專利名稱：：豬仔笠類黃酮提取物及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及豬仔笠類黃酮提取物及其制備方法和應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬仔笠屬名五n》se7wacto7eraeFog，為豆科毛瓣花屬植物，約100種，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。據(jù)《中藥大詞典》記載豬仔笠塊根入藥，具有清熱解毒、生熱煩渴、化痰潤(rùn)肺、止咳之功效，而且是治療傷風(fēng)咳嗽、止呼吸道感染、發(fā)熱煩渴、痢疾、跌打損傷等疾病的珍稀名貴中草藥。豬仔笠主要用于治療咳嗽、哮喘，療效顯著，安全可靠，價(jià)廉而方便，是一種良好的中草藥資源，值得開發(fā)研究和推廣運(yùn)用。豬仔笠雖然已在民間應(yīng)用較廣，但對(duì)豬仔笠的有效成分以及生物活性的研究未見(jiàn)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，豬仔笠的臨床用藥機(jī)理尚不明確，僅憑經(jīng)驗(yàn)，這就限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍而沒(méi)有得到充分有效的開發(fā)利用。同時(shí)，由于其主要活性成分不明，就無(wú)法對(duì)豬仔笠的有效成分進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行有效控制和道地藥材進(jìn)行權(quán)威鑒定。在中藥的諸多研究中，對(duì)活性成分、藥理作用和藥效與成分關(guān)系的研究較少，所以無(wú)法闡明中藥治療疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理等重要科學(xué)問(wèn)題，也無(wú)法為尋找新藥物或合成新藥提供先導(dǎo)物或結(jié)構(gòu)母核，無(wú)法提升中藥新藥研究方法和技術(shù)水平。因此深入、系統(tǒng)和有效地分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及活性的追蹤驗(yàn)證是開展和加強(qiáng)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理系統(tǒng)研究的必然。而在傳統(tǒng)的分離技術(shù)基礎(chǔ)之上，積極探索和應(yīng)用新的分離方法和技術(shù)是加速中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì)。開展對(duì)豬仔笠藥理活性成分的研究，掌握豬仔笠被廣泛用于治療咳鰍、化痰的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可為豬仔笠治療咳嗽、化痰的藥理研究和臨床應(yīng)用提供參考，為探索該屬植物的活性成分及其化學(xué)分類學(xué)方面提供借鑒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種豬仔笠類黃酮提取物及其提取方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的豬仔笠類黃酮提取物，其分子量為436，分子式為C26H2806，具有下述結(jié)構(gòu)的類黃酮化合物，本發(fā)明以化合物l表述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>本發(fā)明所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法為包括如下步驟1)將豬仔笠塊根粉碎，用乙醇回流提取獲得乙醇提取液，將乙醇提取液減壓濃縮得浸膏，浸膏加入水混懸，用石油醚萃取，減壓濃縮得石油醚浸膏；2)石油醚浸膏在溶劑體系為正己烷、醋酸乙酯、甲醇、水構(gòu)成的色譜條件下經(jīng)過(guò)制備型HSCCC分離，形成色譜峰形，有組分1和組分2的色譜峰，組分1經(jīng)手工收集后，本發(fā)明一般于室溫自然揮發(fā)有黃色油狀物析出；3)黃色油狀物采用展開劑為石油醚和醋酸乙酯的薄層制備，得到黃色方晶的類黃酮化合物。上述的減壓濃縮可以采用本領(lǐng)域通用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。上述步驟2)的HSCCC分離的溶劑體系(以體積比計(jì)量范圍)為正己烷醋酸乙酯甲醇水=36:36:58:24;固定相為上相；流動(dòng)相為下相；HSCCC分離流速0.54.0mLmin";轉(zhuǎn)速6001200rmin-1;固定相的保留值不低于50%。步驟l)粉碎的豬仔笠塊根，可以用50100。/。乙醇浸沒(méi)藥材且液面高出藥材約0.5lcm,在8095。C和常壓力回流提取24次，合并乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入2i5倍量的水混懸，用0.52倍水的石油醚萃取8i2次，合并上述萃取的所有石油醚萃取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。當(dāng)然優(yōu)選用95%乙醇在優(yōu)選8285t:和常壓力下回流提取三次，合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入35倍的水混懸，用0.51倍水的石油醚萃取10次，合并上述萃取的所有石油醚萃取液后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。步驟3)的展開劑為石油醚和醋酸乙酯其優(yōu)選石油醚醋酸乙酯(以體積比計(jì)量)=4:1。步驟2)所述的HSCCC分離的最佳的HSCCC溶劑體系(以體積比計(jì)量)為正己烷-醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3;固定相為上相；流動(dòng)相為下相；HSCCC分離流速2.0mL.min—1;轉(zhuǎn)速700r'min";面定相的保留值不低于50%。