專利名稱：結(jié)合cd19的人源化抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段。更具體而言，本發(fā)明涉及結(jié)合人 ⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和/或包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；和/或包括包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和/或包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
背景技術(shù)：
B細(xì)胞表面標(biāo)志物一般被建議作為治療B細(xì)胞病癥或疾病、自身免疫病和移植排斥的靶。B細(xì)胞表面標(biāo)志物的實(shí)例包括⑶10、⑶19、⑶20、⑶21、⑶22、⑶23、⑶24、⑶37、 CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85 和 CD86 白細(xì)胞表面標(biāo)志物。已開發(fā)了特異性結(jié)合某些這類標(biāo)志物的抗體，且測試了其中一些用于治療疾病和病癥。例如，針對(duì)成熟B細(xì)胞及其惡性對(duì)應(yīng)物的特異性CD20細(xì)胞表面分子的嵌合或放射性標(biāo)記的單克隆抗體(HiAb)療法，表現(xiàn)出在體內(nèi)有效治療非霍奇金淋巴瘤(Tedder等人， Immunol. Today 15:450-454(1994) ；Press 等人，Hematology，221-24(^2001) ；Kaminski 等人，N. Engl. J. Med. ,329 :459-465(1993) ；Weiner, Semin. Oncol, 26 :43-51 (1999) ；Onrust 等人，Drugs,58 :79-88(1999) ；McLaughlin 等人，Oncology, 12 :1763-1769(1998) ；Reff 等人，Blood,83 :435-445(1994) ；Maloney 等人，Blood,90 :2188-2195(1997) ；Maloney 等人，J. Clin. Oncol, 15 :3266-3274(1997) ；Anderson 等人，Biochem. Soc. Transac, 25 :705-708(1997))。還發(fā)現(xiàn)抗⑶20單克隆抗體療法緩解了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特發(fā)性血小板減少性紫癜和溶血性貧血，以及其他免疫介導(dǎo)性疾病的表現(xiàn) (Silverman ·入，Arthritis Rheum. ,48 :1484-1492(2002) ；Edwards ^A,Rheumatology, 40 :1-7(2001) ；De Vita 等 K, Arthritis Rheumatism,46 :2029-2033(2002) ；Leandro φ A, Ann. Rheum. Dis. ,61 :883-888(2002) ；Leandro φ A, Arthritis Rheum. ,46 ^73-2677(2001))。抗CD20單克隆抗體LL_2表現(xiàn)出有效治療經(jīng)歷化療治療的進(jìn)行性和復(fù)發(fā)性淋巴瘤患者(Goldenberg 美國專利號(hào) 6，134, 982 ^P 6，306，393)。抗 CD20 (IgGl) 抗體RITUXAN(TM)成功的用于治療某些疾病，例如成人免疫血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫性溶血性貧血(Cured等人，WO 00/67796)。盡管該療法有效，但大部分的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和許多其他的B細(xì)胞惡性腫瘤不表達(dá)CD20，或者以低水平表達(dá)⑶20，或者在⑶20免疫療法后丟失了⑶20表達(dá)(Smith等人，Oncogene, 22 7359-7368(2003))。此外，⑶20的表達(dá)不能預(yù)測對(duì)抗⑶20療法的響應(yīng)，因?yàn)閮H一半的非霍奇金淋巴瘤患者響應(yīng)針對(duì)⑶20的免疫療法。人CD19分子是在人B細(xì)胞的表面上表達(dá)的結(jié)構(gòu)上不同的細(xì)胞表面受體，所述B 細(xì)胞包括但不限于前B細(xì)胞、處于早期發(fā)育中的B細(xì)胞(S卩，未成熟B細(xì)胞)、經(jīng)過終末分化為漿細(xì)胞的成熟B細(xì)胞，和惡性B細(xì)胞。大部分的前B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、 非霍奇金淋巴瘤、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、原淋巴細(xì)胞白血病、多毛細(xì)胞白血病、普通急性淋巴細(xì)胞白血病和一些Null-急性淋巴細(xì)胞白血病都表達(dá)⑶19 (Nadler等人， J. Immunol. , 131 :244-250(1983) ；Loken 等人，Blood，70 :1316-1324 (1987) ；Uckun 等人， Blood, 71 :13-29(1988) ；Anderson 等人，1984. Blood，63 1424-1433 (1984) ；Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18 =385-397 (1995)) CD19在漿細(xì)胞上的表達(dá)進(jìn)一步提示，它可能在分化的B細(xì)胞腫瘤上表達(dá)，例如多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤、Waldenstrom腫瘤(Grossbard等人， Br. J. Haematol, 102 :509-15(1998) ；Treon 等人，Semin. Oncol, 30 :248-52 Q003))。⑶19抗原也是免疫療法的多個(gè)假定靶之一。CLB-⑶19抗體(抗⑶19鼠 IgG2a mAb)表現(xiàn)出抑制移植到無胸腺小鼠中的人腫瘤的生長(Hooi jberg等人，Cancer Research, 55 :840-846 (1995))。在另一項(xiàng)研究中，使用人IgGlFc區(qū)嵌合單克隆鼠抗體 FMC63(IgG2a) (Zola 等人，Immunol Cell Biol 69:411-22(1991))。該抗體不在體外誘導(dǎo)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性或ADCC，其施用到有人B細(xì)胞淋巴瘤的SCID小鼠(異種移植模型)中導(dǎo)致中等但非特異性的殺傷所移植的腫瘤細(xì)胞(Pietersz等人，Cancer Immunol. Immunother. ,41 :53-60(1995))。使用植入腫瘤的異種移植小鼠模型獲得的結(jié)果導(dǎo)致在人類患者中使用鼠抗CD19 抗體的研究。將鼠CLB-CD 19抗體施用到6位診斷為進(jìn)行性非霍奇金淋巴瘤的患者中，上述患者未能在之前用常規(guī)療法(化療或放療)成功治療。給予這些患者的總抗體劑量是從 225 至 IOOOmg (Hekman 等人，Cancer Immunol. Immunotherapy, 32 :364-372 (1991))。雖然在抗體注入后，兩名患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞暫時(shí)降低了，但是在兩個(gè)階段的抗體治療后，僅1 名患者實(shí)現(xiàn)了部分減輕。從該小組復(fù)發(fā)型患者中不能得出關(guān)于治功效果的任何結(jié)論。之后，這些研究人員展示了在移植模型中，未綴合的CD20mAb的抗腫瘤效應(yīng)遠(yuǎn)高于 CD 19mAb 的(Hooijberg 等人，Cancer Res. ,55 :840-846(1995)；禾口 Hooijberg 等人， Cancer Res. ,55 :2627-2634(1995)) 此外，他們未觀察到當(dāng)組合使用CD19和CD20mAb時(shí)的增益或協(xié)同效應(yīng)(Hooijberg等人，Cancer Res.，55 :840-846 (1995))。雖然異種移植動(dòng)物模型被視為是對(duì)人類對(duì)象的功效的不充分的預(yù)后指示物，但是在上述動(dòng)物研究中獲得的消極結(jié)果打消了對(duì)裸露的抗CD19抗體療法的興趣?；诳笴D19抗體的免疫毒素的應(yīng)用產(chǎn)生了同樣令人失望的結(jié)果。在早期臨床試驗(yàn)中，將B4抗CD19抗體(鼠IgGlmAb)與植物毒素蓖麻毒蛋白綴合，施用給之前在常規(guī)療法中失敗的患多發(fā)性骨髓瘤(Grossbard 等人，British Journal of Haematology, 102 509-515(1998))、高等非霍奇金淋巴瘤(advanced non-Hodgkin，s lymphoma) (Grossbard 等人，Clinical Cancer Research, 5 :2392-2398 (1999))，和復(fù)發(fā)性 B 細(xì)胞惡性腫瘤 (Grossbard等人，Blood，79 :576-585(1992))的人類患者。這些試驗(yàn)一般性的證實(shí)了向人類施用B4-蓖麻毒蛋白綴合物的安全性；然而，相比RITUXAN(TM)的臨床試驗(yàn)(Grossbard 等人，Clinical Cancer Research，5 :2392-2398 (1999))，結(jié)果是混雜的，而響應(yīng)速率則令人失望。此外，顯著一部分的患者出現(xiàn)了人抗小鼠抗體(HAMA)響應(yīng)或人抗蓖麻毒蛋白抗體 (HARA)響應(yīng)。考慮到使用裸露的抗CD19抗體或基于抗CD19抗體的免疫毒素的現(xiàn)有療法產(chǎn)生同樣令人失望的結(jié)果，需要開發(fā)更有效地治療CD19介導(dǎo)的病癥的抗CD19抗體，例如，通過觸發(fā)凋亡和阻斷B細(xì)胞增殖，以及介導(dǎo)通過ADCC的殺傷，能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的抗 CD19抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明一般涉及結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其制備和使用的方法，包括治療CD19介導(dǎo)的病癥的方法。本發(fā)明的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段表現(xiàn)出多種理想的特性，包括例如ADCC活性、誘導(dǎo)凋亡和抑制B細(xì)胞增殖。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :27的氨基酸序列的重鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 的氨基酸序列的重鏈⑶R2， 和/或包含SEQ ID N0:29的氨基酸序列的重鏈⑶R3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1，和 /或包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和/或包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含 SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重鏈 ⑶R2，和/或包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；和/或包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和/或包含 SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括選自 SEQ ID NO 19、20、21、22和42的重鏈可變區(qū)序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括這樣的重鏈可變框架區(qū)，所述重鏈可變框架區(qū)是選自V3-33 * 01 (SEQ ID NO :11)、V3_11 * 01 (SEQ ID NO 12) ,V3-30 * -18 (SEQ ID NO :13)和 V3-48 * 01 (SEQ ID NO 14)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括選自 SEQ ID NO :23,24,25,26和41的輕鏈可變區(qū)序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括這樣的輕鏈可變框架區(qū)，所述輕鏈可變框架區(qū)是選自V1-5 * 03 (SEQ ID NO :3)、V1-27 * 01 (SEQ ID NO :4)、Vl-39 * -01 (SEQ ID NO :5)和 Vl-12 * 01 (SEQ ID NO :6)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括選自 SEQ ID NO :33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、54 和 55 的重鏈可變區(qū)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括選自 SEQ ID NO :25、38、39、40、48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62 和 63 的輕鏈可變區(qū)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括(a)包含SEQ ID NO 64的氨基酸序列的重鏈序列；和(b)包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括(a)包含SEQ ID NO 66的氨基酸序列的重鏈序列；禾口(b)包含SEQ ID NO 67的氨基酸序列的輕鏈序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括CN 102421800 A
說明書
4/69 頁 (a)包含SEQ ID NO 66的氨基酸序列的重鏈序列；和(b)包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括人重 (鏈)和/或輕(鏈)恒定區(qū)，其中所述人重(鏈)恒定區(qū)包括同種型變體，所述變體包含人IgGl的CHl、人IgGl的鉸鏈區(qū)和人IgG3的Fc區(qū)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的包含變體人IgG Fc區(qū)的人源化抗體或其片段，其中所述變體人IgG Fc區(qū)包括相對(duì)于親本抗體的人IgG Fc區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾，而包含變體人IgG Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)出相比親本抗體改變的效應(yīng)子功能。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述抗體包括變體人IgG Fc區(qū)，所述變體人IgG Fc區(qū)包含用天冬酰胺替換親本抗體的氨基酸324 位的絲氨酸的氨基酸取代S3MN，而包括所述變體人IgG Fc區(qū)的抗體相比親本抗體表現(xiàn)出改善的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，所述抗體具有各種理想的特性，例如與Raji腫瘤細(xì)胞結(jié)合、與人⑶19結(jié)合(具有的親和力(Kd)為50nM 或更低)、保留了相應(yīng)嵌合抗體的至少20%的CD19結(jié)合親和力(Kd)、競爭結(jié)合Raji腫瘤細(xì)胞(具有的親和力(Ki)為50nM或更低)、在Raji腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡、在Raji腫瘤細(xì)胞中的ADCC活性、抑制惡性B細(xì)胞的增殖、抑制Raji腫瘤細(xì)胞的克隆發(fā)生、導(dǎo)致血液中的B 細(xì)胞耗盡、在Raji腫瘤細(xì)胞中內(nèi)化和FAB片段熱穩(wěn)定溫度大于65°C。本發(fā)明還提供了編碼結(jié)合人CD19的人源化抗體及其片段的分離的核酸、載體，和包含所述核酸或載體的宿主細(xì)胞。還提供了包含所述人源化抗體或其片段以及藥學(xué)可接受的載體的組合物，和包括與治療劑連接的所述人源化抗體或其片段的免疫綴合物。本發(fā)明還提供了治療CD19介導(dǎo)的病癥的方法、抑制表達(dá)CD19的腫瘤細(xì)胞生長的方法，和在需要此類治療的對(duì)象中耗盡B細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了藥盒和制品，其包括所述人源化抗體或其片段、用于治療CD19介導(dǎo)的病癥的組合物或免疫綴合物。
附圖簡介圖IA和IB顯示了流式細(xì)胞儀分析，確定移植到人受體抗體框架上的FMC63-CDR 在Raji腫瘤細(xì)胞上的結(jié)合活性。圖2A和2B顯示了 FMC63的輕鏈(A)或重鏈⑶可變區(qū)與選定的VBASE2的種系框架和CDR移植供體擴(kuò)增框架的比對(duì)。使用Kabat編號(hào)，并顯示在編號(hào)行下。圖3顯示了由流式細(xì)胞儀所確定的人源化抗體在SU-DHL-6人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞上的結(jié)合活性。圖4A和4B顯示了人源化抗⑶19抗體的katchard分析曲線。使用銪標(biāo)記的抗體在Raji腫瘤細(xì)胞上實(shí)施分析。圖5A和5B顯示了人源化抗CD19抗體對(duì)Raji腫瘤細(xì)胞的ADCC活性。圖6顯示了人源化抗⑶19抗體對(duì)Raji腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡。圖7A顯示了人源化抗⑶19抗體抑制SU-DHL-6人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖。圖7B 顯示了用人源化抗CD19抗體治療后的Raji腫瘤細(xì)胞的克隆發(fā)生。
圖8顯示了抗CD19抗體在Raji腫瘤細(xì)胞中的內(nèi)化。內(nèi)化受肥皂草毒蛋白綴合的二抗(Hum-ZAP)的細(xì)胞毒性監(jiān)控。圖 9 顯示了與野生型 VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A 比較，S324 位的抗 CD19 抗體突變體的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC) =(I)IgGl對(duì)照抗體；(2)VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (3)VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/ N92A ；(4)VH16R94K/S324G-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (5)VH16R94K/S324A-VL43V3Q/T7S/ P44I/N92A ； (6)VH16R94K/S324V-VL433Q/T7S/P44I/N92A ； (7)VH16R94K/S324L-VL43V3Q/ T7S/P44I/N92A ； (8)VH16R94K/S324I-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (9)VH16R94K/ S324P-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (10)VH16R94K/S324T-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (11) VH16R94K/S324C-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (12)VH16R94K/S324M-VL43V3Q/T7S/P44I/ N92A ；(13)VH16R94K/S324Q-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (14)VH16R94K/S324F-VL43V3Q/ T7S/P44I/N92A ； (15)VH16R94K/S324Y-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (16)VH16R94K/ S324W-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (17)VH16R94K/S324R-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (18) VH16R94K/S324D-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (19)僅血清。

圖10顯示了在似69、S298和S3M位上具有取代的抗⑶19抗體變體的⑶C測定(1)陰性對(duì)照——無抗體；⑵ IgGl 對(duì)照抗體；(3)VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (4)VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (5)VH16R94K/S298A/S324N-VL43V3Q/T7S/ P44I/N92A ； (6)VH16R94K/E269D/S298A/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A.圖11顯示了選定的抗CD19抗體變體的基于細(xì)胞的ADCC測定(1)陰性對(duì)
照-無抗體；( IgGl 對(duì)照抗體；C3)VH16R94K-VL43V3Q/I7S/P44I/N92A ； (4) VH16R94K/
S298A-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (5)VH16R94K/E269D/S298A-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A0圖12顯示了選定的抗⑶19抗體變體的基于細(xì)胞的ADCC測定=(I)IgGl對(duì)照抗體；(2) VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (3) VH16R94K(1133) -VL43V3Q/T7S/P44I/ N92A ；(4)VH16R94K/K274Q-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (5)VH16R94K/N276K-VL43V3Q/T7S/ P44I/N92A ； (6)VH16R94K/K334R-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (7)VH16R94K/S324N-VL43V3Q/ T7S/P44I/N92A； (8)VH16R94K/K274Q/N276K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A； (9)VH16R94K/ K274Q/N276K/K334R-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (10)陰性對(duì)照——無抗體——無血清； (11)陰性對(duì)照——僅血清。圖13顯示了去巖藻糖基化的抗CD19抗體變體的基于細(xì)胞的ADCC測定⑴ 陰性對(duì)照——無抗體；(2) IgGl 對(duì)照抗體；(3) VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (4) VH16R94K(shRNA)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (5)VH16R94K(GNTIII)-VL43V3Q/T7S/P44I/ N92A ； (6)VH16R94K/E269D/S298A(shRNA)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (7)VH16R94K/E269D/ S298A(GNTIII)-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A.圖14顯示了在SCID小鼠的脾臟中檢測到的抗⑶19抗體變體的B細(xì)胞耗盡(總B 細(xì)胞的ACN) :(1)陰性對(duì)照——無人PBMC ； (2)人PBMC——Herceptin ；⑶Apbmc——
Mabthera ； (4)人 PBMC-VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (5)人 PBMC-
VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A0圖15顯示了在SCID小鼠的脾臟中檢測到的抗CD19抗體變體的B細(xì)胞耗盡(總B細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))(1)陰性對(duì)照一無人PBMC ；⑵人PBMC—Herceptin ；⑶
人 PBMC-Mabthera ； (4)人 PBMC-VH16R94K-VL43V3Q/T7S/P44I/N92A ； (5)人
