專利名稱：長(zhǎng)效促胰島肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾的促胰島肽。特別是，本發(fā)明涉及對(duì)糖尿病和其他促胰島肽有關(guān)疾病的治療、胃腸功能以及與胰高血糖素水平有關(guān)的活動(dòng)具有長(zhǎng)效作用的修飾胰高血糖素樣肽和exendin肽。
所以需要修飾GLP-1、exendin 3、exendin 4和其他促胰島肽在體內(nèi)提供長(zhǎng)效作用，同時(shí)保持其低毒性和治療功效。
本發(fā)明涉及修飾的促胰島肽，其含有與血液化合物上氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的反應(yīng)性基團(tuán)。
本發(fā)明涉及含有GLP-1及其衍生物的修飾片段、尤其是GLP-1(7-36)酰胺的促胰島素。本發(fā)明又涉及所述化合物的治療用途，尤其是修飾GLP-1(7-36)酰胺在治療成年型糖尿病(II型糖尿病)中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及修飾的Exendin 3和Exendin 4片段和此類化合物的治療用途。
特別是，本發(fā)明涉及GLP-1(1-36)Lys37(ε-MPA)-NH2；GLP-1(1-36)-Lys37(ε-AAEA-AEEA-MPA)-NH2；GLP1(7-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2；GLP-1(7-36)-Lys37-(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2；D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2；Exendin-4(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2；Exendin-4(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2；Exendin-3(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2；Exendin-3(1-39)-Lys40(-AEEA-AEEA-MPA)-NH2；Lys26(ε-MPA)GLP-1(7-36)-NH2；GLP-1(7-36)-EDA-MPA和Exendin-4(1-39)-EDA-MPA。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有所述促胰島肽的衍生物的組合物和該組合物在治療人體糖尿病中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及提高胰島素的表達(dá)的方法，其包括給哺乳動(dòng)物胰腺β型胰島細(xì)胞提供有效量的上述公開的經(jīng)修飾的促胰島肽。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種治療成熟期起始的糖尿病的方法，該方法包括給需要治療的患者施用有效量的上述促胰島肽。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及利用本發(fā)明的經(jīng)修飾的促胰島肽對(duì)其他促胰島肽相關(guān)性疾病和病癥的治療。發(fā)明詳述定義為了保證完全理解本發(fā)明，提供下列定義促胰島肽促胰島肽(ITPs)是具有促胰島活性的肽類化合物。顯然，促胰島肽刺激激素胰島素的合成或表達(dá)或引發(fā)這種刺激。此類肽包括肽如胰高血糖素樣肽、exendin 3和exendin 4以及其他具有促胰島活性的肽的前體、類似物、片段。
胰高血糖素樣肽胰高血糖素樣肽(GLP)和GLP衍生物是腸激素，其一般在高血糖癥中刺激胰島素的分泌，抑制胰高血糖素分泌，促進(jìn)胰島素(原)的生物合成并且減慢胃排空和胃酸分泌。一些GLP和GLP衍生物促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖，但不促進(jìn)胰島素表達(dá)，如美國(guó)專利No.5,574,008所述，其在此引入作為參考。
Exendin 3和Exendin 4肽Exendin 3和exendin 4肽和肽衍生物是39個(gè)氨基酸的肽，其約53％與GLP-1同源并具有促胰島活性。
反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)性基團(tuán)是能夠形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。此類反應(yīng)試劑與所述促胰島肽偶聯(lián)或鍵合形成修飾的促胰島肽。反應(yīng)性基團(tuán)一般在含水環(huán)境中穩(wěn)定，而且通常為羧基、磷?；蜻m當(dāng)?；蛘呤酋セ蚧旌纤狒?，或亞胺酸酯(鹽)，由此能夠與位于流動(dòng)血液組分的靶位點(diǎn)上的官能團(tuán)如氨基、羥基或巰基形成共價(jià)鍵。在多數(shù)部分，酯包括酚類化合物，或是硫醇酯、烷基酯、磷酸酯等。反應(yīng)性基團(tuán)包括琥珀酰亞胺基和馬來酰亞胺基。
官能團(tuán)官能團(tuán)是血液組分上的基團(tuán)，其與經(jīng)修飾的促胰島肽上的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵。官能團(tuán)包括鍵合酯反應(yīng)體的羥基；與馬來酰胺和馬來酰亞胺基反應(yīng)的巰基、亞胺酸酯和硫代酸酯基；與反應(yīng)體上的羧基、磷?；蝓；I合的氨基；和與氨基鍵合的羧基。所述血液組分包括血液蛋白質(zhì)。
連接基團(tuán)連接基團(tuán)是將反應(yīng)性基團(tuán)鍵合或相連于ITP的化學(xué)基團(tuán)。連接基團(tuán)可以包括一個(gè)或多個(gè)烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基等；烷氧基，鏈烯基，炔基或被烷基取代的氨基，環(huán)烷基，多環(huán)基團(tuán)，芳基，多芳基，取代芳基，雜環(huán)基和取代雜環(huán)基。連接基團(tuán)也可以含有聚乙氧基氨基酸，例如AEA((2-氨基)乙氧基乙酸)或優(yōu)選的連接基團(tuán)AEEA([2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸)。
血液組分血液組分可以是固定或者流動(dòng)的。固定血液組分是非流動(dòng)血液組分并包括組織、膜受體、間質(zhì)蛋白、纖維蛋白、膠原、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及其相關(guān)膜和膜受體、軀體體細(xì)胞、骨骼肌和平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元組成、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞以及所有機(jī)體組織，尤其是與循環(huán)和淋巴系統(tǒng)有關(guān)的組織。流動(dòng)血液組分是在任意長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)不具有固定位點(diǎn)的血液組分，一般不超過5分鐘，更常常是1分鐘。這些血液組分與膜無關(guān)并且長(zhǎng)時(shí)間存在于血液內(nèi)，并且以至少0.1μg/ml的最低濃度存在。流動(dòng)血液組分包括血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白和免疫球蛋白，如IgM和IgG。流動(dòng)血液組分的半衰期至少約12小時(shí)。
保護(hù)基保護(hù)基是用于保護(hù)肽衍生物不發(fā)生自身反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。多種保護(hù)基公開在本文和U.S.5,493,007(在此引入作為參考)中。此類保護(hù)基包括乙?；?、芴基甲氧基羰基(FMOC)、叔丁氧基羰基(BOC)、芐氧基羰基(CBZ)等。具體的保護(hù)氨基酸列在表1中。
敏感官能團(tuán)-敏感官能團(tuán)是指代表ITP肽上潛在反應(yīng)位點(diǎn)的原子的基團(tuán)。如果存在，敏感官能團(tuán)可以選擇為用于連接反應(yīng)性基團(tuán)修飾的附著點(diǎn)。敏感官能團(tuán)包括但不限于羧基、氨基、巰基和羥基。
經(jīng)修飾的肽-經(jīng)修飾ITP是通過附著反應(yīng)性基團(tuán)被修飾且能夠通過與血液組分結(jié)合形成肽酶穩(wěn)定化肽的肽。反應(yīng)性基團(tuán)可以通過連接基團(tuán)附著于治療性肽，或選擇性地不采用連接基團(tuán)附著于治療性肽。也可以考慮把一種或多種附加氨基酸引入治療性肽來促進(jìn)反應(yīng)性基團(tuán)的附著。經(jīng)修飾的肽可以體內(nèi)給藥使其在體內(nèi)發(fā)生與血液組分的結(jié)合，或者首先使它們與體外血液組分結(jié)合，所得肽酶穩(wěn)定化肽(如下定義)體內(nèi)給藥。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的治療性肽”和“經(jīng)修飾的肽”在本申請(qǐng)中可以互換使用。
肽酶穩(wěn)定化ITP-肽酶穩(wěn)定化ITP是經(jīng)過經(jīng)修飾的肽的反應(yīng)性基團(tuán)和血液組分的官能團(tuán)之間的共價(jià)鍵、在有或沒有連接基團(tuán)下與血液組分結(jié)合的經(jīng)修飾的肽。肽酶穩(wěn)定化肽在體內(nèi)肽酶的存在下比非穩(wěn)定化肽更加穩(wěn)定。肽酶穩(wěn)定化治療性肽一般比相同序列的非穩(wěn)定化肽具有提高至少10-50％的半衰期。通過對(duì)比血清或血液中未修飾ITP的半衰期和血清或血液中經(jīng)修飾相應(yīng)治療性肽的半衰期可以測(cè)定肽酶穩(wěn)定性。通過在經(jīng)修飾和未經(jīng)修飾的肽的給藥后采集血清或血液樣本并測(cè)定肽的活性可以測(cè)出半衰期。除了測(cè)定活性以外，也可以利用HPLC和質(zhì)譜測(cè)量ITP的長(zhǎng)度。發(fā)明詳述鑒于上述定義，本發(fā)明的焦點(diǎn)在于通過選擇性結(jié)合在蛋白載體上來修飾促胰島肽從而提高生物利用度，延長(zhǎng)半衰期和分布，但不改變其顯著治療特性。本發(fā)明選擇的載體(但不限于)是與用馬來酰亞胺基團(tuán)衍生化的促胰島肽提供的自由巰基結(jié)合的白蛋白。
1.促胰島肽A.GLP-1和其衍生物已知合成的激素胰高血糖素是一種大分子量前體分子，其隨后在蛋白水解下裂解為三種肽胰高血糖素、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)和胰高血糖素樣肽2(GLP-2)。GLP-1在其未加工形式中具有37個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO1.所示。未加工GLP-1尤其無法介導(dǎo)胰島素生物合成的誘導(dǎo)。然而，未加工GLP-1肽自然地轉(zhuǎn)化為具有GLP-1的氨基酸7-37(″GLP-1(7-37)″)的31個(gè)氨基酸的長(zhǎng)肽(7-37肽)SEQ ID NO2。GLP-1(7-37)也可以經(jīng)過附加的加工，通過蛋白水解除去C末端的甘氨酸以生成GLP-1(7-36)，其主要存在形式為其C末端殘基精氨酸為酰胺化形式的精氨酰胺，即GLP-1(7-36)酰胺。這種加工發(fā)生在腸內(nèi)和胰臟中的較小范圍內(nèi)，得到具有GLP-1(7-37)的促胰島活性的多肽。
如果化合物能夠刺激激素胰島素的合成或表達(dá)或引起這種刺激，則該化合物被視作具有“促胰島活性”。GLP-1(7-37)和GLP-1(736)的激素活性表現(xiàn)出對(duì)胰腺β細(xì)胞具有特異性，在此處，它表現(xiàn)為能夠誘導(dǎo)胰島素的生物合成。本發(fā)明的胰高血糖素樣肽激素可以有助于對(duì)成年型糖尿病的發(fā)病機(jī)理的研究，該疾病是一種以高血糖以特征的病癥，其中胰島素分泌的動(dòng)力學(xué)異常。此外，胰高血糖素樣肽適用于該疾病的治療和處理，以及高血糖癥的治療和處理。
選自已測(cè)序的人GLP-1的氨基酸序列的肽組成部分(片段)構(gòu)成了包含本發(fā)明在內(nèi)的研究的起點(diǎn)。可互換術(shù)語(yǔ)“肽片段”和“肽組成部分”是指包括由天然氨基酸序列衍生的合成和天然氨基酸序列。