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明溶劑體系正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3的固定相的保留率為63.96%。本發(fā)明所述的豬仔笠類黃酮提取物，能作為防治抑菌、抗炎、止咳和化痰的藥物，以及作為制備防治金黃葡萄球菌的藥物的應(yīng)用本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本實(shí)驗(yàn)用傳統(tǒng)的溶劑回流提取方法，通過(guò)HSCCC與傳統(tǒng)的薄層層析制備相結(jié)合進(jìn)行分離純化，首次從豬仔笠藥材石油醚部位分離得到新的化合物l。本發(fā)明和傳統(tǒng)的通過(guò)溶劑萃取、反復(fù)層析的方法相比，HSCCC不僅可以大大簡(jiǎn)化諸多步驟、節(jié)約時(shí)間，且不會(huì)造成溶劑和樣品的損失，目標(biāo)產(chǎn)物能達(dá)到較高的純度。且在HSCCC操作過(guò)程中，只要調(diào)試好儀器，進(jìn)樣完畢后，后續(xù)分離過(guò)程則完全可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且分離過(guò)程可以結(jié)合紫外進(jìn)行檢測(cè)。上述特點(diǎn)顯示了HSCCC在分離、提純化合物方面的明顯優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明還研究探索出分離石油醚部位的最佳溶劑配比系統(tǒng)以體積比計(jì)量為正己垸醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3，這些溶劑體系不僅有合適的上、下相之比，合適的固定相保留值，而且對(duì)目標(biāo)成分有比較理想的分配。本發(fā)明通過(guò)對(duì)豬仔笠的提取物——化合物l研究發(fā)現(xiàn)，1)豬仔笠的提取物——化合物1對(duì)金黃葡萄球菌有較好的抑菌活性，豬仔笠的提取物——化合物1對(duì)某些菌也具有一定的抑制效果，可能含有量比較少但是活性很高的物質(zhì)。2)本發(fā)明的豬仔笠的提取物——化合物1能抑制二甲苯所致的小白鼠耳腫脹作用，具有良好的抗炎效果。3)本發(fā)明的豬仔笠的提取物——化合物l能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具有良好的鎮(zhèn)咳作用。4)本發(fā)明的豬仔笠的提取物——化合物1明顯增加小鼠氣管酚紅排泌量，表明可促進(jìn)腺體分泌，使痰液黏度下降而易于咳出，從而起到祛痰作用。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明第一部分豬仔笠石油醚萃取物的化學(xué)成分研究1實(shí)驗(yàn)儀器及材料1.1藥材豬仔笠購(gòu)自地點(diǎn)福建龍巖；鑒定福建省中醫(yī)藥研究院王振登研究員鑒定。1.2儀器微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；恒溫水浴鍋；部分收集器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(VARIAN,Cary50);AVATAR360紅外光譜儀<美國(guó)ThermoNicoier);GS20分析型高速逆流色譜儀(北京天寶物華生物技術(shù)有限公司)；GS10制備型高速逆流色譜儀(北京天寶物華生物技術(shù)有限公司)；高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent1100series);元素分析儀(德國(guó)VarioELIII);質(zhì)譜儀(美國(guó)LCQDecaXPMax);核磁共振儀(美國(guó)Unity500)。1.3試劑正己烷、醋酸乙酯、甲醇、雙蒸水、石油醚(60-90°C)均為AR級(jí)；色譜甲醇；無(wú)特別標(biāo)明均為分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)方法2.1樣品制備將豬仔笠塊根粉碎ikg,用95%乙醇浸沒(méi)藥材且液面高出藥材約1cm,在8285。C和常壓力回流提取三次(2h，2h，2h)，合并乙醇提取液。將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏140g，加入約7001000mL的水混懸，用300500mL石油醚萃取810次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏30g。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例將豬仔笠塊根粉碎1kg，用95%乙醇浸沒(méi)藥材且液面高出藥材約lcm，在優(yōu)選84。C溫度和常壓力下回流提取三次(2h，2h,2h),合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏140g,浸膏加入850毫升水混懸，用0.8倍上述水量的石油醚萃取10次，合并石油醚萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏30g。2.2HSCCC溶劑體系的選擇及樣品溶液的制備高速逆流色譜法〈High-speedCcmnterciiiTentChro-matography,簡(jiǎn)稱"HSCCC"，下同)是兩個(gè)互不混溶的溶劑逆向流動(dòng)，樣品在兩相之間分配，不用固態(tài)吸附劑的全液態(tài)色譜方法；HSCCC溶劑體系的選擇按照被分離物質(zhì)的粗略極性選擇分離體系類別，在該實(shí)驗(yàn)中，選擇弱極性的正己烷體系，同時(shí)采用薄層色譜法選擇溶劑體系的配比，首先按選定的溶劑系統(tǒng)配制一定量的兩相溶劑，各取2mL于小試管中，加入數(shù)毫克樣品，劇烈振蕩lmin后，靜置分層，用毛細(xì)管取近似等量的上下兩層溶液于TLC板上，待溶劑揮發(fā)完后用溶劑系統(tǒng)中的有機(jī)層展開，用碘缸顯色，根據(jù)斑點(diǎn)色度和面積可以觀察樣品中各組分在兩相溶劑中的分配情況，即估算分配系數(shù)的大小和差異，由此判斷溶劑系統(tǒng)的適用性，再通過(guò)分析型高速逆流確定溶劑系統(tǒng)。