專(zhuān)利名稱(chēng)：：人源化c-Kit抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)要求2006年4月24日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/794,771號(hào)的優(yōu)先權(quán)，并將該臨時(shí)申請(qǐng)并入本文作為參考。本發(fā)明涉及治療c-Kit相關(guān)的炎癥、纖維化疾病、自身免疫性疾病和癌癥的組合物，還涉及包含人源化c-Kit抗體的組合物。
背景技術(shù)：
：肥大細(xì)胞參與介導(dǎo)炎癥，例如哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎性腸病，其在過(guò)敏性炎癥中的作用也己經(jīng)得到廣泛承認(rèn)。肥大細(xì)胞的數(shù)目在來(lái)自嚴(yán)重哮喘患者的肺外植體中增加，并且是臨床相關(guān)炎癥介質(zhì)，例如白三烯、組胺和Th2細(xì)胞因子的主要來(lái)源。肥大細(xì)胞還是疾病組織中預(yù)形成的TNF的主要來(lái)源。干細(xì)胞因子(SCF)是一種糖蛋白，其通過(guò)下文中稱(chēng)作c-Kit的細(xì)胞和膜相關(guān)酪氨酸激酶受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通常與其它細(xì)胞因子協(xié)同地在造血活動(dòng)中起正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)因子的關(guān)鍵作用。脫落的可溶性c-Kit受體起調(diào)節(jié)SCF的作用。c-Kit在是淋巴系和紅細(xì)胞系成熟細(xì)胞前體的多能造血千細(xì)胞上表達(dá)。與其它造血細(xì)胞不同的是，肥大細(xì)胞的前體和成熟的肥大細(xì)胞保持了高水平的c-Kit表達(dá)。因此，通過(guò)c-Kit的SCF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于肥大細(xì)胞的發(fā)育、功能、運(yùn)輸和存活至關(guān)重要，并且也在配子發(fā)生和黑素合成中起作用。在W位點(diǎn)發(fā)生c-Kit失活突變的小鼠幾乎沒(méi)有肥大細(xì)胞。人體中的活化c-Kit的突變與肥大細(xì)胞增多癥相關(guān)。c-Kit陽(yáng)性多能造血干細(xì)胞是包括間葉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞的多種細(xì)胞類(lèi)型的前體。纖維化疾病的部分特征在于成纖維細(xì)胞活性過(guò)高和過(guò)分增殖導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)沉積。已有報(bào)道稱(chēng)c-Kit陽(yáng)性的骨髓多能造血干細(xì)胞是纖維化組織中成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞的來(lái)源。肥大細(xì)胞可為炎癥介質(zhì)、造血介質(zhì)、促有絲分裂和成纖維介質(zhì)提供穩(wěn)定來(lái)源。肥大細(xì)胞在功能和解剖學(xué)上與成纖維細(xì)胞偶聯(lián)，并且在活化成纖維細(xì)胞中起直接作用。肥大細(xì)胞增進(jìn)成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的膠原收縮、細(xì)胞外基質(zhì)沉積的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和強(qiáng)度并可以將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞則分泌SCF以進(jìn)一歩活化并擴(kuò)增肥大細(xì)胞，這兩種細(xì)胞類(lèi)型都是成纖維網(wǎng)絡(luò)的組分。在包括特發(fā)性肺纖維化(idi叩athicpulmonaryfibrosis,IPF)和硬皮病(scleroderma)在內(nèi)的大多數(shù)人纖維化疾病中，肥大細(xì)胞的數(shù)目和肥大細(xì)胞介質(zhì)均顯著升高。在一些硬皮病患者和硬皮病的Tsk小鼠模型中檢測(cè)到有差異的肥大細(xì)胞表現(xiàn)型。侵襲性系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥可被表征為骨髓纖維化，這表明肥大細(xì)胞是纖維化中的效應(yīng)細(xì)胞。GleevecTM和其它如SutentTM類(lèi)的藥物是靶向c-Kit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，但也能夠抑制許多其它激酶的多耙標(biāo)酪氨酸激酶受體抑制劑。這些激酶抑制劑被指明用于腫瘤治療。已有報(bào)道指出Gleevec導(dǎo)致了骨髓抑制、貧血以及包括心臟毒性和外周水腫在內(nèi)的許多副作用。因此，這些分子在長(zhǎng)期治療C-Kit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方面不具有最優(yōu)效益。因此，人們需要新的治療方案和試劑，特別是那些效力更強(qiáng)、選擇性更好，且在治療c-Kit相關(guān)炎癥和纖維化疾病時(shí)具有更高安全性的治療方案和試劑。此類(lèi)化合物還可以對(duì)如髓性白血病的癌癥、如GIST和肥大細(xì)胞增多癥的c-Kit突變相關(guān)疾病、與黑色素瘤和多種SCLC中也出現(xiàn)的c-Kit過(guò)表達(dá)和/或SCF自分泌活性過(guò)高相關(guān)的疾病顯示出顯著提高的療效和安全性質(zhì)。目前尚缺乏靶向人c-Kit的能夠影響治療效益，但沒(méi)有顯著副作用的治療方案和試劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供作為拮抗劑以及細(xì)胞相關(guān)和膜c-Kit受體處的SCF的中性拮抗劑的試劑，例如單克隆抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，提供了結(jié)合c-Kit的人源化(非鼠源)單克隆抗體。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體包含選自SEQIDNo.2、4和6列出的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼任一上述抗體或特異性結(jié)合劑的核酸。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，提供了包含任一上述核酸序列的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含任一上述核酸或載體的宿主細(xì)胞。6在一個(gè)實(shí)施方案中，c-Kit結(jié)合劑和中性拮抗劑可包含SEQIDNo.2、4或6的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，任一上述試劑包含與SEQIDNo.2、4和6列出的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列。在此類(lèi)實(shí)施方案中，分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.2、4或6的序列變異可以表現(xiàn)為，例如，在那個(gè)位點(diǎn)使用可選的人類(lèi)氨基酸的IgG對(duì)應(yīng)骨架區(qū)的保守性取代。在示范性實(shí)施方案中，所述抗體或結(jié)合c-Kit的特異性結(jié)合劑包含SEQIDNo.2、4或6列出的氨基酸序列。然而，可預(yù)期本發(fā)明的抗體可以是多個(gè)IgG抗體亞型的混合物(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型的混合物)。例如，上述抗體均可以是天然或突變的IgG抗體(例如，IgGl或IgG3亞型或任意其它IgG亞型)。根據(jù)表面等離子共振(BIAcore分析)的測(cè)定，上述抗體可顯示出表征為kd小于lxl(^或小于lx10—3、lxlO-4、lxlO-5、lxl()-6、lxlO-7、lxlO-8、lxl(T9的親和力。根據(jù)細(xì)胞試驗(yàn)的測(cè)定，上述抗體可顯示出小于lxl(^或小于lx10—3、1xlO-4、lxlO-5、lxl(T6、lxl(T7、lxlO-8、1xl(T9的中性拮抗劑IC50。在--個(gè)具體實(shí)施方案中，所述人源化抗體的親和力和功能效力至少可與親本鼠抗體的親和力和效力相比。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗體不是c-Kit受體激動(dòng)劑并不激活導(dǎo)致類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的肥大細(xì)胞，但它應(yīng)該顯示出至少可與親本鼠抗體相比的PD/PK和免疫原性質(zhì)。本發(fā)明涉及多個(gè)方法。例如，提供了一種制備上述抗體或特異性結(jié)合劑的方法，包含培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞以表達(dá)核酸從而產(chǎn)生抗體或試劑。此類(lèi)方法還包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體或試劑的步驟。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，提供了由上述方法制備的分離抗體或試劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用任一上述抗體或特異性結(jié)合劑的方法，例如通過(guò)施用有效量的上述抗體或特異性結(jié)合劑治療或預(yù)防c-Kit相關(guān)病癥。此類(lèi)可治療病癥的一個(gè)實(shí)例是纖維化疾病。附圖簡(jiǎn)述圖1:SR-1抑制創(chuàng)傷活化模型中的肥大細(xì)胞。圖2:創(chuàng)傷愈合模型中的肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖3:人源化SR-1亞型抑制干細(xì)胞因子(SCF)引發(fā)的c-Kit活化以及隨后經(jīng)c-Kit的磷酸化作用。發(fā)明詳述分別并入本文作為參考的美國(guó)專(zhuān)利第5,919,911號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第5,489,516號(hào)描述了鼠抗人c-Kit抗體SR-1。SR-1顯示出合適的c-Kit結(jié)合特性并且阻斷SCF介導(dǎo)的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，然而，除了明顯的免疫原性問(wèn)題之外，該分子并不具有人類(lèi)治療方案所需要的所有特點(diǎn)。Broudy報(bào)道了SR-1具有一些可能導(dǎo)致受體內(nèi)化和磷酸化的激動(dòng)劑樣活性(JCellPhysiol.1994Mar;158(3):545-54)。這些功能活性導(dǎo)致此分子效力和安全性下降。雖然單克隆抗體的人源化是一種成熟的方法，并且通?？烧_翻譯出期望的生物活性，但是依賴(lài)于人類(lèi)骨架區(qū)的人源化SR-1抗體的構(gòu)象可能導(dǎo)致針對(duì)c-Kit的不同內(nèi)在活性和以此造成的不同生物功能。在此具體實(shí)施例中，所追求的是所需的藥理學(xué)性質(zhì)，而不是非理想的"激動(dòng)劑"性質(zhì)，但是實(shí)現(xiàn)這一目的的方法尚未被公開(kāi)。已將SR-1抗體的互補(bǔ)決定區(qū)插入結(jié)構(gòu)上不同于IgGl、IgG2禾口IgG4的人類(lèi)重鏈和輕鏈的獨(dú)特組合中，并意外地保持了相似的對(duì)c-Kit的親和力。然而，己證明這些骨架區(qū)都有缺陷。已證明IgG2背景中的人源化SR-1對(duì)c-Kit具有高親和力，但是在多種細(xì)胞類(lèi)型中不能完全阻斷SCF介導(dǎo)的受體內(nèi)化，并且在肥大細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)中導(dǎo)致c-Kit磷酸化并介導(dǎo)非正常的細(xì)胞凝集現(xiàn)象，其中c-Kit磷酸化是一種細(xì)胞生存信號(hào)。由于治療策略的目的是通過(guò)阻斷SCF生存信號(hào)使肥大細(xì)胞和其前體凋亡耗盡，并且避免可導(dǎo)致體內(nèi)類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)的肥大細(xì)胞活化，因此這些性質(zhì)具有潛在的不利性。當(dāng)將鼠SR-lCDR區(qū)插入人IgGl骨架區(qū)時(shí)，抗體的親和力和功能效力得到保持，但是由于在此亞型的抗體中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體激活和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，因而此背景并不適合。當(dāng)將鼠SR-1CDR區(qū)插入人IgG4骨架區(qū)時(shí)，抗體的親和力和功能效力也可以得到保持，然而在純化和擴(kuò)增此分子的過(guò)程中意外出現(xiàn)了顯著的聚集現(xiàn)象。因此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)努力創(chuàng)造出了一種不具有補(bǔ)體激活性并不會(huì)活化c-Kit和肥大細(xì)胞，同時(shí)保留了對(duì)膜c-Kit受體而非可溶性c-Kit受體的所需的8親和力、中性拮抗劑效力的抗體，從而克服了以上各分子的缺點(diǎn)。這種抗體還可以顯示出適合的PD/PK，能夠有效消除肥大細(xì)胞，并且沒(méi)有在體內(nèi)激動(dòng)肥大細(xì)胞的跡象。人源化SR-1k輕鏈SEQIDNo.1表示編碼SR-1人源化k輕鏈的核酸AGTGTTGA(SEQIDNo.1)以下為SEQIDNo.2，其中粗體的部分表示CDR(例如，CDR1是SEQIDNo.2中第43至第58位氨基酸，CDR2是SEQIDNo.2中第74至第80位氨基酸，和CDR3是SEQIDNo.2中第113至第121位氨基酸)。1MVLQTQVF1SLLLWISGAYGD1VMTQSPDSLAVSLGERATincrasesvd51iygnsemhwyQQKPGQPPKLl1ylasnlesGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS101SLQAEDVAVYycqqnnedpyTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK201STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO.2)SEQIDNo.2中第20至第248位氨基酸是成熟的人源化k輕鏈。人源化SR-1脫糖基-IgGl重鏈SEQIDNo.3SEQIDNo.4中粗體的部分表示CDR(例如，CDRl是SEQIDNo.4中第50至第54位氨基酸，CDR2是SEQIDNo.4中第69至第85位氨基酸，和CDR3是SEQIDNo.4中第118至第125位氨基酸)51YNMHWVRQAPGQGLEWMGVIYSGNGDTSYNQKFKGRVTITADKSTSTAYM<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQIDNo.5)以下為SR-lIgG2重鏈的全長(zhǎng)氨基酸序列，且CDR以粗體字表示:51Y薩HWVRQAPGQGLEWMGVIYSGNGDTSYNQKFKGRVTITADKSTSTAYM101ELSSLRSEDTAVYYCARERDTRFGNWGGGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPC151201251301NAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT401QPE腦YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH451YTQKSLSLSPGK(SEQIDNo.6)SR-lMULCTTGA(SEQIDNO.7)CDR以粗體字表示:121METDTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPASLAVSLGLRATISCRASESVD51IYGNSEMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTID101PVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLT151SGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMS201STLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQIDNo.8)SR-lmuIgG2a重鏈TCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA(SEQIDNo.9)421GSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQIDNo.10)SR-1的輕鏈CDR1是RASESVDIYGNSFMH(SEQIDNo.8中第44至第58位氨基酸)，CDR2是LASNLES(SEQIDNo.8中第74至第80位氨基酸)，和CDR3是QQNNEDPYT(SEQIDNo.8中第111至第121位氨基酸)。重鏈CDR1是SYNMH(SEQIDNo.10中第50至第54位氨基酸)，CDR2是VIYSGNGDTSYNQKFKG(SEQIDNo.10中第69至第85位氨基酸)，CDR3是RDTRFGN(SEQIDNo.10中第118至第125位氨基酸)。應(yīng)當(dāng)理解的是本申請(qǐng)中所描述的各個(gè)重鏈和輕鏈均會(huì)在細(xì)胞中被加工成成熟形式。也就是信號(hào)肽會(huì)被切除，并且抗體重鏈的C末端的賴(lài)氨酸會(huì)被切除。因此，所述成熟形式已經(jīng)過(guò)蛋白酶解加工并且還包含其它翻譯后修飾，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的糖基化修飾。各重鏈和輕鏈的信號(hào)肽為SEQIDNo.2和10中第1至第20位氨基酸，以及SEQIDNo.4、6和10中的第1至第19位氨基酸。SEQIDNo.7和SEQIDNo.8列出了鼠SR-1輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNo.9和SEQIDNo.10列出了鼠SR-1重鏈的核苷酸和氨基酸序列。具有進(jìn)一步取代(例如鼠氨基酸的保守性取代)的變體也可保留高結(jié)合親和力?？稍贑DR和骨架區(qū)的位點(diǎn)中進(jìn)行取代、刪除或插入而不影響親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗體包含保留了原始鼠SR-1的CDR，例如，SEQIDNo.8中44-58附近、74-80附近和113-121附近的位點(diǎn)的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗體包含保留了鼠SR-1的CDR，例如，SEQIDNo.10中50-54附近、68-85附近和118-125附近的位點(diǎn)的重鏈，并且具有源自于人類(lèi)的骨架區(qū)。