上可獲得的長效胰島素比如由地特胰島素構(gòu)成的諾和平(Levemir)和由在胰島素的B鏈中具有取代和插入的甘精胰島素六聚體構(gòu)成的來得時(Lantus)更短的洗脫時間和更低的解離系數(shù)，這指示皮下注入之后，六聚體比商業(yè)胰島素具有更大的體積和穩(wěn)定性(實(shí)施例7)。這些結(jié)果支持本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體具有卓越的體內(nèi)效力持久性和穩(wěn)定性，并且因此多聚體或包括該多聚體的組合物可用于治療糖尿病。
[0044]在另一方面中，本發(fā)明提供本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體的制備方法，包括使非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應(yīng)以產(chǎn)生非肽基聚合物-胰島素多聚體的步驟。
[0045]在本發(fā)明中，制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應(yīng)，從而制備根據(jù)本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體，其中可通過共價連接胰島素與具有選自醛、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物的反應(yīng)性基團(tuán)的非肽基聚合物和從反應(yīng)混合物分離非肽基聚合物-胰島素綴合物制備非肽基聚合物-胰島素綴合物。
[0046]非肽基聚合物的反應(yīng)性基團(tuán)中的琥珀酰亞胺衍生物可以是丙酸琥珀酰亞胺酯、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基羧甲基或琥珀酰亞胺基碳酸酯。
[0047]鈷離子與非肽基聚 合物-胰島素綴合物的摩爾比可以是0.1至I。
[0048]可非限制性地使用任何溶液，只要該溶液包含鈷離子。優(yōu)選地，溶液可包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽、其水合物，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑，或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。更優(yōu)選地，溶液可包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑，通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑，或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。
[0049]解離成二價鈷離子的鹽可以是氯化鈷(II) (CoCl2)，并且解離成三價鈷離子的鹽可以是氯化鈷(III) (CoCl3)。
[0050]另外,本發(fā)明有用的氧化劑可包括比如過氧化氫的物質(zhì),其具有將水溶液中和非肽基聚合物-胰島素多聚體中的二價鈷離子轉(zhuǎn)化成三價鈷離子的氧化力(oxidizingpower)。優(yōu)選地,氧化劑與二價鈷離子的摩爾比可以是0.5至5。
[0051]優(yōu)選地，反應(yīng)可在pH5_9的緩沖液中進(jìn)行，和更優(yōu)選地，在pH7.5-8.5的緩沖液中進(jìn)行。
[0052]在仍另一方面中，本發(fā)明提供預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，包括本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體作為有效成分。
[0053]進(jìn)一步，在仍另一方面中，本發(fā)明提供預(yù)防或治療糖尿病的方法，其包括向具有糖尿病或懷疑具有糖尿病的對象施用本發(fā)明的藥物組合物。
[0054]如在本文中使用，術(shù)語“糖尿病”是指由胰島素的分泌或功能異常導(dǎo)致的代謝性疾病。向?qū)ο笫┯帽景l(fā)明的組合物，以控制血糖水平，從而治療糖尿病。
[0055]如在本文中使用，術(shù)語“預(yù)防”是指通過施用該組合物抑制糖尿病的癥狀或阻止糖尿病的發(fā)生的所有行為，并且術(shù)語“治療”是指通過施用該組合物將糖尿病的癥狀變好或有利地改變的所有行為。治療糖尿病可以應(yīng)用于可能患有糖尿病的任何哺乳動物，并且其實(shí)例包括人和靈長類以及家畜諸如牛、豬、綿羊、馬、狗和貓，而沒有限制，并且優(yōu)選是人。
[0056]如在本文中使用，術(shù)語“施用”是指將預(yù)定量的物質(zhì)通過某些合適方法引入患者。非肽基聚合物-胰島素多聚體可以經(jīng)由任意常用途徑施用，只要其能夠到達(dá)期望的組織?？紤]多種施用模式,包括腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、口服、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)，但本發(fā)明不限于這些例舉的施用模式。然而，由于肽在口服施用后被消化，用于口服施用的組合物的活性成分應(yīng)當(dāng)被包衣或配制以保護(hù)免于在胃中降解。優(yōu)選地，多聚體可以以可注射形式施用。另外，藥物組合物可以使用能夠?qū)⒒钚猿煞州斔椭涟屑?xì)胞中的某些設(shè)備進(jìn)行施用。
[0057]本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體在低濃度范圍中保持其形式而不解離成單體，從而顯示卓越的作為藥物組合物的存儲性(圖4)。所以，本發(fā)明的藥物組合物可包括本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體，其濃度為0.0111|1至10(^1，優(yōu)選地0.111皿至100 μ Μ，更優(yōu)選地I μ M至100 μ Μ，和非常更優(yōu)選地10 μ M至100 μ Μ。