若干研究人員報(bào)導(dǎo)了GLP-1的氨基酸序列(Lopez，L.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 805485-5489(1983)；Bell，G.I.等，Nature 302716-718(1983)；Heinrich，G.等，Endocrinol.1152176-2181(1984))。前胰高血糖素原(preproglucagon)mRNA結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)氨基酸序列是已知的。前體基因產(chǎn)物，胰高血糖素原成為胰高血糖素和兩種的蛋白水解加工業(yè)已定性。在此所用的表示GLP-1(1-37)是指具有從第1(N-末端)至第37(C-末端)全部氨基酸的GLP-1多肽。同樣地，GLP-1(7-37)是指具有從第7(N-末端)至第37(C-末端)全部氨基酸的GLP-1多肽。同樣地，GLP-1(7-36)是指具有從第7(N-末端)至第36(C-末端)全部氨基酸的GLP-1多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-1(7-36)及其肽片段是通過如下所述的常規(guī)方式合成，例如通過Merrifield，J.M.(Chem.Soc.852149(1962))和Stewart & Young(Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman，SanFrancisco，1969)，pages 27-66)所述的公知固相肽合成，這些文獻(xiàn)在此引入作為參考。然而，也可以利用如蛋白水解酶通過將天然氨基酸序列片段化獲得胰高血糖素多肽的片段或GLP-1的片段。此外，可以利用重組DNA技術(shù)獲得所需的胰高血糖素原肽或GLP-1的片段，如Maniatis，T.等，Molecular BiologyA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York(1982)所述，其在此引入作為參考。
本發(fā)明包括由諸如GLP-1(1-37)和GLP-1(7-36)的GLP-1衍生的肽。如果可以通過片段化天然序列獲得，或者如果可以基于對(duì)編碼該序列的天然氨基酸的序列或遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)的認(rèn)識(shí)合成得到，這種肽被稱作“由天然氨基酸序列衍生”。
屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是那些被稱作GLP-1衍生物的分子，例如GLP-1(137)和尤其是GLP-1(7-36)。所述“衍生物”具有以下特征(1)其分享GLP-1的實(shí)質(zhì)同源性或相似大小的GLP-1片段；(2)能夠起促胰島素作用和(3)利用至少一種此處所提供的試驗(yàn)，該衍生物具有或者(i)比GLP-1的促胰島活性高的促胰島素活性，或更優(yōu)選，(ii)即使當(dāng)衍生物以10-10M的濃度存在時(shí)也可以檢測(cè)到促胰島活性，或最優(yōu)選，(iii)即使當(dāng)衍生物以10-11M的濃度存在時(shí)促胰島活性也可以檢測(cè)到。
如果GLP-1衍生物的氨基酸序列至少80％、更優(yōu)選至少90％和最優(yōu)選至少95％與GLP-1(1-37)的氨基酸序列相同，該GLP-1的衍生物被稱作分享GLP-1的“實(shí)質(zhì)同源性”。
本發(fā)明的衍生物包括GLP-1片段，其除了含有基本與天然GLP-1肽同源的序列之外，可以在其氨基和/或其羧基末端含有一個(gè)或多個(gè)附加氨基酸。所以，本發(fā)明涉及可以含有一個(gè)或多個(gè)在天然GLP-1序列中可能不存在的氨基酸的GLP-1的多肽片段。條件是該多肽具有比GLP-1高的促胰島活性。附加的氨基酸可以是D-氨基酸或L-氨基酸或它們的結(jié)合。
本發(fā)明也包括GLP-1片段，其雖然含有與天然GLP-1肽基本上同源的序列，但可以在其氨基和/或其羧基末端缺少一個(gè)或多個(gè)天然GLP-1發(fā)現(xiàn)的附加氨基酸。所以，本發(fā)明涉及可以缺少一個(gè)或多個(gè)正常存在于天然GLP-1序列中的氨基酸的GLP-1的多肽片段，條件是該多肽具有超過GLP-1的促胰島活性。
本發(fā)明還包括上述片段的顯著或細(xì)微的變體，其具有不重要的氨基酸替代(并因此具有不同于天然序列的氨基酸序列)，條件是該變體具有與上述GLP-1衍生物基本相同的促胰島活性。顯著或細(xì)微的替代的例子包括一個(gè)堿性殘基替代另一個(gè)(即Arg替代Lys)、一個(gè)疏水性殘基替代另一個(gè)(即Leu替代Ile)或一個(gè)芳族殘基替代另一個(gè)(即Phe替代Tyr)等。
除了那些具有促胰島活性的GLP-1衍生物以外，那些促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖但不刺激胰島素表達(dá)或分泌的GLP-1衍生物也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類GLP-1衍生物描述于美國(guó)專利No.5,574,008。
可以用于本發(fā)明的促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖但不刺激胰島素表達(dá)或分泌的GLP-1衍生物包括R1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa-Gly-Arg-R2(SEQ ID NO3)其中R1選自a)H2N；b)H2N-Ser；c)H2N-Val-Ser；d)H2N-Asp-Val-Ser；e)H2N-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO4)；f)H2N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO5)；g)H2N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO6)；h)H2N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQID NO7)；i)H2N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO8)；j)H2N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO9)；或k)H2N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO10)。在所述肽中，X選自Lys或Arg，R2選自NH2、OH、Gly-NH2或Gly-OH。這些肽是不具有促胰島活性但可有效治療糖尿病和高血GLP-1糖癥的C-末端片段，如US專利No.5,574,008所述。
B.Exendin 3和Exendin 4肽Exendin 3和Exendin 4是與GLP-1約有53％同源性且發(fā)現(xiàn)用作促胰島劑的39個(gè)氨基酸肽(在第2和3殘基處不同)。
Exendin-3[SEQ ID No11]序列是HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS，和Exendin-4[SEQ ID No12]序列是HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS。
本發(fā)明還包括exendin-4的促胰島片段，其含有氨基酸序列Exendin-4(1-31)[SEQ ID No13]HGEGTFTSDLSKQMEEAVR LFIEWLKNGGPY和Exendin4(1-31)[SEQ ID No14]HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY。
本發(fā)明也包括exendin-4的抑制片段，其包含氨基酸序列Exendin-4(9-39)[SEQ ID No15]DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS實(shí)施例中提出的其它促胰島肽如SEQ ID NO16-22所示。
本發(fā)明包括可由天然exendin 3和exendin 4肽衍生的肽。若可以通過片段化天然序列獲得，或者若可以基于對(duì)編碼該序列的天然氨基酸序列或遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)的認(rèn)識(shí)合成得到，這種肽被稱作“可由天然氨基酸序列衍生”。
屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是那些被稱作exendin 3和exendin 4的“衍生物”的分子。此類“衍生物”具有下列特征(1)其分享exendin 3和exendin 4的實(shí)質(zhì)同源性或相似大小的GLP-1片段；(2)能夠起促胰島素作用和(3)利用至少一種此處所提供的試驗(yàn)，該衍生物具有或者(i)比exendin3或exendin4的促胰島活性高的促胰島素活性，或更優(yōu)選，(ii)即使當(dāng)衍生物以10-10M的濃度存在時(shí)也可以檢測(cè)到促胰島活性，或最優(yōu)選，(iii)即使當(dāng)衍生物以10-11M的濃度存在時(shí)促胰島活性也可以檢測(cè)到。
如果衍生物的氨基酸序列為至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，與exendin 3或4或具有和衍生物同樣數(shù)目的氨基酸殘基的exendin 3或4的片段的氨基酸序列相同，該exendin 3和exendin 4的衍生物被稱作分享exendin 3和exendin 4的“實(shí)質(zhì)同源性”。
本發(fā)明的衍生物包括exendin 3或exendin 4片段，其除了含有基本與天然exendin 3或exendin 4肽同源的序列之外，可以在其氨基和/或其羧基末端含有一個(gè)或多個(gè)附加氨基酸。所以，本發(fā)明涉及可以含有一個(gè)或多個(gè)在天然exendin 3或exendin 4序列中可能不存在的氨基酸的exendin 3和exendin 4的多肽片段，條件是該多肽具有比exendin 3或exendin 4高的促胰島活性。
同樣地，本發(fā)明包括exendin 3或exendin 4片段，其雖然含有與天然exendin 3或exendin 4肽基本上同源的序列，但可以在其氨基和/或其羧基末端缺少一個(gè)或多個(gè)在天然exendin 3或exendin 4肽上發(fā)現(xiàn)的附加氨基酸。所以，本發(fā)明涉及可以缺少一個(gè)或多個(gè)正常存在于天然exendin 3或exendin 4序列中的氨基酸的exendin 3或exendin 4的多肽片段，條件是該多肽具有超過exendin 3或exendin 4的促胰島活性。
本發(fā)明還包括上述片段的顯著或細(xì)微的變體，其具有不重要的氨基酸替代(并因此具有不同于天然序列的氨基酸序列)，條件是該變體具有與上述exendin 3或exendin 4衍生物基本相同的促胰島活性。顯著或細(xì)微的替代的例子包括一個(gè)堿性殘基替代另一個(gè)(即Arg替代Lys)、一個(gè)疏水性殘基替代另一個(gè)(即Leu替代Ile)或一個(gè)芳族族殘基替代另一個(gè)(即Phe代替Tyr)等。
2.修飾的促胰島肽本發(fā)明涉及修飾的促胰島肽及其衍生物。本發(fā)明的經(jīng)修飾的促胰島肽包括反應(yīng)性基團(tuán)，其可以與血液組分上的有效反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵。本發(fā)明也涉及上述修飾、上述與血液組分的結(jié)合及其應(yīng)用方法。這些方法包括延長(zhǎng)經(jīng)修飾的促胰島肽的體內(nèi)有效治療半衰期。
為了與蛋白上的官能團(tuán)形成共價(jià)鍵，多種活性羧基，特別是酯可以用作化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)(反應(yīng)本體)，其中羥基在修飾促胰島肽所需的水平上是生理上可接受的。這些連接試劑中可以采用多種不同的羥基，最常見的是N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)、馬來酰亞胺-苯甲?；?琥珀酰亞胺(MBS)、γ-馬來酰亞胺基-丁酰氧基琥珀酰亞胺酯(GMBS)和馬來酰亞胺基丙酸(MPA)。
伯胺是NHS酯的主要靶向，如下圖所示。蛋白質(zhì)N末端上的敏感α-氨基與NHS酯反應(yīng)。然而，蛋白質(zhì)上的α-氨基也可以不是NHS偶合所需要的或可利用的。當(dāng)5個(gè)氨基酸在其側(cè)鏈中含氮時(shí)，只有賴氨酸的ε-胺有效地與NHS酯反應(yīng)。當(dāng)NHS酯與伯胺的偶聯(lián)反應(yīng)釋放N-羥基琥珀酰亞胺時(shí)形成酰胺鍵，如下圖所示。這些含有反應(yīng)性基團(tuán)的琥珀酰亞胺在此稱作琥珀酰亞胺基(succinimidyl)。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白上的官能團(tuán)應(yīng)為巰基且化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)應(yīng)為含馬來酰亞胺基的基團(tuán)，如(GMBA或MPA)。GMBA代表γ-馬來酰亞胺-丁酰胺。此類含馬來酰亞胺的基團(tuán)在此被稱作馬來酰亞胺基(maleido)。
當(dāng)反應(yīng)混合物的pH維持在6.5至7.4之間時(shí)，馬來酰亞胺基首選肽上的巰基。在pH7.0下，馬來酰亞胺基(maleimido)與巰基的反應(yīng)的速率比其與胺的反應(yīng)速率快1000倍。馬來酰亞胺基和巰基之間形成穩(wěn)定硫醚鍵，其在生理?xiàng)l件下不能斷裂。 本發(fā)明的促胰島肽和肽衍生物可以針對(duì)特異性標(biāo)記或非特異性標(biāo)記的血液組分進(jìn)行修飾。
A.特異性標(biāo)記優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)修飾的促胰島肽(ITP)被設(shè)計(jì)為特異性地與流動(dòng)血液蛋白質(zhì)上的巰基反應(yīng)。此類反應(yīng)優(yōu)選通過用馬來酰亞胺鍵修飾的治療性肽(例如，由GMBS、MPA或前體馬來酰亞胺制備)與流動(dòng)血液蛋白(如血清白蛋白或IgG)上的巰基之間的共價(jià)鍵來建成。