PBMC-VH16R94K/S324N-VL43V3Q/T7S/P44I/N92Ao發(fā)明詳述本發(fā)明涉及結(jié)合人⑶19的人源化抗體及其片段。本文中使用的術(shù)語“人⑶19”包括人⑶19的變體、同種型和物種同源物。因此， 在某些情況下，本發(fā)明的人源化抗體可與人以外的物種的CD19交叉反應(yīng)。在某些情況下， 抗體可以完全對(duì)一種或多種人CD19蛋白特異并且可以不表現(xiàn)出物種或其它類型的非人交叉反應(yīng)。示例性的人⑶19的完整氨基酸序列具有SwissProt登錄號(hào)P 15391 (SEQ ID NO: 125)。CD19也被稱為B細(xì)胞表面抗原B4、B細(xì)胞抗原⑶19、⑶19抗原和Leu-12。人CD19 被 Entrez Gene 稱為 GeneID :930，被 HGNC 稱為 HGNC :1633。CD19 可以被稱為 CD19 的基因編碼。本文中“人CD19”的使用涵蓋了人CD19的所有已知的或仍未被發(fā)現(xiàn)的等位基因和多態(tài)形式。如未另外具體指出，則本文中使用的術(shù)語“CD19”指“人CD19”。本文中使用的術(shù)語“結(jié)合人CD19的抗體”包括結(jié)合人CD19的親和力(Kd)為500nM 或更低，優(yōu)選IOOnM或更低，更優(yōu)選50nM或更低的抗體，優(yōu)選IgG抗體，所述人CD19例如在 Raji腫瘤細(xì)胞的表面表達(dá)的人⑶19，所述細(xì)胞如Raji腫瘤細(xì)胞DSMZ ACC319。本文中使用的“B細(xì)胞”或“B淋巴細(xì)胞”意指在骨髓中發(fā)育的淋巴細(xì)胞類型，其在血液和淋巴液中循環(huán)，并提供體液免疫。B細(xì)胞識(shí)別游離的抗原分子，并分化或成熟為分泌使抗原失活的免疫球蛋白(抗體)的漿細(xì)胞。還產(chǎn)生記憶細(xì)胞，所述細(xì)胞在之后遇到此類抗原時(shí)制造特定的免疫球蛋白(抗體)。在胰島(islet of Langerhans)中，B細(xì)胞也被稱為“β細(xì)胞”。本文中使用的術(shù)語“抗體”包括完整的抗體和任何抗原結(jié)合片段或其單鏈?！翱贵w” 指包括通過二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白，或其抗原結(jié)合片段。每條重鏈都包括重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈都包括輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)。 輕鏈恒定區(qū)包括一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，其分散在被稱為框架區(qū)(FR或FW)的更保守的區(qū)域中。每個(gè)VH和VL都包括3個(gè) CDR和4個(gè)FR，按下列順序從氨基端向羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。 重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)子細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一補(bǔ)體(CIq)。本文中使用的術(shù)語“嵌合抗體”包括這樣的抗體，其中可變區(qū)序列源自一個(gè)物種， 而恒定區(qū)序列源自另一個(gè)物種，例如可變區(qū)序列源自小鼠抗體，而恒定區(qū)序列源自人抗體的抗體。本文中使用的術(shù)語“人源化抗體”包括這樣的抗體，其中源自另一種哺乳動(dòng)物物種 (例如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人的框架序列上。在人的框架序列和源自另一種哺乳動(dòng)物物種的種系的CDR序列中也可以進(jìn)行額外的框架區(qū)修飾。本文中使用的術(shù)語“人抗體”包括這樣的抗體，所述抗體具有框架和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。此外，如果所述抗體含有恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包括不是人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外的隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或者通過體內(nèi)的體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，本文中使用的術(shù)語“人抗體”并非意在包括這樣的抗體，所述抗體中源自另一種哺乳動(dòng)物物種 (例如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人的框架序列上。如果抗體的可變框架區(qū)獲得自使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)，則本文中使用的人源化抗體包括這樣的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)，所述可變框架區(qū)是特定的人種系序列 (人基因)的“產(chǎn)物”或“源自”所述特定的人種系序列。此類系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩選展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫。可以通過比較人源化抗體的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列，來鑒別包括這樣的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的人源化抗體，所述可變框架區(qū)是人種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“源自”所述人種系免疫球蛋白序列。包括是特定的人種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的人源化抗體具有氨基酸序列與特定的人種系免疫球蛋白序列的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)100%相同的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)。由于例如天然存在的體細(xì)胞突變或有意導(dǎo)入的定點(diǎn)突變，相比特定種系序列的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)，包括“源自”所述特定的人種系免疫球蛋白序列的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的人源化抗體可含有氨基酸差異。然而，通常選定的人源化抗體的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列與由人種系免疫球蛋白基因的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)編碼的氨基酸序列至少90%相同，并且，當(dāng)相比其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠種系序列)時(shí)，含有鑒別所述人源化抗體是源自人的氨基酸殘基。 在某些情況下，人源化抗體的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列與由種系免疫球蛋白基因編碼的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列可優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，最優(yōu)選至少97%，特別是至少98%，最特別是至少99%相同。通常，源自特定的人種系序列的人源化抗體的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)將展現(xiàn)出與由人種系免疫球蛋白基因編碼的重鏈或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列不超過10個(gè)、優(yōu)選不超過5個(gè)、或者甚至更優(yōu)選不超過4、3、2或 1個(gè)氨基酸差異。本文中使用的術(shù)語“Fab”或“Fab區(qū)”包括包含VH、CHI、VL和CL免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多肽。Fab可以指分離的該區(qū)域，或者位于全長抗體或抗體片段環(huán)境中的該區(qū)域。本文中使用的術(shù)語“Fe”或“Fe區(qū)”包括包含除第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以外的抗體恒定區(qū)的多肽。因而，F(xiàn)c指IgA、IgD和IgG的最后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域， 和IgE和IgM的最后三個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，和這些結(jié)構(gòu)域N端的柔性鉸鏈。對(duì)于 IgA和IgM，F(xiàn)c可包括J鏈。對(duì)于IgG，F(xiàn)c包括免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域Cy2和Cy3(C[y]2和 (卜]3)，和在(^1(([^]1)和CY2(C[Y]2)之間的鉸鏈。雖然Fc區(qū)的邊界可以改變，但人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為在其羧基端包含殘基或P230，其中編號(hào)是根據(jù)Kabat的 EU索引。對(duì)于人IgGl，F(xiàn)c在本文定義為包含殘基P232至其羧基端，其中編號(hào)是根據(jù)Kabat 中的EU索引。Fc可以指分離的該區(qū)域，或者位于Fc多肽，例如抗體，環(huán)境中的該區(qū)域。本文中的術(shù)語“鉸鏈”或“鉸鏈區(qū)”或“抗體鉸鏈區(qū)”包括包含在抗體的第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸的柔性多肽。結(jié)構(gòu)上，IgG CHl結(jié)構(gòu)域終止于EU 220位，IgG CH2 結(jié)構(gòu)域始于殘基EU 237位。因而，對(duì)于IgG，本文中抗體鉸鏈定義為包括221 (IgGI的D221) 至231 (IgGI的A231)位，其中編號(hào)是根據(jù)Kabat的EU索引。
本文中使用的術(shù)語“親本抗體”或“親本免疫球蛋白”包括未修飾的抗體，所述抗體之后經(jīng)修飾產(chǎn)生變體。所述親本抗體可以是天然存在的抗體，或者天然存在的抗體的變體或改造版本。親本抗體可以指抗體本身，包含所述親本抗體的組合物，或其編碼氨基酸序列。本文中使用的“親本抗CD19抗體”意指結(jié)合人CD19的抗體或免疫球蛋白，并經(jīng)修飾產(chǎn)生變體。本文中使用的術(shù)語“親本抗體”或“親本免疫球蛋白，，包括之后經(jīng)修飾產(chǎn)生人源化抗體的鼠抗體或嵌合抗體。本文中使用的術(shù)語“變體抗體”或“抗體變體”包括由于相比親本的至少一個(gè)氨基酸修飾，而不同于親本抗體序列的抗體序列。本文中的變體抗體序列優(yōu)選的具有與親本抗體序列至少約80%，最優(yōu)選至少約90%，更優(yōu)選至少約95%的氨基酸序列同一性。抗體變體可以指抗體本身，包含所述親本抗體的組合物，或編碼其的氨基酸序列。本文中的術(shù)語“氨基酸修飾”包括在多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。 本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一種氨基酸替換親本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指這樣的變體多肽，其中94位的精氨酸被賴氨酸替換，此情況為重鏈可變框架區(qū)變體。對(duì)于前例，94K表示用賴氨酸取代94位。出于本文的目的，通常通過斜杠分隔多個(gè)取代。例如，R94K/L78V指包含取代R94K和L78V的雙變體。本文中使用的 “氨基酸插入”或“插入”意指在親本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。例如，插入-94表示在94位的插入。本文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除親本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如R94-表示刪除94位的精氨酸。本文中使用的術(shù)語“保守修飾”或“保守序列修飾”意指不顯著影響或改變含有所述氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。此類保守修飾包括氨基酸取代、插入和缺失?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將修飾導(dǎo)入本發(fā)明的抗體中，例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。保守的氨基酸取代是用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換氨基酸殘基的取代。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括含堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如、天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈 (例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。 因而，可以用其他相同側(cè)鏈家族的氨基酸殘基替換本發(fā)明抗體的CDR區(qū)中或框架區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并可以測試所改變的抗體(變體抗體)保留的功能。本發(fā)明中討論的所有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)位置，都根據(jù)Kabat的EU索引編號(hào) (Kabat 等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,通過弓|用全文整合)?！癒abat的EU索引”指人IgGl EU抗體的殘基編號(hào)，如Edelman等人，1969， Biochemistry 63 :78-85本文中使用的術(shù)語“全長抗體”包括構(gòu)成抗體的天然生物學(xué)形態(tài)的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)。例如，在大部分哺乳動(dòng)物包括人和小鼠中，IgG類的全長抗體是四聚體，由兩對(duì)相同的成對(duì)免疫球蛋白鏈組成，每對(duì)都具有一條輕鏈和一條重鏈，每條輕鏈都包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VL和CL,每條重鏈都包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VH、CHl (C[y]l),CH2(C[y]2)和CH3(C[ y]3)0在一些哺乳動(dòng)物中，例如駱駝和美洲駝，IgG抗體可以只由兩條重鏈組成， 每條重鏈都包含與Fc區(qū)連接的可變結(jié)構(gòu)域?？贵w片段包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段，包括 Fab，和Fab，-SH，(ii) VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段，(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由單個(gè)可變區(qū)組成的dAb片段(Ward等人，1989，Nature 341 544-546) ； (v)F(ab' ) 2片段，包含2個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；(vi)單鏈Fv分子 (scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連接，所述接頭允許兩個(gè)結(jié)構(gòu)域關(guān)聯(lián)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird 等人，1988，Science 242 :423-426 ；Huston 等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :5879-5883) ； (vii)雙特異性單鏈 Fv 二聚體(PCT/US92/09965)； (viii)“二體”或“三體”，通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(Tomlinson等人，2000， Methods Enzymo 1. 326 :461-479 ；W094/13804 ；Holliger 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 :6444-6448)；和(ix)與相同或不同抗體遺傳融合的 scFv(Coloma&Morrison， 1997, Nature Biotechnology 15，159-163)。根據(jù)恒定區(qū)基因測定，將抗體分類，也稱為同種型。人的恒定輕鏈分為κ (CK)和 λ (C[x ])輕鏈。重鏈分為μ、δ、Υ、α或ε，并分別定義抗體的同種型IgM、IgD、IgG、 IgA和IgE。IgG類是最常用于治療目的的。在人中，該類別包括亞類IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4。在小鼠中，該類別包括亞類IgGU IgG2a、IgG2b和IgG3。IgM具有亞類，包括但不限于IgMl和IgM2。IgA具有若干亞類，包括但不限于IgAl和IgA2。因而，本文中使用的“同種型”意指通過恒定區(qū)的化學(xué)和抗原特征定義的免疫球蛋白的任何類或亞類。已知的人免疫球蛋白同種型是 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgMl、IgM2、IgD 和 IgE。本文中使用的術(shù)語“ADCC”或“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”包括細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc[ γ ]R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，之后導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解。在各個(gè)方面，增強(qiáng)的ADCC效應(yīng)子功能可以意指增強(qiáng)的效價(jià)或增強(qiáng)的功效。實(shí)驗(yàn)背景中使用的“效價(jià)”意指當(dāng)觀察特定的治功效應(yīng)EC50時(shí)抗體的濃度(半最大有效濃度)。實(shí)驗(yàn)背景中使用的“功效”意指飽和水平的抗體的最大可能的效應(yīng)子功能。本文中使用的術(shù)語“ADCP”或“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用”包括細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc[ γ ]R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，之后導(dǎo)致靶細(xì)胞的吞噬作用。本文中使用的術(shù)語“⑶C”或“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”包括這樣的反應(yīng)，其中一種或多種補(bǔ)體蛋白質(zhì)組分識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，之后導(dǎo)致靶細(xì)胞的裂解。本文中使用的術(shù)語“效應(yīng)子功能”包括由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體相互作用導(dǎo)致的生物化學(xué)事件。效應(yīng)子功能包括Fc [ γ ] R-介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，例如ADCC和ADCP，和補(bǔ)體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，例如CDC。本文中使用的術(shù)語“對(duì)象”包括任何人或非人動(dòng)物。術(shù)語“非人動(dòng)物”包括所有的脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、 爬行類等。優(yōu)選的對(duì)象是人。本文中使用的術(shù)語“同種型變體”包括這樣的氨基酸修飾，所述氨基酸修飾將一種同種型的至少一個(gè)氨基酸，優(yōu)選將一種同種型的重鏈恒定區(qū)的至少一個(gè)氨基酸，轉(zhuǎn)化為不同的、匹配的同種型中的相應(yīng)氨基酸。氨基酸修飾可包括整個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)化，或者優(yōu)選一種同種型的Fc區(qū)轉(zhuǎn)化為不同的同種型，例如人IgGl重鏈恒定區(qū)的Fc區(qū)轉(zhuǎn)化為人IgG3的Fc區(qū)導(dǎo)致同種型變體包含人IgGl的CH1、人IgGl的鉸鏈和人IgG3的Fc區(qū)。本文中使用的術(shù)語“同種型修飾”包括將一種同種型的一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)化為不同的、 匹配的同種型中的相應(yīng)氨基酸的氨基酸修飾。例如，因?yàn)镮gGl在Kabat的296位具有酪氨酸，而IgG2具有苯丙氨酸，所以IgG2中的M96Y取代被認(rèn)為是同種型修飾。本文中使用的術(shù)語“成熟的核心糖類結(jié)構(gòu)”包括與Fc區(qū)連接的加工的核心糖類結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)一般包括糖類結(jié)構(gòu)GlcNAc (巖藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2,即，如下示意性呈現(xiàn)的典型二觸角(biantermary)寡糖
GlcNAc(p 1，2) Mana 1,6Fuc(a 1，6)
Man(pl,4) -^GlcNAc(pi,4) GlcNAc GlcNAc(pi,2) —ManaU^7該術(shù)語具體包括缺少β l，2GlcNAc殘基的G-I型核心成熟糖類結(jié)構(gòu)。然而優(yōu)選的， 核心糖類結(jié)構(gòu)包括兩種β l，2GlcNAc殘基。本文中的成熟核心糖類結(jié)構(gòu)一般不是高甘露糖基化的。成熟核心糖類結(jié)構(gòu)與糖蛋白的Fc區(qū)連接，一般通過N連接至Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的 Asn297?？笴D19 抗體在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含 SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重鏈 ⑶R2，和/或包含SEQ ID N0:29的氨基酸序列的重鏈⑶R3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1， 和/或包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和/或包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈CDR3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶Rl，和/或包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和/或包含SEQ ID NO J9的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；和/或包括包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和 /或包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。優(yōu)選的，所述結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :27的氨基酸序列的重鏈⑶Rl，包含SEQ ID NO 的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和包含SEQ ID NO :29的氨基酸序列的重鏈⑶R3，和/或包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶Rl，包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和包含 SEQ ID N0:32的氨基酸序列的輕鏈CDR3。更優(yōu)選的，所述結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :27的氨基酸序列的重鏈⑶Rl，包含SEQ ID NO 的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和包含SEQ ID NO : 的氨基酸序列的重鏈⑶R3;和包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶Rl，包含SEQ ID NO :31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。本領(lǐng)域普遍已知⑶R3結(jié)構(gòu)域不依賴于⑶Rl和/或⑶R2結(jié)構(gòu)域，單獨(dú)就可以確定抗體對(duì)同族抗原的結(jié)合特異性，基于共同的CDR3序列可以可預(yù)測的產(chǎn)生具有相同結(jié)合特異性的多種抗體。參見例如 Klimka 等人，British J. of Cancer 83(2) =252-260(2000) (描述了僅使用鼠抗⑶30抗體Ki-4的重鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶R3生產(chǎn)人源化抗⑶30抗體)； Beiboer 等人，J. Mol. Biol. 296 :833-849(2000)(描述了僅使用親本鼠 M0C-31 抗 EGP-2 抗體的重鏈CDR3序列生產(chǎn)重組的上皮糖蛋白_2(EGPD抗體)；Rader等人，Proc. Natl Acad. Sci U. S. Α. 95 :8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整聯(lián)蛋白[α ] ν[ β ] 3 抗體 LM609 的重鏈和輕鏈可變CDR3結(jié)構(gòu)域的一組人源化抗整聯(lián)蛋白[α ]ν[ β ]3抗體，其中每個(gè)抗體成員在CDR3結(jié)構(gòu)域之外都包括不同的序列，并能夠以與親本鼠抗體同樣高或更高的親和力結(jié)合與親本鼠抗體相同的表位)；Barbas等人，J. Am. Chem. Soc. 116 :2161-2162(1994) (描述了 CDR3結(jié)構(gòu)域?yàn)榭乖Y(jié)合提供了最重要的貢獻(xiàn))。因此，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體及其片段，其包括來自非人動(dòng)物抗體的一個(gè)或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，例如來自鼠抗體(如FMC63)的，特別是包括包含SEQ ID NO 29的氨基酸序列的重鏈⑶R3，和/或包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈CDR3，其中所述抗體能夠結(jié)合CD19。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括來自非人動(dòng)物抗體的一個(gè)或多個(gè)重鏈和/或輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，所述抗體與相應(yīng)的親本非人(例如鼠)抗體(a)能夠競爭結(jié)合；(b)保留功能特征；(c)結(jié)合相同的表位；和/或(d)具有相似的結(jié)合親和力。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括選自 SEQ ID NO :19、20、21、22和42的重鏈可變區(qū)序列，優(yōu)選選自SEQ ID NO :21、22和42的重鏈可變區(qū)序列，更優(yōu)選包含SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括選自 SEQ ID NO :23、24、25、26和41的輕鏈可變區(qū)序列，優(yōu)選選自SEQ ID NO :25和41的輕鏈可變區(qū)序列，更優(yōu)選包含SEQ ID NO 41的輕鏈可變區(qū)序列。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段包括選自SEQ ID NO :19、 20、21、22和42的重鏈可變區(qū)序列和選自SEQ ID NO :23、對(duì)、25、沈和41的輕鏈可變區(qū)序列，優(yōu)選選自SEQ ID NO :21、22和42的重鏈可變區(qū)序列和選自SEQ ID NO :23,24,25,26 ^P 41的輕鏈可變區(qū)序列，更優(yōu)選選自SEQ ID NO :21、22和42的重鏈可變區(qū)序列和選自SEQ ID NO 25和41的輕鏈可變區(qū)序列，最優(yōu)選包含SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)序列和包含SEQ ID NO 41的輕鏈可變區(qū)序列?？紤]到這些重鏈和輕鏈可變區(qū)序列各自可以結(jié)合人⑶19，可以“混合和匹配”重鏈和輕鏈可變區(qū)序列來產(chǎn)生本發(fā)明的抗CD19結(jié)合分子?？