樣品溶液的制備將200mg石油醚粗提物溶解在2mL體積比為i/i的上下相溶劑系統(tǒng)中，用4.5ym有機(jī)系的濾膜過(guò)濾，本發(fā)明的實(shí)例中濾膜采用尼龍的濾膜，以備HSCCC進(jìn)樣。2.3HSCCC分離步驟每次分離之前，首先配制已選擇好的兩相溶劑系統(tǒng)，將其充分混合后靜置分層。在使用前將兩相分離，先用恒流泵將上述選定溶劑體系的上相打入HSCCC的柱內(nèi)(總體積為V)，直至注滿整個(gè)管子。然后開啟HSCCC，轉(zhuǎn)速為700r'min'1，同時(shí)流動(dòng)相以2.0mLmin—1的流速打入HSCCC，等到聚四氟乙烯管尾端流出流動(dòng)相后，表明HSCCC中兩相已達(dá)到平衡，收集柱尾端流出的固定相體積V!,通過(guò)六通閥將樣品注入HSCCC，流動(dòng)相流出端紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為254nm。根據(jù)色譜圖手工收集各色譜峰組分。分離結(jié)束后，用氮?dú)鈱上嗳軇木鬯姆蚁┞菪苤袥_出，測(cè)定固定相的保留值(SF)SF-V-V,/VX1000/。。2.4各個(gè)組分的純度分析豬仔笠石油醚粗提物經(jīng)HSCCC分離得到的各組分通過(guò)HPLC進(jìn)行純度分析。2.5各個(gè)組分的結(jié)構(gòu)鑒定分離得到的化合物通過(guò)元素分析、MS、IR、UV、NMR等波譜學(xué)方法進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)鑒定。3結(jié)果與分析3.1HSCCC溶劑體系按"2.2"項(xiàng)下方法篩選，最后得到較佳的溶劑體系(以體積比計(jì)量)正己垸醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3。在下述最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)溶劑體系正己烷醋酸乙酯甲醇水(5:5:7:3);固定相上相；流動(dòng)相下相；流速1.0mLHlin";轉(zhuǎn)速1200r'min'1，獲得石油醚萃取物的分離，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出有4個(gè)峰，其中后面2個(gè)峰分離度比較好，達(dá)到基線分離。3.2HSCCC分離結(jié)果實(shí)驗(yàn)條件為溶劑體系(以體積比計(jì)量)正己烷醋酸乙酯甲醇水(5:5:7:3);固定相上相；流動(dòng)相下相；流速2.0mL.min";轉(zhuǎn)速700rmin"，200mg石油醚萃取物在一定色譜條件(溶劑體系正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3)下經(jīng)過(guò)制備型HSCCC分離，形成色譜峰形，有組分1和組分2的色譜峰，組分i經(jīng)手工收集后，于室溫自然揮發(fā)有黃色油狀物析出，黃色油狀物經(jīng)薄層制備，展開劑為石油醚醋酸乙酯(以體積比計(jì)量)=4:1，得到黃色方晶(乙醇液中)，得到29mg化合物l;組分2經(jīng)手工收集后，于室溫自然揮發(fā)有淡黃色針狀結(jié)晶析出，得到4mg化合物2。33固定相保留值固定相保留值對(duì)分離效果影響很大，保留值越大，分離效果越好。影響固定相保留值的因素很多，包括溶劑系統(tǒng)本身的特點(diǎn)、流動(dòng)相流速、HSCCC儀器的工作性能等。為保證分離效果，固定相的保留值不能低于50%。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定溶劑體系(以體積比計(jì)量)正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3的固定相的保留率為63.96%。3.4HSCCC逆流分離組分的純度在3.2中HSCCC分離所得化合物1在HPLC色譜測(cè)定條件:水/乙腈以起始比例85:15，75min后為80:20，10min后為60:40,20min后為50:50，30min為40:60，40min后為20:80，45min后為10:90，柱溫30°C，流速1mLmin-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254歸的條件下分析顯示HPLC圖譜為單一峰，且峰形對(duì)稱，表明為純一組分，可進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析；化合物2在HPLC色譜測(cè)定條件水/乙腈以起始比例80:20,25min后為60:40，30min后為50:50，33min為40:60，35min后為20:80，40min后為10:90，柱溫30°C，流速1mLmin-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm的條件下分析顯示HPLC圖譜為單一峰，且峰形對(duì)稱，也表明為純一組分，可進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。3.5化合物l的結(jié)構(gòu)3.5.1化合物l的紫外吸收光譜根據(jù)化合物1的紫外光譜判斷，屬于類黃酮化合物，因分子中存在桂皮酰基及苯甲?；M成的交叉共軛體系，故其在200400nm的區(qū)域內(nèi)存在兩個(gè)主要的紫外吸收帶，稱為峰帶I(300400nm)及峰帶II(220280nm)。根據(jù)化合物1的紫外光譜，有2個(gè)主要的吸收帶，出現(xiàn)在帶I(300400nm)及帶H(220280證)之間，說(shuō)明化合物1可能是類黃酮化合物。