在某些環(huán)境下，具有馬來酰亞胺的特異性標(biāo)記提供了若干比用基團(tuán)如NHS和磺基-NHS非特異性標(biāo)記的流動(dòng)蛋白更好的優(yōu)越性。巰基在體內(nèi)不如氨基般含量豐富。所以，本發(fā)明的馬來酰亞胺衍生物應(yīng)不與蛋白共價(jià)鍵合。譬如，在白蛋白(最豐富的血液蛋白)中只存在一個(gè)巰基。所以，ITP-馬來酰亞胺-白蛋白偶聯(lián)物應(yīng)該包括約1∶1的IP和白蛋白摩爾比。除了白蛋白以外，IgG分子(II型)也具有自由巰基。由于IgG分子和血清白蛋白組成了血液中絕大多數(shù)的可溶性蛋白，它們也構(gòu)成血液中多數(shù)能夠與馬來酰亞胺修飾ITP共價(jià)鍵合的自由巰基。
此外，甚至在含自由巰基的血液蛋白中，具有馬來酰亞胺的特異性標(biāo)記導(dǎo)致ITP馬來酰亞胺-白蛋白偶聯(lián)物的優(yōu)先形成，這歸因于白蛋白自身的獨(dú)特特性。在多種物質(zhì)中非常守恒的白蛋白的唯一自由巰基位于第34個(gè)氨基酸殘基(Cys34)上。目前業(yè)已證實(shí)，白蛋白的Cys34比位于其他含自由巰基的蛋白質(zhì)上的自由巰基更高的反應(yīng)性。這部分歸因于白蛋白Cys34具有非常低的pK值5.5。該值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于普通半胱氨酸殘基的典型pK值，其典型為約8。由于這種低pK，在正常的生理?xiàng)l件下，白蛋白的Cys34主要呈電離形式，據(jù)報(bào)導(dǎo)由此急劇提高了其反應(yīng)性。除了Cys34的pK值低以外，另一個(gè)提高Cys34的反應(yīng)性的因素是其位置，它位于接近于白蛋白V區(qū)的一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的表面的裂縫內(nèi)。這樣的位置使Cys34非常容易為所有種類的配體利用，在Cys34作為自由基捕獲物和自由巰基清除劑的生物作用中是非常重要的因素。這些特性令Cys34非常容易和ITP-馬來酰亞胺反應(yīng)，該反應(yīng)速率的加快可以是TP-馬來酰亞胺與其他含自由巰基蛋白的反應(yīng)的速率的1000倍。
ITP-馬來酰亞胺-白蛋白偶聯(lián)物的另一個(gè)優(yōu)越性是與肽和Cys34特異性白蛋白的1∶1負(fù)荷有關(guān)的重現(xiàn)性。其他技術(shù)如戊二醛、DCC、EDC和其他如自由胺的化學(xué)活化缺乏這樣的選擇性。譬如，白蛋白含有52個(gè)賴氨酸殘基，其中的25-30個(gè)位于白蛋白的表面并且易于偶聯(lián)?；罨@些賴氨酸殘基，或者選擇性地修飾肽以通過這些賴氨酸殘基偶聯(lián)，可以得到異種種群的偶聯(lián)物。即使采用1∶1摩爾比的肽和白蛋白，產(chǎn)物應(yīng)由多種偶聯(lián)產(chǎn)物組成，一些產(chǎn)物每個(gè)白蛋白含有0、1、2或多個(gè)肽，并且各產(chǎn)物具有隨機(jī)偶聯(lián)在任一25-30個(gè)可利用賴氨酸位點(diǎn)上的肽?？紤]到可能存在多種組合形式，難以描述各批次的精確組成和特性，并且批次和批次之間的重現(xiàn)性幾乎是不可能的，使此類偶聯(lián)物無法成為所期望的治療劑。而且，雖然似乎通過白蛋白的賴氨酸殘基的偶聯(lián)作用至少具有每個(gè)白蛋白分子可傳遞多個(gè)治療劑的優(yōu)點(diǎn)，研究顯示優(yōu)選1∶1的治療劑和白蛋白比例。在Stehle等的″The Loading RateDetermines Tumor Targeting Properties of Methotrexate AlbuminConjugates in Rats，″Anti-Cancer Drugs，Vol.8，pp.677-685(1997)(該文獻(xiàn)在此引入作為參考)中，作者報(bào)導(dǎo)了經(jīng)戊二醛偶聯(lián)的1∶1比例的抗癌氨甲蝶呤和白蛋白產(chǎn)生最有希望的結(jié)果。這些偶聯(lián)物被腫瘤細(xì)胞吸收，而帶有5∶1至20∶1氨甲蝶呤分子的偶聯(lián)物具有改變的HPLC性能，并且在體內(nèi)迅速被肝臟攝取。由此假定，在這些較高的比例下，白蛋白的構(gòu)象改變削弱了其作為治療載體的有效性。
通過馬來酰亞胺-ITP的體內(nèi)控制給藥，人們也可以控制體內(nèi)白蛋白和IgG的特異性標(biāo)記。在常規(guī)的給藥中，80-90％施用的馬來酰亞胺-ITP將標(biāo)記白蛋白，5％以下標(biāo)記IgG。也可以出現(xiàn)自由巰基如谷胱甘肽的痕量標(biāo)記。此類特異性標(biāo)記優(yōu)選體內(nèi)應(yīng)用，因?yàn)樗軌蚓_計(jì)算所給藥物的半衰期。
除了提供可控體內(nèi)特異性標(biāo)記以外，馬來酰亞胺-TP可以提供離體血清白蛋白和IgG的特異性標(biāo)記。這種離體標(biāo)記包括將馬來酰亞胺-ITP加入含有血清白蛋白和/或IgG的血液、血清或鹽水溶液中。一旦馬來酰亞胺-TP離體修飾后，血液、血清或鹽水溶液可以重新施用到血液中進(jìn)行體內(nèi)治療。
與NHS-肽相反，馬來酰亞胺-ITP在水溶液和自由胺的存在下一般相當(dāng)穩(wěn)定。由于馬來酰亞胺-ITP只與自由巰基反應(yīng)，通常不需要用保護(hù)基來防止馬來酰亞胺-ITP自身發(fā)生反應(yīng)。此外，提高了的肽的穩(wěn)定性允許應(yīng)用進(jìn)一步的純化步驟如HPLC來制備高度純化的適合體內(nèi)使用的產(chǎn)物。最后，提高了的化學(xué)穩(wěn)定性為產(chǎn)物提供了較長(zhǎng)的半衰期。
B.非特異性標(biāo)記為了血液組分的非特異性標(biāo)記也可以修飾本發(fā)明的ITP。對(duì)于非特異性標(biāo)記，一般采用與氨基鍵合，尤其是形成酰胺鍵。為了形成這種鍵，可以采用多種活性羧基、特別是酯作為化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)與ITP偶聯(lián)，其中羥基部分在所需水平下為生理可接受的。雖然這些連接劑中可以采用許多不同的羥基，但最常用的是N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N-羥基-磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)。
其他可利用的連接劑公開在美國(guó)專利5,612,034，其在此引入作為參考。
具有非特異ITP的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)的多種位點(diǎn)可以在體內(nèi)反應(yīng)，包括細(xì)胞，特別是血紅細(xì)胞(紅細(xì)胞)和血小板，以及蛋白質(zhì)，例如免疫球蛋白，包括IgG和IgM、血清白蛋白、鐵蛋白、甾類結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2-巨球蛋白等。那些與衍生化ITP反應(yīng)且無法長(zhǎng)時(shí)間存活的受體一般在約3天內(nèi)自人體宿主中消除。基于在血液中的濃度，上述蛋白質(zhì)(包括細(xì)胞的蛋白)將在血流中保存至少3天，并且可以保存5天或更長(zhǎng)時(shí)間(一般不超過60天，更常見不超過30天)特別是對(duì)于半衰期。
首先，反應(yīng)是與血液中的流動(dòng)組分，特別是血液蛋白和細(xì)胞，更具體為血液蛋白和紅細(xì)胞。所謂“流動(dòng)”是指在任意長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，一般不超過5分鐘，更常為1分鐘，沒有固定位點(diǎn)，雖然一些血液組分可能在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)相對(duì)靜止。最初，應(yīng)存在相對(duì)異質(zhì)群體的標(biāo)記蛋白和細(xì)胞。然而，在多數(shù)情況中，上述群體在給藥后數(shù)天內(nèi)將從起始群體發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化，這取決于標(biāo)記蛋白在血流中的半衰期。所以，通常是在約3天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，IgG變?yōu)檠髦械膬?yōu)勢(shì)標(biāo)記蛋白。
通常，在給藥后5天后，IgG、血清白蛋白和紅細(xì)胞將是至少約60％摩爾、通常至少約75％摩爾的血液偶聯(lián)組分，并且IgG、IgM(非常低的范圍)和血清白蛋白是至少約50％摩爾、通常至少約75％摩爾、更常至少約80％摩爾的非細(xì)胞偶聯(lián)組分。
預(yù)期的非特異性ITP和血液組分的偶聯(lián)物可以通過給患者直接施用ITP體內(nèi)制備，該患者可以是人體或其他哺乳動(dòng)物。給藥可以采取快速濃注或利用計(jì)量流量等通過輸液在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)緩慢輸注的給藥形式。
如果希望，目標(biāo)偶聯(lián)物也可以通過結(jié)合血液和本發(fā)明的衍生化ITP來離體制備，使修飾的ITP和血液組分上的反應(yīng)性官能團(tuán)共價(jià)鍵合，隨后把偶聯(lián)血液返回或施用給宿主。此外，上述制備也可通過首先純化各血液組分或有限數(shù)量的組分如血紅細(xì)胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等來實(shí)現(xiàn)，并且把這些組分或離體組分與化學(xué)反應(yīng)性ITP結(jié)合。隨后把標(biāo)記血液或血液組分返回給宿主以在體內(nèi)提供目標(biāo)治療有效偶聯(lián)物。在離體操作中也可以對(duì)血液進(jìn)行處理以防止其凝結(jié)。
3.修飾ITP的合成A.ITP合成ITP片段可以利用所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)固相肽化學(xué)方法合成。譬如，ITP片段可以通過固相化學(xué)技術(shù)按照下面由Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，III.，(1984)所述方法利用Applied Biosystems合成儀制備。同樣地，可以合成多個(gè)片段，隨后連接在一起形成更大的片段。這些合成肽片段也可在特定位置用氨基酸替代制備。
對(duì)于固相肽合成，有關(guān)多種技術(shù)的概述可以參見J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(SanFrancisco)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973。經(jīng)典的溶液合成法可參見G.Schroder和K.Lupke，The Peptides，Vol.1，Acacemic Press(NewYork)。一般地，這些方法包括順序加入一種或多種氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸使肽鏈延長(zhǎng)。正常情況下，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基被適宜的保護(hù)基保護(hù)。隨后，該保護(hù)或衍生化氨基酸附著在惰性固相載體上或通過加入的下一個(gè)在序列中具有互補(bǔ)(氨基或羧基)基團(tuán)的適當(dāng)保護(hù)的氨基酸且在適合形成酰胺鍵的條件下以溶液形式被利用。隨后從新加入的氨基酸殘基除去保護(hù)基并且加入下一個(gè)氨基酸(適當(dāng)保護(hù)除的)，并且如此繼續(xù)。
當(dāng)所有預(yù)期的氨基酸已經(jīng)以適當(dāng)序列連接后，依次或同時(shí)脫除任何殘留的保護(hù)基(和任何固體載體)以得到最終的多肽。通過對(duì)這種通用方法的簡(jiǎn)化改進(jìn)，可以一次添加一個(gè)以上的氨基酸使鏈延長(zhǎng)，譬如，通過偶聯(lián)(在不外消旋化手性中心的條件下)保護(hù)的三肽和適當(dāng)保護(hù)的二肽，在脫保護(hù)后形成五肽。
特別優(yōu)選的制備本發(fā)明化合物的方法包括固相肽合成法，其中用酸或堿敏感基團(tuán)保護(hù)氨基酸α-N-末端。該保護(hù)基應(yīng)具有對(duì)肽鍵形成的條件穩(wěn)定的特性，同時(shí)易于脫除而不破壞生長(zhǎng)的肽鏈或不外消旋化含于其中的任何手性中心。適用的保護(hù)基是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧基羰基(Cbz)、聯(lián)苯基異丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、異冰片基氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧基羰基、鄰硝基苯基次磺?；?-氰基-叔丁氧基羰基等。9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)保護(hù)基特別適用于ITP片段的合成。其他優(yōu)選的側(cè)鏈保護(hù)基是對(duì)于側(cè)鏈氨基如賴氨酸和精氨酸是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?pmc)、硝基、對(duì)甲苯磺?；?、4-甲氧基苯磺?；?、Cbz、Boc和金剛烷氧基羰基；對(duì)于酪氨酸是，芐基、鄰溴芐氧基羰基、2，6-二氯芐基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環(huán)己基、環(huán)戊基和乙酰基(Ac)；對(duì)于絲氨酸，是叔丁基、芐基和四氫吡喃基；對(duì)于組氨酸，是三苯甲基、芐基、Cbz、對(duì)甲苯磺?；?，4-二硝基苯基；和對(duì)于色氨酸，是甲?；?；對(duì)于天門冬氨酸和谷氨酸，是芐基和叔丁基；和對(duì)于半胱氨酸，是三苯基甲基(三苯甲基)。