[0058]本發(fā)明的藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體。對于口服施用，藥學(xué)上可接受的載體可以包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、著色劑和風(fēng)味劑。對于可注射制劑，藥學(xué)上可接受的載體可以包括緩沖劑、防腐劑、止痛劑、增溶劑、等滲劑和穩(wěn)定劑。對于局部施用的制劑，藥學(xué)上可接受的載體可以包括基質(zhì)(base)、賦形劑、潤滑劑和防腐劑。本發(fā)明的藥物組合物可以與上述的藥學(xué)上可接受的載體組合配制成多種劑型。例如，對于口服施用，藥物組合物可以被配制成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或薄片(wafer)。對于可注射制劑，藥物組合物可以被配制成單位劑型，諸如多劑量容器或作為單劑量劑型的安瓿。藥物組合物也可以被配制成為溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊和長效制劑。
[0059]另一方面，適合于藥物制劑的載體、賦形劑和稀釋劑的實(shí)例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。另外，藥物制劑可以進(jìn)一步包括填料、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、風(fēng)味劑和消毒劑。
[0060]可以以藥學(xué)上有效量施用本發(fā)明的組合物。如本文所使用，術(shù)語“藥學(xué)上有效量”指足以用于治療疾病的量，其與適于醫(yī)學(xué)治療的合理益處/風(fēng)險比相稱?？苫趯ο蠛图膊〉膰?yán)重性、年齡、性別、藥物活性、藥物敏感性、施用時間、施用途徑、排泄速率、治療持續(xù)時間、同時使用的藥物和藥學(xué)上已知的其他因素確定本組合物的有效劑量。
[0061]根據(jù)本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體比非肽基聚合物-胰島素綴合物和胰島素多聚體具有更卓越的體內(nèi)效力持久性和穩(wěn)定性，從而可用于預(yù)防和治療糖尿病。因此，施用包括其的藥物組合物促進(jìn)疾病的預(yù)防和治療。
[0062]在仍另一方面中，本發(fā)明提供用于制備本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒，其包括通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物；和包含鈷離子的溶液，其中該溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑；通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑；或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽，或其水合物。
[0063]在用于制備本發(fā)明的非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒中，鹽或其水合物和氧化劑可存儲在單個容器中或分別存儲在各自的容器中。
[0064]進(jìn)一步，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括描述最佳反應(yīng)條件的說明書和藥學(xué)上可接受的載體。說明書可包括指南，比如小冊子或宣傳材料、貼在試劑盒上的標(biāo)簽和在包含試劑盒的包裝表面上的說明。另外，指南可包括通過電子介質(zhì)比如因特網(wǎng)發(fā)布或提供的信息。
[0065]本發(fā)明的模式
[0066]下文中，將參照下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅用于例證性目的，并且本發(fā)明不意欲由這些實(shí)施例限制。
[0067]實(shí)施例1.合成和分離PEG-胰島素綴合物
[0068]為了連接分子量為5k或20k的mPEG-醛(單甲氧基聚乙二醇-醛)與人天然胰島素B鏈的氨基末端，將胰島素和mPEG-醛以1:2的摩爾比與濃度為2mg/mL的胰島素在4°C下反應(yīng)12h。此時，反應(yīng)在pH6.0下的IOOmM檸檬酸鈉緩沖液中進(jìn)行，并且向其添加20mM氰基硼氫化鈉(SCB)作為還原劑。使用填充至HR柱(GE Healthcare)的S0URCE15S(GEHealthcare)樹脂從反應(yīng)混合物分離在B鏈氨基末端處單-聚乙二醇化的胰島素。如圖1中顯示，在主峰處觀察到PEG (5k或20k)_胰島素綴合物(圖1)。
[0069]柱:填充在HR 柱(GE Healthcare)中的 Sourcel5S 介質(zhì)
[0070]流速:1.8mL/min
[0071]梯度:A0—50%100min B (A:20mM檸檬酸鈉(檸檬酸鈉)ρΗ3.0+60% 乙醇，B:Α+0.5ΜKCl)
[0072]實(shí)施例2.PEG-胰島素綴合物的肽作圖
[0073]使用Glu_C(Roche Applied Science)切割PEG-胰島素綴合物或人天然胰島素。反應(yīng)在pH8.2下的20mM HEPES緩沖液中和25°C條件下進(jìn)行12h。通過反相高效液相色譜分析反應(yīng)物。在 Agilentl200Series 模塊上操作 Jupiter5 微米 C18 柱(Phenomenex, Inc.)。如圖2中顯示，發(fā)現(xiàn)大部分PEG連接至胰島素B鏈的氨基末端(圖2)。
[0074]柱:Jupiter5微米 C18 (Phenomenex, Inc.)