3.5.2化合物1的紅外吸收光譜根據(jù)化合物l的紅外光譜將主要峰歸屬如下3466cm"附近的強(qiáng)寬吸收峰，表明有多個(gè)羥基所形成的相互結(jié)合的氫鍵所致，1659cm"為黃酮的羰基吸收峰，1630cm—、1588cm"的吸收峰顯示有苯環(huán)存在，833cm"為苯中C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰，2961cm"吸收峰表明有甲基存在，2923cm"吸收峰表明有亞甲基存在，2840cnT1吸收峰表明苯環(huán)上有甲氧基，1255cm"吸收峰顯示有醚結(jié)構(gòu)存在?？梢猿醪脚袛嗷衔飈為類黃酮化合物。3.5.3化合物1的元素組成和質(zhì)譜分析結(jié)果元素分析測(cè)定值N:<0.30%，C:71.29%，H:6.61%;由化合物1的質(zhì)譜圖顯示結(jié)果推斷化合物1的分子量為436，結(jié)合元素分析，推斷化合物l的分子式為C26H2806。3.5.4化合物1的核磁共振氫譜和碳譜化合物l的1H-NMR(400MHZ,CDCB)和13C-NMR(100MHZ,CDCi3)的數(shù)據(jù)如下^-NMR(400MHZ,CDCl3)5ppm:3.85(3H，s，5-OCH3)，1.45-1.64(12H，s，4CH3)，3.17(2H,d,r'腳2H),5.13(lH,t,2"'-lH),4.49(lH，d，3-H),5.01(lH,d，2-H),5.53(lH,d,3"-H),6.63(lH，d，4"-H),U.40(lH，s,4'陽(yáng)OH),7.47(2H,d，2'，6'-H),6.98(2H，d,3',5'-H)。13C-NMR(100MHZ，CDC13)Sppm:196.26(C隱4),160.69(C-9),160.16(C-7),159.35(C-5),155.94(C-4')，131.37(C-2"),128.73(C-3'")，126.43(C-2',6')，126.18(C國(guó)1'),122.12(C-2'"),H5.43(C-3'，5'),114.15(C-4")，113.84(C-3")，109.25(C-10)，103.12(C-8),100.27(C-6),82.82(C-3),72.53(C-2)，55.35(-OCH3)，17.88(C-l'"),21.28(C隱4'"),25.82(C-5"')，28.39(C-2"-Me2)。從氫譜和碳譜可知，所有的氫信號(hào)和碳信號(hào)都有合理的歸宿，再結(jié)合紫外圖譜、紅外圖譜、質(zhì)譜和元素分析，可知化合物1的結(jié)構(gòu)式如下所示，是首次從該豬仔笠植物分離出的一種新的類黃酮化合物。本發(fā)明采用分離、純化的新手段HSCCC分離來(lái)分離純化豬仔笠石油醚部位的化學(xué)成分。HSCCC利用多層螺旋管行星式運(yùn)動(dòng)形成特殊的離心力矢量場(chǎng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)兩溶劑相在管柱里的單向性流體動(dòng)力學(xué)分布狀態(tài)，在這種情況下，可以保證流動(dòng)相高速穿過(guò)管柱時(shí)固定相在管柱里的保留百分率達(dá)50%以上，同時(shí)大大促進(jìn)了兩相間的充分混合和逆流傳遞。這種體系由于能夠采用多樣的體系條件和操作方式，對(duì)從天然產(chǎn)物粗提物中分離提取不同特性的有效成分提供了良好的條件，因而，更符合分離分析和制備純化工作的需要。HSCCC溶劑體系的選擇對(duì)于HSCCC十分關(guān)鍵，同對(duì)也是最難解決的問(wèn)題，溶劑選擇的困難制約了逆流色譜的應(yīng)用。通常，兩相溶劑體系應(yīng)滿足以下要求(1)不造成樣品的分解或變性；(2)足夠高的樣品溶解度；(3)上-下兩相的體積大致相等，以免浪費(fèi)溶劑；〈4)樣品在溶劑系統(tǒng)中合適的分配系數(shù)值；〈5)溶劑體系的分層對(duì)間小于30s，使固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留。一般來(lái)說(shuō)，前三點(diǎn)可以較簡(jiǎn)便地進(jìn)行判斷，后兩點(diǎn)對(duì)高速逆流色譜儀顯得特別重要，需要經(jīng)過(guò)測(cè)定或?qū)嶒?yàn)判斷。測(cè)定方法包括TLC、HPLC和分析型HSCCC法等。TLC法的準(zhǔn)確度較低，但方便、快速，可以對(duì)溶劑系統(tǒng)的適用性作出便捷的初步判斷。根據(jù)斑點(diǎn)色度可以觀察樣品中各組分的相對(duì)含量及其在兩相溶劑中的分配情況，即估計(jì)分配系數(shù)的大小及差異，由此可以確定溶劑系統(tǒng)的適用性及各組分的流出順序。因此本實(shí)驗(yàn)采用TLC法，但TLC法只能對(duì)溶劑系統(tǒng)的適用性作出初步的判斷，對(duì)分配系數(shù)作大致的估算，在缺乏經(jīng)驗(yàn)的情況下，很難據(jù)此把握溶劑系統(tǒng)用于逆流色譜分離的可行性。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TLC法檢測(cè)到溶劑的上、下相均有目標(biāo)產(chǎn)物后，再通過(guò)分析型HSCCC法篩選最佳的溶劑系統(tǒng)。結(jié)果表明1.溶劑體系的選擇是HSCXX分離中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，溶劑體系選擇的合適與否，直接關(guān)系到分離結(jié)果得好壞。石油醚部位的極性較弱，因此應(yīng)選用弱極性體系。正己垸/醋酸乙酯/甲醇/水是已被廣泛應(yīng)用的溶劑分離系統(tǒng)之一，主要應(yīng)用于弱極性物質(zhì)的分離。在溶劑體系中，正己烷和水分別成為兩相，再根據(jù)需要加入甲醇、醋酸乙酯來(lái)調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達(dá)到好的分離效果。對(duì)于正己烷/醋酸乙酯/甲醇/水的體系，若目標(biāo)組分易溶于該體系的上相，增加甲醇水的含量，可將目標(biāo)組分拉向下相。反之，則可降低甲醇的比例。原因在于當(dāng)甲醇的量增加時(shí)，其一方面可以減小水相的極性，同時(shí)又可增加有機(jī)相的l及性,可以9達(dá)到改變待分離成分在兩相中的分配系數(shù)的目的。