在固相肽合成方法中，α-C-末端氨基酸附著在適當(dāng)?shù)墓腆w載體或樹脂上。適于上述合成的固體載體是那些對(duì)逐級(jí)縮合-脫保護(hù)反應(yīng)的試劑和條件呈惰性且在所用介質(zhì)內(nèi)不溶解的物質(zhì)。α-C-末端羧基肽的合成所優(yōu)選的固體載體是4-羥基甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。α-C-末端酰胺肽的優(yōu)選固體載體是Applied Biosystems(FosterCity，Calif.)出售的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂。α-C-末端氨基酸與樹脂通過N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N，N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲-六氟磷酸鹽(HBTU)的方式偶聯(lián)，有或沒有4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)或雙(2-氧-3-噁唑烷基)氯化膦(BOPCI)介導(dǎo)下偶聯(lián)在10至50℃內(nèi)于溶劑如二氯甲烷或DMF中進(jìn)行約1至約24小時(shí)。
當(dāng)固體載體是4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂時(shí)，在與上述α-C-末端氨基酸偶聯(lián)之前，F(xiàn)moc基用仲胺、優(yōu)選哌啶裂解。和脫保護(hù)的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基樹脂偶聯(lián)的優(yōu)選方法是在DMF中利用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲六氟-磷酸(HBTU，1當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑(HOBT，1當(dāng)量)。連續(xù)保護(hù)的氨基酸的偶聯(lián)可以在所屬領(lǐng)域熟知的自動(dòng)多肽合成儀中進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生長(zhǎng)肽鏈的α-N-末端氨基酸用Fmoc保護(hù)。通過用仲胺，優(yōu)選用哌啶處理可以從生長(zhǎng)肽鏈的α-N-末端側(cè)脫去Fmoc保護(hù)基。隨后將各保護(hù)的氨基酸以約3倍摩爾過量引入，優(yōu)選在DMF中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。偶聯(lián)劑一般是O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1當(dāng)量)和1-羥基苯并三唑e(HOBT，1當(dāng)量)。
在固相合成結(jié)束時(shí)，連續(xù)或在同一操作中從樹脂上脫下多肽并且脫保護(hù)。多肽的脫除和脫保護(hù)可以在同一操作中通過用裂解劑處理樹脂結(jié)合多肽完成，裂解劑包括硫苯甲醚(thianisole)、水、乙烷二硫醇和三氟乙酸。在多肽的α-C-末端為烷基酰胺的情形下，樹脂用烷基胺通過氨解裂解。另外，肽可以通過酯交換脫去，例如用甲醇，隨后通過氨解或直接酰胺基轉(zhuǎn)移。保護(hù)肽可以在此時(shí)純化，或者直接進(jìn)行下一步。側(cè)鏈保護(hù)基的脫除是利用上述混合裂解劑進(jìn)行。完全脫保護(hù)肽通過一系列的采用下列任何或全部類型的色譜步驟進(jìn)行純化弱堿性樹脂(乙酸型)上的離子交換；在未衍生聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如Amberlite XAD)上的疏水吸附色譜；硅膠吸附色譜；在羧甲基纖維素上的離子交換色譜；分配色譜，例如在SephadexG-25、LH-20上或逆流分配；高效液體色譜(HPLC)，尤其是在辛基-或十八烷基甲硅烷基-硅膠鍵合相柱填充上的反相HPLC。
這些ITP的分子量利用快速原子轟擊(FAB)質(zhì)譜法測(cè)定。
本發(fā)明的ITP可以利用N-和C-末端保護(hù)基合成作為前藥使用。
1.N-末端保護(hù)基如上所述，術(shù)語(yǔ)“N-保護(hù)基”是指那些用于保護(hù)氨基酸或肽的α-N-末端或保護(hù)氨基酸或肽的氨基在合成過程中不發(fā)生預(yù)期外反應(yīng)的基團(tuán)。常用的N-保護(hù)基公開在“Protective Groups In OrganicSynthesis”(John Wiley & Sons，New York(1981))，其在此引入作為參考。另外，保護(hù)基可以作為前藥使用，其易于在體內(nèi)裂解，例如通過酶促水解，釋放出生物活性母體。α-N-保護(hù)基含有低級(jí)烷基，例如甲?；⒁阴；?″Ac″)、丙?；?、新戊酰基、叔丁基乙?；?；其他酰基包括2-氯乙?；?-溴乙?；?、三氟乙?；⑷纫阴；?、鄰苯二?；⑧徬趸窖趸阴；?、-氯丁酰基、苯甲?；?、4-氯苯甲?；?、4-溴苯甲?；?、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，例如苯磺?；-甲苯磺?；龋话被姿狨バ纬苫鶊F(tuán)，例如芐氧基羰基、對(duì)氯芐氧基羰基、對(duì)甲氧基芐氧基羰基、對(duì)硝基芐氧基羰基、2-硝基芐氧基羰基、對(duì)溴芐氧基羰基、3，4-二甲氧基芐氧基羰基、3，5-二甲氧基芐氧基羰基、2，4-二甲氧基芐氧基羰基、4-乙氧基芐氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基芐氧基羰基、3，4，5-三甲氧基芐氧基羰基、1-(p-聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二異丙基甲氧基羰基、異丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、環(huán)戊基氧基羰基、金剛烷氧基羰基、環(huán)己基氧基羰基、苯基硫代羰基等；芳烷基，例如芐基、三苯甲基、芐氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等；和甲硅烷基，例如三甲基硅烷基等。
2.羧基保護(hù)基如上所述，術(shù)語(yǔ)″羧基保護(hù)基″是指當(dāng)反應(yīng)涉及化合物的其他官能位點(diǎn)時(shí)用于阻斷或保護(hù)羧酸官能度的羧酸保護(hù)酯或酰胺基。羧基保護(hù)基公開在Greene，″Protective Groups in Organic Synthesis″pp.152-186(1981)，其在此引入作為參考。此外，羧基保護(hù)基可以用作前藥，由此羧基保護(hù)基可以易于在體內(nèi)裂解，例如通過酶促水解，釋放生物活性母體。此類羧基保護(hù)基為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，業(yè)已廣泛用在青霉素和頭孢菌素領(lǐng)域中的羧基保護(hù)，如美國(guó)專利Nos.3,840,556和3,719,667，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。典型羧基保護(hù)基是C1-C8低級(jí)烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等)；芳烷基，例如苯乙基或芐基以及它們的取代衍生物，例如烷氧基芐基或硝基芐基等；芳基鏈烯基，例如苯基乙烯基等；芳基及其取代衍生物，例如5-二氫茚基等；二烷基氨基烷基，例如二甲基氨基乙基等)；烷酰氧基烷基，例如乙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基、異丁酰氧基甲基、異戊酰氧基甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(新戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、新戊酰乙基甲基、丙酰氧基甲基等；環(huán)烷酰氧基烷基，例如環(huán)丙基羰氧基甲基、環(huán)丁基羰氧基甲基、環(huán)戊基羰氧基甲基、環(huán)己基羰氧基甲基等；芳酰氧基烷基，例如苯甲酰氧基甲基、苯甲酰氧基乙基等；芳烷基羰氧基烷基，例如芐基羰氧基甲基、2-芐基羰氧基乙基等；烷氧基羰基烷基或環(huán)烷氧基羰基烷基，例如甲氧基羰基甲基、環(huán)己氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基等；烷氧基羰氧基烷基或環(huán)烷氧基羰氧基烷基，例如甲氧基羰氧基甲基、叔丁氧基羰氧基甲基、1-乙氧基羰氧基-1-乙基、1-環(huán)己氧基羰氧基-1-乙基等；芳氧基羰氧基烷基，例如2-(苯氧基羰氧基)乙基、2-(5-二氫茚基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基烷基羰氧基烷基，例如2-(1-甲氧基-2-甲基丙烷-2-酰氧基)乙基等；芳烷氧基羰氧基烷基，例如2-(芐氧基羰基氧基)乙基等；芳基鏈烯基氧基羰氧基烷基，例如2-(3-苯基丙烯-2-基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基羰基氨基烷基，例如叔丁氧基羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基，例如甲基氨基羰基氨基甲基等；烷?；被榛?，例如乙?；被谆龋浑s環(huán)羰氧基烷基，例如4-甲基哌嗪基羰氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基，例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等；(5-(低級(jí)烷基)-2-氧-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)烷基，例如(5-叔丁基-2-氧-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基等；和(5-苯基-2-氧-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)烷基，例如(5-苯基-2-氧-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-4-基)甲基等。
代表性的酰胺羧基保護(hù)基是氨基羰基和低級(jí)烷基氨基羰基。
優(yōu)選的本發(fā)明羧基保護(hù)化合物是這樣的化合物，其中保護(hù)羧基是低級(jí)烷基、環(huán)烷基或芳烷基酯，譬如甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、仲丁酯、異丁酯、戊酯、異戊酯、辛酯、環(huán)己酯、苯乙酯等；或烷酰氧基烷基、環(huán)烷酰氧基烷基、芳酰氧基烷基或芳烷基羰氧基烷基酯。優(yōu)選的酰胺羧基保護(hù)基是低級(jí)烷基氨基羰基。譬如，天門冬氨酸在α-C-末端被酸活潑基團(tuán)(例如叔丁基)保護(hù)和在β-C-末端被氫化活潑基團(tuán)(例如芐基)保護(hù)，隨后在合成過程中選擇性地脫保護(hù)。
B.ITP的修飾本發(fā)明制備修飾TIP的方式根據(jù)含有ITP的不同要素的本質(zhì)變化多端。合成方法的選擇應(yīng)簡(jiǎn)便、提供高產(chǎn)率并且能夠得到高純度產(chǎn)物。通常，化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)應(yīng)在合成的最后階段產(chǎn)生，譬如，羧基酯化生成活性酯。本發(fā)明制備修飾ITP的具體方法如下所述。
為經(jīng)受用連接基和反應(yīng)試劑修飾選擇的各個(gè)ITP按照下列標(biāo)準(zhǔn)修飾如果一個(gè)位于起始ITP上的對(duì)保持其藥理學(xué)活性沒有決定作用的羧基可利用，并且ITP上不存在其他反應(yīng)性官能度時(shí)，則選擇該羧基作為連接基-反應(yīng)本體修飾的附著點(diǎn)。如果沒有羧酸可利用，則選擇其他對(duì)保持藥理學(xué)活性沒有決定性影響的官能團(tuán)作為連接基-反應(yīng)體修飾的附著點(diǎn)。如果位于ITP上有若干官能團(tuán)可以利用，保護(hù)基的聯(lián)合形式應(yīng)以一定方式應(yīng)用以使連接基/反應(yīng)本體的加入和全部保護(hù)官能團(tuán)脫保護(hù)后仍然保持藥理學(xué)活性。如果ITP上沒有反應(yīng)性官能團(tuán)可利用，合成實(shí)踐應(yīng)以能夠保持生物活性且保證受體或靶向特異性的方式修飾起始ITP。