梢允褂美鐚?shí)施例中描述的結(jié)合測定，來測試此類“混合和匹配”的抗體的CD19結(jié)合。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段的變體。因而， 本發(fā)明提供了人源化抗體或其片段，具有與重鏈或輕鏈的(例如分別如SEQ ID N0:21或 SEQ ID NO :41的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的)親本人源化抗體的重鏈和/或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列至少80%相同的重鏈和/或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列(具有至少 80%氨基酸序列同一性)。優(yōu)選的，重鏈和/或輕鏈可變框架區(qū)的氨基酸序列同一性是至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，特別是96 %，更特別97 %，甚至更特別98 %，最特別 99%，包括例如 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和100%。本文中關(guān)于氨基酸序列的同一性或同源性定義為在比對(duì)序列和為了實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性，在必要時(shí)導(dǎo)入空位后，候選序列中與結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段相同的氨基酸殘基的百分比。因而，可以通過通常用于比較兩條多肽的氨基酸位置相似性的標(biāo)準(zhǔn)方法，來確定序列同一性。使用計(jì)算機(jī)程序例如BLAST或FASTA，比對(duì)兩條多肽各自氨基酸的最佳匹配(沿一條或兩條序列的全長或者沿一條或兩條序列預(yù)定的部分)。程序提供了默認(rèn)的開放罰分和默認(rèn)的空位罰分，評(píng)分矩陣?yán)?PAM250(標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分矩陣；參見Dayhoff 等人，in Atlas of Protein Sequence and Mructure，第5卷，第3期增補(bǔ)(1978))可與計(jì)算機(jī)程序結(jié)合使用。例如，百分比同一性可計(jì)算為相同匹配的總數(shù)乘以100，再除以匹配跨度中較長序列的總長度和為了比對(duì)兩條序列向較長序列中導(dǎo)入的空位數(shù)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明因而提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括與SEQ ID N0:19、20、21、22或42的框架區(qū)序列至少80%相同的重鏈可變框架區(qū)序列，和/或與SEQ ID NO :23、對(duì)、25、沈和41的框架區(qū)序列至少 80 %相同的輕鏈可變框架區(qū)序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括與SEQ ID NO :21、22或42的框架區(qū)序列至少80%相同的重鏈可變框架區(qū)序列，和/或與SEQ ID NO 25或41的框架區(qū)序列至少80%相同的輕鏈可變框架區(qū)序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括與SEQ ID NO :21的框架區(qū)序列至少80%相同的重鏈可變框架區(qū)序列，和/或與SEQ ID NO 41的框架區(qū)序列至少80%相同的輕鏈可變框架區(qū)序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括如上文所述的重鏈和/或輕鏈CDR，并還包括這樣的重鏈可變框架區(qū)，所述重鏈可變框架區(qū)是選自 V3-33 * 01 (SEQ ID N0:11)、V3_11 * 01 (SEQ ID N0:12)、V3_30 * _18(SEQ ID NO :13) 和V3-48 01 (SEQ ID NO :14)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因；優(yōu)選這樣的重鏈可變框架區(qū)，所述重鏈可變框架區(qū)是V3-30 * -18 (SEQ ID NO 13)或V3-48 * 01 (SEQ ID NO: 14)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因；更優(yōu)選這樣的重鏈可變框架區(qū)，所述重鏈可變框架區(qū)是V3-30 -18 (SEQ ID NO :13)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因。重鏈可變框架區(qū)可包括一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3和/或4個(gè))重鏈框架區(qū)序列(例如，框架I(FWl)、框架2(FW2)、框架3(FW3)和/或框架4 (FW4))，其存在于這些人基因的產(chǎn)物中或源自這些人基因。優(yōu)選的，重鏈可變區(qū)框架包括FWl、FW2和/或FW3，更優(yōu)選FWl、FW2和/或FW3，存在于選自 V3-33 * 01 (SEQ ID N0:11)、V3_11 * 01 (SEQ ID N0:12)、V3_30 * -18 (SEQ ID NO 13)和V3-48 ★ OKSEQ ID NO :14)的人基因的產(chǎn)物中或源自所述人基因。本文使用的重鏈框架區(qū)序列包括FWl (位置1至位置25)、FW2 (位置36至位置49)、FW3 (位置66至位置94)和FW4 (位置103至位置11 ，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示所述氨基酸位置。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括這樣的輕鏈可變框架區(qū)，所述輕鏈可變框架區(qū)是選自V1-5 * 03 (SEQ ID NO :3)、V1-27 * 01 (SEQID NO :4)、Vl-39 * -01 (SEQ ID NO 5)和 V1-12 * 01 (SEQ ID NO 6)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因；優(yōu)選這樣的輕鏈可變框架區(qū)，所述輕鏈可變框架區(qū)是V1-39 ★ -OKSEQ ID NO 5)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因。輕鏈可變區(qū)框架區(qū)可包括一個(gè)或多個(gè)(例如，1、 2、3和/或4個(gè))輕鏈框架區(qū)序列(例如，框架1(冊1)、框架2(冊2)、框架3(冊3)和/或框架4 (FW4))，其存在于這些人基因的產(chǎn)物中或源自這些人基因。優(yōu)選的，輕鏈可變區(qū)框架包括 FW1、FW2 和 / 或 FW3，更優(yōu)選 FW1、FW2 和 FW3，其存在于選自 V1-5 * 03 (SEQ ID NO :3)、 V1-27 * 01 (SEQ ID N0:4)、V1_39 * -01 (SEQ ID NO :5)和 Vl-12 * 01 (SEQ ID NO :6)的人基因的產(chǎn)物中或源自所述人基因。本文使用的輕鏈框架區(qū)序列包括FWl (位置1至位置 23)、FW2 (位置35至位置49)、FW3 (位置57至位置88)和FW4 (位置98至位置108)，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示所述氨基酸位置。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段包括這樣的重鏈可變框架區(qū)和這樣的輕鏈可變框架區(qū)，所述重鏈可變框架區(qū)是選自V3-33 * 01 (SEQ ID NO 11), V3-11 * 01 (SEQ ID NO ⑵、V3-30 * -18 (SEQ ID NO 13)和 V3-48 * 01 (SEQ ID NO 14)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因，所述輕鏈可變框架區(qū)是選自V1-5 * 03 (SEQ ID NO :3)、 V1-27 * 01 (SEQ ID N0:4)、V1_39 * -01 (SEQ ID NO :5)和 Vl-12 * 01 (SEQ ID NO :6)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因；優(yōu)選這樣的重鏈可變框架區(qū)和這樣的輕鏈可變框架區(qū)， 所述重鏈可變框架區(qū)是 V3-30 * -18 (SEQ ID NO 13)或 V3-48 * 01 (SEQ ID NO 14)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因，所述輕鏈可變框架區(qū)是Vl-39 * -OKSEQ ID NO 5)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因；更優(yōu)選這樣的重鏈可變框架區(qū)和這樣的輕鏈可變框架區(qū)，所述重鏈可變框架區(qū)是V3-30 ★ -18 (SEQ ID NO 13)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因，所述輕鏈可變框架區(qū)是Vl-39 * -OKSEQ ID NO 5)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因。本發(fā)明還涵蓋了存在于不同的人基因的產(chǎn)物中或源自所述人基因的重鏈可變區(qū)框架區(qū)，和/或存在于不同的人基因的產(chǎn)物中或源自所述人基因的輕鏈可變區(qū)框架區(qū)的組合，例如，存在于 V3-30 * -18 (SEQ ID NO 13)的產(chǎn)物或源自 V3-30 * -18 (SEQ ID NO: 13)的 FWl 和 FW2，與存在于 V3-48 * 01 (SEQ ID NO 14)的產(chǎn)物中或源自 V3-48 * 01 (SEQ ID N0:14)的FW3組合，和/或存在于V1-39 * -01 (SEQ ID NO 5)的產(chǎn)物中或源自V1-39 * -01 (SEQ ID NO 5)的 FWl 和 FW2，與存在于 Vl-12 * 01 (SEQ ID NO 6)的產(chǎn)物中或源自 Vl-12 * 01 (SEQ ID NO 6)的 FW3 組合。人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可見于“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫中(可獲得自因特網(wǎng)的 www, mrc-cpe. cam, ac. uk/vbase)，以及 Kabat，Ε. Α.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U. S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 ；Tomlinson, I. M.等人，(1992) " The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops " J. MoI. Biol. 227 :776-798 ；禾口 Cox, J. P. L 等人，(1994) " A Directory of Human Germline VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24 :827-836。如另一個(gè)實(shí)例，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可見于Genbank數(shù)據(jù)庫。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中至少一個(gè)重鏈⑶R和/或至少一個(gè)輕鏈⑶R包括至少一個(gè)氨基酸修飾?？梢詫?shí)施定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，來導(dǎo)入修飾，并可以在如本文所述的和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)測定中評(píng)估對(duì)抗體結(jié)合的影響或者其他的目標(biāo)功能特性。優(yōu)選的導(dǎo)入保守修飾。修飾可以是氨基酸取代、添加或缺失，但優(yōu)選是取代。通常，在CDR區(qū)中實(shí)施不超過5個(gè)，優(yōu)選不超過4個(gè)，更優(yōu)選不超過3個(gè)，甚至更優(yōu)選不超過2個(gè)，最優(yōu)選不超過1個(gè)的氨基酸修飾。因而，本發(fā)明還提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含重鏈⑶Rl 中的氨基酸取代Y32F的氨基酸修飾，和/或包括包含重鏈CDR2中的氨基酸取代TO8F或 Y59F的氨基酸修飾，和/或包括包含重鏈⑶R3中的一個(gè)或多個(gè)選自Y96F、Y97F、Y98F和 YIOObF的氨基酸取代的氨基酸修飾。人源化抗體或其片段的優(yōu)選的氨基酸修飾是重鏈CDRl 中的氨基酸取代Y32F，和重鏈CDR3中的選自Y96F、Y97F、Y98F和YIOObF的氨基酸取代。人源化抗體或其片段的更優(yōu)選的氨基酸修飾是重鏈CDRl中的氨基酸取代TO2F，和/或重鏈 CDR3中的氨基酸取代Y100bF。本發(fā)明還提供了人源化抗體或其片段，其包括包含輕鏈CDRl中的氨基酸取代 Y32F的氨基酸修飾，和/或包括包含輕鏈⑶R3中的選自N92A、T93A和T93V的氨基酸取代的氨基酸修飾。人源化抗體或其片段的優(yōu)選的氨基酸修飾是輕鏈CDRl中的氨基酸取代 Y32F,和/或輕鏈CDR3中的氨基酸取代N92A。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含重鏈CDRl中的氨基酸取代TO2F的氨基酸修飾，和/或包括包含重鏈CDR2中的氨基酸取代TO8F或TO9F的氨基酸修飾，和/或包括包含重鏈CDR3中的一個(gè)或多個(gè)選自Y96F、Y97F、 Y98F和YIOObF的氨基酸取代的氨基酸修飾，且包括包含輕鏈⑶Rl中的氨基酸取代TO2F的氨基酸修飾，和/或包括包含輕鏈⑶R3中的選自N92A、T93A和T93V的氨基酸取代的氨基酸修飾。在某些實(shí)施方案中，框架序列可用于改造可變區(qū)，產(chǎn)生變體抗體。本發(fā)明的變體抗體包括對(duì)VH和/或VK中的框架區(qū)殘基進(jìn)行了修飾的變體，例如改善抗體的特性。通常，進(jìn)行此類框架區(qū)修飾來減少抗體的免疫原性。例如，一種方法是“回復(fù)突變”一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)殘基為相應(yīng)的鼠序列，或者“回復(fù)突變”一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)殘基為相應(yīng)的種系序列。因而在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段的至少一個(gè)重鏈可變區(qū)的框架區(qū)包括來自相應(yīng)鼠抗體的重鏈可變區(qū)的相應(yīng)框架區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾。優(yōu)選的，所述氨基酸修飾是氨基酸取代。通常，在框架區(qū)內(nèi)實(shí)施不超過5個(gè)，優(yōu)選不超過4個(gè)，更優(yōu)選不超過3個(gè)，甚至更優(yōu)選不超過2個(gè)，最優(yōu)選不超過1個(gè)的氨基酸修飾。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸修飾包括在選自37、42、48、49、67、71、78和94的氨基酸位置上的氨基酸取代。優(yōu)選的重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸取代是在選自42、67、71、78和94的氨基酸位置上的。更優(yōu)選的重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的氨基酸取代是選自G42R、F67L、R71K、L78V 和R94K，其條件是如果氨基酸修飾是R94K，則重鏈可變區(qū)序列不是SEQ ID N0:19或SEQ ID N0:20，而R94K是重鏈可變區(qū)的框架區(qū)的最優(yōu)選的氨基酸取代。本發(fā)明還提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段的至少一個(gè)輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)包括來自相應(yīng)鼠抗體的輕鏈可變區(qū)的相應(yīng)框架區(qū)的至少一個(gè)氨基酸修飾。優(yōu)選的，所述氨基酸修飾是氨基酸取代。通常，在框架區(qū)內(nèi)實(shí)施不超過5個(gè)，優(yōu)選不超過4個(gè)，更優(yōu)選不超過3個(gè)，甚至更優(yōu)選不超過2個(gè)，最優(yōu)選不超過1個(gè)的氨基酸修飾。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人源化抗體或其片段，其中輕鏈可變區(qū)序列的框架區(qū)的氨基酸修飾包括在選自44、71和87的氨基酸位置上的氨基酸取代。更優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列的框架區(qū)的氨基酸取代是選自P44V、P44I、P44L、F71Y、F71H、F7IS、F7IT和 Y87F。最優(yōu)選的輕鏈可變區(qū)序列的框架區(qū)的氨基酸取代是選自P44V、P44I、F71Y和Y87F， 而P44I是特別優(yōu)選的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其片段可包括如上文所述的重鏈可變區(qū)序列的框架區(qū)的氨基酸修飾，和如上文所述的輕鏈可變區(qū)序列的框架區(qū)的氨基酸修飾。本發(fā)明還提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括選自SEQ ID NO :33、 34、35、36、37、43、44、45、46、47、54 和 55 的重鏈可變區(qū)，優(yōu)選選自 SEQ ID NO :37、43 禾口 47， 更優(yōu)選選自SEQ ID NO 37和47的重鏈可變區(qū)。本發(fā)明還提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括選自SEQ ID NO :25、 38、39、40、48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62 和 63 的輕鏈可變區(qū)，優(yōu)選選自 SEQ ID NO 25,59和60，更優(yōu)選選自SEQ ID NO 59和60的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段包括選自SEQ ID NO :33、 34、35、36、37、43、44、45、46、47、54 和 55 的重鏈可變區(qū)，和選自 SEQ ID NO :25、38、39、40、 48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62 和 63 的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段包括選自SEQ ID NO :37、 43和47的重鏈可變區(qū)，和選自SEQ ID NO :25、59和60的輕鏈可變區(qū)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段包括選自SEQ ID NO :37和47的重鏈可變區(qū)，和選自SEQ ID NO :59和60的輕鏈可變區(qū)。最優(yōu)選的是結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段， 其包括包含SEQ ID NO 37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO 59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO 60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO 59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :25的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)； 結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO 49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID N0:49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :43的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；特別是結(jié)合人 ⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO 47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO 60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO :47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO 59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)?？紤]到每種上述重鏈和輕鏈可變區(qū)序列都可以結(jié)合人⑶19，可以“混合和匹配”重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，來產(chǎn)生本發(fā)明的抗CD19結(jié)合分子?？梢允褂美鐚?shí)施例中描述的結(jié)合測定，來測試此類“混合和匹配”的抗體的CD19結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO 64 的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO 66 的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :67的氨基酸序列的輕鏈序列。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO 66 的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列。本發(fā)明還提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其還包括人重鏈和/或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。人重鏈恒定區(qū)可選自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgMl、IgM2、IgD和 IgE構(gòu)成的人免疫球蛋白的組，而人重鏈恒定區(qū)IgG，特別是IgGl是優(yōu)選的。人輕鏈恒定區(qū)可選自κ或λ恒定區(qū)構(gòu)成的人免疫球蛋白的組，而人κ恒定區(qū)是優(yōu)選的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗體或其片段包括人IgGl重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和人輕鏈κ恒定結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括人重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)，其中人重鏈恒定區(qū)包括包含人IgGl的CH1、人IgGl的鉸鏈區(qū)和人IgG3的Fc區(qū)的同種型變體。優(yōu)選的包含同種型變體的人源化抗體是全長抗體。對(duì)于包括包含人IgGl的CHl、 人IgGl的鉸鏈區(qū)和人IgG3的Fc區(qū)的同種型變體的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段， 特別優(yōu)選的是包括包含SEQ ID NO :1 的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID N0:65的氨基酸序列的輕鏈序列。已發(fā)現(xiàn)同種型變體表現(xiàn)出改善的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)，這是相比下述結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段包括人IgGl的人重鏈恒定區(qū)(通常是天然的人IgGl)，即相比只有涉及修飾的重鏈恒定區(qū)時(shí)不同于同種型變體的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段。本發(fā)明還提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體片段，所述片段選自Fab、Fab'、 Fab' -SH、Fd、Fv、dAb、F(ab' )2、scFv、雙特異性單鏈Fv 二聚體、雙抗體、三鏈抗體和與相同或不同抗體遺傳融合的scFv。優(yōu)選的片段是scFv、雙特異性單鏈Fv 二聚體和雙抗體。 本發(fā)明還提供了結(jié)合人CD19的全長人源化抗體。除了在框架區(qū)或CDR區(qū)進(jìn)行修飾外，或作為其備選，還可以改造本發(fā)明的抗體以包括Fc區(qū)內(nèi)的修飾，通常改變抗體的一種或多種功能特性，例如血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fx 受體結(jié)合，和/或抗原依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此外，可以化學(xué)修飾(例如，可以在抗體上連接一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分)或修飾本發(fā)明的抗體，改變它的糖基化。下文進(jìn)一步詳細(xì)描述了每種這類實(shí)施方案。如下概述的Fc區(qū)內(nèi)的修飾是根據(jù)Kabat的EU索引的Fc區(qū)內(nèi)的殘基編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CHl的鉸鏈區(qū)，使得改變鉸鏈區(qū)內(nèi)的半胱氨酸殘基數(shù)，例如增加或減少。該方法進(jìn)一步描述在Bodmer等人的美國專利號(hào)5，677，425中。改變CHl 的鉸鏈區(qū)內(nèi)的半胱氨酸殘基數(shù)，以例如促進(jìn)輕鏈和重鏈裝配，或增加或減少抗體的穩(wěn)定性。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，突變抗體的Fc鉸鏈區(qū)，以減少抗體的生物學(xué)半衰期。更具體而言， 在Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域交界區(qū)中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，使得抗體相比天然的Fc鉸鏈結(jié)構(gòu)域SpA結(jié)合具有受損的葡萄球菌A蛋白(SpA)結(jié)合。該方法進(jìn)一步描述在 Ward等人的美國專利號(hào)6，165，745中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾抗體以增加其生物學(xué)半衰期。