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"附近"是指在維持對(duì)c-Kit親和力的情況下的2至5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類(lèi)試劑可包含SEQIDNo.2、4或6所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，任一上述試劑包含與SEQIDNo.2、4和6列出的氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性的氨基酸序列。在此類(lèi)實(shí)施方案中，分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.2、4或6的序列變異可以表現(xiàn)為，例如，在那個(gè)位點(diǎn)使用可選的人類(lèi)氨基酸的IgG對(duì)應(yīng)骨架區(qū)的保守性取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)表面等離子共振(BIAcore分析)的測(cè)定，上述抗體可顯示出表征為Kd小于1x10—2或小于1x10—3、1x10—4、1x10—5、1x10—6、lxl(T7、lxl0—8、lxlO力的的親和力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞試驗(yàn)的測(cè)定，上述抗體可顯示出小于lxl0々或小于lx10—3、lxl(T4、lxIO-5、lx10-6、lxl(T7、lxlO-8、1x10-9的中性拮抗劑IC50。本發(fā)明提供了多種特異性結(jié)合劑和中性拮抗劑，包括但不限于人或人源化的c-Kit特異性抗體，所述c-Kit特異性抗體衍生自鼠SR-1并保留了期望的性質(zhì)，例如對(duì)c-Kit的Kd(解離常數(shù))為1x10—2或更小，或者低至1x10—9或更小(例如，1x10-2、1x10-3、1x10"、1xl(T5、1xl(T6、1xIO.7、1x10—8、lxlO力或更小)禾口/或?qū)-Kit的中性拮抗IC50為lxlO^或更小，或者低至1xIO-9或更小(例如，1xIO'2、1xl(T3、1x10-4、1xIO-5、1xl(T6、1x10隱7、lx10—8、lxlO"或更小)禾Q/或緩解c-Kit相關(guān)病變癥狀的能力。本發(fā)明還提供了編碼所述特異性結(jié)合多肽的核酸、載體和包含所述核酸重組宿主細(xì)胞、制備所述特異性結(jié)合劑的方法、包含所述特異性結(jié)合劑的藥物制劑、制備所述藥物制劑的方法以及使用所述藥物制劑和化合物治療患者的方法。本發(fā)明構(gòu)建了編碼這些修飾的輕鏈可變區(qū)的核酸，并將其與編碼CDR移植重鏈或人源化重鏈的核酸進(jìn)行了共表達(dá)(反之亦然)，并可選擇性地將其連接到恒定區(qū)。在維持適合的結(jié)合親和力的條件下，可以將任意的人源化或嵌合重鏈和輕鏈進(jìn)行組合。將所需基因?qū)氩溉榧?xì)胞，并表達(dá)、純化和表征所得的重組免疫球蛋白產(chǎn)物。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"具有最廣泛的含義，并包括完全組裝的抗15體、單克隆抗體(包括人、人源化或嵌合抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)以及能夠與抗原結(jié)合的抗體片段(例如，F(xiàn)ab'、F(ab)2、Fv、單鏈抗體、微型雙功能抗體)，還包含上述抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，只要它們能夠顯示出所需的生物活性。術(shù)語(yǔ)"抗體"明確地將鼠抗體(即，由鼠雜交瘤產(chǎn)生的抗體或具有與鼠雜交瘤產(chǎn)生的抗體相同序列的抗體)從該術(shù)語(yǔ)的范圍中排除了。術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合劑"包括上述定義的抗體以及重組肽或包含由具有所需抗原結(jié)合性的CDR衍生出的序列的其它化合物。此術(shù)語(yǔ)還特別地包括含有與鼠SR-1的一個(gè)或多個(gè)CDR具有至少80%、90%或100%同一性的氨基酸序列的肽，優(yōu)選地包括重鏈CDR3。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"中性拮抗劑"應(yīng)被理解為是指能夠抑制激動(dòng)劑活性的特異性結(jié)合劑。這些試劑包括上述定義的抗體和重組肽或包含由具有所需抗原結(jié)合性的CDR衍生出的序列的其它化合物。此術(shù)語(yǔ)還特別地包括含有與鼠SR-1的一個(gè)或多個(gè)CDR具有至少80%、90%或100%同一性的氨基酸序列的肽，優(yōu)選地包括重鏈CDR3。此術(shù)語(yǔ)還包括"多肽抗體"(peptibodies)，即包含作為"載體"而被連接到至少一個(gè)抗原結(jié)合肽上的抗體Fc域的分子。來(lái)自SR-1抗體的抗體CDR適合于被整合到多肽抗體中，特別是包括重鏈的CDR3。公開(kāi)于2000年5月4日的PCT公開(kāi)文本W(wǎng)O00/24782簡(jiǎn)要描述了多肽抗體的生產(chǎn)方法。可使用或不使用接頭而將肽串聯(lián)(即依次連接)。包含半胱氨酸殘基的肽可與另一個(gè)包含半胱氨酸殘基的肽發(fā)生交聯(lián)，其中任意一個(gè)或兩個(gè)肽與載體連接。任何具有一個(gè)以上半胱氨酸殘基的肽也可形成肽內(nèi)二硫鍵。所有這些肽均可進(jìn)行衍生化，例如可使用氨基基團(tuán)對(duì)羧基末端進(jìn)行封閉加帽，將半胱氨酸加帽或使用非氨基酸殘基部分取代氨基酸殘基(參見(jiàn)，例如，Bhatnagar等人，J.Med.Chem.39:3814-9(1996)禾口Cuthbertson等人，J.Med.Chem.40:2876-82(1997)，其全文并入本文作為參考)?？蓪?duì)肽序列進(jìn)行類(lèi)似于抗體親和力成熟的優(yōu)化，或通過(guò)丙氨酸掃描或隨機(jī)/定點(diǎn)突變改變肽序列，隨后通過(guò)掃描鑒定最優(yōu)的結(jié)合序列(Ann.Rev.biophys.Biomol.Struct.26:401-24(1997))?？蓪⒍喾N分子插入特異性結(jié)合劑的結(jié)構(gòu)中，例如，肽部分本身或特異性結(jié)合劑的肽與載體部分之間)，同時(shí)保持特異性結(jié)合劑的所需活性。例如，人們可以容易地插入分子，例如Fc域或其片段、聚乙二醇或其它相關(guān)分子，例如葡聚糖、脂肪酸、脂質(zhì)、膽固醇基團(tuán)、小碳水化合物、肽、細(xì)胞毒性劑、化療劑、本文所述的可檢測(cè)部分(包括熒光劑、如放射性同位素的放射性標(biāo)記)、寡糖、寡核苷酸、多核苷酸、干涉RNA(或其它RNA)、酶、激素或類(lèi)似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可鑒別適合于以此方式插入的其它分子，這些分子也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，包括在兩個(gè)連續(xù)氨基酸之間插入所需的分子，任選地通過(guò)合適的接頭進(jìn)行連接。所述"分離"抗體是指經(jīng)過(guò)鑒定并從其表達(dá)細(xì)胞的組分中分離出來(lái)的抗體。細(xì)胞的污染組分是指可干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)樣或非蛋白質(zhì)樣的溶質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)以抗體重量計(jì)大于95%，且最優(yōu)選以重量計(jì)大于99%，(2)足以獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列中的至少15個(gè)殘基的程度，或(3)在使用考馬斯亮藍(lán)染色，或優(yōu)選地使用銀染色的還原或非還原條件下的SDS-PAGE中顯示均一性。發(fā)生自然分離的抗體包括重組細(xì)胞中的原位抗體，因?yàn)榇藭r(shí)抗體天然環(huán)境中的至少一種組分缺失。然而，分離抗體通常是通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備的。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"是指從基本同源的抗體群獲得的抗體，也就是說(shuō)除了可能存在少量天然發(fā)生的突變之外，抗體群中所包含的抗體個(gè)體是相同的。與通常包括靶向不同表位的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，單克隆抗體具有高度特異性，靶向單一的抗原位點(diǎn)或表位?？梢砸罁?jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列將人免疫球蛋白分成不同的類(lèi)。存在有5個(gè)主要的類(lèi)IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的幾個(gè)可以進(jìn)一步分成亞類(lèi)或亞型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類(lèi)的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱(chēng)為ouS、s、Y和p。不同類(lèi)的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型均是公知的。不同的亞型具有不同的效應(yīng)器功能；例如，IgGl和IgG3亞型具有ADCC活性。術(shù)語(yǔ)"超變"區(qū)是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包含來(lái)自于互補(bǔ)決定區(qū)或CDR的氨基酸殘基(即，Kabat等，S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)中所述的輕鏈可變區(qū)殘基24-34(Ll)、50-56(L2)以及89-97(L3)和重鏈可變區(qū)31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3))。即便是單個(gè)CDR也可以識(shí)別并結(jié)合抗原，雖然其親和力低于包含所有CDR的完整抗原結(jié)合部位。需要了解的是，只要抗體能夠保持其對(duì)目標(biāo)分子的結(jié)合能力，抗體的CDR抗原可包含上述指定限制之外的更多或更少的序列。Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)將超變"環(huán)"殘基的另一個(gè)定義描述為輕鏈可變區(qū)殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)。"骨架區(qū)"或FR殘基是指除了超變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)殘基。"抗體片段"包含完整全長(zhǎng)抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；微型雙功能抗體、線(xiàn)性抗體(Zapata等人，ProteinEng.,8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體?？贵w經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的被稱(chēng)為"Fab"片段的抗原結(jié)合片段，以及-個(gè)包含恒定區(qū)的殘留"Fc"片段，其中每個(gè)Fab片段各帶有-一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段包含所有的可變區(qū)，以及輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fc片段上帶有糖，并且負(fù)責(zé)很多抗體效應(yīng)器功能(例如，結(jié)合補(bǔ)體和細(xì)胞受體)，這些效應(yīng)器功能可用來(lái)區(qū)分不同類(lèi)的抗體。胃蛋白酶處理會(huì)產(chǎn)生一個(gè)具有兩個(gè)"單鏈Fv"的F(ab')2片段或包含抗體Vh和Vl域的"sFv"的抗體片段，其中Vh和Vj或存在于單一的多肽鏈上。由于在重鏈CHl域的羧基末端包含了幾個(gè)額外的殘基，其包括一個(gè)或多個(gè)抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基，而使得Fab片段不同于Fab'片段。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽還包含位于Vh和VL域之間的多肽接頭，從而使Fv能夠形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述可參見(jiàn)Pluckthun所著的ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds"Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。"Fv"是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這一區(qū)域由經(jīng)非共價(jià)鍵緊密鏈接的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在此構(gòu)型中，每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)CDR相互作用以在Vh-Vl二聚體的表面限定出抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR—同賦予抗體抗原結(jié)合的特異性。然而，單個(gè)可18變區(qū)(或Fv的一半，僅包含3個(gè)抗原特異性CDR)也具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力，雖然其親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"微型雙功能抗體"是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，所述片段包含在相同多肽鏈(Vh-Vl)中相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VJ。通過(guò)使用短到不足以使相同鏈上的兩個(gè)域發(fā)生配對(duì)的接頭，促使所述域與另一個(gè)鏈上的互補(bǔ)域配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。微型雙功能抗體更詳細(xì)地描述于如EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中?，F(xiàn)己開(kāi)發(fā)出多種用于生產(chǎn)抗體片段的技術(shù)。這些片段在傳統(tǒng)上是通過(guò)完整抗體的蛋白酶消化得來(lái)的，但是也可以直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生。參見(jiàn)，例如Better等人，Science240:1041-1043(1988);Skerra等人，Science240:1038-1041(1988);Carter等人，Bio/Technology10:163-167(1992)。本發(fā)明所提供的用于治療炎癥、自體免疫疾病、腫瘤和纖維化疾病的組合物和方法可單獨(dú)使用或與其它治療劑組合使用一種或多種抗c-Kit治療劑以達(dá)到期望的效果?？捎糜诒景l(fā)明的抗纖維化劑的實(shí)例包括細(xì)胞因子，而其中所述細(xì)胞因子選自于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(3(TGF-p)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-9(IL隱9)、白細(xì)胞介素-13(IL-D)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、白細(xì)胞介素-1(3(IL-ip)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、單核細(xì)胞趨化蛋白KCCL2/MCP-1)和肺部活化調(diào)節(jié)趨化因子(CCL18/PARC)。優(yōu)選通過(guò)重組DNA方法，使用本領(lǐng)域熟知的抗體表達(dá)系統(tǒng)之一(參見(jiàn)，例如HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(1988))制備本發(fā)明的衍生自SR-1的抗體。此類(lèi)抗體優(yōu)選為具有衍生自免疫球蛋白的可變序列和人類(lèi)恒定區(qū)的嵌合融合蛋白質(zhì)，或更優(yōu)選為包含人類(lèi)抗體殘基但優(yōu)選至少保留鼠SR-1的CDR的更類(lèi)似于人抗體的單克隆抗體(例如，人抗體或人源化抗體)。在完整的全長(zhǎng)分子之外，術(shù)語(yǔ)"抗體"還包括完整分子的片段、多聚體或聚集體和/或與c-Kit結(jié)合的片段。術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指衍生自非人類(lèi)抗體的抗體，通常是衍生自鼠單克隆抗體的抗體?；蛘?，人源化抗體可衍生自嵌合抗體，所述嵌合抗體保留19了或基本保留了親本非人類(lèi)抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)，但在施用到人體后顯示出比親本抗體小的免疫原性。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"是指包含衍生自?xún)煞N不同抗體的序列的抗體(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利第4,816,567號(hào))，其中所述兩種不同抗體通常來(lái)自不同的物種。最典型的嵌合抗體包含人類(lèi)和鼠抗體片段，通常為人的恒定區(qū)和鼠的可變區(qū)?？贵w的重組制備可以通過(guò)直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序來(lái)測(cè)定目標(biāo)免疫球蛋白的氨基酸序列，并根據(jù)通用密碼子表設(shè)計(jì)適合的核苷酸編碼序列?；蛘?，可以使用常規(guī)方法(例如，通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合單克隆抗體重鏈和輕鏈的編碼基因的寡核苷酸)由雜交瘤細(xì)胞分離編碼單克隆抗體的DNA，并進(jìn)行測(cè)序。序列測(cè)定通常需要分離至少部分目標(biāo)基因或cDNA。