專利名稱：：二咖啡?？鼘幩岬男掠猛镜闹谱鞣椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及二咖啡酰奎寧酸的新用途，具體地，是在制備腦神經(jīng)保護(hù)劑的藥物中的用途，屬醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：中風(fēng)病又名卒中，是以突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、言語(yǔ)蹇澀或不語(yǔ)、偏身麻木為主癥，并具有起病急、變化快的特點(diǎn)，好發(fā)于中老年的一種疾病，是中老年人的常見多發(fā)病，嚴(yán)重威脅著人類的生存和健康。本病相當(dāng)于西醫(yī)學(xué)的缺血性腦血管病(IschemicCerebralvascularDisease,ICVD)，亦稱缺血性卒中，具有較高的病死率及致殘率，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命安全(饒明俐，林世和.腦血管疾病.人民衛(wèi)生出版社，2002.172)。作為一種常見病、多發(fā)病，ICVD尤其是局限性腦梗死已經(jīng)與心臟病、惡性腫瘤并列多數(shù)國(guó)家的三大致死疾病。流行病學(xué)調(diào)査發(fā)現(xiàn)，我國(guó)屬于該病高發(fā)地區(qū)之一(陳捷.缺血性腦卒中的流行病'學(xué).實(shí)用心腦肺血管病雜志.2000，8(3):179181)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中風(fēng)病其病位在腦，與心、腎、肝、脾密切相關(guān)，為本虛標(biāo)實(shí)之證，病因病機(jī)復(fù)雜，本虛在于肝腎不足，氣虛血少；標(biāo)實(shí)乃肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，風(fēng)火相煽，火熱內(nèi)郁，痰濕壅盛，最終導(dǎo)致痰瘀內(nèi)阻，隨氣機(jī)上逆，擾亂清空，蒙蔽清竅，成上實(shí)下虛，陰陽(yáng)不相維系之危急證候。其突然昏仆不省人事之癥狀，又可納入竅閉神昏之范疇。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中風(fēng)的證候分類中，血瘀證為主導(dǎo)地位，占中風(fēng)病的73%以上(陶根魚，杜曉泉.益氣活血法在缺血性中風(fēng)病中的地位[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，21(3):1)。缺血性中風(fēng)的病機(jī)雖然復(fù)雜，但歸結(jié)起來(lái)，主要矛盾在于瘀血阻滯。近IO年來(lái)，中、西醫(yī)界對(duì)活血化瘀法治療缺血性中風(fēng)進(jìn)行了深入的臨床及實(shí)驗(yàn)研究，活血化瘀法治療缺血性中風(fēng)病的療效已基本得到肯定，其臨床報(bào)道也較多。李祖蔑，二咖啡?？鼘幩?dicaffeoylquinicacids，DCQ)藥理實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展，醫(yī)學(xué)綜述2004年第10巻第4期，報(bào)道了，報(bào)道了二咖啡?？鼘幩崾且活愑煽鼘幩?quincacid)與數(shù)目不等的咖啡酸(caffeicacid)通過(guò)酯化反應(yīng)綜合而成的酚酸類天然成分，廣泛存在于植物界如金銀花、旋覆花、蒼耳等中藥及茶葉、山楂等果樹中。目前報(bào)道DCQ的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗纖維化、抑制平滑肌收縮、降血脂等諸多作用。如,利申請(qǐng)?zhí)?9105113.0，發(fā)明名稱1,5-二-O-咖啡?？鼘幩嵫苌锏闹苽浞椒?，公開了1，5-二-O-咖啡?？鼘幩嵫苌锏闹苽浞椒ǎ簧暾?qǐng)?zhí)?3141616.0，發(fā)明名稱燈盞花素和二咖啡酰奎寧酸藥物組合及其應(yīng)用，公開了燈盞細(xì)辛中提取的有效部位燈盞花素和二咖啡?？鼘幩峤M合及其在治療急、慢性肝病中的新用途；申請(qǐng)?zhí)?3117754.9，發(fā)明名稱燈盞細(xì)辛酚及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用，公開了燈盞細(xì)辛酚有效部位包括燈盞乙素及二咖啡酰奎寧酸的制備方法及在治療心腦血管疾病、老年癡呆疾病、防治高脂疾病的藥用中的應(yīng)用。申請(qǐng)?zhí)?6101141.6,發(fā)明名稱二咖啡酰氧基奎寧酸在制藥中的應(yīng)用，公開了3,4-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩岬闹苽浼八幬锝M合在心腦血管疾病中的應(yīng)用。申請(qǐng)?zhí)?3117753，發(fā)明名稱飛蓬酯乙及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用，公開了新咖啡酸酯類化合物飛蓬酯乙，提取分離方法及作為治療心腦血管疾病藥物。目前尚無(wú)報(bào)道二咖啡?？鼘幩嵊糜谀X神經(jīng)保護(hù)劑的用途，也沒(méi)有將1,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩岬榷Х弱？鼘幩釣樵蠁为?dú)或聯(lián)合用藥的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了二咖啡酰奎寧酸的新用途，具體地，是在制備腦神經(jīng)保護(hù)劑的藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種腦神經(jīng)保護(hù)劑藥物組合物。本發(fā)明提供了二咖啡酰奎寧酸在制備腦神經(jīng)保護(hù)劑的藥物中的用途。其中，所述的藥物是治療缺血性中風(fēng)的藥物。其中，所述的二咖啡?？鼘幩釣?