多種方法都是可以的。例如，可以導(dǎo)入一種或多種下列突變T252L、T2MS、T256F，如 Ward等人的美國專利號(hào)6，277，375所述。可選的，為了增加生物學(xué)半衰期，可以在CHl或CL區(qū)中改變抗體，以含有取自IgG的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的2個(gè)環(huán)中的補(bǔ)救受體(salvage receptor)結(jié)合表位，如I^resta等人的美國專利號(hào)5，869，046和6，121，022所述。在其他實(shí)施方案中，通過用不同的氨基酸殘基替換至少一個(gè)氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)子功能。例如，可以用不同的氨基酸殘基替換選自氨基酸殘基234、235、236、237、四7、 318,320和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，使得抗體具有與效應(yīng)子配體改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。改變親和力的效應(yīng)子配體可以是例如Fc受體或補(bǔ)體的Cl組分。 該方法進(jìn)一步描述在Winter等人的美國專利號(hào)5，624，821和5，648，260中。在另一個(gè)實(shí)例中，可以用不同的氨基酸殘基替換選自氨基酸殘基329、331和322的一個(gè)或多個(gè)氨基酸， 使得抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或降低或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。該方法進(jìn)一步描述在Idusogie等人的美國專利號(hào)6，194, 551中。在另一個(gè)實(shí)例中，改變CH2結(jié)構(gòu)域的N端區(qū)域中氨基酸位置231至238中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，從而改變抗體固定補(bǔ)體的能力。該方法進(jìn)一步描述在Bodmer等人的PCT公開WO 94/29351中。在另一個(gè)實(shí)例中， 修飾Fc區(qū)以增加抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)的能力，和/或增加抗體對(duì) Fc[y]受體的親和力，通過修飾下列位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸238、239、M8、M9、252、 254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、 293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、 331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、 4；34、4；35、437、438 或 439。該方法進(jìn)一步描述在 Presta 的 PCT 公開 WO 00/42072 中。因而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段， 其包括相對(duì)于親本抗體的人IgG Fc區(qū)，包含至少一個(gè)氨基酸修飾的變體人IgG Fc區(qū)，而所述包含變體人IgG Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)出相比親本抗體改變的效應(yīng)子功能。優(yōu)選的，所述抗體包括變體人IgGlFc區(qū)。更優(yōu)選的是包括變體人IgGlFc區(qū)的全長抗體。親本抗體是結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，并且除了在人IgG Fc區(qū)中的氨基酸修飾外，與包含變體人 IgG Fc區(qū)的結(jié)合人CD19的人源化抗體相同，通常是具有天然的人IgG Fc區(qū)的抗體。氨基酸修飾優(yōu)選是非同種型的。改變的效應(yīng)子功能通常是補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和/或Clq結(jié)合和/或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或抗體對(duì)Fc[Y]受體的結(jié)合親和力，優(yōu)選補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和/或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。通過標(biāo)準(zhǔn)的體外測定測量CDC、Clq結(jié)合、ADCC和抗體對(duì)Fc[ γ ]受體的結(jié)合親和力，所述測定是本領(lǐng)域已知的和可商購的。通常，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定測量ADCC，例如本申請(qǐng)實(shí)施例4中所述， 通過基于細(xì)胞的測定測量CDC，例如本申請(qǐng)實(shí)施例10中所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比親本抗體改變效應(yīng)子功能的氨基酸修飾包括在選自沈9、 274、276、四8、3對(duì)和334的氨基酸位置上的氨基酸取代，優(yōu)選選自269、298和324，更優(yōu)選 298和/或324，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。在另一實(shí)施方案中，相比親本抗體改變效應(yīng)子功能的氨基酸修飾包括選自E269D、 K274Q、N276K、S298A、S324N 和 K334R 的氨基酸取代，優(yōu)選選自 E^9D、S298A 和 S324N，更優(yōu)選S^SA和/或S3MN，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。在另一實(shí)施方案中，相比親本抗體改變效應(yīng)子功能的氨基酸修飾包括在選自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代的組合269/274、269/276、269/298、269/324、269/334,274/276,274/298,274/324,274/334,276/298,276/324,276/334,298/324, 298/334、324/334、269/274/276、269/274/298、269/274/324、269/274/334、269/276/298、 269/276/324,269/276/334,269/298/324,269/298/334,274/276/298,274/276/324, 274/276/334,274/298/324,274/298/334,276/298/324 和 276/298/3；34，優(yōu)選選自 274/276,269/298,298/324,274/276/334 和 269/298/3 ，更優(yōu)選選自 298/3 和沈9/四8/324，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。在另一實(shí)施方案中，相比親本抗體改變效應(yīng)子功能的氨基酸修飾包括選自以下的氨基酸取代的組合:E269D/K274Q,E269D/N276K,E269D/S298A,E269D/S324N,E269D/K334R, K274Q/N276K、K274Q/S298A、K274Q/S324N、K274Q/K334R、N276K/S298A、N276K/S324N、 N276K/K334R、S298A/S324N、S298A/K334R、S324N/K334R、E269D/K274Q/N276K、E269D/ K274Q/S298A、E269D/K274Q/S324N、E269D/K274Q/K334R、E269D/N276K/S298A、E269D/ N276K/S324N、E269D/N276K/K334R、E269D/S298A/S324N、E269D/S298A/K334R、K274Q/ N276K/S298A、K274Q/N276K/S324N、K274Q/N276K/K334R、K274Q/S298A/S324N、K274Q/ S298A/K334R、N276K/S298A/S324N 和 N276K/S298A/K334R，優(yōu)選選自 K274Q/N276K、E269D/ S298A、S298A/S324N、K274Q/N276K/K334R 和 E269D/S298A/S324N，更優(yōu)選選自 S298A/S324N 和E269D/S298A/S3MN，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。優(yōu)選的，包含變體人IgG Fc區(qū)的本發(fā)明的人源化抗CD19抗體在如上所述的體外測定中表現(xiàn)出相比親本抗體改善的CDC。本文中使用的表現(xiàn)出的改善的CDC包括a)相比親本抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的CDC，即，親本抗體已表現(xiàn)出CDC，所述CDC通過人IgG Fc區(qū)的氨基酸修飾而增強(qiáng)，和b)相比親本抗體重新表現(xiàn)出⑶C，即，親本抗體沒有表現(xiàn)出⑶C，因而通過人 IgG Fc區(qū)的氨基酸修飾重新導(dǎo)入⑶C。在其他實(shí)施方案中，相比親本抗體在體外測定中表現(xiàn)出改善的CDC的本發(fā)明的人源化抗CD19抗體的人IgG Fc區(qū)變體包括在選自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的組合3對(duì)、3；34、274/276、298/3對(duì)、274/276/3；34和沈9/四8/324，所述位置優(yōu)選選自 324、334、298/324、274/276/334 和 269/298/324，更優(yōu)選選自 324、298/324 和沈9/四8/324，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗CD19抗體的人IgG Fc區(qū)變體包括選自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的組合S324N.K334R,K274Q/N276K、S298A/ S324N、K274Q/N276K/K334R 和 E^9D/S298A/S324N，優(yōu)選選自 S324N、K334R、S298A/S324N、 K274Q/N276K/K334R 和 E269D/S298A/S324N，更優(yōu)選選自 S324N、S298A/S324N 和 E269D/ S298A/S3MN，所述人IgG Fc區(qū)變體相比親本抗體在體外測定中表現(xiàn)出改善的⑶C，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗CD19抗體的人IgG Fc區(qū)變體包括在選自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的組合J69J98J69/^98J69/324、 298/324 和 269/298/3 ，所述位置優(yōu)選選自 298、269/298、269/298/3M，所述人 IgG Fc 區(qū)變體相比親本抗體在體外測定中表現(xiàn)出改善的ADCC，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗CD19抗體的人IgG Fc區(qū)變體包括在選自以下的氨基酸位置上的氨基酸取代或氨基酸取代的組合E269D、S298A、E269D/S298A、E269D/S324N、S298A/S324N 和 E269D/S298A/S324N，優(yōu)選選自 S298A、E269D/S298A 和 E269D/ S298A/S3MN，所述人IgG Fc區(qū)變體相比親本抗體在體外測定中表現(xiàn)出改善的ADCC，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。本發(fā)明提供的結(jié)合人CD19并相比親本人源化抗體表現(xiàn)出改變的效應(yīng)子功能的特別優(yōu)選的人源化抗體或其片段是這樣的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO 114(VH16R94K/S298A)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO 65 (VL43V3Q/T7S/ P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含 SEQ ID NO 115 (VH16R94K/E269D/S298A)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO 65 (VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含SEQ ID NO :116(VH16R94K/S298A/S324N)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO :65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含SEQ ID NO 117 (VH16R94K/E269D/S298A/S324N)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO: 65 (VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含 SEQ ID NO 118 (VH16R94K/ S324N)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO 65 (VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含SEQ ID NO :119(VH16R94K/K274Q)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO :65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含SEQ ID NO :120(VH16R94K/N276K)的氨基酸序列的重鏈序列和包含 SEQ ID NO 65 (VL43V3Q/ T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含SEQ ID NO 121 (VH16R94K/K334R)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO :65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；包含SEQ ID NO 122 (VHl6R94K/K274Q/N276K)的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ ID NO :65(VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列；或者包含SEQ ID NO 123 (VH16R94K/K274Q/N276K/K334R)的氨基酸序列的重鏈序列和包含 SEQ ID NO: 65 (VL43V3Q/T7S/P44I/N92A)的氨基酸序列的輕鏈序列。本發(fā)明還提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述抗體包括變體人 IgG Fc區(qū)，所述變體人IgG Fc區(qū)包括用天冬酰胺替換親本抗體的氨基酸3 位的絲氨酸的氨基酸取代S3MN，而包括所述變體人IgG Fc區(qū)的抗體相比親本抗體表現(xiàn)出改善的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。優(yōu)選的所述抗體包括變體人IgGlFc區(qū)。更優(yōu)選的是包括變體人 IgGlFc區(qū)的全長抗體。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，如實(shí)施例10所述，在氨基酸3 位的16種不同的氨基酸取代中，相比親本抗體，取代S324N顯著地改善了 CDC，而其他的取代相比親本抗體沒有改善CDC。在不受理論約束的條件下，S3MN取代對(duì)CDC的這一預(yù)料不到的選擇性影響似乎是由于與人補(bǔ)體組分Clq的增強(qiáng)的結(jié)合。本發(fā)明還提供了包括人IgG Fc區(qū)的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中與所述人IgG Fc區(qū)連接的成熟核心糖類結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。優(yōu)選的，所述抗體包括人IgGlFc 區(qū)，其中與所述人IgGlFc區(qū)連接的成熟核心糖類結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。更優(yōu)選的是包括人 IgGlFc區(qū)的全長抗體，其中與所述人IgGlFc區(qū)連接的成熟核心糖類結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。從WO 2003/035835已知，與人IgG Fc區(qū)連接的成熟核心糖類結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖可增強(qiáng)ADCC。因而， 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體或其片段包括這樣的人IgG Fc區(qū)，其中與所述人 IgG Fc區(qū)連接的成熟核心糖類結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖，而所述缺乏巖藻糖的抗體相比不缺乏巖藻糖的親本人源化抗體或其片段表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC。包括這樣的人IgG Fc區(qū)的結(jié)合人CD19 的優(yōu)選抗體或其片段是包括包含SEQ ID NO :64的氨基酸序列的重鏈序列和包含SEQ IDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列的抗體，其中與所述人IgG Fc區(qū)連接的成熟核心糖類結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖，而所述缺乏巖藻糖的抗體相比不缺乏巖藻糖的親本人源化抗體或其片段表現(xiàn)出增強(qiáng)的ADCC。產(chǎn)生缺乏巖藻糖的抗體的方法是例如(a)使用改造或突變的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是巖藻糖代謝缺陷的，使得其對(duì)其中表達(dá)的蛋白質(zhì)巖藻糖基化能力降低(或不能巖藻糖基化)；(b)在阻止或降低巖藻糖基化的條件下培養(yǎng)細(xì)胞；(c)翻譯后去除巖藻糖 (例如，使用巖藻糖苷酶)；(d)翻譯后添加理想的糖類，例如，在重組表達(dá)未糖基化的糖蛋白之后；或者(e)純化糖蛋白，選擇沒有巖藻糖基化的產(chǎn)物。優(yōu)選使用的是實(shí)施例14描述的方法,例如 Longmore 等人(1982) Carbohydr. Res. 365-92 或 Imai-Nishiya 等人，(2007)， BMC Biotechnol. 7，84 中描述的方法?？耿?9抗體特性評(píng)估抗體例如人CD19的抗體的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)測定是本領(lǐng)域已知的，包括例如 ELISA、Western印跡、RIA和流式細(xì)胞儀分析。合適的測定詳細(xì)描述在實(shí)施例中。也可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定來評(píng)估抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如，結(jié)合親和力如Kd)，例如 katchard或BiaCOre< (R) >系統(tǒng)分析，并可如例如實(shí)施例3所述實(shí)施和計(jì)算?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)競爭性測定來評(píng)估相對(duì)結(jié)合親和力Ki,并可如例如實(shí)施例3所述實(shí)施和計(jì)算。 為了評(píng)估結(jié)合，可以使用Raji腫瘤細(xì)胞(人伯基特淋巴瘤，DSMZACC319)、NALM_6 (人B細(xì)胞前體白血病，DSMZ AC128)或SU-DHL-6 (人B細(xì)胞淋巴瘤，DSMZ ACC572)，優(yōu)選使用Raji腫瘤細(xì)胞，例如人伯基特淋巴瘤，DSMZ ACC319或SU-DHL-6 (人B細(xì)胞淋巴瘤，DSMZ ACC572)， 更優(yōu)選使用Raji腫瘤細(xì)胞，例如人伯基特淋巴瘤，DSMZACC319?？梢詮墓娍色@得的來源獲得這些細(xì)胞，例如 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braimsctweig，德國，并可用于標(biāo)準(zhǔn)測定例如流式細(xì)胞分析?？捎糜诒景l(fā)明測定中的相應(yīng)嵌合抗體通常是鼠抗體FMC63的嵌合版，其由與人IgGl重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合的FMC63鼠重鏈可變結(jié)構(gòu)域，和與κ恒定結(jié)構(gòu)域融合的鼠輕鏈可變結(jié)構(gòu)域組成。優(yōu)選用于本發(fā)明測定中的相應(yīng)嵌合抗體是抗體FMC63的嵌合版，其包括包含SEQ ID NO :68的氨基酸序列的重鏈序列，與包含SEQ ID NO :69的氨基酸序列的輕鏈序列。親本非人源化抗體或可用于本發(fā)明測定中的相應(yīng)親本非人源化抗體通常是鼠抗體，特別是鼠抗體FMC63。本發(fā)明還提供了結(jié)合Raji腫瘤細(xì)胞的人源化抗體或其片段，其相對(duì)于相應(yīng)嵌合抗體的結(jié)合的中點(diǎn)熒光(MPF)為至少10%。Raji腫瘤細(xì)胞在表面上表達(dá)人源化抗體或其片段可以結(jié)合的CD19。可以使用流式細(xì)胞儀根據(jù)測量染色細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)對(duì)比抗體濃度來獲得中點(diǎn)熒光值。優(yōu)選的，相對(duì)于相應(yīng)嵌合抗體的結(jié)合，人源化抗體或其片段結(jié)合Raj i腫瘤細(xì)胞的MPF為至少30 %，更優(yōu)選至少50 %，最優(yōu)選至少70 %，特別是至少80 %， 更特別是至少90%，最特別是至少95%。如上文所述的Raji腫瘤細(xì)胞可用于評(píng)估與⑶19 的結(jié)合。本發(fā)明還提供了結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其親和力(Kd)為50nM或更低，特別是40nM或更低，更特別是30nM或更低，甚至更特別是20nM或更低，最特別是15nM 或更低。如上文所述的Raji腫瘤細(xì)胞可用于評(píng)估與人CD19的結(jié)合。本發(fā)明還提供了保留了相應(yīng)嵌合抗體的至少20%的⑶19結(jié)合親和力(Kd)的人源化抗體或其片段。優(yōu)選的所述人源化抗體或其片段保留了相應(yīng)嵌合抗體的至少40%，更優(yōu)選至少60%，最優(yōu)選至少80%，特別是至少90%，更特別是至少95%的⑶19結(jié)合親和力(Kd)。如上文所述的Raii腫瘤細(xì)胞或SU-DHL-6細(xì)胞可用于評(píng)估與人CD19的結(jié)合。本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合人 ⑶19，且競爭結(jié)合Raji腫瘤細(xì)胞，所述結(jié)合的親和力(Ki)為50nM或更低，優(yōu)選20nM或更低，更優(yōu)選IOnM或更低，最優(yōu)選5nM或更低，特別是4nM或更低，更特別是3nM或更低，最特別是至少約1. 5nM至約5. OnM (例如，1. 9 ;1. 6或2. 9至約2. 6或4. 9nM)。通常針對(duì)相應(yīng)的嵌合抗體測量結(jié)合競爭，而如上文所述的Raji腫瘤細(xì)胞可用于評(píng)估&。本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合人 ⑶19，且在Raji腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。可以通過膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙碇染色測量Raji腫瘤細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)(Vermes等人，1995，J. Immunol. Methods. 184 :39-51)。根據(jù)相應(yīng)的嵌合抗體對(duì)凋亡沒有影響的事實(shí)，誘導(dǎo)凋亡是本發(fā)明的人源化抗體展現(xiàn)出的非常令人驚訝的特性。如上文所述的Raji腫瘤細(xì)胞可用于評(píng)估凋亡。因而，本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，其中在至少10 %，優(yōu)選至少15 %，更優(yōu)選至少20 %，最優(yōu)選至少25 %的Raj i 腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合人 ⑶19，且在Raji腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)ADCC?？梢允褂美缛樗崦摎涿羔尫艤y定(CytoTox 96 非放射性測定，Promega, Madison, USA)，來評(píng)估如上文所述的靶細(xì)胞，例如Raji腫瘤細(xì)胞的ADCC相關(guān)性特異性裂解。令人驚訝的是，結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段在Raji腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)的ADCC活性等于，甚至大于相應(yīng)的嵌合抗體誘導(dǎo)的ADCC活性。優(yōu)選的，結(jié)合 CD19的人源化抗體或其片段具有相應(yīng)的嵌合抗體至少80%，更優(yōu)選至少100%，最優(yōu)選至少120%的ADCC活性。本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合人 CD19，且抑制惡性B細(xì)胞的增殖。優(yōu)選的，所述人源化抗體或其片段保留了相應(yīng)嵌合抗體的至少60 %，更優(yōu)選至少80 %，最優(yōu)選至少90 %，特別是95 %，更特別是100 %的對(duì)惡性B細(xì)胞增殖的抑制。為了測量抗體對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，可以使用如上文所述的Raji腫瘤細(xì)胞或 SU-DHL-6細(xì)胞評(píng)估惡性B細(xì)胞增殖。本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合人 CD19，且抑制Raji腫瘤細(xì)胞的克隆發(fā)生。通過在用抗體處理后計(jì)數(shù)克隆數(shù)，測量對(duì)克隆發(fā)生的抑制，可根據(jù)例如 Nahimana 等人，2009，Blood. 0 :blood-2008-08_173369vl” (Blood, 2009，卷113，No. 14,pp. 3276-3286)進(jìn)行?？梢允褂萌缟衔乃龅腞aji腫瘤細(xì)胞評(píng)估克隆發(fā)生。