這通常需要克隆DNA，或優(yōu)選地克隆編碼單克隆抗體的mRNA(即cDNA)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)，例如Sambrook等人，(1989)Molecular.Cloning:ALaboratoryGuide,Vols1-3,ColdSpringHarborPress,其文件已并入本文作為參考)進(jìn)行克隆。例如，可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄polyA+mRNA，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄膜相關(guān)mRNA(membrane-associatedmRNA)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，并使用人類(lèi)免疫球蛋白多肽基因序列特異的探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然而，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中使用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)擴(kuò)增編碼目標(biāo)免疫球蛋白基因片段(例如，輕鏈可變片段)的cDNA(或全長(zhǎng)cDNA的一部分)?？梢院苋菀椎貙U(kuò)增序列克隆進(jìn)任何合適的載體，例如表達(dá)載體、小基因載體(minigenevector)或噬菌體展示載體中。應(yīng)當(dāng)了解的是只要能夠測(cè)定目標(biāo)免疫球蛋白多肽的部分序列，所使用的具體克隆方法并不重要。本文中所使用的"分離"核苷酸分子或"分離"核酸序列是指(O從至少一條通常與天然來(lái)源核酸相結(jié)合的污染核酸分子中鑒定并分離的核酸分子，或(2)能夠從背景核酸中克隆、擴(kuò)增、標(biāo)記或分離，從而測(cè)定目標(biāo)核酸序列的核酸分子。分離核酸分子的形式或背景與其天然存在的不同。然而，分離的核酸分子包括正常表達(dá)抗體的細(xì)胞中含有的核酸分子，其中該核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位與在天然細(xì)胞中的定位不同。從轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞，并將所得B細(xì)胞與永生細(xì)胞相融合而產(chǎn)生的雜20交瘤是用于克隆和測(cè)序的RNA的一個(gè)來(lái)源。使用雜交瘤的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于其易于篩選并選擇產(chǎn)生目的人單克隆抗體的雜交瘤。或者，可以從經(jīng)免疫的動(dòng)物的B細(xì)胞(或整個(gè)脾臟)中分離RNA。在使用非雜交瘤的其它來(lái)源時(shí)，可能需要篩選編碼免疫球蛋白或具有特異結(jié)合特征的免疫球蛋白多肽的序列。一種用于此類(lèi)篩選的方法是使用噬菌體展示技術(shù)。噬菌體展示描述于例如，Dower等人，WO91/17271;McCafferty等人，WO92/01047以及Caton和Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6450-6454(1990)中，所述文獻(xiàn)均并入本文作為參考。在一個(gè)使用噬菌體展示技術(shù)的實(shí)施方案中，從經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中分離cDNA(例如，總脾臟cDNA)，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增編碼部分免疫球蛋白多肽(例如，CDR區(qū))的cDNA序列，并且將擴(kuò)增序列插入噬菌體載體。通過(guò)如淘選法(panning)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定編碼目標(biāo)肽的cDNA，例如編碼具有所需結(jié)合特征的可變區(qū)肽的cDNA。隨后確定擴(kuò)增或克隆的核酸的序列。典型的方案是測(cè)定編碼免疫球蛋白多肽的整個(gè)可變區(qū)的序列，然而，有些情況下，僅測(cè)定可變區(qū)的一部分，例如編碼CDR的部分也是足夠的。通常，測(cè)序部分的長(zhǎng)度為至少30個(gè)堿基，更常見(jiàn)的是對(duì)可變區(qū)編碼長(zhǎng)度的至少三分之一或至少二分之一的堿基進(jìn)行測(cè)可以使用從cDNA文庫(kù)中分離的克隆進(jìn)行測(cè)序，或者在使用PCR的情況下，可以在將擴(kuò)增序列進(jìn)行亞克隆之后進(jìn)行測(cè)序，或通過(guò)PCR直接對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，參見(jiàn)Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryGuide,Vols1-3,ColdSpringHarborPress;禾口Sanger,F.等人，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463-5467，以上文獻(xiàn)已并入本文作為參考)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)將克隆核酸的序列與人類(lèi)免疫球蛋白基因和cDNA的公開(kāi)序列進(jìn)行比對(duì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)測(cè)序的區(qū)域很容易地確定(i)雜交瘤免疫球蛋白多肽(包括重鏈亞型)的種系片段特征和(ii)重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列，包括由N-區(qū)添加和體細(xì)胞突變過(guò)程產(chǎn)生的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一個(gè)來(lái)源是位于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.)的美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(NationalLibraryofMedicine)所屬的美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)。21DNA分離后，即可將其可操作地連接于表達(dá)控制序列或?qū)⑵洳迦氡磉_(dá)載體，隨后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或轉(zhuǎn)染前不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以指導(dǎo)重組宿主細(xì)胞中單克隆抗體的合成?？贵w的重組生產(chǎn)是本領(lǐng)域熟知的技術(shù)。表達(dá)控制序列是指可操作性連接的編碼序列在特定宿主體內(nèi)表達(dá)所必需的DNA序列。例如，適合于原核細(xì)胞的控制序列包括啟動(dòng)子，優(yōu)選操縱子序列，以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞可利用啟動(dòng)子、多腺苷化信號(hào)和增強(qiáng)子。當(dāng)核酸與另一個(gè)核酸序列產(chǎn)生功能上的關(guān)聯(lián)時(shí)，即被可操作性地連接。例如，如果前序列或分泌引導(dǎo)序列的DNA被表達(dá)為參與分泌多肽的前蛋白質(zhì)，那么前序列或分泌引導(dǎo)序列的DNA被可操作性地連接于所述多肽的DNA;如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么所述啟動(dòng)子或增強(qiáng)子被可操作性地連接于所述序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的定位能夠促進(jìn)翻譯，那么所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)被可操作性地連接于所述編碼序列。一般而言，可操作地連接是指將DNA序列連續(xù)連接，并且在分泌引導(dǎo)序列的情況下，是指DNA序列連續(xù)連接并能夠進(jìn)行讀碼。然而，增強(qiáng)子不一定是連續(xù)的?？梢酝ㄟ^(guò)在方便的限制性位點(diǎn)的連接反應(yīng)完成連接。如果不存在此類(lèi)位點(diǎn)，則可以參照常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸適配子或接頭。本文中所有常交替使用名稱(chēng)細(xì)胞、細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)物均包括其子代。轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括初代處理細(xì)胞和不計(jì)傳代次數(shù)的其衍生培養(yǎng)物。需要理解的是，由于有意或無(wú)意突變，并非所有子代含有的DNA都完全一致。具有與篩選的初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同的功能或生物活性的突變子代也被包括在內(nèi)。本發(fā)明還提供了任選地可操作地連接于被宿主細(xì)胞識(shí)別的控制序列的編碼本發(fā)明的特異性結(jié)合劑或抗體的分離核酸，包含所述核酸的載體或宿主細(xì)胞，以及用于生產(chǎn)所述特異性結(jié)合劑或抗體的重組技術(shù)，所述重組技術(shù)可包含培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)所述核酸，以及可選地，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中回收所述特異性結(jié)合劑或抗體。本領(lǐng)域中已經(jīng)已知多種載體。載體組分可包括下列的一種或多種信號(hào)序列(例如，可指導(dǎo)所述特異性結(jié)合劑或抗體的分泌)、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記基因(例如，賦予抗生素或其它藥物抗性、與營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)或提供培養(yǎng)基中缺乏的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng))、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列，所有以上組分均為本領(lǐng)域所熟知。合適的宿主細(xì)胞包括上述的原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。適合于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，如腸桿菌禾斗(五"tera6acfen'"ceae)的埃希氏菌屬(^&c/zen'c/z/fl)(例如大腸桿菌(￡.co/0)、腸道桿菌屬(五"feraZ)acfer)、歐文氏菌屬(￡rw/w'")、克雷伯氏菌屬(尺/efe/e〃a)、變形桿菌屬(Prato^)、沙門(mén)氏菌屬(&/mw7e〃")(例如，鼠傷寒沙門(mén)菌(&z/mo"e〃a(v//2/wwhwm))、沙雷氏菌屬(5ferra"a)(例如，茅占質(zhì)沙雷氏菌(&rraf/"和志賀氏菌屬(幼/ge〃a)，以及桿菌屬(Sac////)，例如枯草芽孢桿菌(S.^&//&)和地衣芽孢桿菌(&//c/^m/wm/s)，假單胞菌屬(P化w^ww"w)和鏈霉菌屬(&^ptow>;c")。除原核生物之外，如絲狀真菌或酵母的真核微生物也適合作為特異性結(jié)合劑編碼載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(&cc/2mw^casce"v/w'^)或普通面包酵母是最常用的低級(jí)真核宿主微生物。然而，本文中也?？墒褂迷S多其它的種、屬或菌株，例如畢赤酵母屬(P/c/2/fl)(例如，巴斯德畢赤酵母(P/Wto/^)、粟酒裂殖-酵母(5b/2/zcwacc/zarcw^ces/70/wZ)e))、克魯纟隹其萬(wàn)酵母屬(A7wyveramyces0、耳卩氏酉孝母屬(K^rcw/a)、念珠5求菌屬(Ca"c//<ia)、里氏木霉(7Hc/0(iew7areas/a)、粗糙脈孢菌(臉wms/oracra咖)、許旺酵母屬(5b/z而聽(tīng)'蘭戸s)(例如，西方許旺酵母(&Mva""/ow_yc"和絲狀真菌，例如脈孢菌屬(A^#Ywpora)、青霉菌屬(尸em'c/〃/ww)、彎頸霉屬(7b/y/oc/<3<i/mw)禾口曲霉菌屬(A^6^/〃m)宿主，例如構(gòu)巢曲霉".mV/w/""s)和黑曲霉"."/取"。適合于表達(dá)糖基化的特異性結(jié)合劑或抗體的宿主細(xì)胞來(lái)自于多細(xì)胞生物體。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞?，F(xiàn)已鑒定出多種桿狀病毒株和變體，以及對(duì)應(yīng)的容許昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞，這些細(xì)胞來(lái)自于如草地貪夜蛾(5^odopfera/n^ipera")(毛蟲(chóng))、埃及斑蛟(Jedaswgy;^/)(蛟子)、白紋伊蚊(v4ecfesa/6o;/c^s)(蛟子)、黑腹果蠅(Drarap/w7awe/awogwfer)(果蠅)和家蠶(So附xww7')等宿主。這類(lèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的許多病毒株是公眾可獲得的，例如苜蓿丫紋夜蛾"wtogra//zaco/i/^"/ca)NPV的Ll變體和家蠶(Somxwon')NPV的Bm-5菌株。23然而，人們最為感興趣的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，而且脊椎動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)增殖(組織培養(yǎng))已經(jīng)成為常規(guī)方法。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，包括CHOKl細(xì)胞(ATCCCCL61)、DXB-ll、DG-44和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞Z-DHFR(CHO,Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細(xì)胞系(293或懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)的亞克隆293細(xì)胞；Graham等人，J.GenVirol.36:59(1977));幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCLIO);小鼠睪丸sertoli細(xì)胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CV1，ATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34);布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75);人肝癌細(xì)胞(HepG2，HB8065);鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Mather等人，AnnalsN.YAcad.Sci.383:44-68(1982));MRC5細(xì)胞或FS4細(xì)胞。使用上述核酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染用于生產(chǎn)特異性結(jié)合劑或抗體的宿主細(xì)胞，并在適合于誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因的經(jīng)改進(jìn)的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，具有由選擇標(biāo)記分離的多拷貝轉(zhuǎn)錄單位的新型載體和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系特別有用，并且優(yōu)選用于表達(dá)特異性結(jié)合劑或抗體。用于生產(chǎn)本發(fā)明的特異性結(jié)合劑或抗體的宿主細(xì)胞可培養(yǎng)于多種培養(yǎng)基中。如Ham'sF10(Sigma)、MinimalEssentialMedium(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)禾nDulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEM,Sigma)的可商購(gòu)培養(yǎng)基均適合培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，也可使用描述于Ham等人，Enz.58:44(1979);Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980);美國(guó)專(zhuān)利第4,767,704號(hào)、第4,657,866號(hào)、第4,927,762號(hào)、第4,560,655號(hào)、或第5,122,469號(hào)；WO90103430;WO87/00195;或U.S.PatentRe.No.30,985號(hào)中的任何一種培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。可以根據(jù)需要向這些培養(yǎng)基中添加激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽類(lèi)(例如，氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺苷和胸苷)、抗生素(例如，藥物GentamycinTM)、微量元素(定義為24通常以微摩爾水平的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)，以及葡萄糖或等效能量源。也可以包含本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的合適濃度的其它必要的補(bǔ)充劑。如溫度、pH和類(lèi)似的培養(yǎng)條件是早先用于選擇細(xì)胞表達(dá)的培養(yǎng)條件，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。將分別包含適當(dāng)?shù)妮p鏈和重鏈對(duì)(如美國(guó)專(zhuān)利申i青第20030082735號(hào)中所述)的表達(dá)載體pDC323和pDC324轉(zhuǎn)染到CS9宿主細(xì)胞系中。培養(yǎng)宿主細(xì)胞時(shí)，特異性結(jié)合劑或抗體可以在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞周質(zhì)產(chǎn)生，或被直接分泌到培養(yǎng)基中。