本發(fā)明研究探索出分離石油醚部位的最佳溶劑系統(tǒng)(以體積比計(jì)量)為正己烷醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3，這些溶劑體系不僅有合適的上、下相之比，合適的固定相保留值，而且對(duì)目標(biāo)成分有比較理想的分配。2.和傳統(tǒng)的通過(guò)溶劑萃取、反復(fù)層析的方法相比，HSCCC不僅可以大大簡(jiǎn)化諸多步驟、節(jié)約時(shí)間，且不會(huì)造成溶劑和樣品的損失，目標(biāo)產(chǎn)物能達(dá)到較高的純度。且在HSCCC操作過(guò)程中，只要調(diào)試好儀器，進(jìn)樣完畢后，后續(xù)分離過(guò)程則完全可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且分離過(guò)程可以結(jié)合紫外進(jìn)行檢測(cè)。上述特點(diǎn)顯示了HSCCC在分離、提純化合物方面的明顯優(yōu)勢(shì)。當(dāng)然，HSCCC在分離、提純化合物方面也不會(huì)是萬(wàn)能的。有的化合物由于難于選擇合適的溶劑系統(tǒng)，則不能借助HSCCC的手段分離。另有，用來(lái)進(jìn)行HSCCC分離的樣品應(yīng)盡可能使目標(biāo)成分純度提高。這樣既便于尋找合適的溶劑系統(tǒng)，又可有效地提高分離效果。因此，HSCCC在應(yīng)用于化學(xué)成分的分離提純時(shí)，應(yīng)盡可能與其它常用的分離方法互補(bǔ)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)用傳統(tǒng)的溶劑回流提取方法，通過(guò)HSCCC與傳統(tǒng)的薄層層析制備相結(jié)合進(jìn)行分離純化，首次從該藥材石油醚部位分離得到2種新的化合物，其中豬仔笠的提取物——化合物1是本發(fā)明保護(hù)的物質(zhì)。第二部分豬仔笠的提取物——化合物1生物活性的研究1實(shí)驗(yàn)儀器及材料1.1藥材豬仔笠購(gòu)自地點(diǎn)福建龍巖；鑒定福建省中醫(yī)藥研究院王振登研究員鑒定。豬仔笠的提取物——化合物1由本發(fā)明的第一部分實(shí)驗(yàn)獲得。1.2儀器紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(VARIAN,Cary50);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BS210S型微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；電熱干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海國(guó)華儀器設(shè)備有限公司)；超低溫冰箱(Sanyo);超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL—16G高速冷凍離心機(jī)(上海安亭儀器廠)；低速大容量離心機(jī)(上海安亭儀器廠)；蒸餾水器(上海亞榮生化儀器廠)；SSB—1超凈工作臺(tái)(上海凈化設(shè)備廠)。1.3試劑細(xì)菌菌株金黃色葡萄球菌(GIM1.55)、大腸桿菌(GIM1.115)、傷寒沙門氏菌(ATCC6539)、枯草芽抱桿菌(0901)，由福建農(nóng)林大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；普通瓊脂培養(yǎng)基(醫(yī)用)，新華中速濾紙，紅霉素，復(fù)方甘草口服溶液(廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠)；氨水(25%28%);地塞米松磷酸鈉(福建三愛(ài)藥業(yè)有限公司)；鼢紅；石油醚(AR，沸程60-90°C)、無(wú)水乙醇(AR)、NaOH、NaCl、NHUC1均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，平均體重為(1822g)，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2實(shí)驗(yàn)方法2.1豬仔笠的提取物——化合物1抑菌活性的研究2.1.1檢測(cè)菌懸液的制備將檢測(cè)菌接至斜面，37'C培養(yǎng)24h，用震蕩器將菌苔在生理鹽水(已滅菌)中震蕩分散，并用瓊脂培養(yǎng)基將其稀釋到所需的OD值。2丄2濾紙片法測(cè)定抑菌活性用打孔器將濾紙片(厚約4mm)打成直徑5mm的圓片，高壓滅菌后待用。用上述制備好的菌懸液浸濕無(wú)菌棉簽后，讓棉簽在試管壁上輕輕擠壓，擠掉多余的菌懸液，用棉簽的側(cè)面而不是頂端從三個(gè)不同角度密涂平皿，每個(gè)角度相差約60°，最后沿平皿內(nèi)緣涂沫一周。取直徑6mm的滅菌濾紙片，每片滴加含量為250mgmL"的化合物1提取液20y1作為實(shí)驗(yàn)樣片，陰性對(duì)照樣片滴加20u1無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照樣片滴加20U1的lOugmL—1紅霉素溶液，50t:烘干，用無(wú)菌鑷子取出濾紙片貼在含菌平板上，并輕輕按壓使其充分接觸。置37i:恒溫培養(yǎng)18—24h。測(cè)定濾紙片的抑菌圈大小，比較抑菌效果。2丄3試管連續(xù)稀釋法根據(jù)抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取敏感菌測(cè)定各提取物對(duì)其的最低抑菌濃度。采用雙倍稀釋法，以吐溫80做為助溶劑，吐溫80的濃度為2%。取小號(hào)試管7支，編號(hào)。第l步每支管各加1mL肉湯培養(yǎng)基，然后在第1管加1mL藥液，用吸管在第i管吹吸數(shù)次，使藥液與肉湯培養(yǎng)基混勻，取出1mL加于第2管，混均取出1mL加于第3管，如此稀釋至第6管棄去lmL，第7管不加藥液作為對(duì)照。第3步每管加菌液50wl，混勻，置37'C溫箱中培養(yǎng)24h。