在用本發(fā)明的人源化抗體處理后計(jì)數(shù)的克隆數(shù)比用相應(yīng)嵌合抗體處理后計(jì)數(shù)的克隆數(shù)少至少30 %，優(yōu)選至少40 %，更優(yōu)選至少50 %，最優(yōu)選至少60 %。對(duì)Raji腫瘤細(xì)胞的克隆發(fā)生的抑制驗(yàn)證了本發(fā)明的人源化抗體對(duì)惡性B細(xì)胞增殖的強(qiáng)抑制功能。本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合人 CD19，且導(dǎo)致血液中的B細(xì)胞耗盡。優(yōu)選的，所導(dǎo)致的B細(xì)胞耗盡與相應(yīng)嵌合抗體導(dǎo)致的B 細(xì)胞耗盡至少相同，優(yōu)選是其至少1. 5倍，更優(yōu)選是其至少2倍?？梢匀鐚?shí)施例所述，通過用抗體孵育后，確定全血中的％陽性B細(xì)胞，來評(píng)估B細(xì)胞耗盡。本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段結(jié)合人 CD19，且在Raji腫瘤細(xì)胞中內(nèi)化。本發(fā)明的人源化抗體或其片段的內(nèi)化程度可與相應(yīng)嵌合抗體的內(nèi)化程度相比。優(yōu)選的，以0. 01 μ g/ml使用的本發(fā)明的人源化抗體的內(nèi)化程度是相應(yīng)嵌合抗體的內(nèi)化程度的50%和150%之間，更優(yōu)選60%和140%之間，最優(yōu)選70%和 130%之間?？梢允褂美缗c毒素肥皂草毒蛋白綴合的次級(jí)抗人抗體，在如上文所述的Raji 腫瘤細(xì)胞上評(píng)估抗體內(nèi)化(Hum-hp，Advanced Targeting Systems, San Diego，CA，USA)。本發(fā)明還提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段具有熱穩(wěn)定溫度大于65°C，優(yōu)選大于70°C，更優(yōu)選大于75°C，最優(yōu)選大于80°C的FAB 片段。為了分析FAB片段的熱穩(wěn)定性，使用差示掃描量熱法，而鑒別在全長IgG背景中的FAB片段的中點(diǎn)熔融溫度。這類量熱法測量是技術(shù)人員已知的，可根據(jù)例如Garber和 Demarest (2007), BBRC 355 :751-7進(jìn)行。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人源化抗體具有等于相應(yīng)嵌合抗體的FAB片段熱穩(wěn)定溫度。因而，本發(fā)明還提供了結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，所述人源化抗體或其片段具有等于相應(yīng)嵌合抗體的FAB片段熱穩(wěn)定溫度的 FAB片段熱穩(wěn)定溫度。核酸、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供了編碼結(jié)合人CD19的人源化抗體和其片段分離的核酸、載體以及包含所述核酸或載體的宿主細(xì)胞。核酸可位于完整細(xì)胞中、細(xì)胞裂解液中或者以部分純化的或基本純化的形式。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括堿/SDS處理、CsCl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和其他本領(lǐng)域普遍已知的技術(shù)，與其他細(xì)胞組分或其他污染物(例如，其他的細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì))純化分離時(shí)，核酸是“分離的”或“使得基本純的”，參見例如F. Ausubel，等人編著，(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA，可以含有或不含內(nèi)含子序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸是cDNA分子。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)獲得本發(fā)明的核酸，例如可以通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)，獲得編碼抗體的輕鏈和重鏈或者編碼VH和VL區(qū)段的cDNA。對(duì)于從免疫球蛋白基因文庫獲得的抗體(例如，使用噬菌體展示技術(shù))，可以從文庫回收編碼抗體的一種或多種核酸。向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入外源核酸的方法是本領(lǐng)域普遍已知的，并可隨所使用的宿主細(xì)胞而變化。技術(shù)包括但不限于葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、氯化鈣處理、聚凝胺(polybrene)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，原生質(zhì)體融合、電穿孔、病毒或噬菌體感染、在脂質(zhì)體中封裝多核苷酸和直接顯微注射DNA到核中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的情況下，轉(zhuǎn)染可以是瞬時(shí)或穩(wěn)定的。優(yōu)選的本發(fā)明核酸分子是編碼選自SEQ ID NO :25，38，39，40，48，49，50，51，52， 53，56，57，58，59，60，61，62 和 63 的輕鏈可變區(qū)，和 / 或選自 SEQ ID NO :33，34，35，36，37， 43，44，45，46，47，M和55的重鏈可變區(qū)的那些。更優(yōu)選的是這樣的核酸分子，所述核酸分子編碼包含SEQ ID NO :64的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；編碼包含SEQ ID NO 66的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO 67的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO 66的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :114的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :115的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID N0: 116的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :117的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO 118的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :119的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :120的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :121的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :122的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO 123的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列；或編碼包含SEQ ID NO :1 的氨基酸序列的重鏈序列，和包含SEQ ID NO :65的氨基酸序列的輕鏈序列。本發(fā)明還提供了分離的核酸，其包括結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的重鏈編碼核酸序列，于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登錄號(hào)DSM 23302。由保藏的結(jié)合人⑶19的人源化FMC63變體的核酸序列編碼的重鏈包括包含SEQ ID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶Rl，包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和包含SEQ ID NO :29的氨基酸序列的重鏈⑶R3。本發(fā)明還提供了分離的核酸，其包括結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的輕鏈編碼核酸序列，于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登錄號(hào)DSM 23303。由保藏的結(jié)合人⑶19的人源化FMC63變體的核酸序列編碼的輕鏈包括包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1，包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈CDR3。因而，本發(fā)明還提供了這樣的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其由包含結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的重鏈編碼核酸序列的分離的核酸和包括結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的輕鏈編碼核酸序列的分離的核酸所編碼，所述重鏈編碼核酸序列于2010年 2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登錄號(hào)DSM 23302，所述輕鏈編碼核酸序列于2010 年2月5日保藏在DSMZ的微生物中，具有登錄號(hào)DSM 23303。在一個(gè)實(shí)施方案中，由分離的核酸編碼的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段包括變體人IgG Fc區(qū)，優(yōu)選變體人IgGlFc區(qū)，其中所述分離的核酸包括結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的重鏈編碼核酸序列，所述重鏈編碼核酸序列于2010年2月5日保藏在DSMZ 的微生物中，具有登錄號(hào)DSM 23302，所述變體人IgG Fc區(qū)包括在選自沈9，274，276，四8， 324和334，優(yōu)選選自沈9，298和324，更優(yōu)選298和/或324的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每一組成員的氨基酸位置。一旦獲得編碼VH和VL區(qū)段的DNA片段，則可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因，或轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)于上文所述片段的片段基因，如Fab片段或轉(zhuǎn)化為scFv基因。在這些操作中，將VL或VH編碼DNA片段有效的連接至編碼另一種蛋白質(zhì)的另一種DNA片段上，例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭。該上下文中使用的術(shù)語“有效連接”意指連接兩個(gè)DNA片段，使得所述兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保留在框內(nèi)。通過將VH編碼DNA與另一種編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的DNA 分子有效連接，可以將編碼VH區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。這些人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Kabat，E. A.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication No. 91-3242)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得涵蓋了這些區(qū)域的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以是IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但最優(yōu)選是IgGl恒定區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因，可以將V [pi]-編碼DNA與另一種只編碼重鏈CHl恒定區(qū)的DNA 分子有效連接。通過將VL編碼DNA與另一種編碼輕鏈恒定區(qū)CL的DNA分子有效連接，可以將編碼VL區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。這些人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Kabat，Ε. A.等人，(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services. NIH Publication No. 91-3242)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得涵蓋了這些區(qū)域的DNA片段。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，優(yōu)選κ恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv 基因，可以將VH和VL-編碼DNA片段與另一種編碼柔性接頭的片段有效連接，例如，編碼氨基酸序列(GIy4-kr) 3的片段，使得VH和VL序列可以作為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)表達(dá)，其中VL 和VH區(qū)通過柔性接頭連接(參見例如，Bird等人，(1988)Science242 =423-426 ；Huston等人，(1988)Proc. Natl. Acad. ScL USA85 :5879-5883 ；McCafferty 等人，(1990) Nature 348 552-554)。已開發(fā)了各種技術(shù)生產(chǎn)人源化抗體的抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段源自完整抗體的蛋白質(zhì)水解消化(參見例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24 :107-117(1992)；和Brennan等人，Science，229 :81 (1985))。然而，現(xiàn)在可以通過重組宿主細(xì)胞直接生產(chǎn)這些片段。例如，可以從上文討論的抗體噬菌體文庫中分離抗體片段?？蛇x的，可以從大腸桿菌中直接回收Fab' -SH片段，并將其化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab' )2 片段(Carter等人，Bio/Technology, 10 163-167 (1992)) 0根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離F(ab' )2片段。生產(chǎn)抗體片段的其他技術(shù)對(duì)熟練的技術(shù)人員而言是顯而易見的。在其他實(shí)施方案中，選定的抗體是單鏈Fv片段(scFv)，參見例如WO 1993/16185 ；美國專利號(hào)5，571，894和美國專利號(hào)5，587，458?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如美國專利號(hào)5，641，870所述。為了表達(dá)蛋白質(zhì)，可以將編碼本發(fā)明抗體的核酸整合到表達(dá)載體中。多種表達(dá)載體可用于蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)載體可包括自我復(fù)制的染色體外載體，或整合到宿主基因組中的載體。構(gòu)建的表達(dá)載體與宿主細(xì)胞類型是可相容的。因而，可用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括但不限于使蛋白質(zhì)能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、酵母和體外系統(tǒng)中表達(dá)的那些。 如本領(lǐng)域已知的，多種表達(dá)載體是可商業(yè)或其他方式獲得的，可用于本發(fā)明中來表達(dá)抗體。表達(dá)載體通常包括與控制或調(diào)控序列、可選擇的標(biāo)志物、任何融合伙伴和/或其他元件有效連接的蛋白質(zhì)。本文中，“有效連接”意指核酸置于與另一種核酸序列的功能性關(guān)聯(lián)中。術(shù)語“調(diào)控序列”意在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他表達(dá)控制元件(例如，多聚腺苷酸化信號(hào))。此類調(diào)控序列描述在例如Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185， Academic Press， San Diego, CA (1990))中。一般而言，這些表達(dá)載體包括與編碼抗體的核酸有效連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸，且通常對(duì)用于表達(dá)所述蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞是恰當(dāng)?shù)?。一般而言，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，和增強(qiáng)子或激活子序列。還如本領(lǐng)域已知的，表達(dá)載體通常含有選擇基因或標(biāo)志物，允許選擇含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。選擇基因是本領(lǐng)域普遍已知的，可隨使用的宿主細(xì)胞而變化。 例如，通?？蛇x擇的標(biāo)志物基因賦予已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞對(duì)藥物的抗性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤。優(yōu)選的可選擇的標(biāo)志物基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于用氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞中)和neo基因(用于G418選擇)。用于在克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的合適的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞、酵母或更高等的真核細(xì)胞。用于該目的的合適的原核細(xì)胞包括真細(xì)菌，包括革蘭氏陰性生物或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌屬Escherichia)例如大腸桿菌、腸桿菌屬(EntercAacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、 沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌屬 (Serratia)例如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans)，和志賀菌屬(Shigella)，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、 假單胞菌屬O^seudomonas)例如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)和鏈霉菌屬 (Str印tomyces)。合適的大腸桿菌克隆宿主包括大腸桿菌294 (ATCC 31，446)、大腸桿菌B、 大腸桿菌 X1776(ATCC 31，537)和大腸桿菌 W3110 (ATCC 27，325)。除原核細(xì)胞外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母是合適的克隆或表達(dá)宿主。在低等真核宿主微生物中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的貝克酵母是最常用的。然而，多種其他屬、種和菌株通常是可獲得且有效的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharoriyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，包括乳酸克魯維酵母(K. lactis)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC24, 178), K. WaItH(AJCC 56，500)、果蠅克魯維酵母(K. drosopmarum) (ATCC 36，906)、耐熱克魯維酵母(K. thermoto lerans)或 K. marxianusyarrowia (EP 402226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP183，070)；念珠菌屬(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia(EP244234))；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)例如許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；禾口絲狀真菌，包括鏈抱霄屬(Neurospora)、 青霉屬(Penicillium)、Tolypocladium或曲霉屬(Aspergillus)宿主例如構(gòu)巢曲霉 (A. nidulans) ^11^ (A. niger)。用于表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體的合適的宿主細(xì)胞源自多細(xì)胞生物。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括Plaril和昆蟲細(xì)胞。已鑒別了多種桿狀病毒菌株和變體，與相應(yīng)的許可昆蟲宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞來自宿主例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes augypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)。用于轉(zhuǎn)染的多種病毒菌株是公眾可獲得的， 例如苜蓿尺蛾(Autographa californica) NPV的L-I變體和家蠶NPV的Bm_5菌株，此類病毒可特別用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾細(xì)胞。還可以利用棉花、玉米、土豆、大豆、牽牛、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的宿主細(xì)胞優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包括dhfr<->CH0細(xì)胞，描述在Urlaub和Chasin, (1980)Proc. Natl. Acad. ScL USA 77 :4216-4220 中，與 DHFR 可選擇標(biāo)志物一起使用，例如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982) J. MoI. Biol 159 :601-621 所述)、NSO 骨髓瘤細(xì)胞、COS 細(xì)胞和 SP2 細(xì)胞。特別的，為了與NSO骨髓瘤細(xì)胞一起使用，另一種優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)是GS基因表達(dá)系統(tǒng)，公開在 WO 87/04462 (Wilson)、WO 89/01036 (Bebbington)和 EP 338841 (Bebbington)中。當(dāng)將重組的抗體基因?qū)氩溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞一定時(shí)間來生產(chǎn)抗體，所述時(shí)間足以允許抗體在所述宿主細(xì)胞中的表達(dá)，或更優(yōu)選的，允許抗體分泌到所述宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中?？梢栽诙喾N培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)結(jié)合人CD19的抗體的宿主細(xì)胞。可商購的培養(yǎng)基例如Ham' s FlO(Sigma)、最低必需培養(yǎng)基((MEM)，(Sigma))、 RPMI-1640(Sigma 或 Chemie Brunschwig AG, PAA, Basel, Switzerland)禾口 Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium((DMEM), Sigma))適合培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化方法，從培養(yǎng)基中回收抗體?？贵w可與融合伙伴有效連接，使得能夠進(jìn)行表達(dá)的蛋白質(zhì)的靶向、純化、篩選、展示等。融合伙伴可通過接頭序列與抗體序列連接。接頭序列一般包括少量氨基酸，通常少于10個(gè)，但也可以使用更長的接頭。通常，選擇柔性且抗降解的接頭序列。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，任一種多樣的序列都可用作接頭。例如，普通的接頭序列包括氨基酸序列GGGGS。融合伙伴(parterner)可以是靶向序列或信號(hào)序列，指導(dǎo)抗體和任何相關(guān)的融合伙伴到達(dá)理想的細(xì)胞位置或胞外基質(zhì)中。如本領(lǐng)域已知的，某些信號(hào)序列可以將蛋白質(zhì)靶向分泌到生長基質(zhì)中，或位于細(xì)胞的內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)空間中。融合伙伴還可以是編碼使得能夠純化和/或篩選的肽或蛋白質(zhì)的序列。此類融合伙伴包括但不限于多聚組氨酸標(biāo)簽(His-tag)(例如H6和HlO或其它與固定化金屬親和層析(IMAC)系統(tǒng)一起使用的標(biāo)簽(例如，Ni<+2>親和柱))、GST融合物、MBP融合物、Str印-標(biāo)簽、細(xì)菌酶BirA的BSP生物素化靶序列，和由抗體靶向的表位標(biāo)簽(例如c-myc標(biāo)簽、flag標(biāo)簽等)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，此類標(biāo)簽可用于純化、篩選或兩者。構(gòu)建和生產(chǎn)抗體通過技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)抗體。此外，可以通過酶促或化學(xué)切割天然存在的抗體，來生產(chǎn)抗體?？梢酝ㄟ^將來自非人動(dòng)物(例如小鼠)的VH和/或VL區(qū)的一個(gè)或多個(gè)CDR或其部分轉(zhuǎn)移至人VH和/或VL區(qū)的一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)上，來構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體。