，5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩幔Y(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>1，5-二咖啡?？鼘幩?，5-二咖啡?？鼘幩?，4-二咖啡?？鼘幩酧H3，5-二咖啡?？鼘幩帷１景l(fā)明提供了一種腦神經(jīng)保護(hù)劑的藥物組合物，它是由1，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、3,4-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡酰奎寧酸中的一種其一種以上混合為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔料性成分制備而成的藥劑。進(jìn)一步優(yōu)選地，它是由1，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩釣榛钚猿煞峙湮橹苽涠傻乃巹?，其重量配比為1，5-二咖啡?？鼘幩?-10份、4，5-二咖啡?？鼘幩?-10份、3，4-二細(xì)啡酰奎寧酸1-10份、3，5-二咖啡?？鼘幩?-10份。其中，所述的1，5-二咖啡酰奎寧酸和3，4-二咖啡酰奎寧酸來(lái)源于燈盞細(xì)辛Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.—Mazz.藥材，具體提取分離方法為用95呢乙醇60L，70義乙醇20L乙醇滲漉，真空減壓回收乙醇。乙酸乙酯層浸膏，常壓硅膠柱層析和反相C18柱層析反復(fù)純化可得到1，5-二咖啡?？鼘幩岷?,4-二咖啡酰奎寧酸。本發(fā)明四個(gè)化合物均為公知的化合物，可按下述文獻(xiàn)進(jìn)行提取(I.Merfort.CaffeoylquinicacidsfromflowersofarnicaMontanaandarnicachamissonis[J].Phytochemistry,1992,31(6):2111.H.Morshita.Chromatographicseparationandidentificationofnaturallyoccurringchlorogenicacidsby'Hnuclearmagneticresonacespec-troscopyandmassspectrometry[J].Chromatography,1984,315:253.BarbaranTi咖ermann，JosephHoffmann.Constituentsofchrysothamnuspaniculatus3:3，4，5—tricai"feoylquinicacidand3，4，-3，5-and4,5-dicaffeoylquinicacids[J].J.Nat.Prod,1983，46(3):578.滕榮偉，等.白花刺參中的咖啡?；鼘幩岢煞?波譜學(xué)雜志，2002，19(2):167~174)'其中，所述的制劑為注射劑、滴丸或氣霧劑。本發(fā)明還提供了藥物組合物在制治療備缺血性中風(fēng)的藥物中的用途。本發(fā)明提供的一種治療缺血性中風(fēng)的藥物組合物，可以通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)1、從燈盞細(xì)辛中提取各化合物，然后加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。2、也可以采用市售或植物來(lái)源的二咖啡?？鼘幩釣樵?，然后加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。本發(fā)明上述藥物組合可以購(gòu)自市售的商品原料，也可以按照已有文獻(xiàn)報(bào)道方法提取或制備。本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備治療缺血性中風(fēng)后遺癥、腦血管疾病的腦神經(jīng)損傷的藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)研究表明，二咖啡酰奎寧酸類成分是一類具有較好腦神經(jīng)保護(hù)的有效成分，具有促進(jìn)體外大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活和抗氧化作用，且具有一定透過(guò)血腦屏障能力；用于治療缺血性中風(fēng)藥效明確，為臨床提供了一種新的選擇。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)伊J。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l本發(fā)明化合物的制備燈盞細(xì)辛Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.藥材(去雜草)，分別用9596乙醇60L，70y。乙醇20L乙醇滲漉，真空減壓回收乙醇。乙酸乙酯層浸膏，常壓硅膠柱層析和反相C18柱層析反復(fù)純化可得到1,5-二咖啡酰奎寧酸和3，4-二咖啡?？鼘幩?。本發(fā)明四種化合物也可以來(lái)源于市售品種，如1,5-二咖啡酰奎寧酸(中山康之源生物科技有限公司)、4，5-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?石家莊巖峰醫(yī)藥科技有限公司)、3,4-二咖啡?？鼘幩嶙灾?，純度大于95%。實(shí)施例2本發(fā)明藥物注射液的制備.取1，5-二咖啡?？鼘幩?g、4，5-二咖啡?？鼘幩?g、3,4-二咖啡?？鼘幩?g、3,5-二咖啡?？鼘幩?g，氯化鈉85g，亞硫酸鈉2g，加注射用水溶解，制成10000ml，分裝成3mg/2ml/支的注射液，中間體檢測(cè)，灌封，滅菌，貼簽。實(shí)施例3本發(fā)明藥物注射液的制備取1，5-二咖啡?？鼘幩?g、4，5-二咖啡?？鼘幩?0g、3，4-二咖啡酰奎寧酸50g、3，5-二咖啡?？鼘幩?0g，氯化鈉85g，亞硫酸鈉2g，加注射用水溶解，制成10000ml，分裝成3mg/2ml/支的注射液，中間體檢測(cè)，灌封，滅菌，貼簽。