然后從每管中取出培養(yǎng)物20lii接種于普通瓊脂平板上，再繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最高稀釋濃度為該藥液的最低抑菌濃度。平行做3次，以2次或3次相同結(jié)果為準(zhǔn)，并設(shè)立吐溫80對(duì)照和無(wú)菌水對(duì)照。因?yàn)橹兴幰罕旧淼幕鞚岷腿藶橐曈X(jué)的差異，細(xì)菌生長(zhǎng)后，使得肉眼無(wú)法觀察，或觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果易出現(xiàn)偏差，因此，再?gòu)拿恳还苤腥∨囵B(yǎng)物20lU，轉(zhuǎn)種到瓊脂平板培養(yǎng)基上，用L棒涂布，置37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h，以不生長(zhǎng)菌落的最高藥物稀釋度為該藥物對(duì)該種細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)。2.2化合物l抗炎活性的研究2.2.1供試液的制備從第一部分獲得的石油醚萃取物——化合物1以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后以水定容，配制的濃度為4.680mg'ml/(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)。2.2.2對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響將30只小白鼠隨機(jī)分成3組，每組10只；陰性對(duì)照組灌生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組按5mg'kg"經(jīng)皮下注射地塞米松磷酸鈉給藥，實(shí)驗(yàn)組灌石油醚萃取物——化合物l，每日上午給動(dòng)物喂食前給藥，給藥液體積為lOmL'kg'1，連續(xù)給藥10d。于第10d給藥lh后右耳殼滴二甲苯20ul，致炎后30min脫臼處死小鼠，用脫脂棉輕拭去左右耳殘留藥物，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為8mm的打孔器分別在兩耳同一部位打下圓耳片，電子天平稱重，求出兩耳重量差，以兩耳重量差作為炎癥腫脹程度的指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn)。2.3止咳活性的研究2.3.1供試液的制備豬仔笠的提取物——化合物1以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后以水定容，配制的濃度為4.680mg'mL"(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)。2.3.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法將30只小白鼠隨機(jī)分成3組，每組10只；陰性對(duì)照組灌生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌復(fù)方甘草口服溶液(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)，實(shí)驗(yàn)組灌豬仔笠的提取物——化合物l，每日上午給動(dòng)物喂食前灌胃給藥，給藥液體積為10mL'kg—1，連續(xù)給藥10d。2.3.3小鼠氨水引咳法本試驗(yàn)于末次給藥1h后進(jìn)行。250mL廣口瓶?jī)?nèi)放一注有80y1氨水的棉球，用裝有通氣管的塞子塞上，待氨水飽和后，將被測(cè)試的小白鼠逐個(gè)放入廣口瓶?jī)?nèi)，記錄小白鼠被放入杯內(nèi)到出現(xiàn)腹肌收縮張嘴的對(duì)間(即第一次咳嗽的時(shí)伺)以及1.5min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，觀察記錄氨水引起動(dòng)物的咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)，每測(cè)試一只動(dòng)物均要更換新的氨水棉球。2.4化痰活性的研究2.4.1供試液的制備豬仔笠的提取物——化合物1以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后以水定容，配制的濃度為4.680mg'mU1(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)酚紅曲線的繪制用分析天平準(zhǔn)確稱取一定量的酚紅，加5%碳酸氫鈉溶液溶解，配成lmL含100ug，然后順次稀釋成每毫升含酚紅0.050，0.100，0.125，0.250，0.500,1.000,1.250，2.500,5.000，10.000Ug，用分光光度計(jì)于546nm處測(cè)吸光值A(chǔ)，以酚紅劑量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.4.3氣管段酚紅法取小鼠30只，隨機(jī)分成3組，每組10只。陰性對(duì)照組灌生理鹽水，按10mL'kg"灌胃蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組按lg'kg"灌胃氯化銨，實(shí)驗(yàn)組灌豬仔笠的提取物一一化合物l，按10mLkg"灌胃，給藥每日上午給動(dòng)物喂食前灌胃給藥，連續(xù)給藥10d。末次給藥lh后，按0.5g'k^的劑量分別給每只小白鼠腹腔注射酚紅-生理鹽水，注射酚紅0.5h后，處死小白鼠，小心剝離氣管周圍結(jié)締組織，剪下從甲狀軟骨至支氣管分叉處的氣管，放入盛有2mL生理鹽水的試管中，再加0.1mL氫氧化鈉溶液(lmol'L—1)，搖勻，于546nm處測(cè)吸光值A(chǔ)。根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酚紅含量，給藥組和陰性對(duì)照組之間進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。