如果特異性結(jié)合劑或抗體產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)，那么第一步要通過(guò)離心或超濾除去顆粒碎片，例如宿主細(xì)胞或裂解的片段。例如，可以使用如羥基磷灰石層析、陽(yáng)離子或陰離子交換層析，或優(yōu)選使用目標(biāo)抗原、蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G作為親和配基的親和層析來(lái)純化特異性結(jié)合劑或抗體。蛋白質(zhì)A可被用來(lái)純化基于人Yl、Y2或y4重鏈的特異性結(jié)合劑或抗體(Lindmark等人，J.ImmunolMeth.62:1-13(1983))。蛋白質(zhì)G適合于所有的鼠亞型和人y3(Guss等人，EMBOJ.5:15671575(1986))。最常用的附著親和配基的基質(zhì)是瓊脂糖，但也可使用其它基質(zhì)。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)，例如孔徑可控的玻璃或聚苯乙烯/二乙烯基苯可獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時(shí)間。當(dāng)特異性結(jié)合劑或抗體包含CH3域時(shí)，可使用BakerbondABX樹(shù)脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ.)進(jìn)行純化?？梢砸罁?jù)待回收的特異性結(jié)合劑或抗體選擇使用其它的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，例如乙醇沉淀、反相HPLC、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。嵌合抗體和人源化抗體可以使用本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)Morrison,S.L.等人，(1984)ChimericHumanAntibodyMolecules;MouseAntigenBindingDomainswithHumanConstantRegionDomains,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6841-6855;禾口Boulianne，GL.等人，Nature312,643-646.(1984))產(chǎn)生嚙齒動(dòng)物單克隆抗體的Ig可變區(qū)與人Ig恒定區(qū)相融合的嵌合的單克隆抗體。雖然己經(jīng)證明一些嵌合的單克隆抗體在人體中的免疫原性較小，但是嚙齒動(dòng)物Ig可變區(qū)仍會(huì)導(dǎo)致顯著的人抗嚙齒動(dòng)物反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法獲得人源化抗體，例如(1)將非人類(lèi)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植進(jìn)人類(lèi)骨架區(qū)和恒定區(qū)(本領(lǐng)域中是指通過(guò)"CDR移植"進(jìn)《亍人源化的過(guò)程)，或者(2)移植整個(gè)非人類(lèi)可變區(qū)，但是通過(guò)替換表面殘基將其"偽裝"成類(lèi)似于人類(lèi)抗體的表面(本領(lǐng)域中是指"鑲飾"過(guò)程)。這些方法公開(kāi)于，例如Jones等人，Nature321:522525(1986);Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL,U.S.A.,81:68516855(1984);Morrison和Oi，Adv.Immunol"44:6592(1988);Verhoeyer等人，Science239:15341536(1988);Padlan，Molec.Immun.28:489498(1991);Padlan,Molec.Immunol.31(3):169217(1994)和Kettleborough,CA.等人，ProteinEng.4(7):77383(1991)，以上文獻(xiàn)均并入本文作為參考。特別地，將嚙齒動(dòng)物抗體單獨(dú)或以偶聯(lián)物的形式連續(xù)地向人體體內(nèi)施用將導(dǎo)致受體中產(chǎn)生針對(duì)嚙齒動(dòng)物抗體的免疫反應(yīng)；即所謂的HAMA反應(yīng)(人抗鼠抗體反應(yīng))。在需要重復(fù)給藥的情況下，HAMA反應(yīng)會(huì)使藥物的效果受到限制?？梢允褂萌缇垡叶嫉挠H水聚合物對(duì)抗體進(jìn)行化學(xué)修飾或使用基因工程方法使抗體具有更類(lèi)似于人的結(jié)合結(jié)構(gòu)，以減少抗體的免疫原性。CDR移植包括將來(lái)自鼠重鏈和輕鏈Ig可變區(qū)中6個(gè)CDR中的一個(gè)或多個(gè)引入到人類(lèi)Ig可變區(qū)的合適的骨架區(qū)中。此技術(shù)(Riechmann,L.等人，Nature332,323(1988))利用保守的骨架區(qū)(FR1-FR4)作為支架以支持作為抗原主要接觸區(qū)的CDR環(huán)。然而，CDR移植的一個(gè)顯著缺點(diǎn)是可造成人源化抗體的結(jié)合親和力顯著小于原始的鼠抗體，這是因?yàn)楣羌軈^(qū)的氨基酸有助于抗原結(jié)合，還因?yàn)镃DR環(huán)的氨基酸會(huì)影響兩個(gè)Ig可變區(qū)的結(jié)合。在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中，嵌合的SR-1抗體沒(méi)能表現(xiàn)出合適的功效?？梢酝ㄟ^(guò)選擇最接近于原始鼠抗體骨架區(qū)的人類(lèi)骨架區(qū)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)構(gòu)建抗原結(jié)合位點(diǎn)的模型以輔助進(jìn)行骨架區(qū)內(nèi)或CDR內(nèi)的單氨基酸定點(diǎn)突變，來(lái)改進(jìn)CDR移植技術(shù)以維持人源化單克隆抗體的親和力(例如，Co,M.S.等人，(1994)，J:Immunol.152,2968-2976)人源化抗體的一個(gè)方法包含的步驟有比對(duì)非人類(lèi)重鏈和輕鏈序列與人類(lèi)重鏈和輕鏈，基于上述比對(duì)選擇非人類(lèi)骨架區(qū)并將其替換成人類(lèi)骨架區(qū)，進(jìn)行分子建模以預(yù)測(cè)人源化序列的構(gòu)象，并將預(yù)測(cè)的構(gòu)象與親本抗體的構(gòu)象進(jìn)行比較。在此過(guò)程后，反復(fù)對(duì)CDR區(qū)中干擾CDR結(jié)構(gòu)的殘基進(jìn)行回復(fù)突變，直到人源化序列模型的預(yù)測(cè)構(gòu)象非常接近于親本非人類(lèi)抗體中非人類(lèi)CDR的構(gòu)象。例如，可以通過(guò)Ashwdl受體等，進(jìn)一步對(duì)此類(lèi)人源化抗體進(jìn)行衍生化以促進(jìn)其吸收和清除(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利第5,530,101號(hào)和第5,585,089號(hào))?，F(xiàn)己報(bào)道了很多合理設(shè)計(jì)的鼠單克隆抗體的人源化產(chǎn)物(參見(jiàn)，例如公開(kāi)于2002年7月11日的20020091240、WO92/11018和美國(guó)專(zhuān)利第5,693,762號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第5,766,866號(hào))?？贵w的人類(lèi)工程化還描述在，例如，Studnicka等人，美國(guó)專(zhuān)利第5,766,886號(hào)；Studnicka等人，ProteinEngineering7:805-814(1994)中?？贵w變體的生產(chǎn)可通過(guò)向編碼DNA中引入合適的核苷酸變化或肽合成制備所需特異性結(jié)合劑或抗體的氨基酸序列變體。此類(lèi)變異體包括，刪除和/或插入和/或取代特異性結(jié)合劑或抗體氨基酸序列中的殘基。只要其最終構(gòu)建物具有所需的特征，可以通過(guò)刪除、插入和取代的任意組合獲得最終構(gòu)建物。氨基酸的變化還會(huì)改變特異性結(jié)合劑或人源化抗體或抗體變體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。可通過(guò)本領(lǐng)域己知的多種方法制備編碼特異性結(jié)合劑或抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。此類(lèi)方法包括寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))突變、PCR突變以及對(duì)預(yù)先制備的變體和非變體形式的特異性結(jié)合劑或抗體的盒式突變。如CunninghamandWellsScience,244:1081-1085(1989)所述，用于鑒定特異性結(jié)合劑或抗體中的特定殘基或區(qū)域?yàn)閮?yōu)選突變位點(diǎn)的有用方法被稱(chēng)為"丙氨酸掃描突變"。在此過(guò)程中，鑒定目標(biāo)殘基中的一個(gè)或一組殘基(例如，如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸和谷氨酸的帶電殘基)并將其替換成中性或帶負(fù)電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)以影響氨基酸和抗原的相互作用。隨后，對(duì)于功能易受其取代影響的那些氨基酸位點(diǎn)，可通過(guò)在取代位點(diǎn)進(jìn)一步引入該突變或取代成其它變體來(lái)優(yōu)選這些氨基酸位點(diǎn)。因此，由于預(yù)先確定了引入氨基酸序列突變的位點(diǎn)，而不再需要預(yù)定突變本身的性質(zhì)。例如，為了分析給定位點(diǎn)突變的表現(xiàn)，可在目標(biāo)密碼子或目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)突變，并篩選具有所需活性的表達(dá)變體。通常，特異性結(jié)合劑或抗體的氨基酸序列變體的氨基酸序列與原始的特27異性結(jié)合劑或抗體(鼠抗體或人源化抗體)重鏈或輕鏈的氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一性，或至少65%、至少70%、至少75%、至少80%的同一性，更優(yōu)選至少85%的同一性，更優(yōu)選至少90%的同一性，和最優(yōu)選至少95%的同一性，包括如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、和100%的同一性。本文中將此序列的同一性或同源性定義為在比對(duì)序列并引入達(dá)到最大序列同一性所必須的間隔后，候選序列中氨基酸殘基與原始序列的相同的百分比，并且保守性取代(如下表I中的定義)不被認(rèn)為是序列同一性的一部分。在特異性結(jié)合劑或抗體序列的N末端、C末端或中間部分的延長(zhǎng)、刪除或插入都不認(rèn)為影響序列的同一性或同源性。因此，可通過(guò)常用的比較兩條多肽中氨基酸位置相似性的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定序列同一性。使用如BLAST或FASTA的計(jì)算機(jī)程序比對(duì)兩條多肽，以獲得其各自氨基酸的最佳匹配(根據(jù)一條或兩條序列的全長(zhǎng)或根據(jù)一條或兩條序列的預(yù)定部分)。所述程序提供了與計(jì)算機(jī)程序配套使用的默認(rèn)開(kāi)放罰分(openingpenalty)、默認(rèn)空位罰分(gappenalty)和記分矩陣，例如PAM250(標(biāo)準(zhǔn)記分矩陣；參見(jiàn)Dayhoff等人，AtlasofProteinSequenceandStructure,vol.5,supp.3(1978))。例如，可按以下方式計(jì)算同一性百分率將相同匹配的總數(shù)乘以IOO，然后除以匹配范圍內(nèi)較長(zhǎng)序列的總長(zhǎng)以及為了比對(duì)兩條序列而引入較長(zhǎng)序列中的空位的數(shù)目。插入氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端的長(zhǎng)度為一個(gè)殘基至包含一百個(gè)或一百個(gè)以上殘基的多肽的融合，以及向序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。末端插入的實(shí)例包括使特異性結(jié)合劑或抗體與N末端蛋胺酰殘基融合或使特異性結(jié)合劑或抗體(包括抗體片段)與表位標(biāo)簽或補(bǔ)救受體表位(salvagereceptorepitope)相融合。特異性結(jié)合劑或抗體分子的其它插入變體包括，例如在N末端或C末端與延長(zhǎng)特異性結(jié)合劑或抗體的血清半衰期的多肽的融合。表位標(biāo)簽的實(shí)例包括流感HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5(Field等人，Mol.Cell.Biol.8:2159-2165(1988));c-myc標(biāo)簽以及其抗體8F9、3C7、6E10、G4、B7禾口犯10(Evan等人，MolCell.Biol.5(12):3610-3616(1985));和單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體(Paborsky等人，ProteinEngineering3(6):547-553(1990))。其它的示范性標(biāo)簽有聚組氨酸序列，其通常具有約6個(gè)組氨酸殘基，并可以使用鎳螯合物標(biāo)記的化合物進(jìn)行分離。其它的標(biāo)記物和標(biāo)簽，例如FLAG⑧標(biāo)簽(EastmanKodak,Rochester,NY)也為本領(lǐng)域熟知和常用，。術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"是指負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子(例如，IgG,、IgG2、IgG3或IgG4)的體內(nèi)血清半衰期的IgG分子Fc區(qū)表位。取代變體的另一種類(lèi)型是氨基酸取代變體。在這些變體中，至少?gòu)奶禺愋越Y(jié)合劑或抗體分子上移除一個(gè)氨基酸殘基并在移除位點(diǎn)插入不同的殘基。所考慮的是高變區(qū)、CDR區(qū)或骨架區(qū)中任何一個(gè)區(qū)的取代突變。表1中列出了保守性的取代。在"優(yōu)選取代"標(biāo)題下為最保守的取代。如果此類(lèi)取代的結(jié)果不改變生物活性，則可以引入表l中"典型取代"所示的其它實(shí)質(zhì)性變化或下文參考氨基酸類(lèi)型進(jìn)一步描述的其它實(shí)質(zhì)性變化，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行篩選。表1原始典型取代優(yōu)選取代殘基Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Asp;Lys;GinArgAsp(D)Glu;AsnGluCys(C)Ser;AlaSerGin(Q)Asn;GluAsnGlu(E)Asp;GinAspGly(G)AlaHis(H)Asn;Gin;Lys;Arglie(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeu;正亮氨酸Leu(L)正亮氨酸；lie;Val;Met;Ala;Phelie29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>可以通過(guò)選擇取代完成特異性結(jié)合劑或抗體生物學(xué)性質(zhì)的實(shí)質(zhì)性修飾，所選取代保持(a)取代區(qū)域多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)該分子目標(biāo)位點(diǎn)的帶電性或疏水性，或(c)側(cè)鏈體積的效果存在顯著區(qū)別。天然存在的殘基可根據(jù)常見(jiàn)側(cè)鏈性質(zhì)分為以下類(lèi)別(1)疏水性正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性親水性Cys、Ser、Thr;(3)酸性:Asp、Glu;(4)堿性Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影響鏈方向的殘基:Gly、Pro;和(6)芳香性Trp、Tyr、Phe。保守性取代包括將氨基酸替換成與之同類(lèi)的另一個(gè)氨基酸。非保守性取代包括將一個(gè)類(lèi)別的氨基酸替換成另一個(gè)類(lèi)別的氨基酸。通常使用絲氨酸取代特異性結(jié)合劑、人源化抗體或抗體變體中不參與維持正常構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基，從而改善分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。反之，也可以向特異性結(jié)合劑或抗體中加入半胱氨酸鍵以改進(jìn)其穩(wěn)定性(特別是在所述抗體為抗體片段，例如Fv片段的情況下)。親和力成熟親和力成熟包括制備和篩選在親本特異性結(jié)合劑或抗體的CDR內(nèi)發(fā)生突變(刪除、插入或取代)的特異性結(jié)合劑或抗體變體，并選擇與親本特異性結(jié)合劑或抗體相比，具有改進(jìn)的生物學(xué)性質(zhì)(例如，結(jié)合親和力)的變體。產(chǎn)生此類(lèi)取代變體的常規(guī)方式是使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，突變多個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如，6-7個(gè)位點(diǎn))以在各位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。將以此產(chǎn)生的特異性結(jié)合劑或抗體變體與在各病毒顆粒內(nèi)包裝的M13的基因III的產(chǎn)物相融合，并以單價(jià)形式由絲狀噬菌體顆粒展示。隨后，對(duì)噬菌體展示變體的生物活性(例如，結(jié)合親和力)進(jìn)行篩選?？蛇M(jìn)行丙氨酸掃描突變以鑒定顯著促進(jìn)抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基。額外地或在此基礎(chǔ)上，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定特異性結(jié)合劑或抗體與抗原的接觸位點(diǎn)也是有益的。根據(jù)本文中闡述的技術(shù)，此類(lèi)接觸性殘基或相鄰殘基是取代的候選殘基。一旦產(chǎn)生變體，即可按本文所述對(duì)變體組進(jìn)行篩選，并且可選擇在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)試驗(yàn)中顯示出較好性質(zhì)的特異性結(jié)合劑或抗體進(jìn)行進(jìn)一歩研究?？