實(shí)施例4本發(fā)明藥物注射液的制備取1，5-二咖啡酰奎寧酸50g、4，5-二咖啡酰奎寧酸5g、3，4-二咖啡酰奎寧酸5g、3，5-二咖啡?？鼘幩?g，氯化鈉85g，亞硫酸鈉2g,加注射用水溶解，制成10000ml，分裝成3mg/2ml/支的注射液，中間體檢測(cè)，灌封，滅菌，貼簽。以下通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步證明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物對(duì)體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活的影響本發(fā)明公開1,5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡酰奎寧酸的藥效研究結(jié)果。鋪板取96孔板，每孔加入0.1mgmL-1多聚賴氨酸50A，振蕩均勻，室溫靜置過(guò)夜，備用。，制備細(xì)胞懸液將乳鼠斷頸處死，75%酒精浸泡消毒，無(wú)菌條件分離大腦皮層組織，盡量除去腦血管膜，置入冰Hanks液中漂洗3次。將所獲組織剪成lmm3組織塊，用0.25%的胰蛋白酶+0.05%1I型膠原酶37"C下消化，30min后加入培養(yǎng)液終止消化，用75Mm細(xì)胞篩網(wǎng)濾過(guò)。將濾液1000rmin-l離心8min，棄上清液。加入完全培養(yǎng)液(900mL'l^DMEM高糖培養(yǎng)基，100mLL—1胎牛血清，L-谷氨酰胺0.45gL-1，NaHC033gL-l，HEPES4.5g*L-1，青霉素1X105UL—\鏈霉素1X105U*L—0，吸管吹打使之分散均勻制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)并調(diào)整培養(yǎng)液量使每mL含1X106個(gè)細(xì)胞。接種培養(yǎng)和藥物加入方法將細(xì)胞懸液接種于經(jīng)包被的96孔板中，每孔IOOPL培養(yǎng)24h后換液，72h后加入阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，以后每2d半量換液，第7d換液后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，分別加入各種質(zhì)量濃度梯度的各受試藥物(設(shè)5個(gè)劑量組，按一定比例稀釋)，每孔總體積200PL，同時(shí)加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)。MTT微量自動(dòng)比色法加入藥物作用ld后，每孔加入MTT液(四甲基偶氮唑鹽，5mg'mL—1)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，去上清液，PBS液漂洗2次，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150PL，充分振蕩，室溫靜置10min，用酶標(biāo)儀于492nin波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。結(jié)果表明，以上化合物均有較好的促進(jìn)體外大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活的作用。結(jié)果見表13。表13，5-DCQ和1，5-DCQ對(duì)體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活的影響(X，『6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>燈盞細(xì)辛有效成分對(duì)體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活的影響(X，<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表33，4-DCQ對(duì)體外培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活的影響(X，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1,5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩帷?，4-二咖啡酰奎寧酸透血腦屏障研究結(jié)果，結(jié)果表明，1，5-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩峥刹煌潭鹊耐高^(guò)體外血腦屏障模型。綜合以上腦神經(jīng)保護(hù)的研究結(jié)果，1，5-二咖啡酰奎寧酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幙赏高^(guò)血腦屏障發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用。試驗(yàn)例2體外血腦屏障模型建立及透血腦屏障由于血腦屏障的存在，幾乎所有大分子藥物和98%的小分子藥物都不能進(jìn)入大腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而藥物能否跨越血腦屏障并達(dá)到有效的治療濃度是至關(guān)重要的。為尋找和進(jìn)一步分析燈盞細(xì)辛腦靶向神經(jīng)保護(hù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型體外模擬血腦屏障。用高效液相色譜分析，在8h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定本發(fā)明化合物的透過(guò)率。1、材料與儀器日本島津LC-10A高效液相色譜儀，SPD-10AV紫外檢測(cè)器；SCL-10A系統(tǒng)控制器；CBL恒溫箱，N2000色譜數(shù)據(jù)工作站。