任選的，當(dāng)減少抗體的免疫原性和/或維持結(jié)合親和力需要或理想時(shí)，可以通過相應(yīng)的非人(例如小鼠)殘基替換位于VH和/或VL區(qū)中的人框架殘基。任選的，可以用人殘基替換位于CDR中的非人氨基酸殘基?？梢曰谌缟纤鲋苽涞姆侨藛慰寺】贵w的序列，來制備本發(fā)明的嵌合或人源化抗體?？梢詮哪康姆侨穗s交瘤中獲得編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA，并使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將其改造為含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)連接(參見例如，Cabilly等人的美國專利號(hào)4，816，567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠CDR區(qū)插入到人框架中(參見例如，Winter等人的美國專利號(hào) 5，225，539，和 Queen 等人的美國專利號(hào) 5，530，101 ；5，585,089 ；5, 693, 762 和 6，180，370)。可以構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體，其中基于在潛在的受體分子可變區(qū)和鼠抗體重鏈可變區(qū)之間的同源性的考慮，來選擇重鏈可變區(qū)的人受體分子。種系候選人受體分子優(yōu)選是降低潛在的免疫原性的。種系數(shù)據(jù)庫由讀取時(shí)穿過重鏈FW3區(qū)的末端且部分至⑶R3序列的抗體序列構(gòu)成。為了選擇FW4區(qū)，可以搜索源自選定的種系分子的成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫，或使用源自人類供體的選定的種系分子的抗體序列。人受體分子優(yōu)選選自與鼠供體分子相同的重鏈類型，而且是與鼠供體分子的可變區(qū)相同的經(jīng)典結(jié)構(gòu)類型。針對(duì)重鏈可變區(qū)選擇人受體分子的次要考慮是規(guī)避鼠供體分子和人受體分子之間在CDR長度上的同源性。優(yōu)選通過搜索V-BASE數(shù)據(jù)庫的同源性，來選擇人受體抗體分子，但也可以使用其他數(shù)據(jù)庫如Kabat和公開的NCBI數(shù)據(jù)庫?？梢詷?gòu)建本發(fā)明的人源化抗體，其中基于在潛在的受體分子可變區(qū)和鼠抗體輕鏈可變區(qū)之間的同源性的考慮，來選擇輕鏈可變區(qū)的人受體分子。種系候選人受體分子優(yōu)選是降低潛在的免疫原性的。種系數(shù)據(jù)庫由讀取時(shí)穿過重鏈FW3區(qū)的末端且部分至⑶R3序列的抗體序列構(gòu)成。為了選擇FW4區(qū)，可以搜索源自選定的種系分子的成熟抗體數(shù)據(jù)庫，或使用源自人類供體的選定的種系分子的抗體序列。人受體分子優(yōu)選選自與鼠供體分子相同的輕鏈類型，且是與小鼠供體分子的可變區(qū)相同的經(jīng)典結(jié)構(gòu)類型。針對(duì)輕鏈可變區(qū)選擇人受體分子的次要考慮包括鼠供體分子和人受體分子之間在CDR長度上的同源性。優(yōu)選通過 V-BASE數(shù)據(jù)庫的同源性搜索，來選擇人受體抗體分子，但也可以使用其他數(shù)據(jù)庫如Kabat 和公開的NCBI數(shù)據(jù)庫。人源化非人抗體的方法如本文所述，包括下文實(shí)施例。本發(fā)明提供了生產(chǎn)結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段的方法，包括培養(yǎng)包含分離的核酸(編碼結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段)或包含含有分離的核酸(編碼結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段)的載體的宿主細(xì)胞，使得核酸表達(dá)并生產(chǎn)抗體。優(yōu)選分離所述抗體。可以使用上文所述作為宿主細(xì)胞、核酸和載體?？梢酝ㄟ^例如本領(lǐng)域普遍已知的 (例如，Morrison，S. (1985) Science 229 1202)和上文進(jìn)一步概述的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合，獲得核酸表達(dá)。例如，為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)(例如PCR擴(kuò)增或使用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤的cDNA克隆)獲得編碼部分或全長的輕鏈和重鏈DNA，并可將所述DNA插入到載體中，例如表達(dá)載體。選擇的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞是可相容的?？梢詫⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入到分離的載體中，或更通常的，兩種基因都插入到同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，連接抗體基因片段和載體上互補(bǔ)的限制性位點(diǎn)，或者如果不存在限制性位點(diǎn)時(shí)平端連接)將抗體基因插入到表達(dá)載體中。通過將本文所述的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)插入到已編碼理想同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得VH區(qū)段與載體內(nèi)的CH區(qū)段有效連接，VK區(qū)段與載體內(nèi)的CL區(qū)段有效連接，將其用來產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因?？耿?9抗體的表征和純化可以測試本發(fā)明的抗體與人⑶19的結(jié)合，通過例如標(biāo)準(zhǔn)的ELISA或與Raji腫瘤細(xì)胞的結(jié)合?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方式分離或純化本發(fā)明的抗體。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括層析技術(shù)，包括在大氣壓下進(jìn)行的離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析、尺寸層析或凝膠過濾層析，和反相層析，或使用系統(tǒng)例如FPLC和HPLC在高壓下進(jìn)行。純化方法還包括電泳的、免疫學(xué)的、沉淀、透析和層析聚焦技術(shù)。超濾和透析過濾技術(shù)也可與蛋白質(zhì)濃縮結(jié)合使用。為了純化抗CD19抗體，可以在例如用于單克隆抗體純化的轉(zhuǎn)瓶中生長選定的宿主細(xì)胞。在用蛋白A瓊脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)的親和層析之前，可以過濾和濃縮上清液?？梢酝ㄟ^凝膠電泳和高效液相層析檢測洗脫的IgG，以保證純度。免疫綴合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了與治療劑連接的結(jié)合人CD19的人源化抗CD19抗體或其片段，所述治療劑例如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素。此類綴合物在本文中稱為“免疫綴合物”。包括一種或多種細(xì)胞毒素的免疫綴合物被稱為“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞致命(例如殺死細(xì)胞)的任何活性劑。實(shí)例包括紫杉醇(taxol)、細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D (gramicidin D)、 溴化乙錠(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷 (etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、 秋水仙堿(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素 (mithramycin)、放線菌素 D (actinomycin D)、1-脫氧睪酮(Ι-dehydrotestosterone)、 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、普萘洛爾(propranolol)，和嘌呤霉素(puromycin)及其類似物或同源物。治療劑還包括例如抗代謝劑(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)、6_巰基嘌呤 (6-mercaptopurine)、6_硫代鳥曙呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5_氟尿嘧 氛煉味胺(5-f luorouracil decarbazine))、燒化劑(例如，氣芥(mechlorethamine、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法倉(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)和洛莫司汀(Iomustine) (CCNU)、環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安 (busulfan)、二溴甘露酉享(dibromomannitol)、鏈脲霉素(streptozotocin)、絲裂霉素 C(mitomycin C)和順式-二氯二胺鉬(II) (cis-dichlorodiamine platinum(II) (DDP)順怕(cisplatin)、惠環(huán)類(anthracyclines)(例如，柔紅霄素(daunorubicin)(原道i若霄素(daunomycin)和多柔比星(doxorubicin)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin) (原放線菌素(actinomycin))、博來霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin) (AMC))和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿(vincristine)和長春堿 (vinblastine))。可以與本發(fā)明抗體連接的治療性細(xì)胞毒素的其他實(shí)例包括多卡米星 (duocarmycins)、力口利車霉素(calicheamicins)、美坦辛(maytansines)禾口 auristatins， 及其衍生物。加利車霉素抗體綴合物的實(shí)例是可商購的(Mylotarg ; American Home Products)。可以使用本領(lǐng)域可獲得的接頭技術(shù)連接本發(fā)明的抗體與細(xì)胞毒素。用于綴合細(xì)胞毒素與抗體的接頭類型的實(shí)例包括但不限于腙硫醚、酯、二硫化物和含肽接頭。可以選擇例如對(duì)溶酶體區(qū)室內(nèi)的低PH切割敏感的或?qū)Φ鞍酌盖懈蠲舾械慕宇^，所述蛋白酶例如在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、C、D)。關(guān)于細(xì)胞毒素、接頭類型和將治療劑與抗體綴合的方法的進(jìn)一步討論，還參見&iito，G等人，(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 :199-215 ；Trail, P. A ^A, (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52 :328-337 ；Payne, G. (2003)Cancer Cell 3:207-212 ；Allen, Τ. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2 :750-763 ；Pastan, I.禾口 Kreitman, R. J. (2002)Curr. Opin. Investig. Drugs 3 :1089-1091 ；Senter, P. D.禾口 Springer，CJ. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53 247-2640本發(fā)明的抗體還可與放射性同位素連接，產(chǎn)生細(xì)胞毒性的放射藥物，也被稱為放射性免疫綴合物?？膳c用于診斷或治療性抗體綴合的放射性同位素的實(shí)例包括但不限于碘 131、銦m、釔90和镥177。本領(lǐng)域已建立了制備放射性免疫綴合物的方法。放射性免疫綴合物的實(shí)例是可商購的，包括Zevalin (EDEC Pharmaceuticals)和Bexxar (Corixa !Pharmaceuticals)，相似的方法可用于制備使用本發(fā)明抗體的放射性免疫綴合物。本發(fā)明的抗體免疫綴合物可用于修飾給定的生物學(xué)應(yīng)答，而藥物部分不被視為限制于經(jīng)典化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有理想生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。此類蛋白質(zhì)可包括例如酶促活性毒素，或其活性片段，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A(riCin Α)、假單胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)；蛋白質(zhì)例如腫瘤壞死因子或干擾素_[ Y ]；或生物學(xué)應(yīng)答修飾劑，例如淋巴因子、白介素-1 (IL-I)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生長因子。連接此類治療劑與抗體的技術(shù)是普遍已知的，參見例如Arnon等人，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy" , in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld ^A (Ilelr), % 243-56 M (Alan R. Liss, Inc. 1985) ；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery" , in Controlled Drug Delivery (第2版)，Robinson等人(編著)，第623-53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987)； Thorpe, “ Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review", in Monoclonal Antibodies' 84 :Biological And Clinical Applications, Pinchera 等人(Ilelr ),11 475-506 M (1985) ； “ Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy" , in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等人(編著)，第 303-16 頁 (Academic Press 1985)禾口 Thorpe 等人，Immunol. Rev. ,62 :119-58(1982)。藥物組合物在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，例如藥物組合物，其包括本發(fā)明的人源化抗體或其片段和藥學(xué)可接受的載體。此類組合物可包括一種本發(fā)明的抗體或免疫綴合物，或其組合(例如，兩種或多種不同的抗體或免疫綴合物)。例如，本發(fā)明的藥物組合物包括結(jié)合靶抗原的不同表位，或具有互補(bǔ)活性的抗體(或免疫綴合物)的組合。本發(fā)明的藥物組合物還可以在組合療法中施用，即與其它活性劑組合。例如，組合療法可包括與至少一種其它的抗炎劑或免疫抑制劑組合的本發(fā)明的抗CD19抗體。本文中使用的“藥學(xué)可接受的載體”包括任意的和所有的溶劑、分散基質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲的和延遲吸附的活性劑，以及諸如此類生理學(xué)相容的。優(yōu)選的，載體是適合靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、不經(jīng)腸道的、脊柱的或表皮施用的(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)施用途徑，活性化合物(即，抗體或免疫綴合物)可包被在材料中，保護(hù)所述化合物免受可能滅活所述化合物的酸和其它天然條件的作用。藥學(xué)可接受的載體包括無菌的含水溶液或分散液，和用于即時(shí)制備的無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。此類基質(zhì)和活性劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域已知的。除非是與所述活性化合物不相容的任何常規(guī)基質(zhì)或活性劑，否則可考慮其在本發(fā)明的藥物組合物中的用途。補(bǔ)充的活性化合物也可被摻入到所述組合物中。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含免疫綴合物和藥學(xué)可接受的載體的組合物，所述免疫綴合物包括與治療劑連接的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段?？扇缟衔乃鍪褂妹庖呔Y合物和治療劑。本發(fā)明的藥物組合物還可包括藥學(xué)可接受的抗氧化劑。藥學(xué)可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、 亞硫酸鈉等；( 油溶性抗氧化劑，例如棕櫚?？箟难狨?ascorbyl palmitate)、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α生育酚等；和( 金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒景l(fā)明的藥物組合物中的合適的含水和不含水載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油例如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。例如通過使用包被材料(如卵磷脂)，通過維持所需的顆粒大小(分散體的情形下)和通過使用表面活性劑，可以維持恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可以含有佐劑，例如防腐劑、濕潤劑、 乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上文的滅菌程序和通過包含各種抗菌劑和抗真菌劑來確保防止存在微生物，所述抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸苯酚(phenol sorbic acid)等。組合物中包括等滲劑也是理想的，例如糖、氯化鈉等。此外，通過包括延遲吸附的后星級(jí)，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以產(chǎn)生可注射的藥物形式的延長吸附。治療和其他用途本發(fā)明的人源化抗體具有多種體外和體內(nèi)的診斷和治療性用途，涉及CD19介導(dǎo)的病癥的診斷和治療。例如，可以在體外或離體條件下，將這些分子施用給培養(yǎng)的細(xì)胞，或例如在體內(nèi)條件下，施用給人類對(duì)象，來治療、預(yù)防和診斷多種CD19介導(dǎo)的病癥。優(yōu)選的對(duì)象是人，包括患CD19活性介導(dǎo)的病癥(CD19介導(dǎo)的病癥)的患者。方法特別適合治療患與異常B細(xì)胞群體相關(guān)的CD19介導(dǎo)的病癥的人類患者。出于本發(fā)明的目的，“患者”包括人和其他動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物和最優(yōu)選人。因而， 本發(fā)明的抗體同時(shí)具有人類治療和獸醫(yī)應(yīng)用。本發(fā)明中的術(shù)語“治療”意在包括治療性治療，以及對(duì)疾病或病癥的預(yù)防性或抑制性的手段。因而，例如，在疾病發(fā)動(dòng)前成功的施用抗體，導(dǎo)致疾病的治療。作為另一個(gè)實(shí)例，在疾病的臨床表征后成功的施用抗體，來抗?fàn)幖膊〉陌Y狀，包括疾病的治療?！爸委煛边€涵蓋了在疾病出現(xiàn)后，為了消除所述疾病而施用抗體。 在發(fā)動(dòng)后或出現(xiàn)臨床癥狀后成功的施用抗體，伴隨臨床癥狀的可能的減輕以及也許疾病的緩解，包括了疾病的治療。上述“需要治療的”包括已患所述疾病或病癥的，以及傾向于患所述疾病或病癥的哺乳動(dòng)物，包括要被預(yù)防疾病或病癥的那些。在特定的實(shí)施方案中，人源化抗體在體內(nèi)用于治療、預(yù)防或診斷多種CD19介導(dǎo)的疾病。因而，本發(fā)明提供了在對(duì)象中治療CD19介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康娜嗽椿贵w或其片段。示例性的CD19介導(dǎo)的病癥包括包含類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫病癥，癌癥、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma)、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia) (ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)、多毛細(xì)胞白血病(hairy cell leukemia)、伯基特淋巴瘤、 間變性大細(xì)胞淋巴瘤(anaplastic large-cell lymphomas) (ALCL)、皮膚Τ-細(xì)胞淋巴瘤 (cutaneous T-cell lymphomas)、結(jié)節(jié)性小裂細(xì)胞淋巴瘤(nodular small cleaved-cell lymphomas)、夕卜周T-細(xì)胞性淋巴瘤(peripheral T-cell lymphomas)、倫納特淋巴瘤 (Lennert' s lymphomas)IfitiS(immunoblastic lymphomas), ~ MM^ 血病 / 淋巴瘤(ATLL) (T-cell leukemia/lymphomas)、成人 T-細(xì)胞白血病(adult T-cell leukemia) (T-ALL)、內(nèi)分芽型/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡型淋巴瘤癌癥(entroblastic/ centrocytic (cb/cc) follicular lymphomas cancers)、B系彌漫j"生大細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphomas of B lineage)、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞性淋巴瘤(angioimmunoblastic lymphadenopathy (AILD) -like T cell lymphoma)、HIV 相關(guān)性體腔淋巴瘤(HIV associated body cavity based lymphomas)、胚性癌(Embryonal Carcinomas)、鼻口因部白勺未分化癌(undifferentiated carcinomas of the rhino-pharynx) (例如，施明克瘤(Schmincke' s tumor))、卡斯?fàn)柭?Castleman' s disease)、卡波氏肉瘤(Kaposi' s Sarcoma)、多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥(Waldenstrom' s macroglobulinemia)、抗CD20抗體耐受性B細(xì)胞癌癥和其他的B 細(xì)胞淋巴瘤和白血病?？笴D20抗體耐受性B細(xì)胞癌癥是例如利妥昔單抗(Rituxan ) 耐受性B細(xì)胞癌癥，這是優(yōu)選的抗CD20抗體耐受性B細(xì)胞癌癥。優(yōu)選的癌癥是血液癌癥， 尤其是涉及表達(dá)CD19的淋巴瘤和白血病的癌癥，特別是非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、多毛細(xì)胞白血病。用本發(fā)明的抗體治療的優(yōu)選的 CD19介導(dǎo)的病癥選自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病 (CLL)、多毛細(xì)胞白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和抗⑶20抗體耐受性B 細(xì)胞癌癥。用本發(fā)明的抗體治療的更優(yōu)選的CD19介導(dǎo)的病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、非霍奇金淋巴瘤或抗CD20抗體耐受性B細(xì)胞癌癥。 “自身免疫病癥”包括同種異體胰島移植排斥(allogenic islet graft rejection)、斑秀(alopecia areata)、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis) > 抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome)、自身免疫性艾迪生病(autoimmune Addison' s disease)、抗嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)自身抗體(antineutrophil cytoplasmic autoantibodies) (ANCA)、腎上腺的自身免疫病(autoimmune diseases of the adrenal gland)、自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)、自身免疫性肝炎 (autoimmune hepatitis) > ^ ^(autoimmune myocarditis) > g ^iiSiiBf 中性白血球減少癥(autoimmune neutropenia)、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎(autoimmune oophoritis and orchitis)、自身免疫性血小板減少癥(autoimmune thrombocytopenia) > (autoimmune urticaria) > S S K (Behcet ' s disease) > ^ 類天皰疫(bullous pemphigoid)、心肌病(cardiomyopathy)、Castleman 氏綜合征 (Castleman ' s syndrome) > celiac spruce—dermatitis、個(gè)曼性免疫豐幾能失常綜& 征(chronic fatigue immune disfunction syndrome)、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)、丘斯綜合征(Churg—Strauss syndrome)、疤痕性類天皰瘡(cicatrical pemphigoid)、CREST 綜合征(CREST syndrome) > 冷凝集素疾病(cold agglutinin disease)、克羅恩氏病(Crohn ' s disease)、皮肌炎(dermatomyositis)、盤狀狼瘡(discoid lupus)、特發(fā)性混合性冷球蛋白血癥 (essential mixed cryoglobulinemia)、因子 VIII 缺陷(factor VIII deficiency) 維月il痛 _ 纖維肌炎(fibromyalgia-fibromyositis)、lIf zj、球1If 炎(glomerulonephritis)、 格雷夫斯氏病(Grave ‘ s disease)、GuilIain-Barre，古德帕斯徹氏綜合征 (Goodpasture‘ s syndrome)、移植物抗宿主病(graft -versus-host disease (GVHD))、 橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto ‘ s thyroiditis)、血友病A (hemophilia A)、特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenia purpura) (ITP)、IgA 神經(jīng)病(IgA neuropathy)、IgM 多發(fā)性神經(jīng)病(IgM polyneuropathies)、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥(immune mediated thrombocytopenia) ^ 1 春期關(guān)節(jié)炎(juvenile arthritis)、川崎病(Kawasaki ‘ s disease)、lichen planrus、紅斑狼瘡(lupus erthematosis)、美尼爾氏病(Meniere' s disease)、混合型結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis (MS))、 I 型糖尿病(type ldiabetes mellitus)、重癥肌無力(myasthenia gravis)、尋常天皰瘡(pemphigus vulgaris)、惡性貧血(pernicious anemia)、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動(dòng)脈炎 (polyarteritis nodosa)、多軟骨炎(polychondritis)、多腺體綜合征(polyglandular syndromes)、風(fēng)、濕性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、多肌炎(polymyositis)禾口皮肌炎(dermatomyositis)、原發(fā)性無丙禾中球蛋白血癥(primary agammaglobinulinemia)、 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、銀屑病(psoriasis)、牛皮癬關(guān)節(jié)炎(psoriatic arthritis)、Reynauld 氏現(xiàn)象(Reynauld ‘ s phenomenon)、萊特爾綜合征(Reiter' s syndrome)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis) (RA)、肉狀瘤病 (sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)、干燥綜合征(Sjogren' s syndrome)、實(shí)體器官移植排斥(solid organ transplant rejection)、僵人綜合征(stiff-man syndrome)、系統(tǒng) {4^1(systemic lupus erythematosus) (SLE)、大動(dòng)l/Jc炎(takayasu arteritis) > 暫時(shí)性動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(temporal arteristis/giant cell arteritis)、血栓性血小減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenia purpura)、饋蕩性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、眼色素層炎(uveitis)、血管炎病(vasculitides)例如皰疹樣皮炎脈管炎 (dermatitis herpetiformis vasculitis)、白癜風(fēng)(vitiligo)、與抗中性白細(xì)胞胞質(zhì)抗體 ffiIftiWiit (anti-neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis) 物抗宿主病(graft vs. host disease)、冷球蛋白血癥(cryoglobulinemia)、IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病(IgM mediated neuropathy)、視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica)、特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy)、斜視生目艮陣_ (opsoclonus myoclonus)禾口韋格納氏肉芽月中病(Wegner' s granulomatosis)。此外，考慮CD19在多種腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)，并考慮如上所述本發(fā)明的人源化抗體或其片段抑制表達(dá)CD19的惡性B細(xì)胞增殖的事實(shí)，CD19介導(dǎo)的疾病優(yōu)選是腫瘤發(fā)生性病癥，如癌癥，例如特征是存在表達(dá)CD19的腫瘤細(xì)胞的病癥，包括例如非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、多毛細(xì)胞白血病、伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞白血病(lymphocytic lymphomas)外周T-細(xì)胞性淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、 免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-細(xì)胞白血病(T-ALL)、內(nèi)分芽型/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡型淋巴瘤癌癥、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞性淋巴瘤、HIV相關(guān)性體腔淋巴瘤、胚性癌、鼻咽部的未分化癌 (例如，施明克瘤)、卡斯?fàn)柭　⒖úㄊ先饬?、多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、 抗⑶20抗體耐受性B細(xì)胞癌癥和其他的B細(xì)胞淋巴瘤和白血病。因而在其他方面，本發(fā)明提供了抑制表達(dá)⑶19的腫瘤細(xì)胞生長的方法，包括將細(xì)胞與本發(fā)明的人源化抗體或其片段接觸，其量有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長。腫瘤細(xì)胞通常選自人伯基特淋巴瘤細(xì)胞、人B細(xì)胞前體白血病細(xì)胞、人B細(xì)胞白血病細(xì)胞或人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，優(yōu)選人伯基特淋巴瘤細(xì)胞或人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞。考慮本發(fā)明的人源化抗體或其片段導(dǎo)致血液中的B細(xì)胞耗盡的事實(shí)，本發(fā)明還提供了耗盡對(duì)象中的B細(xì)胞的方法，包括向?qū)ο笫┯靡欢康谋景l(fā)明的人源化抗體或其片段，所述量有效的耗盡對(duì)象中的B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于檢測CD19的水平，或在其膜表面含有 CD19的細(xì)胞的水平，所述水平之后可與某些疾病癥狀關(guān)聯(lián)。可選的，抗體可用于抑制或阻斷 CD19功能，反過來可與某些疾病癥狀的預(yù)防或緩解相關(guān)，從而提示CD19作為疾病的介質(zhì)。 這可以通過在允許抗體和CD19之間形成復(fù)合體的條件下，將樣品和對(duì)照樣品與抗CD19抗體接觸來實(shí)現(xiàn)。檢測在抗體和CD19之間形成的任何復(fù)合體，并比較樣品和對(duì)照。根據(jù)本發(fā)明抗體與CD19的特異性結(jié)合，本發(fā)明抗體可用于特異性檢測細(xì)胞表面表達(dá)的CD19表達(dá)，進(jìn)而可用于通過免疫親和純化來純化⑶19。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以初步測試本發(fā)明抗體與治療或體外診斷用途相關(guān)的結(jié)合活性。例如，可以使用下文實(shí)施例所述的流式細(xì)胞儀測定，來測試本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了使用人源化抗體或其片段作為藥物的用途，和人源化抗體或其片段在制備用于治療CD19介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人源化抗體或其片段，其用作為藥物。本發(fā)明還提供了人源化抗體或其片段，用在治療CD19 介導(dǎo)的病癥的方法中。CD19介導(dǎo)的病癥如上文所述。如前所述，本發(fā)明的人抗CD19抗體可以和一種或其它多種治療劑共同施用，例如細(xì)胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑。抗體可以與活性劑連接(作為免疫復(fù)合物)或者可以與活性劑分別施用。在后一種情況下(分別施用)，可以在活性劑之前、之后或同時(shí)施用抗體，或者可以與其它已知的療法共同施用抗體，所述療法例如抗癌療法，例如放射。對(duì)于施用抗體，劑量范圍從約0. 0001至100mg/kg，更常見從0. 01至10mg/kg的宿主體重。示例性的治療方案需要每周一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次或每3至6個(gè)月一次施用。通常在多種情況施用所述抗體。單次劑量之間的間隔可以是例如每周、每月、每三月或每年。間隔還可以是不規(guī)律的，通過測量血液的抗體水平與患者中的靶抗原提示。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量獲得約1-1000μ g/ml的血漿抗體濃度，而在一些方法中，約25-300 μ g/ml?？蛇x的，可以以持續(xù)釋放的配方施用抗體，在此情況下需要較低的施用頻率。劑量和頻率根據(jù)患者中的抗體的半衰期而變化。施用的劑量和頻率可以根據(jù)所述治療是預(yù)防性還是治療性而改變。在預(yù)防性應(yīng)用中，在較長時(shí)間段中，以相對(duì)較不頻繁的間隔，施用相對(duì)較低的劑量。一些患者在其余生中持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)較短的間隔施用相對(duì)較高的劑量，直到降低或終止疾病的進(jìn)展?；钚猿煞值膶?shí)際劑量(S卩，本發(fā)明的藥物組合物中的抗體)是可以改變的，從而獲得活性成分的這樣的量，對(duì)于特定的患者、組合物和施用模式，所述量有效的實(shí)現(xiàn)理想的治療響應(yīng)，而對(duì)患者沒有毒性。選定的劑量水平取決于多種藥物動(dòng)力學(xué)因子，包括所使用的本發(fā)明特定組合物的活性、施用途徑、施用時(shí)間、所使用的特定抗體的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與所使用的特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、年齡、性別、體重、 病況、健康狀態(tài)和受治患者之前的藥物史等本領(lǐng)域普遍已知的因素。“治療有效量”的本發(fā)明的抗CD19抗體優(yōu)選導(dǎo)致疾病癥狀嚴(yán)重程度的減少、疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)期的增加，和/或預(yù)防由于病痛導(dǎo)致的損傷或殘疾。例如，對(duì)于治療腫瘤發(fā)生性病癥(CD19<+>腫瘤)，相對(duì)于未治療的對(duì)象，“治療有效量”優(yōu)選抑制細(xì)胞生長或腫瘤生長至少約20%，更優(yōu)選至少約40%，甚至更優(yōu)選至少約60%，仍然更優(yōu)選至少約 80%。可以在預(yù)測人類腫瘤功效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)估化合物抑制腫瘤生長的能力?？蛇x的，可以通過檢驗(yàn)化合物抑制細(xì)胞生長的能力，來評(píng)估組合物的該特性，可以通過熟練的技術(shù)人員已知的測定在體外測量此類抑制作用。治療有效量的治療性化合物可以減小腫瘤尺寸，或者減輕對(duì)象的癥狀。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠基于如下因素確定所述量，例如對(duì)象的尺寸、對(duì)象癥狀的嚴(yán)重程度，和所選定的特定組合物或施用途徑?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的各種方法中的一種或多種，通過一種或多種施用途徑， 來施用本發(fā)明的抗體或組合物。如熟練的技術(shù)人員所理解的，施用的途徑和/或方式將根據(jù)所需的結(jié)果而改變。優(yōu)選的施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱的或其它不經(jīng)腸道的施用途徑，例如通過注射或輸注。更優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)或皮下的。本文中使用的詞組“不經(jīng)腸道的施用”意指除腸和局部施用以外的施用方式，通常通過注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、硬膜內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)(intraorbital)、 心內(nèi)(intracardiac)、皮內(nèi)(intradermal)、腹膜內(nèi)(intraperitoneaD、經(jīng)氣管的 (transtracheal)、1 Τ"、^ 1 Τ" (subcuticular) > ^； i P^ (intraarticular)、■ Τ" (subcapsular)(subarachnoid)(intraspiriEil)、MH夕卜(epidural)禾口胸骨內(nèi)(intrasternal)的注射和輸注。可選的，可以通過非不經(jīng)腸道的途徑施用本發(fā)明的抗體，例如局部的、表皮的或粘膜的施用途徑，例如鼻內(nèi)、口服、陰道的、經(jīng)直腸的、舌下的或局部的。制品和藥盒在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療CD19介導(dǎo)的病癥的、包括本發(fā)明的人源化抗體或其片段、組合物或免疫綴合物的制品。制品可包括容器，和與容器相關(guān)聯(lián)或在其上的標(biāo)簽或包裝內(nèi)置物。合適的容器包括例如瓶、管狀瓶或注射器?？梢杂枚喾N材料形成容器，例如玻璃或塑料。容器保留對(duì)治療疾病有效的的組合物，可具有無菌的入口(例如，容器可以是靜脈內(nèi)用溶液包或管狀瓶，具有可被皮下注射針頭穿刺的瓶塞)。組合物中的至少一種活性劑是本文所述的人源化抗體。標(biāo)簽或包裝內(nèi)置物可指示所述組合物可用于治療的選擇的疾病，例如癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)簽或包裝內(nèi)置物可指示包括人源化抗體的所述組合物可用于治療CD19介導(dǎo)的病癥。此外，制品可包括(a)其中含有組合物的第一容器，其中所述組合物包括本文的人源化抗體，和(b)其中含有組合物的第二容器，其中所述組合物包括人源化抗體以外的治療劑。本發(fā)明的這一實(shí)施方案中的制品可進(jìn)一步包括包裝內(nèi)置物，其指示第一和第二組合物可組合的用于治療CD19介導(dǎo)的疾病或病癥。此類治療劑可以是上述章節(jié)中描述的任何附屬療法(例如，血栓溶解劑、抗血小板劑、化療劑、抗血管發(fā)生劑、抗激素化合物、保心藥和/或哺乳動(dòng)物免疫功能的調(diào)節(jié)劑，包括細(xì)胞因子)。可選的或額外的，制品可還包括包含藥學(xué)可接受的緩沖液的第二(或第三)容器，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸緩沖鹽溶液、林格液(Ringer' s solution)和葡萄糖溶液。還可包括其他對(duì)商業(yè)和用戶觀點(diǎn)而言理想的材料，包括其他的緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。還落入本發(fā)明范圍內(nèi)的包括包含本發(fā)明的抗體、組合物或免疫綴合物和使用說明的藥盒。藥盒可進(jìn)一步含有一種或多種其他試劑，例如免疫抑制劑、細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑，或一種或多種其他的本發(fā)明的人源化抗體(例如，結(jié)合CD19中不同于第一人源化抗體的表位的人源化抗體，其具有補(bǔ)充活性)。材料的保藏
下列材料保藏在 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Inhoffenstr. 7B, 38124Braunschweig, Germany 中于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物(大腸桿菌)，具有登錄號(hào)DSM 23303， 其包含分離的核酸，所述核酸包含如實(shí)施例1所述結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的輕鏈編碼核酸序列。于2010年2月5日保藏在DSMZ的微生物(大腸桿菌)，具有登錄號(hào)DSM 23302，其包含分離的核酸，所述核酸包含如實(shí)施例1所述結(jié)合人⑶19的人源化FMC63變體的重鏈編碼核酸序列。這些保藏都是根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約及其規(guī)程中的布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行的(布達(dá)佩斯條約)。不需進(jìn)一步描述，可以相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以利用上述說明和下列示例性實(shí)施例，制造和利用本發(fā)明的物質(zhì)和實(shí)施要求保護(hù)的方法。下列工作實(shí)施例供促進(jìn)本發(fā)明的實(shí)踐所用，并非被視為對(duì)本發(fā)明其余內(nèi)容的任何方式的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1 抗人⑶19的小鼠單克隆FMC63抗體的人源化本文描述了人源化抗人CD19的鼠抗體FMC63，包括人受體框架的選擇、回復(fù)突變和基本保留和/或改善人CDR移植受體框架結(jié)合特性的突變。FMC63是鼠IgG^i，從用人幼淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系JVM3免疫的小鼠中分離的κ 抗體(Zola H.等人，(1991), Immunol Cell Biol.，69 :411-22)，其可變區(qū)是已知的且公眾可獲得的(重鏈 NCBI 登錄號(hào)CAA74659(SEQ ID NO 1)；輕鏈 NCBI 登錄號(hào)CAA74660 (SEQ ID NO :2))。測定抗原結(jié)合親和力的方法是本領(lǐng)域普遍已知的，包括半最大結(jié)合測定、競爭測定和katchard印跡分析。設(shè)計(jì)改造的可變區(qū)選擇人受體框架使用同源性匹配來選擇移植FMC63CDR的人受體框架。可使用數(shù)據(jù)庫(例如，人和小鼠免疫球蛋白基因座的種系可變基因的數(shù)據(jù)庫，VBASE2(Retter I.等入，2005，Nucleic Acids Res. ,33, Database issue D671-D674) ^Kabat ^ig(Johnson G.等人，2000，Nucleic Acids Res.，28，第 214-218 頁))或出版物(例如，Kabat 等人， Sequences of Proteins ofImmunologicallnterest, 1992)鑒別鼠重鏈和輕鏈 V 區(qū)所屬的人亞族，并確定用作受體分子的最適人種系框架。在這些用作受體的亞族中選擇VH和VL序列可基于序列同源性和/或CDRl和CDR2區(qū)的結(jié)構(gòu)匹配，來幫助在移植后保留六個(gè)CDR的恰當(dāng)?shù)南鄬?duì)呈現(xiàn)。例如，VBASE2數(shù)據(jù)庫的使用提示FMC63的κ輕鏈?zhǔn)铅?1亞族，因?yàn)樵贔MC63VL框架和人κ亞族I的成員之間鑒別了良好的同源性。對(duì)四種種系序列觀察到了 CDR和框架序列的最高同源性和同一性IGKVl-5 * 03(VBASE2ID humIGKV087) (SEQ ID NO :3)，IGKV1-27 * 01(VBASE2ID humIGKV106)(SEQ ID NO :4)，IGKV1-39 * 01(VBASE2ID humIGKV115)(SEQ ID NO :5)，和 IGKV1-12 * 01(VBASE2ID humIGKV094) (SEQ ID NO :6)；其在達(dá)到 CDR3 的整個(gè)序列分別具有70. 4^^75^^76. 和72. 7%的序列同一性，而在框架區(qū)分別具有74. 3%、 78. 6%、78. 6%和77. 的序列同一性。因?yàn)閂BASE2中不包括完整的IXDR3和框架4區(qū)， 所以通過分析從健康的供體B細(xì)胞mRNA制備的互補(bǔ)DNA(cDNA)，來鑒別與人受體框架最匹配的JK區(qū)段序列，之后使用簡并引物擴(kuò)增，表1顯示了 κ同種型的免疫球蛋白輕鏈第一恒定結(jié)構(gòu)域。利用該方法，擴(kuò)增的與 IGKV1-5 * 03 (SEQ ID NO :3)、IGKV1-27 * 01 (SEQ ID NO :4)、IGKV1-39 * 01 (SEQ ID NO 5)和 IGKV1-12 * 01 (SEQ ID NO 6)最匹配序列分別是SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO :10。
表1:
正向引物序列(5·—3，)反向引物序列(5，—3，)GATCGGATCCACTGG TGATATTGTGATGAC YCAGWCTCC (SEQ ID NO: 70)GATCGCGGCCGCACA CTCTCCCCTGTTGAA GCTCTT (SEQ ID NO: 71)
權(quán)利要求
1.結(jié)合人⑶19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQID NO :27的氨基酸序列的重鏈⑶R1，和/或包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和/或包含SEQ ID NO 29 的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；和/或包括包含SEQ ID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶R1，和/ 或包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和/或包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
2.權(quán)利要求1的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶Rl，包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和包含 SEQ ID NO 29的氨基酸序列的重鏈⑶R3。
3.權(quán)利要求1的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQID NO 30的氨基酸序列的輕鏈⑶Rl，包含SEQ ID NO 31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和包含 SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈CDR3。。
4.權(quán)利要求1的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQID NO 27的氨基酸序列的重鏈⑶Rl，包含SEQ IDNO 28的氨基酸序列的重鏈⑶R2，和包含SEQ ID NO :29的氨基酸序列的重鏈⑶R3 ；以及包括包含SEQ ID NO :30的氨基酸序列的輕鏈 ⑶R1，包含SEQ ID NO :31的氨基酸序列的輕鏈⑶R2，和包含SEQ ID NO :32的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。
5.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括選自SEQ ID NO :19、20、21、22和42的重鏈可變區(qū)序列。
6.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括與SEQ ID N0:19、20、21、22或42的框架區(qū)序列至少80%相同的重鏈可變框架區(qū)序列。
7.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括SEQ ID NO 21的重鏈可變區(qū)序列。
8.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括與SEQ ID NO 21的框架區(qū)序列至少80%相同的重鏈可變框架區(qū)序列。
9.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括這樣的重鏈可變框架區(qū)，所述重鏈可變框架區(qū)是選自V3-33 OKSEQ ID N0:11)、V3_11 * 01 (SEQ ID N0:12)、V3-30 * _18(SEQ ID NO :13)和 V3-48 * 01(SEQ ID NO :14)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因。
10.權(quán)利要求1至9的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段的至少一個(gè)重鏈⑶R包含至少一種氨基酸修飾。
11.權(quán)利要求10的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括在重鏈CDRl內(nèi)的氨基酸取代TO2F，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示氨基酸位置。
12.權(quán)利要求10的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括在重鏈CDR2內(nèi)的氨基酸取代TO8F或TO9F，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
13.權(quán)利要求10的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括在重鏈CDR3內(nèi)的選自 Y96F、Y97F、Y98F和Y100BF的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
14.權(quán)利要求5至13的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段的重鏈可變區(qū)的至少一個(gè)框架區(qū)包含至少一種氨基酸修飾，所述氨基酸修飾來自相應(yīng)的鼠抗體的重鏈可變區(qū)的相應(yīng)的框架區(qū)。