墒褂脩?yīng)用基因重排和定向進(jìn)化的技術(shù)制備并篩選特異性結(jié)合劑或抗體以獲得所需的活性。例如，Jermutus等人在ProcNatlAcadSciUSA.2001Jan2;98(l):75-80中公開(kāi)，將基于核糖體展示的改良型體外選擇策略與經(jīng)DNA重排的體外多樣化結(jié)合以改進(jìn)單鏈Fv抗體片段(scFv)的解離速率和熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性；Fermer等人在TumourBiol.2004Jan-Apr;25(l-2):7-13中報(bào)道噬菌體展示和DNA重排組合使用將親和力提高了幾乎三個(gè)數(shù)量級(jí)。糖基化的改變也可以制備與親本特異性結(jié)合劑或抗體相比，具有改良的糖基化模式的特異性結(jié)合劑或抗體變體，例如，刪除特異性結(jié)合劑或抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)糖部分，和/或添加特異性結(jié)合劑或抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。包括抗體的多肽的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接是指糖部分與天門(mén)冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天門(mén)冬酰胺-X-絲氨酸和天門(mén)冬酰胺-X-蘇氨酸(X為脯氨酸之外的氨基酸)是天門(mén)冬酰胺側(cè)鏈與糖部分之間酶連接的識(shí)別序列。多肽中存在這些三肽之一即產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。因此，可通過(guò)改變含有一個(gè)或多個(gè)這些三肽序列的氨基酸序列在特異性結(jié)合劑或抗體中添加N-連接的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化是指將N-乙酰半乳糖胺、31半乳糖或木糖之一的糖與羥氨基酸的連接，最常見(jiàn)的羥氨基酸是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴(lài)氨酸。通過(guò)在原始特異性結(jié)合劑或抗體序列中插入或取代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基，可將O-連接的糖基化位點(diǎn)添加到特異性結(jié)合劑或抗體中。其它修飾可在Fc區(qū)內(nèi)移除或引入半胱氨酸殘基，從而減少或增加此區(qū)域中鏈間二硫鍵的形成。以此產(chǎn)生的特異性結(jié)合劑或抗體的同源二聚體具有改進(jìn)的內(nèi)化能力和/或增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用和抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron等人，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。也可以使用如Wolff等人，CancerResearch53:2560-2565(1993)所述的異源雙功能交聯(lián)劑制備特異性結(jié)合劑或抗體的同源二聚體?；蛘邔?duì)特異性結(jié)合劑或抗體進(jìn)行工程化，使其具有兩個(gè)Fc區(qū)，并因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解活性和ADCC能力。參見(jiàn)Stevenson等人，Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。現(xiàn)已顯示CDR中的序列可導(dǎo)致抗體與MHCII類(lèi)分子結(jié)合并引發(fā)有害的輔助T細(xì)胞反應(yīng)。保守性取代可使特異性結(jié)合劑或抗體保留結(jié)合能力，同時(shí)降低其引發(fā)有害的輔助T細(xì)胞反應(yīng)的能力。也可考慮移除重鏈或輕鏈N末端20個(gè)氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)。延長(zhǎng)血清半衰期的修飾也是可取的，例如，通過(guò)引入或添加補(bǔ)救受體結(jié)合表位(例如，通過(guò)適當(dāng)區(qū)域的突變，或通過(guò)DNA合成或肽合成將表位引入到隨后被融合到特異性結(jié)合劑或抗體的任一末端或中間部分的肽標(biāo)簽上)(參見(jiàn)，例如W096/32478)或添加如PEG或其它水溶性聚合物的分子，包括多糖聚合物。在由補(bǔ)救受體結(jié)合表位組成的區(qū)域中，優(yōu)選將來(lái)自Fc域中一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基轉(zhuǎn)移到特異性結(jié)合劑或抗體或片段的類(lèi)似位置。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)移來(lái)自Fc域中一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的三個(gè)或更多殘基。甚至更優(yōu)選地，將來(lái)自Fc區(qū)(例如，IgG的Fc區(qū))中CH2域的表位轉(zhuǎn)移到特異性結(jié)合劑或抗體的Ch1、Ch3或Vh區(qū)，或多個(gè)上述區(qū)域。或者，將來(lái)自Fc區(qū)中Ch2域的表位轉(zhuǎn)移到特異性結(jié)合劑或抗體片段的Q^區(qū)或/和Vl區(qū)。也可參見(jiàn)描述了Fc變體及其與補(bǔ)救受體相互作用的國(guó)際申請(qǐng)WO97/34631和WO96/32478。體內(nèi)IgG動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)依賴(lài)于IgG與FcRn的結(jié)合。已有報(bào)道，改變IgG的Fc區(qū)和FcRn間的相互作用可改進(jìn)單克隆抗體的血清半衰期。優(yōu)選對(duì)新生Fc受體FcRn可產(chǎn)生較高親和力的結(jié)合，并減緩降解、改進(jìn)PK特性的Fc突變。IgG中的FcRn結(jié)合位點(diǎn)位于Ch2-Ch3域的界面。此區(qū)域中殘基的突變(M428L禾[JT250Q/M428L、T250Q/M428L、P257I/Q311I、M252Y/S254T/T256E、H433K/N434F/Y436H或M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H)可增大pH6.0和pH7.3條件下IgGl對(duì)人類(lèi)FcRn的親和力。此外，對(duì)猴子靜脈給藥時(shí)，此類(lèi)突變中的一些可改進(jìn)藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(清除更慢、半衰期延長(zhǎng))?，F(xiàn)已確定恒定區(qū)的其它位點(diǎn)負(fù)責(zé)補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性，例如Clq結(jié)合位點(diǎn)和/或抗體依賴(lài)的細(xì)胞毒性(ADCC)(參見(jiàn)，例如Molec.Immunol.29(5):633-9(1992);Shields等人，J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604(2001)，其全文并入本文作為參考)。Fc受體結(jié)合位點(diǎn)中的殘基的突變可造成效應(yīng)器功能的改變(即，增強(qiáng)或減弱)，例如，改變ADCC或CDC活性或改變半衰期。如上文所述，可能的突變包括一個(gè)或多個(gè)殘基的插入、刪除或取代，包括丙氨酸取代、保守性取代、非保守性取代或在來(lái)自不同亞類(lèi)的相同位置處用對(duì)應(yīng)氨基酸殘基替換(例如，將lgGl殘基替換成此位置上對(duì)應(yīng)的IgG2殘基)。其它共價(jià)修飾特異性結(jié)合劑或抗體的共價(jià)修飾也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在適合的條件下，可以通過(guò)化學(xué)合成，或通過(guò)酶切或化學(xué)裂解特異性結(jié)合劑或抗體進(jìn)行共價(jià)修飾。通過(guò)目標(biāo)氨基酸殘基與有機(jī)衍生化試劑的反應(yīng)可將其它類(lèi)型的共價(jià)修飾引入特異性結(jié)合劑或抗體，其中所述有機(jī)衍生化試劑能夠與所選的惻鏈或N末端或C末端殘基發(fā)生反應(yīng)。半胱氨酰殘基最常與a-鹵代乙酸酯(以及對(duì)應(yīng)的胺)(例如氯乙酸或氯乙酰胺)發(fā)生反應(yīng)，從而生成羧甲基或羧胺甲基衍生物。也可以通過(guò)與溴三氟丙酮、a-溴-卩-(5-咪唑)丙酸、氯乙酰磷酸酯、N-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基-2-吡啶二硫化物、對(duì)氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基酚、或氯-7-硝基苯-2-氧雜-l,3-二唑的反應(yīng)對(duì)半胱氨酰進(jìn)行衍生化?？赏ㄟ^(guò)在pH5.5-7.0的條件下與焦碳酸二乙酯的反應(yīng)對(duì)組氨酰殘基進(jìn)行衍生化，因?yàn)榇嗽噭?duì)組氨酰側(cè)鏈具有相對(duì)特異性。也可使用對(duì)溴苯酰甲基溴；優(yōu)選在pH6.0的條件下在0.1M二甲基砷酸鈉中進(jìn)行反應(yīng)。可將賴(lài)氨?；虬被┒藲埢c琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。使用這些試劑進(jìn)行衍生化具有逆轉(zhuǎn)賴(lài)氨酰殘基帶電性的作用。其它適合于含(X-氨基的殘基衍生化的試劑包括亞氨酸酯，例如methylpicolinimidate、吡咳醛磷酸鹽、吡哆醛、氯硼氫化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮和使用乙醛酸的轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)。可通過(guò)與一種或多種常規(guī)試劑的反應(yīng)修飾精氨酰殘基，所述試劑包括苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。因?yàn)殡夜倌軋F(tuán)的高pKa，精氨酸殘基的衍生化反應(yīng)需要在堿性條件下進(jìn)行。此外，這些試劑還與賴(lài)氨酸基團(tuán)以及精氨酸s-氨基基團(tuán)反應(yīng)。可以通過(guò)與芳香族重氮鹽或四硝基甲垸的反應(yīng)特異性地修飾酪氨酰殘基，特別是向酪氨酰殘基引入光譜標(biāo)記。最常使用N-乙酰咪唑和四硝基甲垸以分別形成O-乙酰酪氨酰類(lèi)和3-硝基衍生物?？墒褂?251或'311碘化酪氨酰殘基以制備用于放射性免疫測(cè)定的標(biāo)記蛋白質(zhì)。可通過(guò)與碳二亞胺(R-N=C=N-R')的反應(yīng)選擇性地修飾羧基側(cè)鏈(天冬氨?；蚬劝滨?，其中R和R'為不同的烷基基團(tuán)，例如，l-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或"乙基-3-(4-氮鐵-4,4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，可通過(guò)與銨離子的反應(yīng)將天冬氨?；蚬劝滨埢D(zhuǎn)化成天冬氨酰胺和谷氨酰胺殘基。經(jīng)常脫去谷氨酰胺和天冬氨酰胺殘基中的酰胺基以分別獲得對(duì)應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。在中性或堿性條件下進(jìn)行這些殘基的脫酰胺反應(yīng)。這些殘基的脫酰胺形式也屬于本發(fā)明的范圍。其它修飾包括脯氨酸和賴(lài)氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基中羥基基團(tuán)的磷酸化，賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈中a-氨基基團(tuán)的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983))、N末端胺的乙?；约癈末端羧基基團(tuán)的酰胺化。另--類(lèi)型的共價(jià)修飾包括經(jīng)化學(xué)或酶促方式將糖苷偶聯(lián)到特異性結(jié)合劑34或抗體上。這些方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要在具有N-連接或O-連接糖基化能力的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)特異性結(jié)合劑或抗體。依據(jù)使用的偶聯(lián)模式，可將糖連接到(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基基團(tuán)，(C)游離巰基基團(tuán)，例如半胱氨酸的巰基基團(tuán)，(d)游離羥基基團(tuán)，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基基團(tuán)，(e)芳基基團(tuán)，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳基基團(tuán)，或(f)谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)。1987年9月11日公開(kāi)的WO87/05330以及AplinandWriston,CRCCrit.Rev.Biochem.,pp.259-306(1981)中描述了這些方法?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)或酶促方式除去特異性結(jié)合劑或抗體上存在的任何糖部分?；瘜W(xué)脫糖基化需要將特異性結(jié)合劑或抗體暴露于三氟甲磺酸化合物或等效化合物。這種處理的結(jié)果是切除連接糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖，同時(shí)保持特異性結(jié)合劑或抗體的完整性。化學(xué)脫糖基化描述于Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Bi叩hys.259:52(1987)以及Edge等人，Anal.Biochem.，118:131(1981)中。可使用Thotakura等人，Meth.Enzymol.138:350(1987)描述的多種內(nèi)切和外切糖苷酶完成特異性結(jié)合劑或抗體上糖部分的酶促切除。特異性結(jié)合劑或抗體的另一類(lèi)共價(jià)修飾包括將特異性結(jié)合劑或抗體連接到多種非蛋白質(zhì)聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油、聚氧化烯或多糖聚合物，例如葡聚糖中的一種上。此類(lèi)方法是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利第4,640,835號(hào)、第4,496,689號(hào)、第4,301,144號(hào)、第4,670,417號(hào)、第4,791,192號(hào)、第4,179,337號(hào)、第4,766,106號(hào)、第4,179,337號(hào)、第4,495,285號(hào)、第4,609,546號(hào)或EP315456。治療應(yīng)用"治療"是指以阻止病癥發(fā)展或改變病癥病理學(xué)為目的而進(jìn)行的干涉活動(dòng)。因此，"治療"包括治療性處理以及預(yù)防性或防止性的措施。需要治療的對(duì)象包括已患有病癥的患者以及需要預(yù)防所述疾病的那些對(duì)象。用于本發(fā)明目的的"哺乳動(dòng)物"包括哺乳動(dòng)物分類(lèi)中的任何動(dòng)物，包括人類(lèi)、養(yǎng)殖和馴養(yǎng)的動(dòng)物、動(dòng)物園的動(dòng)物、以及用于體育運(yùn)動(dòng)的動(dòng)物或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗、馬、貓、牛等。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人類(lèi)。35本文所用短語(yǔ)"治療有效量"是指減少肥大細(xì)胞或祖細(xì)胞數(shù)目和/或活性，減少纖維性元件或其前體，或降低C-Kit相關(guān)疾病有關(guān)癥狀的嚴(yán)重性或進(jìn)展(即，提供"治療效力")的治療性或預(yù)防性的人源化C-Kit抗體的量。肥大細(xì)胞和多能造血始祖干細(xì)胞是表達(dá)C-Kit的主要細(xì)胞類(lèi)型，因此可以預(yù)期本發(fā)明的組合物和方法可治療衍生自HSC的細(xì)胞，例如，肥大細(xì)胞和參與疾病的細(xì)胞。短語(yǔ)"減少纖維化的活性"是指參與抑制、完全或部分地逆轉(zhuǎn)免疫系統(tǒng)活化和纖維化造成的炎癥的能力。本文所用術(shù)語(yǔ)"纖維化疾病或病癥"是指與一種或多種組織中的纖維化相關(guān)的疾病。本文所用術(shù)語(yǔ)"纖維化"是指作為反應(yīng)性過(guò)程在器官或組織中過(guò)量纖維性結(jié)締組織的異常形成或發(fā)育，這與作為正常組成的纖維組織的形成或器官或組織的愈合相反。纖維化的特征是任何特定組織中成纖維細(xì)胞的累積和超出正常沉積量的膠原蛋白質(zhì)沉積。本文所用術(shù)語(yǔ)"纖維化"的意思與"異常愈合，包括間葉成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、過(guò)量成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的活性和沉積"相同。成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織細(xì)胞，分散于全身的結(jié)締組織中。成纖維細(xì)胞分泌包含1型和/或III型膠原蛋白質(zhì)的非剛性細(xì)胞外基質(zhì)。響應(yīng)組織傷害時(shí)，鄰近的成纖維細(xì)胞或循環(huán)的間葉前體細(xì)胞可遷移至創(chuàng)面，并受其它細(xì)胞(例如，肥大細(xì)胞)及其介質(zhì)的影響而被選擇性地活化、增殖并產(chǎn)生大量膠原蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)。膠原蛋白質(zhì)是富含甘氨酸和脯氨酸的纖維蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)以及結(jié)締組織、軟骨和骨的主要組分。膠原蛋白質(zhì)分子是被稱(chēng)為a-鏈的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)，a-鏈相互纏繞形成繩狀螺旋。膠原蛋白質(zhì)以多種形式或類(lèi)型存在，其中，發(fā)現(xiàn)于皮膚、肌腱和骨中的I型膠原蛋白質(zhì)最為普遍；III型膠原蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)于皮膚、血管和內(nèi)臟中。