氮吹儀(KL-512，北京康林科技有限責(zé)任公司)高速離心機(jī)(centrifuge5417c，印pendorf公司)超聲波清洗儀(AS10200，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)甲醇、乙腈(Fisher公司，色譜純)，實(shí)施例1的方法所述的化合物1，5-二咖啡?？鼘幩?中山康之源生物科技有限公司)、4，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?石家莊巖峰醫(yī)藥科技有限公'司)、3，4-二咖啡酰奎寧酸自制，純度大于95%。2、方法與結(jié)果2.1樣品制備選擇試漏實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的孔進(jìn)行通透性實(shí)驗(yàn)，向供池中加入1，5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩?、3,5-二咖啡酰奎寧酸、3,4-二咖啡?？黤酸(0.2mg*mL—》受池中加600叱AC培養(yǎng)液。在第0、1、2、4、8小時(shí)分別從受池中小心收集濾液各IOOuL、50nL、50nL、50uL、50yL于-20°C保存，待所有取樣結(jié)束后做樣品處理。其中O小時(shí)為空白對(duì)照，向供池內(nèi)加入的藥液為供池的起始濃度(參見圖5-1)。將各樣品氮?dú)獯蹈?37°C)，分別向其中加入甲醇，超聲處理20min，離心(5000r*min-lX10min)，取上清液，作HPLC分析供試品溶液。2.2HPLC分析色譜條件島津LC-IOA高效液相色譜儀；色譜柱:.為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，依利特SinoCh畫ODS-BP5陶(250X4.6mm)柱號(hào)E1817666,流速1mLmin—N柱溫室溫；3，5-二咖啡?？鼘幩崃鲃?dòng)相為乙腈力.6%甲酸(20:80)。檢測(cè)波長(zhǎng)為330分別精密吸取20A供試品溶液注入高效液相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)。2.3透過(guò)率計(jì)算根據(jù)HPLC測(cè)定結(jié)果，取以下公式計(jì)算透過(guò)率。A供池xV供池其中A受池為受池樣品的峰面積，A供池為供池峰面積，V受池為受池體積,V供池為供池體積。計(jì)算結(jié)果見表4。表4透體外BBBM成分透過(guò)率Tab.4ThepermeabilityofcompoundsontheinvitroBBBmodel<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述試驗(yàn)表明，4，5-DCQ、1，5-DCQ、3，5-DCQ、3，4-DCQ均能透過(guò)BBBM。其中3，5-DCQ透過(guò)BBBM的效果最佳。上述試驗(yàn)證明，本發(fā)明四個(gè)化合物均是新的透血腦屏障的腦神經(jīng)保護(hù)有效成分。權(quán)利要求1、二咖啡酰奎寧酸在制備腦神經(jīng)保護(hù)劑的藥物中的用途。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療缺血性中風(fēng)的藥物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的二咖啡?？鼘幩釣?，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩峄?，5-二咖啡?？鼘幩?，結(jié)構(gòu)如下4，5-二咖啡?？鼘幩?，4-二咖啡?？鼘幩酧H3,5-二咖啡?？鼘幩?。4、一種腦神經(jīng)保護(hù)劑的藥物組合物，其特征在于它是由1，5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩?、3，4-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡?？鼘幩嶂械囊环N或兩種以上的混合物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔料性成分制備而成的藥劑。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于它是由1,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡酰奎寧酸、3，4-二咖啡?？鼘幩?、3,5-二咖啡酰奎寧酸為活性成分配伍制備而成的藥劑，其重量配比為1，5-二咖啡?？鼘幩?-10份、4，5-二咖啡酰奎寧酸1-10份、3，4-二咖啡酰奎寧酸1-l.O份、3,5-二咖啡酰奎寧酸卜10份。6、根據(jù)權(quán)利要求4-5任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑為注射劑、滴丸或氣霧劑。7、權(quán)利要求4-5任意一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備治療缺血性中風(fēng)的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了二咖啡?？鼘幩嵩谥苽淠X神經(jīng)保護(hù)劑的藥物中的用途，該藥物可用于治療缺血性中風(fēng)。本發(fā)明還提供了一種腦神經(jīng)保護(hù)劑的藥物組合物。藥效試驗(yàn)研究表明，二咖啡?？鼘幩犷惓煞质切碌囊活惥哂休^好腦神經(jīng)保護(hù)的有效成分，具有促進(jìn)體外大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞存活和抗氧化作用，且具有一定透過(guò)血腦屏障能力。文檔編號(hào)A61K31/21GK101642450SQ200910164179公開日2010年2月10日申請(qǐng)日期2009年8月4日優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日發(fā)明者孟憲麗,藝張,靜張申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)