活性反應(yīng)本體位于一個(gè)在ITP與血液組分鍵合時(shí)ITP保持大部分未修飾ITP活性的位點(diǎn)。
更具體地說，選擇經(jīng)受連接基和反應(yīng)本體衍生化的各個(gè)ITP按照下列標(biāo)準(zhǔn)修飾如果治療性肽上的末端羧基可以利用并且對(duì)藥理學(xué)活性的保持沒有決定性作用，并且ITP上不存在其他敏感官能團(tuán)，則選擇該羧基作為連接基-反應(yīng)本體修飾的附著點(diǎn)。如果末端羧基涉及藥理學(xué)活性，或如果沒有可利用的羧基，則可以選擇任何其他對(duì)保持藥理學(xué)活性沒有實(shí)質(zhì)影響的敏感官能團(tuán)作為連接基-反應(yīng)本體修飾的附著點(diǎn)。如果在ITP上存在若干個(gè)可利用的敏感官能團(tuán)，保護(hù)基的聯(lián)合形式應(yīng)以一定方式應(yīng)用以使加入連接基/反應(yīng)本體和全部保護(hù)官能團(tuán)脫保護(hù)后，仍然保持藥理學(xué)活性。如果治療性肽上沒有敏感官能團(tuán)可利用，合成實(shí)踐應(yīng)以能夠保持生物活性且保證受體或靶向特異性的方式修飾起始ITP。在這種情形下，修飾發(fā)生在肽的相反末端。
NHS衍生物可以由羧酸在治療性肽中不存在其他敏感官能團(tuán)的條件下合成。具體而言，這種治療性肽與N-羥基琥珀酰亞胺在無水CH2Cl2和EDC中反應(yīng)，利用層析或重結(jié)晶從適當(dāng)溶劑體系純化產(chǎn)物，得到NHS衍生物。
另外，NHS衍生物可以從含有氨基和/或巰基和羧酸的ITP合成。當(dāng)分子中存在自由氨基或巰基時(shí)，優(yōu)選在加入NHS衍生物之前將這些敏感官能團(tuán)保護(hù)起來。譬如，如果分子含有自由氨基，有必要在進(jìn)行上述化學(xué)反應(yīng)之前使胺轉(zhuǎn)化為Fmoc或優(yōu)選轉(zhuǎn)化為tBoc保護(hù)的胺。胺官能團(tuán)應(yīng)在NHS衍生物的制成后脫保護(hù)。所以，這種方法只適用于那些不必釋放其氨基以產(chǎn)生預(yù)期藥理學(xué)效應(yīng)的化合物。此外，NHS衍生物可以從含有氨基或巰基且無羧酸的治療性肽合成。當(dāng)選擇的分子不含有羧酸時(shí)，可以利用一組雙官能連接基使分子轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性NHS衍生物。譬如，將乙二醇-雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)(EGS)和三乙胺溶于DMF中，向其中加入含自由氨基的分子(與EGS的比例是10∶1)，將會(huì)產(chǎn)生一元NHS衍生物。為了從巰基衍生分子制備NHS衍生物，可以利用存在于DMF中的N-[-馬來酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)和三乙胺。馬來酰亞胺基與自由巰基反應(yīng)，利用在硅膠上層析或通過HPLC可以從反應(yīng)混合物純化NHS衍生物。
NHS衍生物也可以從含有多個(gè)敏感官能團(tuán)的ITP合成。各種情況業(yè)已得到分析并以不同的方式解決。然而，借助于大量市售的保護(hù)基和雙官能連接基，本發(fā)明可以應(yīng)用于任何治療性肽，優(yōu)選通過一步只衍生化ITP的化學(xué)步驟，或首先保護(hù)敏感基團(tuán)的兩個(gè)步驟或三個(gè)步驟(保護(hù)、活化和脫保護(hù))。只有在例外的情形中，需要利用多步(超過三步)合成使治療性肽轉(zhuǎn)化為活性NHS或馬來酰亞胺衍生物。
馬來酰亞胺衍生物也可以由含有自由氨基和游離羧酸的ITP合成。為了從氨基衍生化分子制備馬來酰亞胺衍生物，可以利用存在于DMF中的N-[-馬來酰亞胺基丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)和三乙胺。琥珀酰亞胺酯基與自由氨基反應(yīng)，并且通過結(jié)晶或在硅膠上層析或HPLC可從反應(yīng)混合物中純化馬來酰亞胺衍生物。
最后，馬來酰亞胺衍生物可以從含有多個(gè)其他敏感官能團(tuán)且不含游離羧酸的治療性肽合成。當(dāng)選擇不含有羧酸的分子時(shí)，可以利用一組雙官能交聯(lián)劑把該分子轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性NHS衍生物。譬如，馬來酰亞胺基丙酸(MPA)可以和游離胺偶聯(lián)，通過游離胺和MPA的羧基在HBTU/HOBt/DIEA活化下于DMF中的反應(yīng)生成馬來酰亞胺衍生物。
許多市售的其他雜雙官能交聯(lián)劑可以在必要時(shí)作為替代。大量雙官能化合物可以用來連接本體。試劑的實(shí)例包括疊氮基苯甲酰肼、N-[4-(p-疊氮基水楊基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代)丙酰胺)、雙磺基琥珀酰亞胺基辛二酸鹽、二甲基己二酰亞胺酯、二琥珀酰亞胺基酒石酸鹽、N-y-馬來酰亞胺基丁酰氧基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸鹽、N-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]-1，3′-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亞胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸鹽、戊二醛和琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-甲酸鹽。
4.修飾ITP的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP具有多種用途，包括用作糖尿病的治療、鎮(zhèn)靜劑、神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)的治療；用于對(duì)CNS產(chǎn)生抗焦慮作用；用于激活CNS；用于術(shù)后治療和用作胰島素耐受性的治療。
A.糖尿病治療本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP一般通過葡萄糖依賴性、胰島素依賴性和胰島素非依賴性機(jī)理使高血糖正?；?。因此，修飾ITP可以有效地作為治療II型糖尿病的基本藥物和I型糖尿病的輔助藥物。
在糖尿病治療中使用有效量的經(jīng)修飾ITP具有比未修飾ITP更有效的優(yōu)點(diǎn)。由于修飾ITP在體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)移，施用較少量的分子可以產(chǎn)生有效治療。本發(fā)明尤其適合治療患有I型和II型糖尿病的患者，其中肽的作用依賴于血液葡萄糖的濃度，由此比現(xiàn)有治療方法大大降低了低血糖副作用的危險(xiǎn)性。
本發(fā)明還提供一種治療個(gè)體中糖尿病的方法，其中該方法包括提供足以治療糖尿病的量的經(jīng)修飾ITP；其中組合物含有修飾ITP。
B.神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)的治療還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP可以用作鎮(zhèn)靜劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供一種利用本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP對(duì)患有因中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)增強(qiáng)活化導(dǎo)致的異常的哺乳動(dòng)物對(duì)象實(shí)施鎮(zhèn)靜的方法。該方法包括給該對(duì)象施用足夠產(chǎn)生鎮(zhèn)靜或抗焦慮作用量的經(jīng)修飾ITP。修飾ITP可以經(jīng)腦心室內(nèi)、口服、皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。該方法可以有效治療或緩解神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，例如焦慮、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、攻擊、精神病、癲癇發(fā)作、恐慌發(fā)作、癔病和睡眠紊亂。
在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明涉及一種提高哺乳動(dòng)物對(duì)象的活動(dòng)度的方法，包括給該對(duì)象施用足以對(duì)該對(duì)象產(chǎn)生激活作用量的經(jīng)修飾ITP。優(yōu)選地，該對(duì)象患有因中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的活化減弱所致的疾病。發(fā)現(xiàn)修飾ITP特別適用于治療或緩解抑郁、分裂情感性障礙癥、睡眠呼吸窒息、注意力缺乏綜合征伴精神集中低下、失憶、健忘癥和發(fā)作性睡眠，這僅僅列舉了少數(shù)其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)的激發(fā)可以有利的病癥。
可以用本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP誘導(dǎo)激活，用來治療或緩解抑郁、分裂情感性障礙癥、睡眠呼吸窒息、注意力缺乏綜合征伴精神集中低下、失憶、健忘癥和發(fā)作性睡眠。修飾ITP療法的治療功效可以通過探詢患者了解其狀態(tài)、利用心理學(xué)/神經(jīng)學(xué)試驗(yàn)或通過與窒息疾病有關(guān)的癥狀的好轉(zhuǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。譬如發(fā)作性睡眠的治療可以通過監(jiān)測(cè)睡眠發(fā)作的發(fā)生次數(shù)來獲得。另外譬如，可以利用任何所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多診斷試驗(yàn)來測(cè)試修飾ITP對(duì)該對(duì)象注意力或記憶能力的效果。
C.術(shù)后治療可以利用本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP進(jìn)行術(shù)后治療。需要本發(fā)明修飾ITP的患者可以在手術(shù)之前約1-16小時(shí)、在患者手術(shù)過程中和患者術(shù)后不超過約5天內(nèi)實(shí)施。
本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP在手術(shù)開始之前約16小時(shí)至約1小時(shí)時(shí)給藥。當(dāng)本發(fā)明所用的化合物將為減少分解代謝作用和胰島素耐受性給藥時(shí)，術(shù)前時(shí)間的長(zhǎng)短取決于多種因素。這些因素是普通技術(shù)的醫(yī)師所公知的，并且首要包括患者是否在術(shù)前的準(zhǔn)備期間禁食或補(bǔ)充葡萄糖輸注液或飲料，或一些其它形式的營(yíng)養(yǎng)物。其它的重要因素包括患者的性別、體重和年齡，失去調(diào)節(jié)血糖能力的嚴(yán)重程度，不能調(diào)節(jié)血糖的基本原因，預(yù)測(cè)的手術(shù)引起創(chuàng)傷的嚴(yán)重性，給藥途徑和生物利用度，機(jī)體的持久性，配方和所給化合物的效價(jià)。本發(fā)明所用的經(jīng)修飾ITP開始給藥后的優(yōu)選時(shí)間間隔是從手術(shù)開始前約1小時(shí)至約10小時(shí)。開始給藥的最優(yōu)選時(shí)間間隔是在手術(shù)開始之前2小時(shí)至8小時(shí)。
特定類型的手術(shù)，選擇性腹部手術(shù)后的胰島素耐受在術(shù)后第一天最嚴(yán)重，至少持續(xù)5天，并且需要3周恢復(fù)正常。所以，術(shù)后患者可能需要在手術(shù)創(chuàng)傷后施用一段時(shí)間的本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP，這取決于多種由普通技術(shù)的醫(yī)師應(yīng)理解和判斷的因素。這些因素是患者是否在術(shù)后禁食或補(bǔ)充葡萄糖輸注液或飲料，或一些其它形式的營(yíng)養(yǎng)物；并且不限于患者的性別、體重和年齡，失去調(diào)節(jié)血糖能力的嚴(yán)重程度，不能調(diào)節(jié)血糖的基本原因，預(yù)測(cè)的手術(shù)引起創(chuàng)傷的嚴(yán)重性，給藥途徑和生物利用度，機(jī)體的持久性，配方和所給化合物的效價(jià)。本發(fā)明化合物的優(yōu)選給藥持續(xù)時(shí)間是術(shù)后5天以上。