肥大細(xì)胞相關(guān)的纖維化疾病包括病理性纖維化或疤痕(包括心內(nèi)膜硬化)、特發(fā)性間質(zhì)纖維化、肺間質(zhì)纖維化、肌周纖維化(perimuscularfibrosis)、Symmer氏纖維化、中心纖維化(pericentralfibrosis)、肝炎、皮膚纖維瘤、膽汁性肝硬化、酒精性肝硬化、急性肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、急性呼吸窘迫綜合征、腎纖維化/腎小球腎炎、腎纖維化/糖尿病腎病、系統(tǒng)性硬皮病、局部硬皮病、瘢痕瘤、增生性瘢痕、嚴(yán)重關(guān)節(jié)粘連/關(guān)節(jié)炎、骨髓纖維變性、角膜瘢痕、囊腫性纖維化、肌營(yíng)養(yǎng)不良(杜興氏(Duche皿e)肌營(yíng)養(yǎng)不良)、心臟纖維化、肌肉纖維化/視網(wǎng)膜剝落、食道狹窄和皮洛尼氏病(Payronle'sdisease)。手術(shù)可誘導(dǎo)或引發(fā)其它纖維化病變，包括瘢痕修復(fù)/整形手術(shù)、青光眼、白內(nèi)障纖維化、角膜瘢痕、關(guān)節(jié)粘連、移植物抗宿主病、腱手術(shù)、神經(jīng)卡壓癥、杜普伊特倫攣縮(Dupuytren'scontracture)、OB/GYN粘附/纖維化、骨盆粘連、硬膜纖維化、再狹窄。預(yù)期本發(fā)明可用于治療由纖維連接蛋白沉積而導(dǎo)致的纖維化病癥。本發(fā)明可治療的病癥的實(shí)例還包括特發(fā)性肺纖維化、博萊霉素肺、囊腫性纖維化和腎小球腎病，包括以腎臟中Fn沉積為特征并最終導(dǎo)致腎衰竭的疾病。本發(fā)明還可以治療與免疫系統(tǒng)活化相關(guān)的炎癥、其中肥大細(xì)胞分泌如TNF的炎癥細(xì)胞因子，并可以激活淋巴細(xì)胞并直接與其發(fā)生相互作用。硬皮病被認(rèn)為是一種結(jié)締組織的自體免疫疾病，其導(dǎo)致特征在于皮膚增厚和硬化的纖維化病癥，其中皮膚增厚和硬化是由皮膚和其它器官中成纖維細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的新膠原蛋白質(zhì)而引起的。硬皮病可以是局部疾病或累及多個(gè)器官的系統(tǒng)性疾病。硬皮病也被稱(chēng)為系統(tǒng)性硬化癥。硬皮病病理上的發(fā)展與受影響的疾病組織/器官中的肥大細(xì)胞數(shù)目的增加有關(guān)。系統(tǒng)性硬化癥的特征是形成透明加厚的膠原纖維組織，并伴隨有皮膚加厚和下層組織粘連，特別是在手和面部。該病的特征還在于由缺乏蠕動(dòng)性和食道黏膜下層纖維化造成的吞咽困難、由肺纖維化造成的呼吸困難、心臟纖維化以及腎血管病變(Stedman'sMedicalDictionary,第26版，Williams&Wilkins，1995)。30%至70%的硬皮病患者受到肺纖維化的影響，其通常導(dǎo)致限制性肺疾病(Atamas等人，CytokineandGrowthFactorRev14:537-550(2003))。一些患者重疊地患有硬皮病和其它結(jié)締組織疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多肌炎。當(dāng)硬皮病的特征與多肌炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特征同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，這種病癥被稱(chēng)為混合結(jié)締組織病(MCTD)。己知以皮炎的一些形式出現(xiàn)的癥狀是皮膚肥大細(xì)胞的脫?；?，尤其是脫粒化導(dǎo)致的組胺釋放造成的。因此，本發(fā)明適合治療的另一種肥大細(xì)胞相關(guān)病變是色素性蕁麻疹。該病變表現(xiàn)出特征性的皮膚損害，即單個(gè)或多個(gè)著色斑疹或摩擦后出現(xiàn)風(fēng)塊并包含大量肥大細(xì)胞的結(jié)節(jié)。存在不同形式的相關(guān)皮炎(皮膚炎癥)，例如出現(xiàn)在人和動(dòng)物皮膚炎中的紅斑、水腫、丘疹性發(fā)疹、以及瘙癢癥，以上形式均可用本發(fā)明進(jìn)行治療。在很多情況下，肥大細(xì)胞增多癥是腫瘤疾病并且涉及新生性或異常性肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且可能是升高的SCF自分泌信號(hào)或活化的C-Kit突變的結(jié)果。肥大細(xì)胞增多癥可以是限制性疾病或累及多個(gè)器官(例如，骨髓)的系統(tǒng)系疾病。響應(yīng)特定事件時(shí)，肥大細(xì)胞向體內(nèi)釋放特定的介質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，其中之一為組胺。系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥患者的肥大細(xì)胞的數(shù)目增加，或產(chǎn)生形狀異常、不具備正常功能的肥大細(xì)胞。此外，這些肥大細(xì)胞不能按計(jì)劃死亡，因此進(jìn)一步增加了肥大細(xì)胞的總量。肥大細(xì)胞脫?；⑨尫牌鋬?nèi)容物時(shí)，可導(dǎo)致很多急性且潛在嚴(yán)重的病癥或疾病。肥大細(xì)胞病變還包括導(dǎo)致局部疾病的增殖性病變，例如單發(fā)性皮膚細(xì)胞瘤乃至肥大細(xì)胞白血病等更為嚴(yán)重的疾病。實(shí)例包括皮膚肥大細(xì)胞瘤、侵襲性肥大細(xì)胞增多癥、惰性肥大細(xì)胞增多癥、伴有血液系統(tǒng)異常的肥大細(xì)胞增多癥、色素性蕁麻疹、持久性發(fā)疹性斑狀毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(TMEP)、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞病、肥大細(xì)胞白血病、髓細(xì)胞白血病、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥(伴有或沒(méi)有例如色素性蕁麻疹的皮膚表現(xiàn))、肥大細(xì)胞活化綜合征/病變，以及更為常見(jiàn)的小兒肥大細(xì)胞病變，例如單發(fā)性肥大細(xì)胞瘤和彌漫性皮膚肥大細(xì)胞增多癥。肥大細(xì)胞活化綜合征或病變的特征是正常數(shù)量或接近正常數(shù)量的肥大細(xì)胞。然而，這些肥大細(xì)胞極易受激發(fā)而釋放其內(nèi)容物，造成很多相同的癥狀。這種病變存在過(guò)敏性反應(yīng)和休克的危險(xiǎn)，但是與肥大細(xì)胞增殖病變不同，這種綜合征不具有發(fā)展到更高侵襲性或惡性階段的潛能。伴有肥大細(xì)胞脫?；拇祟?lèi)病變的實(shí)例包括腹痛、蕁麻疹和皮疹、過(guò)敏性反應(yīng)、食道炎癥、血壓變化和休克、腸痙攣和腹脹、骨痛(輕度至嚴(yán)重疼痛/虛弱)、瘙癢、伴有或沒(méi)有皮疹、胸痛，肝、脾和其它器官損害、認(rèn)知困難/腦霧(brainfog)、吸收不良、退行性腰椎間盤(pán)疾病、偏頭痛、腹瀉、肌肉痛、頭暈/眩暈/暈眩、惡心、虛弱、骨質(zhì)疏松癥/骨質(zhì)缺乏癥、疲勞、外周神經(jīng)病變和感覺(jué)異常、面紅、心率增快、胃食道返流和嘔吐?，F(xiàn)已使用阻斷肥大細(xì)胞特異性介質(zhì)(例如組胺和皮質(zhì)類(lèi)固醇)并具有引發(fā)肥大細(xì)胞凋亡活性的藥物，在臨床上證實(shí)了肥大細(xì)胞在過(guò)敏性疾病中的作用。其它肥大細(xì)胞相關(guān)疾病包括組胺介導(dǎo)的過(guò)敏性反應(yīng)，這種過(guò)敏性反應(yīng)可通過(guò)抑制趨化因子誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫粒以及組胺釋放進(jìn)行治療?？捎杀景l(fā)明的方法和組合物有效治療的肥大細(xì)胞相關(guān)病變或疾病的實(shí)例還包括，但不限于接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性皮炎、濕疹性皮炎和由昆蟲(chóng)叮咬引起的皮炎。適合由本發(fā)明的方法和組合物治療的其它肥大細(xì)胞相關(guān)適應(yīng)癥包括間質(zhì)性肺疾病(interstitiallungdisease)中的肺部炎癥狀態(tài)，例如結(jié)節(jié)病、新生兒呼吸窘迫綜合癥(RDS)、肺支氣管發(fā)育不良(BPD)和以血清PLA2活性升高為特征的病癥，例如成人RDS(ARDS)?，F(xiàn)已公開(kāi)肥大細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎中的作用。肥大細(xì)胞在RA和OA患者的發(fā)炎的滑膜組織中增多，而已發(fā)現(xiàn)Gleevec可引發(fā)滑膜外植體中肥大細(xì)胞凋亡，對(duì)人類(lèi)患者的研究顯示出其在RA患者體內(nèi)的效力。肥大細(xì)胞在感染性休克、胰腺炎、膠原血管病、急性腎衰竭、腹膜炎和自身免疫性葡萄膜炎中起作用。研究還表明肥大細(xì)胞參與多發(fā)性硬化的病理生理過(guò)程。人們認(rèn)為腦部肥大細(xì)胞釋放可導(dǎo)致脫髓鞘的血管活性胺。肥大細(xì)胞釋放的組胺可改變血管完整性并導(dǎo)致也與多發(fā)性硬化病因相關(guān)的血腦屏障的部分破壞。因此，可預(yù)期本發(fā)明的方法和組合物適合于治療或改善與多發(fā)性硬化病相關(guān)的病狀。C-Kit還表達(dá)于特定的非免疫細(xì)胞，例如黑色素細(xì)胞和腸細(xì)胞以及精母細(xì)胞。本發(fā)明可用于治療黑色素瘤和GIST，并可作為男性避孕藥使用。藥用制劑的服用和制備可將本發(fā)明方法實(shí)施中使用的抗c-Kit特異性結(jié)合劑或抗體制備成包含適合所需給藥方法的載體的藥用組合物。適合用作載體的物質(zhì)不與受試者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，并且在與抗c-Kit特異性結(jié)合劑和中性拮抗劑或抗體組合時(shí)可保持其對(duì)c-Kit的高親和力結(jié)合和效力。實(shí)例包括但不限于多種標(biāo)準(zhǔn)藥物載體的任一種，例如無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液、抑菌水和類(lèi)似物。可使用多種水性載體，例如水、緩沖液、0.4%鹽水、0.3%甘氨酸和類(lèi)似物，并可包括其它用于增加穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)，例如能經(jīng)受溫和化學(xué)修飾或類(lèi)似處理的白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。制劑中的示范性抗體濃度可以是約0.1mg/mL至約180mg/mL或約O.lmg/mL至約50mg/mL，或約0.5mg/mL至約25mg/mL，或者約2mg/mL至約10mg/mL?？稍趐H緩沖液中制備抗體的水性制劑，例如在pH范圍為395.5，或約5.0的條件下。具有此范圍內(nèi)pH值的合適緩沖液的實(shí)例包括醋酸鹽(例如，醋酸鈉)、琥珀酸鹽(例如，琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸緩沖液。緩沖液濃度可以是約lmM至約200mM，或約10mM至約60mM，這取決于緩沖液以及制劑需要的等滲性。本制劑中可包括也能穩(wěn)定抗體的張度劑。張度劑的實(shí)例包括多元醇，例如甘露醇、庶糖或海藻糖。優(yōu)選等滲的水性制劑，但是高滲或低滲溶液也是合適的。制劑中多元醇的示范性濃度范圍為約1%至約15%(w/v)。還可以向抗體制劑中添加表面活性劑以減少制劑抗體的凝聚和/或使制劑中顆粒的形成最小化和/或減少吸附。表面活性劑的實(shí)例包括非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。表面活性劑的示范性濃度范圍為約0.001%至約0.5%，或約0.005%至約0.2%，或者約0.004%至約0.01%(w/v)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含以上確定的試劑(即，抗體、緩沖液、多元醇和表面活性劑)，并且基本不含有一種或多種防腐劑，例如苯甲醇、苯酚、間甲苯酚、氯丁醇和芐索氯銨。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑可包含防腐劑，例如濃度為約0.1%至約2%，或約0.5%至約1%的防腐劑。只要不對(duì)所需的制劑特征產(chǎn)生消極影響，本制劑可包含一種或多種其它藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.Ed.(1980)中所描述的那些。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在其使用的劑量和濃度下對(duì)受體無(wú)毒，且包括其它的緩沖劑、助溶劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸和蛋氨酸)、螯合劑(例如EDTA)、金屬配合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)配合物)、可生物降解的聚合物(例如，聚酯)和/或成鹽平衡離子(例如，鈉)。通過(guò)將所需純度的抗體與可選擇的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.Ed.(1980))相混合，制備凍干劑或水溶液形式的用于存儲(chǔ)的治療性抗體制劑?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在其使用的劑量和濃度下對(duì)受體無(wú)毒，且包括緩沖液(例如，磷酸鹽、擰檬酸鹽和其它有機(jī)酸)、抗氧化劑(包括抗壞血酸和蛋氨酸)、防腐劑(例如，十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲雙銨、苯扎氯銨、芐40索氯銨、苯酚、丁醇或苯甲醇、烷基苯甲酸酯類(lèi)，例如甲基或丙基苯甲酸酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲苯酚)、低分子量多肽(少于約IO個(gè)殘基)，蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天門(mén)冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸)、單糖、二糖和其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖、麥芽糖或糊精)、螯合劑(例如EDTA)、糖類(lèi)(例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)、成鹽平衡離子(例如鈉)、金屬配合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)配合物)和/或非離子表面活性劑(例如，TWEEN、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG))。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明要求保護(hù)的合適制劑包含等滲緩沖液(例如，磷酸鹽、醋酸鹽或TRIS緩沖液)與用于維持張性和穩(wěn)定的張度劑(例如，多元醇、山梨醇、蔗糖或氯化鈉)的組合。此類(lèi)張度劑的一個(gè)實(shí)例是5%山梨醇或蔗糖。此外，所述制劑可任選地包含0.01%至0.02%(w/v)的表面活性劑以防止凝聚和保持穩(wěn)定。帝!j劑的pH范圍可為約4.5-6.5至4.5-5.5。關(guān)于抗體藥用制劑的其它示范性描述可在US2003/0113316和美國(guó)專(zhuān)利第6,171,586號(hào)中找到，其全文分別并入本文作為參考。本文的制劑還包含治療特定病癥所必須的多于一種的活性化合物，優(yōu)選那些具有互補(bǔ)活性、彼此不消極影響的活性化合物。例如，進(jìn)一步提供免疫抑制劑也是合乎需要的。此類(lèi)分子適合于以預(yù)期目的有效量組合存在。所述活性組分也可以包裹在微膠囊中，例如，分別用于膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或粗乳液的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊，所述微膠囊通過(guò)凝聚技術(shù)或界面聚合制備。此類(lèi)技術(shù)公開(kāi)于Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol,A.Ed.(1980)。也可考慮使用懸浮液或晶體形態(tài)的抗體。制備懸浮液和晶體形態(tài)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。用于體內(nèi)服用的制劑必須是無(wú)菌的?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)的公知滅菌技術(shù)對(duì)本發(fā)明的組合物進(jìn)行滅菌。例如，通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾可簡(jiǎn)單完成滅菌?？蓪⑺萌芤喊b使用或在無(wú)菌條件下過(guò)濾并凍干，在服用前將凍干制劑與無(wú)菌溶液混合。41通常使用凍干過(guò)程來(lái)穩(wěn)定長(zhǎng)期存放的多肽，特別是在液體組合物中相對(duì)不穩(wěn)定的多肽。凍干循環(huán)通常由3個(gè)歩驟組成冷凍、一次干燥和二次干燥(Williams禾口Polli，JournalofParenteralScienceandTechnology,38巻，Number2，48-59頁(yè)(1984))。在冷凍步驟中，將溶液冷卻直至完全凍結(jié)。溶液形式的主體水在此階段中形成冰。使用真空干燥機(jī)將氣室壓力降低至冰的蒸汽氣壓之下，從而在一次干燥階段使冰升華。最后，在低氣室壓力和高儲(chǔ)存溫度下的二次干燥階段除去吸附水或結(jié)合水。此方法產(chǎn)生被稱(chēng)為凍干塊的產(chǎn)物。此后，在使用前將凍干塊復(fù)溶。標(biāo)準(zhǔn)的凍干材料復(fù)溶過(guò)程是加回一定體積的純水(通常等于凍干期間除去的體積)，但有時(shí)在制備胃腸外服用的藥品時(shí)也使用抗菌劑的稀釋溶液(Chen，DrugDevelopmentandIndustrialPharmacy,18巻，11禾口12期，1311-1354頁(yè)(1992))。已經(jīng)注意到在一些情況下賦形劑對(duì)凍干產(chǎn)品起穩(wěn)定劑的作用(Carpenter等人，DevelopmentsinBiologicalStandardization,74巻，225-239頁(yè)(1991))。例如，已知的賦形劑包括多元醇(包括甘露醇、山梨醇和甘油)、糖類(lèi)(包括葡萄糖和蔗糖)和氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。此外，常使用多元醇和糖類(lèi)保護(hù)多肽，使其免受冷凍和干燥導(dǎo)致的損害，并增強(qiáng)干燥狀態(tài)下的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。