15.權(quán)利要求14的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括在選自37、42、48、49、 67、71、78和94的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
16.權(quán)利要求14的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括在選自42、67、71、78和 94的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
17.權(quán)利要求14的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括選自G42R、F67L、R71K、 L78V和R94K的氨基酸取代，條件是如果氨基酸修飾是R94K，則重鏈可變區(qū)序列不是SEQ ID N0:19或SEQ ID NO :20，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
18.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括選自SEQ ID NO :23、24、25、26和41的輕鏈可變區(qū)序列。
19.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括與SEQ ID NO :23,24,25,26和41的框架區(qū)序列至少80%相同的輕鏈可變框架區(qū)序列。
20.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括SEQ ID NO 41的輕鏈可變區(qū)序列。
21.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括與SEQ ID NO 41的框架區(qū)序列至少80%相同的輕鏈可變框架區(qū)序列。
22.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括這樣的輕鏈可變框架區(qū)，所述輕鏈可變框架區(qū)是選自V1-5女03 (SEQ ID NO :3)、V1_27 * 01 (SEQ ID NO :4)、Vl-39 * -01 (SEQ ID NO :5)和 Vl-12 * 01 (SEQ ID NO :6)的人基因的產(chǎn)物或源自所述人基因。
23.權(quán)利要求1至4或18至22的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段的至少一個(gè)輕鏈CDR包括至少一種氨基酸修飾。
24.權(quán)利要求23的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括在輕鏈CDRl中的氨基酸取代TO2F，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
25.權(quán)利要求23的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括選自輕鏈CDR3內(nèi)的 N92A、T93A和T93V的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
26.權(quán)利要求18至25的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中人源化抗體或其片段的輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)框架區(qū)包括至少一種氨基酸修飾，所述氨基酸修飾來自相應(yīng)鼠抗體的輕鏈可變區(qū)的相應(yīng)框架區(qū)。
27.權(quán)利要求沈的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括在選自44、71和87的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
28.權(quán)利要求沈的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括選自P44V、P44I、P44L、 F71Y、F71H、F71S、F71T和Y87F的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
29.權(quán)利要求沈的人源化抗體或其片段，其中氨基酸修飾包括選自P44V、P44I、F71Y和Y87F的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
30.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a)選自SEQID NO :19、20、21、22和42的重鏈可變區(qū)序列；和(b)選自SEQID NO :23、24、25、26和41的輕鏈可變區(qū)序列。
31.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a)包含SEQID NO 21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)序列；和(b)包含SEQID NO 41的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列。
32.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括選自 SEQ ID NO :33、34、35、36、37、43、44、45、46、47、54 和 55 的重鏈可變區(qū)。
33.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括選自 SEQ ID NO :25、38、39、40、48、49、50、51、52、53、56、57、58、59、60、61、62 和 63 的輕鏈可變區(qū)。
34.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
35.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包括包含 SEQ ID NO :47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :60的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
36.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
37.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :25的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
38.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :37的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
39.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :47的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :49的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
40.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括包含SEQ ID NO :43的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和包含SEQ ID NO :59的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
41.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a)包含SEQID NO 64的氨基酸序列的重鏈序列；和(b)包含SEQID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
42.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a)包含SEQID NO 66的氨基酸序列的重鏈序列；和(b)包含SEQID NO 67的氨基酸序列的輕鏈序列。
43.權(quán)利要求4的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a)包含SEQID NO 66的氨基酸序列的重鏈序列；和(b)包含SEQID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
44.權(quán)利要求1至40的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其還包括人重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)。
45.權(quán)利要求44的人源化抗體或其片段，其中所述人重鏈恒定區(qū)選自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgMl、IgM2、IgD 和 IgE 組成的人免疫球蛋白的組。
46.權(quán)利要求44的人源化抗體或其片段，其中所述人重鏈恒定區(qū)是人IgG。
47.權(quán)利要求44的人源化抗體或其片段，其中所述人重鏈恒定區(qū)是人IgGl。
48.權(quán)利要求44的人源化抗體或其片段，其中所述人重鏈恒定區(qū)包括包含來自人IgGl 的CH1、來自人IgGl的鉸鏈區(qū)和來自人IgG3的Fc區(qū)的同種型變體。
49.權(quán)利要求48的人源化抗體或其片段，其包括(a)包含SEQID NO 124的氨基酸序列的重鏈序列；和(b)包含SEQID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
50.權(quán)利要求48的人源化抗體或其片段，其中所述同種型變體相比權(quán)利要求47的人源化抗體或其片段表現(xiàn)出改善的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。
51.權(quán)利要求44的人源化抗體或其片段，其中所述人輕鏈恒定區(qū)選自由人κ和人λ 組成的人免疫球蛋白的組。
52.權(quán)利要求51的人源化抗體或其片段，其中所述人輕鏈恒定區(qū)是人κ。
53.權(quán)利要求1至52的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述抗體是全長抗體。
54.權(quán)利要求1至52的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述抗體是抗體片段，其選自 Fab、Fab' ,Fab' _SH、Fd、Fv、dAb、F(ab‘ ) 2、scFv、雙特異性單鏈 Fv 二聚體、雙抗體、 三鏈抗體和與相同或不同抗體遺傳融合的scFv。
55.權(quán)利要求1至53的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述抗體包括相對(duì)于親本抗體的人IgG Fc區(qū)含有至少一種氨基酸修飾的變體人IgG Fc區(qū)，而包含變體人IgG Fc區(qū)的抗體表現(xiàn)出相比親本抗體改變的效應(yīng)子功能。
56.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述效應(yīng)子功能是補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (CDC)和/或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。
57.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述氨基酸修飾包括在選自沈9、274、 276、四8、3對(duì)和334的氨基酸位置上的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
58.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述氨基酸修飾包括選自E269D、K274Q、 N276K、S298A、S324N和K334R的氨基酸取代，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
59.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述氨基酸修飾包括在選自沈9/274， 269/276，269/298，269/324，269/334，274/276，274/298，274/324，274/334，276/298， 276/324,276/334,298/324,298/334,324/334,269/274/276，269/274/298，269/274/324， 269/274/334，269/276/298，269/276/324，269/276/334，269/298/324，269/298/334， 274/276/298,274/276/324，274/276/334,274/298/324,274/298/334,276/298/324,和 276/298/334的氨基酸位置上的氨基酸取代的組合，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
60.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述氨基酸修飾包括選自E269D/K274Q， E269D/N276K, E269D/S298A, E269D/S324N, E269D/K334R, K274Q/N276K, K274Q/S298A, K274Q/S324N, K274Q/K334R, N276K/S298A, N276K/S324N, N276K/K334R, S298A/S324N, S298A/K334R, S324N/K334R, E269D/K274Q/N276K, E269D/K274Q/S298A, E269D/K274Q/S324N, E269D/K274Q/K334R, E269D/N276K/S298A, E269D/N276K/S324N, E269D/N276K/ K334R, E269D/S298A/S324N, E269D/S298A/K334R, K274Q/N276K/S298A, K274Q/N276K/ S324N, K274Q/N276K/K334R, K274Q/S298A/S324N, K274Q/S298A/K334R, N276K/S298A/ S3MN，和N276K/S298A/K334R的氨基酸取代的組合，其中利用Kabat中提出的編號(hào)系統(tǒng)表示每組成員的氨基酸位置。
61.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a)包含SEQID NO 114的氨基酸序列的重鏈序列；(b)包含SEQID NO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
62.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 115的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
63.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 116的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
64.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 117的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
65.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 118的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
66.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 119的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
67.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 120的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
68.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 121的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
69.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 122的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
70.權(quán)利要求55的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段包括(a包含SEQIDNO 123的氨基酸序列的重鏈序列；(b包含SEQIDNO 65的氨基酸序列的輕鏈序列。
71.權(quán)利要求46的人源化抗體或其片段，其中所述與人IgGFc區(qū)連接的成熟的核心糖類結(jié)構(gòu)缺少巖藻糖。
72.結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其中所述抗體包括變體人IgGFc區(qū)，所述變體人IgG Fc區(qū)包含用天冬酰胺替換親本抗體的氨基酸3 位的絲氨酸的氨基酸取代S3MN，而包括所述變體人IgG Fc區(qū)的抗體相比親本抗體表現(xiàn)出改善的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。
73.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段結(jié)合Raji腫瘤細(xì)胞，其具有的中點(diǎn)熒光(MPF)相對(duì)于相應(yīng)嵌合抗體的結(jié)合為至少10%。
74.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段結(jié)合人⑶19，其具有的親和力(Kd)為50nM或更低。
75.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段保留了相應(yīng)嵌合抗體的至少20%的⑶19結(jié)合親和力(Kd)。
76.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體競爭結(jié)合 Raji腫瘤細(xì)胞，其具有的親和力(Ki)為50nM或更低。
77.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段在Raji腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
78.權(quán)利要求77的人源化抗體或其片段，其中在至少10%的Raji腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
79.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段在Raji腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)ADCC活性。
80.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段抑制惡性B細(xì)胞的增殖。
81.權(quán)利要求80的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段保留了相應(yīng)嵌合抗體的至少60%的對(duì)惡性B細(xì)胞增殖的抑制。
82.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段抑制Raji腫瘤細(xì)胞的克隆發(fā)生。
83.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段導(dǎo)致血液中的B細(xì)胞耗盡。
84.權(quán)利要求83的人源化抗體或其片段，其中所導(dǎo)致的B細(xì)胞耗盡至少與相應(yīng)嵌合抗體導(dǎo)致的B細(xì)胞耗盡相同。
85.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體或其片段在Raji腫瘤細(xì)胞中內(nèi)化。
86.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體具有大于 65°C的FAB片段熱穩(wěn)定溫度。
87.權(quán)利要求86的人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體的FAB片段的熱穩(wěn)定溫度等于親本鼠抗體的FAB片段的熱穩(wěn)定溫度。
88.編碼權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段的分離的核酸。
89.分離的核酸，其包括結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的重鏈編碼核酸序列，所述重鏈編碼核酸序列保藏在DSMZ的具有登錄號(hào)DSM 23302的微生物中。
90.分離的核酸，其包括結(jié)合人CD19的人源化FMC63變體的輕鏈編碼核酸序列，所述輕鏈編碼核酸序列保藏在DSMZ的具有登錄號(hào)DSM 23303的微生物中。
91.載體，其包括權(quán)利要求88的分離的核酸或權(quán)利要求89和90的分離的核酸。
92.宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求88的分離的核酸或權(quán)利要求89和90的分離的核酸或權(quán)利要求91的載體。
93.生產(chǎn)結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求92的宿主細(xì)胞，使得表達(dá)核酸和生產(chǎn)抗體。
94.權(quán)利要求89和90的分離的核酸編碼的結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段。
95.組合物，其包括權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，和藥學(xué)可接受的載體。
96.免疫綴合物，其包括與治療劑連接的權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段。
97.組合物，其包括權(quán)利要求96的免疫綴合物，和藥學(xué)可接受的載體。
98.抑制表達(dá)⑶19的腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包括將細(xì)胞與一定量的權(quán)利要求1至72 的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段接觸，所述量有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞選自人伯基特淋巴瘤細(xì)胞、人B細(xì)胞前體型白血病細(xì)胞、人B細(xì)胞白血病細(xì)胞或人B細(xì)胞型淋巴瘤細(xì)胞。
100.耗盡對(duì)象中的B細(xì)胞的方法，其包括向?qū)ο笫┯靡欢康臋?quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，所述量有效的耗盡對(duì)象中的B細(xì)胞。
101.治療對(duì)象中CD19介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康臋?quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段。
102.權(quán)利要求101的方法，其中所述CD19介導(dǎo)的病癥選自包含類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫病癥，癌癥、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病 (CLL)、多毛細(xì)胞白血病、伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、 結(jié)節(jié)性小裂細(xì)胞淋巴瘤、外周T-細(xì)胞性淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-細(xì)胞白血病(T-ALL)、內(nèi)分芽型/中心細(xì)胞性(cb/cc) 濾泡型淋巴瘤癌癥、B系彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(AILD)-樣T細(xì)胞性淋巴瘤、HIV相關(guān)性體腔淋巴瘤、胚性癌、鼻咽部的未分化癌(例如，施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波氏肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、抗CD20抗體耐受性B細(xì)胞癌癥和其他的B細(xì)胞淋巴瘤和白血病。
103.權(quán)利要求101的方法，其中所述CD19介導(dǎo)的病癥選自非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、多毛細(xì)胞白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和抗⑶20抗體耐受性B細(xì)胞癌癥。
104.權(quán)利要求101的方法，其中所述CD19介導(dǎo)的病癥是腫瘤發(fā)生性病癥。
105.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段作為藥物的用途。
106.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段在制備用于治療CD19介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。
107.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其用作為藥物。
108.權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段，其用于治療CD19介導(dǎo)的病癥的方法中。
109.制品，其包括權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段、權(quán)利要求95或 97的組合物或權(quán)利要求96的免疫綴合物，用于治療CD19介導(dǎo)的病癥。
110.藥盒，其包括權(quán)利要求1至72的任一項(xiàng)的人源化抗體或其片段、權(quán)利要求95或97的組合物或權(quán)利要求96的免疫綴合物，用于治療CD19介導(dǎo)的病癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段。更具體而言，本發(fā)明涉及結(jié)合人CD19的人源化抗體或其片段，其包括包含SEQ ID NO27的氨基酸序列的重鏈CDR1，和/或包含SEQ ID NO28的氨基酸序列的重鏈CDR2，和/或包含SEQ ID NO29的氨基酸序列的重鏈CDR3；和/或包括包含SEQ ID NO30的氨基酸序列的輕鏈CDR1，和/或包含SEQ ID NO31的氨基酸序列的輕鏈CDR2，和/或包含SEQ ID NO32的氨基酸序列的輕鏈CDR3。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102421800SQ201080017754
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者C·達(dá)博納維爾, D·斯凱戈羅, M·博特施格爾, S·布萊恩 申請(qǐng)人:格蘭馬克藥品股份有限公司