D.胰島素耐受性的治療可以利用本發(fā)明的經(jīng)修飾ITP治療胰島素耐受性，這與其在術(shù)后治療中的應(yīng)用無關(guān)。胰島素耐受性可以歸因于胰島素對(duì)細(xì)胞表面受體結(jié)合力的降低，或細(xì)胞內(nèi)代謝的變化。在特征為胰島素敏感性降低的第一種類型中，一般通過提高胰島素濃度來克服。特征為胰島素響應(yīng)能力降低的第二種類型無法利用最大胰島素的量來克服。創(chuàng)傷后的胰島素耐受性可以利用與胰島素耐受性成正比的胰島素劑量加以克服，但由此顯然會(huì)導(dǎo)致胰島素敏感性的降低。
修飾ITP正?；颊哐撬降挠行┝繉⑷Q于多種因素，其中包括但不限于患者的性別、體重和年齡，失去調(diào)節(jié)血糖的能力的嚴(yán)重程度，不能調(diào)節(jié)血糖的基本原因，是否同時(shí)給予葡萄糖或另一種碳水化合物源，給藥途徑和生物利用度，機(jī)體的持久性，配方和效價(jià)。
5.修飾ITP的給藥修飾的ITP在給藥時(shí)應(yīng)存在于生理可接受介質(zhì)中，例如去離子水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、鹽水、含水乙醇或其它醇、血漿、蛋白性溶液、甘露糖醇、葡萄糖水、醇、植物油等。其它可以含有的添加劑包括緩沖劑，其中介質(zhì)一般被緩沖在約5至10的pH范圍內(nèi)，而緩沖劑濃度一般約為50至250mM；鹽，其中鹽的濃度通常約為5至500mM；生理可接受穩(wěn)定劑等。組合物可以被冷凍干燥以常規(guī)儲(chǔ)存和運(yùn)輸。
修飾ITP多數(shù)經(jīng)口服給藥，非腸道給藥，例如血管內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)(IA)、肌肉內(nèi)(IM)、皮下(SC)等。在適合的情況中可以通過輸液給藥。在某些場(chǎng)合中，當(dāng)官能團(tuán)的反應(yīng)相對(duì)緩慢時(shí)，可以通過口服、經(jīng)鼻、直腸、透皮或氣溶膠給藥，其中偶聯(lián)物的特性能夠傳遞到血管系統(tǒng)。通常應(yīng)采用單劑量注射，雖然如果需要時(shí)可采用多次注射，可通過任何常規(guī)工具給藥修飾ITP，包括注射器、套管針、導(dǎo)管等。具體給藥方式應(yīng)根據(jù)給藥量、是否單劑量快速濃注或是連續(xù)給藥等改變。優(yōu)選地，應(yīng)血管內(nèi)給藥，引入的位點(diǎn)對(duì)于本發(fā)明而言并不重要，優(yōu)選的位點(diǎn)是血流快速的地方，例如靜脈內(nèi)，外周或中樞靜脈。發(fā)現(xiàn)可以利用其它途徑，使給藥與緩釋技術(shù)或保護(hù)基質(zhì)結(jié)合。這樣做的意圖在于，使ITP有效分布在血液中，由此能夠與血液組分反應(yīng)。偶聯(lián)物的濃度將變化多端，通常約為1pg/ml至50mg/ml。血管內(nèi)給藥的總量一般應(yīng)在約0.1mg/ml至約10mg/ml、更常為約1mg/ml至約5mg/ml的范圍內(nèi)。
通過與長(zhǎng)壽命血液組分結(jié)合，例如免疫球蛋白、血清白蛋白、血紅細(xì)胞和血小板，由此產(chǎn)生了很多優(yōu)越性。修飾ITP化合物的活性延長(zhǎng)到數(shù)天至數(shù)周。在這段時(shí)間內(nèi)只需要給藥一次。可以獲得較高的特異性，因?yàn)榛钚曰衔镏饕c大分子鍵合，由此似乎很少被吸收到細(xì)胞內(nèi)干擾其它生理過程。
血液組分之間共價(jià)鍵的形成可以發(fā)生在體內(nèi)或體外。為了形成離體共價(jià)鍵，把修飾ITP加入血液、血清和含有人血清白蛋白或IgG的鹽水溶液中使修飾ITP和血液組分之間形成共價(jià)鍵。在一個(gè)優(yōu)選形式中，ITP用馬來酰亞胺修飾并且與人血清白蛋白在鹽水溶液中反應(yīng)。一旦修飾的ITP已經(jīng)和血液組分反應(yīng)，形成ITP-蛋白偶聯(lián)物，則該偶聯(lián)物可以施用給患者。
另外，可直接將修飾的ITP給予患者，從而使修飾ITP與體內(nèi)的血液組分之間形成共價(jià)鍵。
6.監(jiān)測(cè)修飾ITP的存在為了監(jiān)測(cè)ITP的活性和/或修飾ITP的存在，可以監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物宿主的血液。在不同的時(shí)間采集宿主血液的部分或樣品，可以測(cè)定出ITP是否已經(jīng)有足夠的量與長(zhǎng)壽命血液組分鍵合變?yōu)榫哂兄委熥饔茫⑶掖撕罂梢詼y(cè)定血液中ITP化合物的水平。如果希望，還可以測(cè)定ITP分子究竟與何種血液組分鍵合。這在采用非特異性ITP時(shí)特別重要。對(duì)于特異性馬來酰亞胺-ITP，計(jì)算血清白和IgG的半衰期更加簡(jiǎn)單。
利用促胰島活性的測(cè)定、HPLC-MS或ITP的抗體可以監(jiān)測(cè)修飾的GLP。
A.促胰島活性的測(cè)定本發(fā)明涉及促胰島活性超過或等于未修飾ITP的促胰島活性的經(jīng)修飾ITP衍生物。通過給動(dòng)物細(xì)胞提供該化合物或把該化合物注射到動(dòng)物中并且分別監(jiān)測(cè)釋放到培養(yǎng)基或動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)中的免疫反應(yīng)性胰島素(IRI)，可以測(cè)定化合物的促胰島活性。利用對(duì)胰島素特異性的放射免疫分析可以檢測(cè)出存在的IRI。
盡管可以采用任何放射免疫分析檢測(cè)存在的IRI，優(yōu)選利用Albano，J.D.M.等(Acta Endocrinol.70487509(1972))的測(cè)定方法的改進(jìn)法。在這種改進(jìn)方法中，采用pH7.4的磷酸鹽/白蛋白緩沖液。利用500μl的磷酸鹽緩沖液、50μl的灌注液樣本或存在于灌注液中的大鼠胰島素標(biāo)準(zhǔn)、100μl的抗胰島素抗血清(Wellcome Laboratories；1∶40,000稀釋)和100μl的[125I]胰島素的連續(xù)條件制備培養(yǎng)液，在10×75mm可任意處理玻璃管中得到750μl的總體積。4℃下培育2-3天后，利用炭分離法將抗體鍵合的胰島素與游離胰島素分開。該測(cè)定靈敏度一般為1-2μl U/ml。為了測(cè)定釋放到在組織培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中的IRI，優(yōu)選將放射標(biāo)記摻雜在胰島素原中。盡管可以利用任何能夠標(biāo)記多肽的放射性標(biāo)記，但優(yōu)選采用3H亮氨酸從而獲得胰島素原的標(biāo)記化。標(biāo)記化可以進(jìn)行任何足以形成可檢測(cè)胰島素原分子庫(kù)的時(shí)間；然而，細(xì)胞優(yōu)選在放射性標(biāo)記的存在下培育60分鐘。盡管任何能夠表達(dá)胰島素的細(xì)胞系都可以用來測(cè)定化合物是否具有促胰島效應(yīng)，但優(yōu)選采用大鼠胰島瘤細(xì)胞，尤其是RIN-38大鼠胰島瘤細(xì)胞。此類細(xì)胞可以在任何適當(dāng)介質(zhì)中生長(zhǎng)；然而，優(yōu)選采用含有0.1％BSA和25mM葡萄糖的DME培養(yǎng)基。
還可以通過胰腺輸注測(cè)定修飾ITP的促胰島特性。就地分離灌注大鼠胰腺制備法是Penhos，J.C.等(Diabetes 18733-738(1969))的方法的改進(jìn)。按照該方法，體重350-600g的禁食大鼠(優(yōu)選雄性Charles River系白化大鼠)用腹膜內(nèi)注射的異戊巴比妥鈉麻醉(Eli Lilly和Co.，160ng/kg)。結(jié)扎腎、腎上腺、胃和下部結(jié)腸血管。切除整個(gè)腸道，但除約4cm的十二指腸和下降結(jié)腸和直腸以外。所以，只灌注小部分的腸道，由此減小具有促胰島免疫反應(yīng)性的腸物質(zhì)可能造成的干擾。灌注液優(yōu)選是含有4％葡聚糖T70和0.2％牛血清白蛋白的改進(jìn)Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(餾分V)，并且優(yōu)選以氣泡形式通入95％O2和5％CO2。優(yōu)選使用一種非脈動(dòng)流、4通道滾柱軸承泵(Buchler polystatic，Buchler Instruments Division，Nuclear-Chicago Corp.)，并且從一種灌注液到另一種灌注液的切換優(yōu)選使用一個(gè)三向旋閥來轉(zhuǎn)換。進(jìn)行、調(diào)試和分析灌注的方式優(yōu)選按照Weir，G.C.等(J.Clin.Investigat.541403-1412(1974))所述的方法，其在此引入作為參考。
B.HPLC-MSHPLC與質(zhì)譜(MS)偶連可以用來測(cè)定肽和經(jīng)修飾的肽的存在，這是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常采用兩種流動(dòng)相0.1％TFA/水和0.1％TFA/乙腈。柱溫度和梯度條件可以改變。具體詳情如下面的實(shí)施例部分所述。
C.抗體本發(fā)明的另一方面涉及利用對(duì)ITP特異性的抗體測(cè)定ITP或其偶聯(lián)物在生物樣本(例如血液)中的濃度的方法以及此類抗體在治療與ITP或偶聯(lián)物潛在相關(guān)的中毒中的應(yīng)用。這是有益的，因?yàn)镮TP在患者體內(nèi)提高了的穩(wěn)定性和壽命可能在治療過程中導(dǎo)致新的問題，包括中毒可能性的增加。使用單克隆或多克隆的對(duì)特定ITP具有特異性的抗ITP抗體可以協(xié)助解決此類問題?？贵w可以產(chǎn)生或衍生自用特定修飾ITP免疫、用試劑的致免疫片段或與試劑的免疫決定簇相應(yīng)的合成免疫原免疫的宿主。優(yōu)選的抗體應(yīng)對(duì)天然、衍生化和偶聯(lián)形式的經(jīng)修飾ITP具有高特異性和親和力。此類抗體也可以用酶、熒光染料或放射性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。
利用純化ITP可以制備對(duì)修飾ITP具有特異性的抗體，來誘導(dǎo)衍生化ITP特異性抗體。通過抗體的誘導(dǎo)，不但可以通過給動(dòng)物注射來刺激免疫反應(yīng)，而且在合成抗體或其它特異性結(jié)合分子的制備中也可以進(jìn)行類似步驟，例如篩選重組免疫球蛋白文庫(kù)。單克隆和多克隆抗體都可以通過所屬領(lǐng)域熟知的方法制備。
可以利用抗體來監(jiān)測(cè)血流中存在的ITP肽。血液和/或血清樣本可以利用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析。這些技術(shù)能夠分析血液或血清測(cè)定出修飾ITP和血液組分的結(jié)合。
還可以利用抗治療劑抗體來治療因修飾ITP給予引起的中毒，并且可以離體或體內(nèi)應(yīng)用。離體方法包括利用固定在固體載體上的抗治療劑抗體免疫透析治療中毒。體內(nèi)方法包括施用足夠有效引發(fā)抗體-治療劑復(fù)合物的清除量的治療劑抗體。
可利用抗體通過在無滅菌條件下令血液與抗體接觸來除去離體患者血液中的經(jīng)修飾ITP及其偶聯(lián)物。譬如，抗體可以固定或固定化在柱基質(zhì)上，患者血液可自患者流出并且經(jīng)過該基質(zhì)。修飾ITP將結(jié)合該抗體，血液含有低濃度的ITP，隨后可以返回到患者循環(huán)系統(tǒng)中。通過調(diào)節(jié)壓力和流量可以控制除去的經(jīng)修飾ITP的量?？蓪⑿揎桰TP從患者血液的血漿組分中優(yōu)先除去，譬如利用半滲透膜，或首先利用所屬領(lǐng)域的已知方法從細(xì)胞組分分離出血漿組分以使血漿組分流經(jīng)含有抗治療劑抗體的基質(zhì)。另外，ITP偶聯(lián)血液細(xì)胞(包括紅細(xì)胞)的優(yōu)先除去可以通過收集和濃縮患者血液中的血細(xì)胞并且使這些細(xì)胞與固定的抗ITP抗體接觸排出患者血液的血清組分來完成。
抗ITP抗體可以經(jīng)非腸道體內(nèi)施用給接受修飾ITP或偶聯(lián)物治療的患者?？贵w將與ITP化合物和偶聯(lián)物結(jié)合。一旦鍵合，如果不是完全阻斷，ITP的活性也將受到阻礙，由此降低ITP化合物在患者血流中的生物有效濃度并且減小有害的副作用。此外，結(jié)合的抗體-ITP復(fù)合物將有助于患者血流中ITP化合物和偶聯(lián)物的清除。
現(xiàn)將通過下列非限定實(shí)施例舉例說明來全面描述本發(fā)明。
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Glu-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Tyr-酰胺的制備 100μM規(guī)模上的類似物的固相肽合成采用手動(dòng)固相合成和順序肽合成儀、利用Fmoe保護(hù)Rink Amide MBHA樹脂、Fmoc保護(hù)的氨基酸、O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中進(jìn)行，并且利用N-甲基嗎啉(NMM)的活化，F(xiàn)moc基團(tuán)的哌啶脫保護(hù)(步驟1)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚進(jìn)行，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟2)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和在λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)，通過RP-HPLC測(cè)定出所需肽的純度＞95％。