通常，糖類(lèi)，特別是二糖，在冷凍干燥過(guò)程和存儲(chǔ)期間均有效。現(xiàn)已報(bào)道，其它類(lèi)型的分子，包括單糖、二糖以及如PVP的聚合物可作為凍干產(chǎn)品的穩(wěn)定劑。用于注射的藥物制劑和/或藥物可以是適合于用上述的合適溶液復(fù)溶的粉末。其實(shí)例包括但不限于冷凍干燥粉、旋轉(zhuǎn)干燥粉或噴霧干燥粉、無(wú)定形粉、顆粒、沉淀物或微粒。用于注射的制劑可選地包含穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑和其組合?？芍苽渚忈屩苿?。緩釋制劑的合適實(shí)例包括包含抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，其中所述基質(zhì)的形式為成型物，例如，膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯或聚乙烯醇)、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利第3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和yethyl-L-glutamate的共聚物、不可降解的乙烯醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LupronDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的注射用微球)，以及聚42(D-(+3-羥基丁酸)。如乙烯醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能夠釋放分子超過(guò)100天，而特定的水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠囊化抗體在體內(nèi)保留長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，37。C下與水分的接觸會(huì)導(dǎo)致抗體變性或聚集，從而會(huì)造成生物活性損失和可能的免疫原性變化。可按照涉及的機(jī)理設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集的機(jī)理是通過(guò)巰基-二硫鍵互換形成的分子內(nèi)s-s鍵，則可通過(guò)修飾巰基殘基，由酸性溶液凍干，控制水分含量，使用合適的添加劑并開(kāi)發(fā)特異的聚合物基質(zhì)組合物以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化?？蓪⒈景l(fā)明的制劑設(shè)計(jì)成本文所述的速效、速釋、長(zhǎng)效或緩釋制劑。因此，也可將藥物制劑制備成控釋或緩釋制劑。可根據(jù)病情、年齡、體重、一般健康狀況、受試者的性別和飲食、劑量間隔、給藥途徑、排泄率以及藥物組合來(lái)調(diào)整特定的劑量。包含有效量的上述所有劑型均在常規(guī)實(shí)驗(yàn)的范圍之內(nèi)，因此也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)任意適合的方式施用所述特異性結(jié)合劑或抗體，包括胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)給藥，以及需要局部治療情況下的病變部位內(nèi)給藥。胃腸外灌注包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給藥。此外，所述特異性結(jié)合劑或抗體適合于脈沖灌注，特別是使用遞減劑量的特異性結(jié)合劑或抗體。優(yōu)選通過(guò)注射給藥，最優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于給藥是短期的還是長(zhǎng)期的。其它可考慮的給藥方法包括局部給藥，特別是經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、直腸、口腔或局部給藥，例如通過(guò)放置在期望位點(diǎn)附近的導(dǎo)管給藥。最優(yōu)選在生理溶液中經(jīng)靜脈注射本發(fā)明的特異性結(jié)合劑或抗體，其劑量為0.01mg/kg至100mg/kg，頻率為每天、每周至每月一次(例如，每天、每?jī)商臁⒚咳?，或每?、3、4、5或6次)，優(yōu)選的劑量為0.1至45mg/kg、0.1至15mg/kg或0.1至10mg/kg，頻率為每周2或3次或每個(gè)月45mg/kg。與其它試劑一同施用本發(fā)明的抗體也可以與其它抗炎治療劑同時(shí)施用。同時(shí)施用包括在不同的時(shí)間以不同的給藥途徑施用兩種不同的治療劑，只要所述試劑在一個(gè)重疊的時(shí)間能夠發(fā)揮其治療功效就可以。本領(lǐng)域中已知的示范性抗c-Kit試劑包括甲磺酸伊馬替尼(ImatinibMesylate)(GleevecTM)。應(yīng)注意甲磺酸伊馬替尼還拮抗來(lái)自Abl酪氨酸激酶的信號(hào)傳導(dǎo)，因此并不是特異的c-Kit抑制劑。43實(shí)施例SR-1的人源化通過(guò)直接的CDR移植使SR-1人源化，意外的是不需要進(jìn)行回復(fù)突變以保持親和力，盡管其保持有所需的功能活性。選擇保持最規(guī)范殘基并且沒(méi)有引入其它脯氨酸殘基的人類(lèi)骨架區(qū)作為受體序列?；谶@些規(guī)則，在重鏈?zhǔn)荏w序列中，選擇VH11-46作為骨架區(qū)1和11，選擇VH1l-e作為骨架區(qū)ni，并選擇JH4作為最近的J區(qū)域(也稱(chēng)為骨架區(qū)IV)。輕鏈?zhǔn)荏w序列為VK4B3種系序列，并選擇JK2作為最近的J區(qū)域。進(jìn)行同種型轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生人IgG2、IgGl、IgG4P和脫糖基化IgGl形式的人源化抗體。通過(guò)將297位(Kabat計(jì)數(shù))的天冬酰胺單堿基突變成谷氨酸，從人類(lèi)IgGl恒定區(qū)序列中除去了N-連接的糖基化共有序列。脫糖基化IgGl(hSR-lalgGl)形式的人源化SR-1按期望的方式結(jié)合膜c-Kit，其對(duì)膜c-Kit的親和力高于對(duì)可溶性c-Kit的親和力，并且基于使用近端末梢讀取c-Kit信號(hào)的實(shí)驗(yàn)，它是一種高效中性SCF拮抗劑，并且不會(huì)在任何細(xì)胞中直接介導(dǎo)c-Kit的激動(dòng)效應(yīng)。選擇脫糖基化IgGl亞型以避免通過(guò)旁效應(yīng)引發(fā)的效應(yīng)器功能和細(xì)胞殺傷作用。此抗體在猴子中顯示出意想不到的合乎需要的半衰期、非線(xiàn)性PK和可飽和的靶標(biāo)介導(dǎo)的抗體清除作用。它還可按預(yù)期在體內(nèi)消除肥大細(xì)胞。與c-Kit二聚體的結(jié)合干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合時(shí)的c-Kit活化最可能通過(guò)網(wǎng)格蛋白(clathrin)依賴(lài)性途徑導(dǎo)致二聚化/寡聚化、自身磷酸化和受體內(nèi)化。根據(jù)Biacore測(cè)定，SR-1單克隆抗體與c-Kit二聚體結(jié)合的親和力比對(duì)可溶性細(xì)胞外區(qū)域c-Kit單體高出100倍。動(dòng)力學(xué)建模表明即使存在有ng/mL的可溶性脫落受體(shedreceptor),SR-1仍可優(yōu)先結(jié)合天然膜偶聯(lián)受體。糖蛋白上存在的糖會(huì)影響其生物學(xué)和功能性質(zhì)。脫糖基化IgGl形式的人源化SR-1顯示出保留的結(jié)合參數(shù)。在Biacore測(cè)試中，人源化SR-1algGl與重組c-Kit受體-Fc結(jié)合的KinExA平衡結(jié)合Kd為1.0pM，hSR國(guó)lalgGl阻斷干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合的Ki等于70pM。hSR-1algGl結(jié)合受體二聚體的親和力高于單體。這是不能以人源化翻譯的確定性預(yù)測(cè)的一個(gè)重要特征，并且可溶性C-Kit單體在體內(nèi)不大可能起抗體接收器的作用。抑制C-Kit依賴(lài)細(xì)胞的存活和受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)人類(lèi)成巨核細(xì)胞系UT-7的存活依賴(lài)于SCF，而除去或抑制SCF可導(dǎo)致其生存能力迅速下降和增殖減少。此試驗(yàn)適合于測(cè)定SCF拮抗劑的IC50效力。hSR畫(huà)lalgGl表現(xiàn)出35pM的平均IC50。hSR-1algGl有效抑制M07e細(xì)胞中SCF介導(dǎo)的c-Kit磷酸化和內(nèi)化，說(shuō)明所述抗體能夠阻斷SCF介導(dǎo)的c-Kit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。與發(fā)現(xiàn)SR-1能夠內(nèi)在地介導(dǎo)c-Kit內(nèi)化和磷酸化相反，在對(duì)hSR-1algGl進(jìn)行的M07ec-Kit受體近端磷酸化讀取中沒(méi)有檢測(cè)到激活作用的證據(jù)。特別地，IgG2抗體hSR-1IgG2的效力稍低，并且不完全抑制SCF介導(dǎo)的c-Kit受體內(nèi)化。使用初代分離的人CD34+、CD117+(c-Kit)骨髓細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，l.Oug/mL的hSR-1algGl可中和SCF對(duì)源自集落形成的GM-CSF的協(xié)同作用。與我們關(guān)于hSR-1algGl不介導(dǎo)c-Kit內(nèi)化或磷酸化的新發(fā)現(xiàn)一致的是，在此試驗(yàn)中沒(méi)冇觀(guān)察到濃度高達(dá)10ug/mL的hSR-1algGl抗體的內(nèi)在激動(dòng)性存活活性。實(shí)際上，所述抗體能夠?qū)⒋婊钜种频交鶞?zhǔn)線(xiàn)以下。肥大細(xì)胞聚集、CDC和FcR活性的缺乏使用源自骨髓CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)的人類(lèi)肥大細(xì)胞測(cè)定所述化合物的表觀(guān)效力和等級(jí)次序。hSR-1algGl抑制SCF依賴(lài)的肥大細(xì)胞存活，不向肥大細(xì)胞傳導(dǎo)存活信號(hào)，不介導(dǎo)c-Kit受體磷酸化(圖3)，也未顯示介導(dǎo)同型肥大細(xì)胞聚集的能力。與之相反，hSR-lIgG2能夠阻斷SCF-肥大細(xì)胞存活，但其本身顯示出部分的傳導(dǎo)存活信號(hào)的激動(dòng)劑活性，介導(dǎo)c-Kit受體磷酸化并產(chǎn)生導(dǎo)致肥大細(xì)胞聚集的可重復(fù)性作用。將hSR-lalgGl抗體以高至30mg/kg的劑量，每周一次，連續(xù)4周或高至150mg/kg的劑量，每周一次，連續(xù)2周皮下注射到非人類(lèi)靈長(zhǎng)動(dòng)物時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到意外異常。hSR-1algGl沒(méi)有表現(xiàn)出可測(cè)量的FcR與U-937細(xì)胞的非特異性結(jié)合，其中U-937細(xì)胞表達(dá)Fcy受體I:CD64;Fcy受體II:CD32和Fey受體III:CD16。與之相反，推測(cè)檢測(cè)到hSR-lalgGl和lgG4P亞型與高親和力FcYRI的結(jié)合。因此，預(yù)測(cè)hSR-lalgGl沒(méi)有ADCC活性，并且迄今為止的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明沒(méi)有補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性細(xì)胞死亡?，F(xiàn)已報(bào)道脫糖基化嵌合鼠/人IgGl抗體保留了某些效應(yīng)器功能(Hybridoma.1991Apr;lO(2):211-7)，因此，hSR-lalgGl的這些所需活性是意料之外的。數(shù)據(jù)顯示應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法并以此選擇典型的IgG2、IgGl或IgG4亞型不能產(chǎn)生具有合適特性的分子，即高親和力結(jié)合劑，c-Kit的功能性中性拮抗劑，且不會(huì)激活肥大細(xì)胞。藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行初步PK研究以比較在3mg/kg的單次IV或SC給藥后雄性獼猴體內(nèi)hSR-lIgG2和hSR-lalgGl的PK值。時(shí)間曲線(xiàn)說(shuō)明兩者均為非線(xiàn)性PK。濃度越低，濃度降低得越快。根據(jù)獼猴在單次IV或SC給藥后的C。/Q^和AUCo.tM測(cè)定，兩種抗體顯示出相似的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)(exposures)?；贏UC。-t^測(cè)定，兩種人源化抗體的血清清除率約為^0.3mL/hr/kg。SC給藥后，hSR-lalgGl和hSR-lIgG2人源化形式的SR-1的生物利用度分別約為82%和69%?；赟R-1和人源化抗體重復(fù)對(duì)非洲綠猴的每周一次給藥的初步藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)，人源化抗體達(dá)到的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)高于SR-1。特別地，hSR-lalgGl在PK組里同樣是最優(yōu)，并且早先已發(fā)現(xiàn)分子的糖基化程度可改變其藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，對(duì)于抗體而言，會(huì)改變其新陳代謝和其它生物學(xué)性質(zhì)(CancerImmunolImmunother.1992;35(3):165-74)。表1.雄性Cyn6m61gus獼猴在3mg/kg單次IV或SC施用hSR-lIgG2或hSR-lalgGl后的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)估測(cè)試物給藥途徑(ug/mL)Timax(hr)AUCo_tiast(hr*ug/mL)CX或CI7Fa(mI7hr/mL)F%hSR-lalgGlIV103-9710$0.309-hSR-lIgG2IV107-10600$0.283-hSR-lalgGlsc36.4727970$0.37682.1hSR-lIgG2sc36.7607290$0.41268.8C。=IV給藥后估計(jì)的初始濃度Cn^二SC給藥后的最大濃度Tmax=達(dá)到CmaJ勺時(shí)間AUC。.tlast=從時(shí)間0到濃度可測(cè)的最后時(shí)間點(diǎn)的濃度-時(shí)間曲線(xiàn)下面積CL二IV給藥后的清除率；CL/F=SC給藥后的表觀(guān)清除率F%=生物利用度％a基于AUC。-t^t計(jì)算的清除率-不適用C。、Cmax、AUC0-tlast、CL、CL/F和F。/o公開(kāi)于3個(gè)重要附圖中。人類(lèi)劑量預(yù)測(cè)猴傷口PD模型中，肥大細(xì)胞擴(kuò)增的最小有效量0.3mg/Kg，每周一次，持續(xù)兩周。根據(jù)基于體表面積的劑量轉(zhuǎn)換，按等效劑量法預(yù)計(jì)人的最小有效量0.1mg/Kg。然而，由于此時(shí)尚不了解臨床終點(diǎn)，以及hSR-lalgGl在人體內(nèi)c-Kit抑制中程度與持續(xù)時(shí)間的藥物動(dòng)力學(xué)關(guān)系，因此這種評(píng)估是初步的。在獲得更多的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù)后，可進(jìn)行更精確的預(yù)測(cè)。體內(nèi)效力使用SR-1和hSR-lalgGl消除猴體內(nèi)肺和結(jié)腸基底肥大細(xì)胞在人體中，表達(dá)類(lèi)胰蛋白酶且缺乏糜酶的肥大細(xì)胞MCt主要定位于如肺和結(jié)腸的粘膜組織，而此亞型現(xiàn)已在皮膚中被發(fā)現(xiàn)，并且一些硬皮病患者中出現(xiàn)了高水平的此細(xì)胞亞型，這說(shuō)明在此條件下肥大細(xì)胞也可能會(huì)被活化。表達(dá)類(lèi)胰蛋白酶和糜酶的肥大細(xì)胞MCtc也共定位于一些此類(lèi)組織中，類(lèi)似47地，也可能與硬皮病和其它纖維化病癥相關(guān)。因此，在粘膜和結(jié)締組織的疾病(例如，IPF、SSc、哮喘、RA和IBD)中，所述兩種亞型均可作為c-Kit抑制劑的主要靶標(biāo)。由于肥大細(xì)胞通常是長(zhǎng)壽命的組織固有細(xì)胞，因此需要治療劑具有高效力、有效性并具有良好的分布容積和PK。此外，肥大細(xì)胞主要為靜止細(xì)胞，直到被活化脫粒并重新合成介質(zhì)時(shí)，它們才會(huì)在炎癥反應(yīng)中起重要作用。體內(nèi)研究的目的是證明消除了如存在于肺和結(jié)腸的基底膜和結(jié)締組織肥大細(xì)胞，并測(cè)定持續(xù)大部分地抑制c-Kit后對(duì)造血作用、祖細(xì)胞以及紅血球生成、黑素生成以及精子發(fā)生(從而可用于男性避孕)的影響?；谌撕秃颿-Kit在CD34+骨髓細(xì)胞CFU測(cè)試中的等價(jià)功能效力(抑制率為1.0ug/mL)及其猴PK，選擇SR-1單克隆抗體。SR-1的施用劑量范圍為3mg/Kg至30mg/Kg，每周一次持續(xù)4周。在時(shí)間進(jìn)程研究中，結(jié)腸基底肥大細(xì)胞的消除在2個(gè)劑量后(第14天)達(dá)到最大值(Ct腿gh〉細(xì)胞IC50的800倍)，因此選擇第14天作為測(cè)定c-Kit拮抗結(jié)腸基底肥大細(xì)胞的藥理活性的時(shí)間點(diǎn)。由于實(shí)踐上的原因，在第28天研究結(jié)束進(jìn)行解剖時(shí)對(duì)肺基底肥大細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。每周一次施用3.0mg/Kg劑量的SR-1時(shí)，觀(guān)察到消除肺基底肥大細(xì)胞的Ctr。ughPK水平大于UT-7細(xì)胞IC50的200倍。沒(méi)有評(píng)估較低劑量SR-1對(duì)肺和結(jié)腸基底肥大細(xì)胞、黑素生成和精子發(fā)生的影響。但是，對(duì)0.3、1.0和3.0mg/Kg的較低劑量的hSR-lalgGl進(jìn)行了研究。第14天，Cfgh水平分別大于細(xì)胞IC50的200倍、2000倍和8000倍，這些C加ugh水平分別對(duì)應(yīng)于無(wú)效力，接近半消除(69%)和接近完全消除(96%)結(jié)腸基底肥大細(xì)胞(總結(jié)于表1中)。hSR-lalgGl的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)與細(xì)胞效力和效果的關(guān)系與關(guān)于SR-1的報(bào)道發(fā)現(xiàn)一致。