[0075]流速:lmL/min
[0076]梯度:A10— 30%65min B, A30 — 40%5min B (A:20mM 硫酸鈉 ρΗ2.0，B:A+100% 乙
腈)
[0077]實(shí)施例3.體外效力檢測
[0078]為了將鼠成纖維細(xì)胞3T3-L1分化成脂肪細(xì)胞，在包含含有地塞米松、IBMX和胰島素的10%FBS/DMEM培養(yǎng)基的48-孔板中以1.0X IO5每孔的細(xì)胞密度接種細(xì)胞。用DPBS沖洗分化的細(xì)胞三次，并且在無血清的DMEM中培養(yǎng)4h。在合適濃度范圍內(nèi)包含糖的DMEM中準(zhǔn)備人天然胰島素、PEG (5k)_胰島素和PEG (20k)_胰島素，并且然后添加至包含分化的脂肪細(xì)胞的48-孔板。在37°C下培養(yǎng)24h之后,使用D-葡萄糖試驗(yàn)試劑盒(Megazyme)測量培養(yǎng)基中殘留的糖濃度，并且計(jì)算EC5tl值并且顯示在表1中。
[0079]表1[0080][表1]
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種非肽基聚合物-胰島素多聚體，其包括兩個或更多個通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物，其中所述綴合物與鈷離子絡(luò)合以形成多聚體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多聚體，其中通過經(jīng)共價鍵連接所述非肽基聚合物與胰島素A鏈的氨基末端、B鏈的氨基末端或B鏈29位處的賴氨酸制備所述非肽基聚合物-胰島素綴合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述胰島素是天然胰島素、通過所述天然胰島素的氨基酸序列的取代、加成、缺失、修飾或其組合中制備的胰島素變體、胰島素衍生物或其片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多聚體，其中所述非肽基聚合物選自生物可降解聚合物、月旨質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸和其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多聚體，其中所述生物可降解聚合物選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸和聚乳酸-乙醇酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多聚體，其中所述生物可降解聚合物是聚乙二醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多聚體，其中共價結(jié)合所述胰島素的所述非肽基聚合物的反應(yīng)性基團(tuán)選自乙醛、丙醛、丁醛、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多聚體，其中所述非肽基聚合物-胰島素綴合物經(jīng)三價鈷陽離子形成多聚體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多聚體，其中所述非肽基聚合物-胰島素多聚體是非肽基聚合物-胰島素六聚體。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的非肽基聚合物-胰島素多聚體的制備方法，包括使非肽基聚合物-胰島素綴合物與包含鈷離子的溶液反應(yīng)以產(chǎn)生非肽基聚合物-胰島素多聚體的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其中所述溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑；通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑；或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其中解離成二價鈷離子的所述鹽是氯化鈷(II)(CoCl2),和解離成三價鈷離子的所述鹽是氯化鈷(III) (CoCl3)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其中所述氧化劑與所述二價鈷離子的摩爾比是0.5 至 5。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其中所述鈷離子與所述非肽基聚合物-胰島素綴合物的摩爾比是0.1至I。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其中所述反應(yīng)在PH5-9的緩沖液中進(jìn)行。
16.預(yù)防或治療糖尿病的藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的非肽基聚合物-胰島素多聚體作為有效成分。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述非肽基聚合物-胰島素多聚體以0.01 μ M至100 μ M的濃度包括。
18.預(yù)防或治療糖尿病的方法，包括向具有糖尿病或懷疑具有糖尿病的對象施用權(quán)利要求16所述的藥物組合物。
19.制備權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的非肽基聚合物-胰島素多聚體的試劑盒，其包括通過經(jīng)共價鍵連接非肽基聚合物和胰島素制備的非肽基聚合物-胰島素綴合物；和包含鈷離子的溶液，其中所述溶液包含通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽和氧化劑；通過在水溶液中溶劑化解離成二價鈷離子的鹽的水合物和氧化劑；或通過在水溶液中溶劑化解離成三價鈷離子的鹽或其水合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述鹽或所述其水合物和所述氧化劑分別存儲在各自 的容器中。
【文檔編號】A61K38/28GK103747806SQ201280038302
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月2日
【發(fā)明者】林圣仁, 張明賢, 金大振, 鄭圣燁, 權(quán)世昌 申請人:韓美科學(xué)株式會社