利用自動(dòng)肽合成法，將下列保護(hù)氨基酸順序加到Rink AmideMBHA樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(tBoc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(tBoc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Tyr(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-OH(步驟1)
Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)。通過RP-HPLC質(zhì)譜、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光計(jì)且利用電子噴射電離測(cè)定產(chǎn)物純度＞95％，該分光計(jì)裝配二極管組檢測(cè)器。
利用自動(dòng)肽合成法，將下列保護(hù)氨基酸順序加到Rink AmideMBHA樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(tBoc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(tBoc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Tyr(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)rnoc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-OH(步驟1)
Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加2個(gè)AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸)和3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(VarianDynamax UVD II)。通過RP-HPLC質(zhì)譜、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光計(jì)且利用電子噴射電離測(cè)定產(chǎn)物純度＞95％，該分光計(jì)裝配二極管組檢測(cè)器。
A.D-Ala2-GLP-1(7-36)酰胺的制備
100μM規(guī)模上的GLP-1類似物的固相肽合成采用手動(dòng)固相合成和順序肽合成儀、利用Fmoc保護(hù)的Rink Amide MBHA樹脂、Fmoc保護(hù)的氨基酸、O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中進(jìn)行，并且利用N-甲基嗎啉(NMM)的活化，F(xiàn)moc基團(tuán)的哌啶脫保護(hù)(步驟1)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟2)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和在λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)，通過RP-HPLC測(cè)定出所需肽的純度＞95％。
按照下面的示意圖通過從加入的賴氨酸殘基的ε-N末端開始連接來合成修飾的GLP-1肽。
B.D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(E-MPA)酰胺的制備
利用自動(dòng)肽合成法，將下列保護(hù)氨基酸順序加到Rink AmideMBHA樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(tBoc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(tBoc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Tyr(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-d-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-OH(步驟1)Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)。通過RP-HPLC質(zhì)譜、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光計(jì)且利用電子噴射電離測(cè)定產(chǎn)物純度＞95％，該分光計(jì)裝配二極管組檢測(cè)器。
A.Exendin 4的制備 Exendin-4在100μM規(guī)模上的固相肽合成利用手動(dòng)固相合成和順序肽合成儀、采用Fmoc保護(hù)的Rink Amide MBHA樹脂進(jìn)行。下列保護(hù)氨基酸順序加到該樹脂上
Fmoc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc--Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，Boc-His(Trt)-OH它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液處理20分鐘脫除Fmoc保護(hù)基(步驟1)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟2)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)。通過RP-HPLC測(cè)定所需肽純度＞95％。
B.修飾Exendin 4(SEQ ID NO18)的制備按照下面的示意圖通過從加入的賴氨酸殘基的ε-N末端開始連接來合成修飾的Exendin-4肽。 利用自動(dòng)肽合成法，將下列保護(hù)氨基酸順序加到Rink AmideMBHA樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Bpf)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，Boc-His(Trt)-OH(步驟1)Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)。通過RP-HPLC質(zhì)譜、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光計(jì)且利用電子噴射電離測(cè)定產(chǎn)物純度＞95％，該分光計(jì)裝配二極管組檢測(cè)器。
利用自動(dòng)肽合成法，將下列保護(hù)氨基酸順序加到Rink AmideMBHA樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Bpf)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，Boc-His(Trt)-OH(步驟1)Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHC13(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加2個(gè)AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸基團(tuán)和3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(VarianDynamax UVD II)。通過RP-HPLC質(zhì)譜、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光計(jì)且利用電子噴射電離測(cè)定產(chǎn)物純度＞95％，該分光計(jì)裝配二極管組檢測(cè)器。
B.修飾Exendin 3的制備利用自動(dòng)肽合成法，將下列保護(hù)氨基酸順序加到Rink AmideMBHA樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Bpf)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(OtBu)-OH，Boc-His(Trt)-OH(步驟1)通過從加入的賴氨酸殘基的ε-N末端開始連接合成修飾的Exendin-3肽。
Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)。通過RP-HPLC質(zhì)譜、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光計(jì)且利用電子噴射電離測(cè)定產(chǎn)物純度＞95％，該分光計(jì)裝配二極管組檢測(cè)器。
利用自動(dòng)肽合成法，將下列保護(hù)氨基酸順序加到Rink AmideMBHA樹脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Arg(Bpf)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(OtBu)-OH，Boc-His(Trt)-OH(步驟1)Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加兩個(gè)AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸)基團(tuán)和3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚實(shí)現(xiàn)，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在約180分鐘內(nèi)以9.5mL/min的梯度洗脫，使用Phenomenex Luna10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(VarianDynamax UVD II)。通過RP-HPLC質(zhì)譜、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光計(jì)且利用電子噴射電離測(cè)定產(chǎn)物純度＞95％，該分光計(jì)裝配二極管組檢測(cè)器。
DACGLP-1類似物在100μM規(guī)模上的固相肽合成利用手動(dòng)固相合成和順序肽合成儀、采用Fmoc保護(hù)的Rink Amide MBHA樹脂進(jìn)行。下列保護(hù)氨基酸順序增加到該樹脂上Fmoc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，Boc-His(Trt)-OH它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液處理20分鐘脫除Fmoc保護(hù)基(步驟1)。Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性脫保護(hù)采用手動(dòng)進(jìn)行且用3當(dāng)量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液處理2小時(shí)該樹脂來完成(步驟2)。隨后樹脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌。合成隨后重新自動(dòng)化用于增加3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。樹脂裂解和產(chǎn)物分離采用86％TFA/5％TIS/5％H2O/2％硫苯甲醚和2％苯酚進(jìn)行，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化，純化時(shí)采Dynamax C18，60，8μm，21mm×25cm柱，該柱帶有用DynamaxC18，60，8μm防護(hù)模塊，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)。通過RP-HPLC測(cè)定所需DAC純度＞95％。
它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液處理20分鐘脫除Fmoc保護(hù)基(步驟1)。用1％TEA/DCM處理樹脂脫下完全保護(hù)的肽(步驟2)。隨后向游離C-末端依次添加乙二胺和3-馬來酰亞胺基丙酸(步驟3)。隨后裂解保護(hù)基，用86％TFA/5％TIS/5％H2O/2％硫苯甲醚和2％苯酚分離產(chǎn)物，隨后用干冰冷卻的Et2O沉淀(步驟4)。產(chǎn)物通過反相制備性HPLC、利用Varian(Rainin)的制備性二元HPLC系統(tǒng)純化，純化時(shí)采Dynamax C18，60A，8μm，21mm×25cm柱，該柱帶有用Dynamax C18，60，8μm防護(hù)模塊，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV檢測(cè)儀(Varian Dynamax UVD II)。通過RP-HPLC測(cè)定所需DAC純度＞95％。