SR-1和hSR-lalgGl在猴肥大細(xì)胞擴(kuò)增的傷口藥效學(xué)模型中的體內(nèi)效力皮膚損傷后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，在所述嚴(yán)重炎癥反應(yīng)中，嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞先后從旁組織和循環(huán)系統(tǒng)中遷移而來(lái)，?；⑦M(jìn)行組織的表皮再生以及成纖維細(xì)胞相關(guān)的下層傷口結(jié)締組織收縮(DiegelmamiRF等人，F(xiàn)rontBiosci.2004，Janl;9:283-9)。皮膚創(chuàng)傷是用于研究纖維化相關(guān)機(jī)制的模型，這是由于多種細(xì)胞類(lèi)型與纖維化疾病相關(guān)。然而，現(xiàn)己報(bào)道人48體內(nèi)的纖維化還與源自成纖維細(xì)胞的SCF增加，以及肥大細(xì)胞的活化和密度增加有關(guān)(TrautmannA等人，J.Pathol.2000，Jan;190(1):100-6)。猴皮膚創(chuàng)傷后，肥大細(xì)胞的數(shù)目以時(shí)間依賴(lài)性方式增加，并在受傷后第14天達(dá)到穩(wěn)定期，這與人類(lèi)示例相似。每周一次服用0.3、1或3mg/Kg劑量的SR-1在第14天導(dǎo)致對(duì)傷口激活的肥大細(xì)胞擴(kuò)增的近似最大抑制(圖1)。最大抑制的定義為在受傷后第14天，100%阻斷肥大細(xì)胞超出基底數(shù)量增長(zhǎng)的能力。在第14天，0.3mpk劑量的C加ugh水平大于UT-7IC50的7倍(表2)。在第3周，血清水平約為UT-7IC50的2倍，并且在此暴露條件下僅觀(guān)察到部分抑制(圖l)。在第3周，1和3mg/Kg劑量組中仍可觀(guān)測(cè)到最大效力，其中血清Ctrough水平維持在大于IC50的200倍。這些研究表明對(duì)傷口擴(kuò)增肥大細(xì)胞的最大抑制很可能需要Ctrough持續(xù)暴露于大于7倍IC50濃度?；诖四Ｐ退镜腟R-1的最大效力，對(duì)0.3、1.0和3.0mg/Kg劑量的hSR-lalgGl進(jìn)行了評(píng)估。在測(cè)試的最低劑量(0.3mg/Kg)下，在2周之內(nèi)觀(guān)測(cè)到對(duì)傷口誘發(fā)的肥大細(xì)胞擴(kuò)增的最大抑制。此時(shí)，血清QTOUgh水平大于UT-7IC50的200倍(表2)。表2SR-1和hSR-lalgGl在傷口PD模型中的PD/PK作用的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>對(duì)人(左)或非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)(右)切傷后鉆取活組織檢査，直到實(shí)驗(yàn)第21天(圖2)。分別通過(guò)染色法和IHC顯示肥大細(xì)胞和/或表達(dá)SCF的成纖維細(xì)胞。在人體正常傷口愈合期間，SCF的表達(dá)增加并回落至基底值，隨后肥大細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)瞬時(shí)增加。在猴中觀(guān)察到相似的肥大細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷的反應(yīng)。在纖維化和異常傷口愈合期間，SCF表達(dá)和肥大細(xì)胞數(shù)目均維持在較高的值。造血作用和黑素生成鼠遺傳學(xué)顯示c-kit在胚胎發(fā)育期間參與造血作用，但是尚未將人類(lèi)斑駁病受試者的雜合失活和/或c-Kit突變體功能缺失與血液學(xué)異常相關(guān)聯(lián)。因?yàn)橐呀?jīng)將SCF與G-CSF組合用于動(dòng)員造血干細(xì)胞，因此SCF和c-Kit對(duì)于人類(lèi)造血作用很重要。此外，現(xiàn)已報(bào)道在GIST患者中，主要靶向BCR-ABL、PDGFR和c-Kit的多激酶抑制劑Gleevec的主要藥理作用有骨髓抑制、重度(3-4級(jí))貧血和血小板減少癥(HensleyML等人，Semin.Hematol.2003,Apr;40(2Suppl2):21-5)。鼠遺傳學(xué)顯示c-Kit在胚胎發(fā)育期間參與成黑素細(xì)胞從神經(jīng)嵴的遷移，這一作用在人類(lèi)斑駁病(Piebaldism)中得到支持。現(xiàn)已有報(bào)道稱(chēng)Gleevec在少數(shù)GIST患者的頭發(fā)中產(chǎn)生"條帶狀"褪色，但是這尚不是一致性的發(fā)現(xiàn)，而且還沒(méi)有關(guān)于色素沉著的報(bào)道。也不能排除其它激酶(例如，PDGF)的作用。使用多激酶抑制劑和c-Kit抗體對(duì)小鼠的研究表明對(duì)頭發(fā)色素沉著的抑制是完全可逆的，這說(shuō)明c-Kit抑制影響黑素細(xì)胞的功能，但在出生后的環(huán)境中不會(huì)一直保留(Moss等人，2003)。連續(xù)4周，每周施用一次劑量范圍為3至30mg/Kg的SR-1以研究測(cè)定抑制造血作用、精子發(fā)生和活躍黑素生成所需的暴露量。對(duì)取自研究開(kāi)始后基線(xiàn)期、第4、7、14、21和28天的血樣進(jìn)行包括細(xì)胞分類(lèi)在內(nèi)的全面血液檢查。在QueenElizabethHospitalClinicalHematologylab,Barbados對(duì)新分離的血樣進(jìn)行分析。雖然在給藥起4周后的藥物處理動(dòng)物中存在不顯著的RBC減少，但在所分析的血液學(xué)參數(shù)中沒(méi)有檢測(cè)出相對(duì)于對(duì)照受試者和基底值的SR-1的顯著影響。在最高測(cè)試劑量(連續(xù)4周，每周一次，30mg/Kg)達(dá)到了大于UT-7IC50效力70,000倍的暴露水平。對(duì)血液學(xué)參數(shù)沒(méi)有顯著影響得到了骨髓組織病理學(xué)分析的驗(yàn)證，其中在骨髓組織病理學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)藥物處理組和對(duì)照組沒(méi)有差別，也沒(méi)有CD117陽(yáng)性造血干細(xì)胞的消除，這說(shuō)明NHP種非洲綠猴中存在潛在冗余的造血途徑。由于可能用于黑素瘤的治療，還測(cè)試了每周一次，持續(xù)四周施用3-30m!3k對(duì)黑素生成的影響。除去毛發(fā)以激發(fā)黑素形成，從而評(píng)估活化黑素細(xì)胞的功能，其中所述活化黑素細(xì)胞可較好地反應(yīng)疾病的狀態(tài)。各組正常毛發(fā)表層的顏色沒(méi)有受到可見(jiàn)的影響。然而，在接受30mg/Kg劑量的猴的新生毛發(fā)中觀(guān)察到可見(jiàn)程度的毛發(fā)著色抑制。未觀(guān)察到10mg/Kg組的影響表明沒(méi)有影響的劑量范圍在10-30mg/Kg之間。在10mg/Kg組中，SR-1的暴露大于UT-7IC50的8,000倍。在大于UT-7IC50的7倍時(shí)達(dá)到最大肥大細(xì)胞消除效力。這些數(shù)據(jù)表明c-Kit抑制影響黑素細(xì)胞功能，并且可能需要較高劑量/暴露以阻斷表征為過(guò)高黑素細(xì)胞活性的疾病。精子發(fā)生現(xiàn)已在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)c-Kit對(duì)于分化的c-Kit受體陽(yáng)性精原細(xì)胞的維持和增殖非常重要，但是對(duì)于精原細(xì)胞分化的起始步驟并不重要。均為非活性c-Kit受體等位基因雜合子的男性和女性斑駁病受試者是可生育的，這說(shuō)明這種程度的c-Kit失活似乎不影響原始生殖細(xì)胞的發(fā)育、精子發(fā)生或卵子發(fā)生。SR-1在0.3-30mg/Kg時(shí)對(duì)精子發(fā)生顯示出劑量依賴(lài)性抑制。每周一次0.3mg/Kg劑量的效力低于在較高劑量下觀(guān)察到的最大效力，并且需要關(guān)于較低劑量范圍的研究以確定ED50。所達(dá)到的暴露為UT-7IC50的7倍，這是傷口模型中肥大細(xì)胞擴(kuò)增的最大效力所需要的暴露。PK外推法表明抗體很可能在最后一次給藥1個(gè)月后被清除，但選擇9個(gè)月作為評(píng)估康復(fù)的保守性時(shí)間點(diǎn)。9個(gè)月時(shí)，所有給藥的動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)正常的精子發(fā)生，這說(shuō)明類(lèi)hSR-lalgGl分子作為男性避孕藥是有用的。心5r人源化抗c-Kit脫糖基化IgGl(hSR-lalgGl)抗體是高效價(jià)的特異性抗體，并且在使用近端末梢讀取c-Kit信號(hào)的所有基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中起中和作用。本質(zhì)上講，hSR-lalgGl不介導(dǎo)c-Kit受體內(nèi)化或磷酸化，這與關(guān)于親本鼠SR-1單克隆抗體的報(bào)道不同?；跇?biāo)準(zhǔn)方法尚不能預(yù)知在人源化IgGl、IgG2和IgG4亞型中選擇脫糖基化IgGl亞型的方法。通過(guò)新實(shí)驗(yàn)靠經(jīng)驗(yàn)選擇的hSR-lalgGl顯示出對(duì)膜c-Kit受體的合適的藥理學(xué)性質(zhì)，避免激發(fā)c-Kit和肥大細(xì)胞的活性，缺乏通過(guò)旁效應(yīng)引發(fā)的效應(yīng)器功能和細(xì)胞殺傷作用。此抗體顯示出優(yōu)良的皮下注射的生物利用度和半衰期、非線(xiàn)性PK和可飽和目標(biāo)介導(dǎo)的抗體清除作用，并在猴體內(nèi)消除肥大細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)可預(yù)測(cè)出適合消除人類(lèi)肥大細(xì)胞的有效量。親本鼠SR-1單抗在猴傷口PD模型中的最小有效劑量小于0.3mg/Kg(Ctrough>細(xì)胞IC50的7倍)，并且在稍高的暴露(Ctough>細(xì)胞IC50的800倍)下可有效消除皮膚、結(jié)腸和肺基底肥大細(xì)胞。相似地，需要使暴露水平大于細(xì)胞IC508,000倍，才能觀(guān)察到其對(duì)新生毛發(fā)中色素沉著的定性影響。現(xiàn)已報(bào)道多激酶抑制劑和c-Kit抗體可抑制嚙齒動(dòng)物新生毛發(fā)的色素沉著，而hSR-lalgGl可用于與過(guò)高黑素細(xì)胞活性相關(guān)的疾病。此作用在治療停止后是可逆的。抑制精子發(fā)生的次最大作用發(fā)生在暴露水平大于細(xì)胞IC50的7倍的水平，此暴露水平在傷口PD模型中顯示最大效力。本說(shuō)明書(shū)提到和/或列出于申請(qǐng)數(shù)據(jù)頁(yè)的所有上述美國(guó)專(zhuān)利、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)、外國(guó)專(zhuān)利、外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)和非專(zhuān)利公開(kāi)均以其全文并入本文作為參考。由上文可知，盡管本文為了解釋說(shuō)明描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是可進(jìn)行多種改進(jìn)而不脫離本發(fā)明的內(nèi)涵和外延。5權(quán)利要求1.與c-Kit特異性結(jié)合的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo2所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:2所示可變區(qū)氨基酸序列具有至少95%或更高同一性的氨基酸序列。3.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:2所示可變區(qū)氨基酸序列具有至少98%或更高同一性的氨基酸序列。4.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合劑，其還包含SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。5.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑的互補(bǔ)決定區(qū)中至少有一個(gè)保守氨基酸取代，其中所述結(jié)合劑對(duì)c-Kit的親和力得到了保留。6.如權(quán)利要求5所述的結(jié)合劑，其中存在一個(gè)保守氨基酸取代。7.與c-Kit特異性結(jié)合的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:4所示氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。8.如權(quán)利要求7所述的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:4所示可變區(qū)氨基酸序列具有至少95%或更高同一性的氨基酸序列。9.如權(quán)利要求7所述的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:4所示可變區(qū)氨基酸序列具有至少98%或更高同一性的氨基酸序列。10.如權(quán)利要求7所述的結(jié)合劑，其還包含SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。11.如權(quán)利要求7所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑的互補(bǔ)決定區(qū)中至少有一個(gè)保守氨基酸取代，其中所述結(jié)合劑對(duì)c-Kit的親和力得到了保留。12.如權(quán)利要求ll所述的結(jié)合劑，其中存在一個(gè)保守氨基酸取代。13.與c-Kit特異性結(jié)合的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:6所示氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。14.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:6所示可變區(qū)氨基酸序列具有至少95%或更高同一性的氨基酸序列。15.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑，其包含與SEQIDNo:6所示可變區(qū)氨基酸序列具有至少98%或更高同一性的氨基酸序列。16.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑，其還包含SEQIDNo:2所示的氨基酸序列。17.如權(quán)利要求13所述的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑的互補(bǔ)決定區(qū)中至少有一個(gè)保守氨基酸取代，其中所述結(jié)合劑對(duì)c-Kit的親和力得到了保留。18.如權(quán)利要求17所述的結(jié)合劑，其中存在一個(gè)保守氨基酸取代。19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑，其通過(guò)表面等離子共振分析測(cè)定，所述結(jié)合劑顯示出的對(duì)c-Kit的親和力b小于10—2。20.編碼結(jié)合c-Kit的特異性結(jié)合劑的核酸，其中所述特異性結(jié)合劑包含與選自SEQIDNo:2、4或6組成的組中的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。21.核酸，其包含的核酸序列與選自SEQIDNo:1、3或5所示核酸序列具有至少90%的同一性。22.載體，其包含權(quán)利要求20或21所述的核酸。23.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求22所述的載體。24.制備c-Kit特異性結(jié)合劑的方法，其包含培養(yǎng)如權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述核酸以產(chǎn)生所述特異性結(jié)合劑。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其進(jìn)一步包含從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述特異性結(jié)合劑的步驟。26.緩解或治療受試者與纖維化、炎癥、自身免疫或癌癥相關(guān)的c-Kit疾病或病變的方法，其包含給受試者施用治療有效量的c-Kit抗體。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述病變或疾病為纖維化。28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述拮抗劑抗體選自以下組成的組人類(lèi)抗體、人源化抗體、單鏈抗體或抗體片段。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述肽或多肽結(jié)合劑、可溶性受體或可溶性異源二聚體受體還包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域。30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述纖維化病變選自以下組成的組:硬皮病、間質(zhì)性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、慢性乙型肝炎或丙型肝炎引起的纖維化、輻射誘導(dǎo)的纖維化和傷口愈合引起的纖維化。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其進(jìn)一步包含施用促纖維化細(xì)胞因子的第二拮抗劑，其中所述細(xì)胞因子選自轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P(TGF-p)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-9(IL-9)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、白細(xì)胞介素-ip(IL-ip)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、抑瘤素M(OSM)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(CCL2/MCP-1)和肺部活化調(diào)節(jié)趨化因子(CCL18/PARC)。32.用于緩解或預(yù)防患有纖維化病變的受試者纖維化的藥物組合物，其包含治療有效量的如權(quán)利要求1所述的成分。全文摘要本發(fā)明涉及治療如纖維化的c-Kit相關(guān)病癥的組合物和方法，更具體地，涉及包含人源化c-Kit抗體的組合物。文檔編號(hào)C07K16/28GK101472949SQ200780020054公開(kāi)日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年4月24日優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日發(fā)明者戈登·吳,沈文彥申請(qǐng)人:安姆根有限公司