校正酚紅含量=酚紅含量(mg)/小鼠體重(kg)化痰率(％)=(給藥組的酚紅含量/模型組的酚紅含量)xioo%3結(jié)果與分析3.1抑菌效果3丄1化合物l的抑菌效果供試樣豬仔笠的提取物——化合物1對(duì)大腸桿菌，傷寒沙門氏菌，枯草芽孢桿菌抑制作用不明顯，而對(duì)金黃葡萄球菌有一定的抑制作用外，抑菌效果見(jiàn)下表表l化合物l的抑菌效果抑菌環(huán)直徑/mm大腸桿菌傷寒沙門氏菌金黃葡萄球菌枯草芽孢桿菌豬仔笠的提取物77108紅霉素溶液17216193丄2化合物1對(duì)金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度從化合物1對(duì)金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出化合物1對(duì)金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度為20mgmL—1，最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表表2各提取物對(duì)金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表中"-"表示無(wú)菌落出現(xiàn)，"+"表示有菌落出現(xiàn)。3.2抗炎效果由表3可以看出，豬仔笠的提取物——化合物1對(duì)二甲苯所致的小鼠耳殼腫脹均有極顯著的抑制作用，與陰性對(duì)照組比較差異極顯著(PO.01)。表3豬仔笠的提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳殼腫脹的影響組別劑量(mg'kg'1)_動(dòng)物數(shù)(只)腫脹度(mg)生理鹽水^^16.77±5.90豬仔笠的提取物46.8069.16士3.62"地塞米松__^_4.16±0.32**注與陰性對(duì)照組比較，**P<0.0133止咳效果由表4可以看出，豬仔笠的提取物"化合物1能延長(zhǎng)小白鼠咳嗽潛伏期及減少每分鐘內(nèi)的咳嗽次數(shù)，與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性，豬仔笠的提取物——化合物1與陰性對(duì)照組比較差異極顯著(po.m)。表4豬仔笠的提取物對(duì)濃氨水致咳小鼠的影響_組別劑量(mg'kg—1)咳嗽潛伏期(s)1.5min內(nèi)的咳嗽次數(shù)~生理鹽水^22.83±0.7538.17±4.88豬仔笠的提取物46.80_2楊±0.89_13.67±1.37**注與生理鹽水比較，*P<0.05,**P<0.013.4化痰效果以酚紅劑量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由曲線回歸方程為y=0.1727x-0.0011;化痰實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，豬仔笠的提取物——化合物1對(duì)小白鼠具有很強(qiáng)的化痰作用，與陰性對(duì)照組比較，差異極顯著，具有較強(qiáng)的化痰活性。_表5豬仔笠的提取物對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響_組別SS酚紅含量校正酚紅含量化痰率(%)(rag*kg—')(ugm「0(ugm1/1kg—')生理鹽水-0.14±0.047.69土1.79-豬仔笠的提取物46-800.30±0、081464±2、70**186.28氯化銨1000.000.43±0.0721.10±1.16**274.53注與陰性對(duì)照組比較，**P<0.014本部分小結(jié)與討論4.1抑菌實(shí)驗(yàn)本試驗(yàn)采用濾紙片法和試管稀釋法，選用常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性代表菌，對(duì)豬仔笠的提取物"~~化合物1的抑菌活性進(jìn)行了研究。天然植物在長(zhǎng)期的自然選擇過(guò)程中，形成了一套精細(xì)的抗菌防御系統(tǒng)，表現(xiàn)為抗菌成分豐富多樣，如揮發(fā)油、脂溶性色素、類黃酮化合物、皂武、多酚類化合物和生物堿等。植物體外抑菌作用的強(qiáng)弱與提取物的成分和濃度有密切關(guān)系，大多數(shù)植物粗提物濃縮到較高的生藥濃度對(duì)，往往變得粘稠，這種提取物成分復(fù)雜，常含有多種抗菌或抑菌成分，也有多糖、淀粉、樹脂、蛋白質(zhì)等無(wú)抑菌作用的成分，無(wú)抑菌作用的成分往往會(huì)影響抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)利用萃取將豬仔笠的萃取物進(jìn)行分段分離，得到豬仔笠的提取物——化合物i，再進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，使得有抑菌或殺菌活性的成分更加集中，用量少，效果更明顯。通過(guò)對(duì)豬仔笠的提取物——化合物1的體外抑菌試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，豬仔笠的提取物——化合物i對(duì)金黃葡萄球菌有較好的抑菌活性，豬仔笠的提取物——化合物1對(duì)某些菌也具有一定的抑制效果，含有量比較少但是活性很高的物質(zhì)。4.2抗炎實(shí)驗(yàn)隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到各種炎癥的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)抗炎藥物成了藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。而目前抗炎藥物主要來(lái)源于副作用大的化學(xué)藥物，而中藥在抗炎藥物的研究中，因其藥效好，不良反應(yīng)少以及來(lái)源豐富等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的重視，研究和開發(fā)具有抗炎活性成分的中藥也逐漸成為熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用常用的炎癥模型對(duì)其進(jìn)行研究，以期從中找到具有抗炎作用的組分應(yīng)用于臨床。