序列表<110>康久化學(xué)公司多米尼克·P·布里頓伯努瓦·拉爾謝維克阿朗·M·埃斯林達(dá)倫·L·霍姆斯阿努克·勒布朗瑟奇·圣皮埃爾<120>長(zhǎng)效促胰島肽<130>1610<140>PCT/US00/13653<141>2000-05-17<150>60/159,783<151>1999-10-15<150>60/134,406<151>1999-05-17<160>22<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>1His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val1 5 10 15Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu20 25 30Val Lys Gly Arg Gly35<210>2<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>2His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>3<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>3Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val1 5 10 15Xaa Gly Arg Xaa Gly Arg20<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>4Ser Asp Val Ser1<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>5Thr Ser Asp Val Ser1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>6Phe Thr Ser Asp Val Ser1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>7Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1 5<210>8<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>8Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>9Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>10Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1 5 10<210>11<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>11His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>12<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>12His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>13<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>13His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Tyr20 25 30<210>14<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>14His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr20 25 30<210>15<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>15Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Met Ile Glu1 5 10 15Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser20 25 30<210>16<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>16His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val1 5 10 15Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu20 25 30Val Lys Gly Arg Lys35<210>17<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>17His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys20 25 30<210>18<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>18His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys35 40<210>19<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>19His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ash Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys35 40<210>20<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>20His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu Met Glu Glu1 5 10 15Glu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Tyr20 25 30<210>21<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>21His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu Met Glu Glu1 5 10 15Glu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr20 25 30<210>22<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>22Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu1 5 10 15Trp Leu Lys Gly Gly Pro Ser Ser Gly Pro Pro Pro Ser20 2權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的促胰島肽或其衍生物，含有與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的反應(yīng)性基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述的反應(yīng)性基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基和馬來酰亞胺基。
3.按照權(quán)利要求2的肽，其中衍生物與血液蛋白上的巰基反應(yīng)。
4.按照權(quán)利要求1的肽，其中所述肽選自SEQID NO2、SEQIDNO3、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ IDNO15。
5.按照權(quán)利要求1的肽，其中所述肽選自SEQ ID NO16、SEQ IDNO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21和SEQ ID NO22。
6.一種用于人體糖尿病治療方法中的含有促胰島肽或其類似物的衍生物的組合物，所述衍生物含有與血液組分上的氨基、羥基、巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的反應(yīng)性基團(tuán)，其中該反應(yīng)性基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基和馬來酰亞胺基。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述衍生物與血液組分反應(yīng)。
8.權(quán)利要求6的組合物，其中所述肽選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ IDNO15。
9.權(quán)利要求6的組合物，其中所述肽選自SEQ ID16、SEQ IDNO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21和SEQ ID NO22。
10.一種促胰島肽的衍生物，該衍生物含有與人血清白蛋白上的巰基反應(yīng)形成共價(jià)鍵的馬來酰亞胺基。
11.權(quán)利要求9的衍生物，其中所述肽選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ IDNO15。
12.權(quán)利要求9的衍生物，其中所述肽選自SEQ ID16、SEQ IDNO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21和SEQ ID NO22。
13.一種用于人體糖尿病治療方法中的含有促胰島肽的衍生物的組合物，所述衍生物含有與人血清白蛋白上的巰基反應(yīng)形成共價(jià)鍵的馬來酰亞胺基。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述肽選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ IDNO15。
15.權(quán)利要求13的組合物，其中所述肽選自SEQ ID16、SEQ IDNO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21和SEQ ID NO22。
16.一種組合物在制備用于延長(zhǎng)促胰島肽在糖尿病患者的體內(nèi)半衰期的藥物中的應(yīng)用，該組合物含有促胰島肽或其類似物的衍生物，所述衍生物含有與血液組分上的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的反應(yīng)性基團(tuán)，其中該反應(yīng)性基團(tuán)選自琥珀酰亞胺基和馬來酰亞胺基。
17.按照權(quán)利要求16的組合物的應(yīng)用，其中所述生物與血液蛋白反應(yīng)。
18.按照權(quán)利要求16的組合物的應(yīng)用，其中所述肽選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ ID NO15。
19.一種促胰島肽，其選自GLP-1(1-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2、GLP-1(1-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、GLP-1(7-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2、GLP-1(7-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37-(ε-MPA)-NH2、D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、exendin-4(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2、exendin-4(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、exendin-3(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2和exendin-3(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)。
全文摘要
本發(fā)明公開了經(jīng)修飾的促胰島肽。經(jīng)修飾的促胰島肽能夠形成肽酶穩(wěn)定的促胰島肽。經(jīng)修飾的促胰島肽能夠與一種或多種血液組分形成共價(jià)鍵以生成偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物可以在體內(nèi)或離體形成。施用修飾的肽可以治療患有糖尿病和其它相關(guān)疾病的人。
文檔編號(hào)C07K14/16GK1350548SQ00806548
公開日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2000年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月17日
發(fā)明者多米尼克·P·布里頓, 伯努瓦·拉爾謝維克, 阿朗·M·埃斯林, 達(dá)倫·L·霍姆斯, 阿努克·勒布朗, 瑟奇·圣皮埃爾 申請(qǐng)人:康久化學(xué)公司