在以血管通透性為主要改變的急性炎癥模型實(shí)驗(yàn)中，豬仔笠的提取物——化合物1能抑制二甲苯所致的小白鼠耳腫脹作用，具有較好的抗炎作用。4.3止咳實(shí)驗(yàn)咳嗽是上呼吸道一種重要的保護(hù)性反射，是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見(jiàn)癥狀。有研究表明，咳嗽的產(chǎn)生主要與RARs受體和C-纖維受體接受刺激有關(guān)，RARs受體主要對(duì)機(jī)械剌激敏感，而C-纖維受體則主要對(duì)化學(xué)刺激敏感，如辣椒素、枸櫞酸等。在動(dòng)物身上，咳嗽可由機(jī)械、化學(xué)刺激和電刺激氣管粘膜、迷走神經(jīng)而產(chǎn)生，其中以化學(xué)和機(jī)械刺激最接近正常生理情況。所以本實(shí)驗(yàn)采用以化學(xué)刺激引咳來(lái)考察藥物的鎮(zhèn)咳作用。豬仔笠的提取物——化合物1能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具有良好的鎮(zhèn)咳作用。4.4化痰實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用酚紅氣管排泄法，利用酚紅至小鼠注射后可從氣管排泄的特點(diǎn)，測(cè)定氣管酚紅的排泄量，以判斷受試藥物對(duì)氣管分泌液量的影響。此法簡(jiǎn)便，但用強(qiáng)堿洗出氣管內(nèi)酚紅能損傷氣管粘膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豬仔笠的提取物——化合物1明顯增加小鼠氣管酚紅排泌量，表明可促進(jìn)腺體分泌，使痰液黏度下降而易于咳出，從而起到祛痰作用。1權(quán)利要求1、一種豬仔笠類黃酮提取物，其分子量為436，分子式為C26H28O6，具有下述結(jié)構(gòu)的類黃酮化合物2、權(quán)利要求1自的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，包括如下步驟1)將豬仔笠塊根粉碎，用乙醇回流提取獲得乙醇提取液，將乙醇提取液減壓濃縮得浸膏，浸膏加入水混懸，用石油醚萃取得石油醚萃取液，石油醚萃取液減壓濃縮得石油醚浸膏；2)石油醚浸膏在溶劑體系為正己垸、醋酸乙酯、甲醇、水構(gòu)成的色譜條件下經(jīng)過(guò)制備型HSCCC分離，形成色譜峰形，有組分1和組分2的色譜峰，組分l經(jīng)手工收集后，有黃色油狀物析出；3)黃色油狀物采用展開劑為石油醚和醋酸乙酯的薄層制備，得到黃色方晶的類黃酮化合物。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于所述的HSCCC分離的HSCCC溶劑體系以體積比計(jì)量范圍為正己烷醋酸乙酯甲醇水二36:36:58:24;周定相為上相；流動(dòng)相為下相；HSCCC分離流速0.54.0mLniin";轉(zhuǎn)速6001200r*min";固定相的保留值不低于50%。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于用50HKF/。乙醇浸沒(méi)藥材且液面高出藥材0.5lem，在8095。C和常壓力下回流提取24次，合并乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入215倍量的水混懸，用0.52倍水的石油醚萃取512次，把合并512次萃取得到的石油醚萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。5、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于展開劑為石油醚和醋酸乙酯，所述的石油醚與醋酸乙酯以體積比計(jì)量為4比1。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于所述的HSCCC分離的HSCCC溶劑體系以體積比計(jì)量為正己垸醋酸乙酯甲醇水=5:5:7:3;固定相為上相；流動(dòng)相為下相；HSCCC分離流速2.0mL'min";轉(zhuǎn)速700r'min-、固定相的保留值不低于50%。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬仔笠類黃酮提取物的提取方法，其特征在于用9095%乙醇在8285。C和常壓力下回流提取三次，合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入35倍的水混懸，用0.51倍水的石油醚萃取810次，合并上述萃取得到的石油醚萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得石油醚浸膏。8、權(quán)利要求1所述的豬仔笠類黃酮提取物，在制備抑菌、抗炎、止咳和化痰的藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求1所述的豬仔笠類黃酮提取物，在制備防治金黃葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬仔笠類黃酮提取物及其提取方法和應(yīng)用，該豬仔笠類黃酮提取物其結(jié)構(gòu)如右，本發(fā)明用傳統(tǒng)的溶劑回流提取方法，通過(guò)HSCCC與傳統(tǒng)的薄層層析制備相結(jié)合進(jìn)行分離純化，首次從豬仔笠藥材石油醚部位分離得到新的化合物之一。本發(fā)明的豬仔笠類黃酮提取物具有抑菌、抗炎、止咳和化痰作用。文檔編號(hào)A61P31/04GK101671344SQ20091011241公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2009年8月24日優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日發(fā)明者李凌峰,李宇翔,李清祿,黃美玲申請(qǐng)人:李清祿