纖維酶輔助的芒果葉中芒果苷和槲皮素的提取方法
【專利說明】纖維酶輔助的芒果葉中芒果苷和槲皮素的提取方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明涉及天然產(chǎn)物提取與應(yīng)用研宄領(lǐng)域，具體涉及一種纖維酶輔助的芒果葉中芒 果苷和槲皮素的提取方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 芒果樹是漆樹科植物之一，普遍栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是世界上的第二大熱 帶水果；我國(guó)的臺(tái)灣、廣西、廣東、福建南部、云南南部和海南均有芒果栽培，資源十分豐富。 芒果葉含有豐富的芒果苷、異芒果苷、槲皮素、原兒茶酸、沒食子酸等多種藥物活性成分，其 具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、免疫、抗炎、保肝利膽、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌等作用。
[0003] 纖維素酶能降解植物細(xì)胞壁，提高細(xì)胞壁的通透性、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)含物的溶出與提 取，所以纖維素酶在植物活性物質(zhì)提取方面得到廣泛應(yīng)用。目前，芒果葉中黃酮類化合物提 取主要采用熱水提取法、超聲波乙醇浸提法、堿提酸沉法、超聲波提取法、微波提取法、回流 提取法，但利用纖維素酶輔助有機(jī)溶劑超聲提取芒果葉中黃酮類化合物的相關(guān)研宄還尚未 見報(bào)道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種纖維酶輔助的芒果葉中芒果苷和槲皮 素的提取方法。
[0005] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：一種纖維酶輔助的芒果葉中芒 果苷和槲皮素的提取方法，其包括如下操作步驟：
[0006] (1)將鮮芒果葉采摘后清洗，置于烘箱中烘干水分，之后進(jìn)行粉碎，過50目篩，得 干燥的芒果葉粉末，備用；
[0007] (2)稱取干燥的芒果葉粉末，并加入pH為5. 1的75 %乙醇溶液，且每克芒果葉粉 末需加入20mL的75%乙醇溶液，之后再加入6mg纖維素酶，接著于55°C下浸泡酶解70min ;
[0008] (3)浸泡后的提取體系在100W下超聲提取40min，真空抽濾，得芒果葉黃酮類物質(zhì) 粗提液；
[0009] (4)將所得芒果葉黃酮類物質(zhì)粗提液過硅膠層析柱分離純化，用不同梯度的洗 脫劑進(jìn)行梯度洗脫，各梯度洗脫劑分別依次為：體積比為1:4:0. 5:0. 5的石油醚-乙酸 乙酯-甲醇-乙酸、體積比為1:5:0.5:0.5的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-乙酸、體積比為 1:6:0. 5:0. 5的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-乙酸、體積比為1:7:0. 5:0. 5的石油醚-乙酸乙 酯-甲醇-乙酸，且每個(gè)梯度使用3倍于柱體積的洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫速率控制在ImL/ min ;分段收集，在第2個(gè)梯度洗脫階段得到芒果苷，第3個(gè)梯度洗脫階段得到槲皮素。
[0010] 進(jìn)一步地，所述步驟（2)中的75%乙醇溶液是加入鹽酸調(diào)節(jié)至pH為5. 1
[0011] 本發(fā)明的有益效果在于：提供了利用纖維素酶輔助有機(jī)溶劑超聲提取芒果葉中的 芒果苷和懈皮素的方法，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中該技術(shù)的空白，而且本發(fā)明提取方法易于操作、 成本低，還具有穩(wěn)定性好、提取率高的特點(diǎn)，能夠適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。 【【附圖說明】】
[0012] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0013] 圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0014] 圖2純化的芒果苷紫外譜圖。
[0015] 圖3純化的槲皮素紫外譜圖。
[0016] 圖4芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品紫外譜圖。
[0017] 圖5槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品紫外譜圖。
[0018] 圖6酶處理時(shí)間對(duì)芒果葉黃酮類物質(zhì)提取率的影響。
[0019] 圖7pH值對(duì)芒果葉黃酮類物質(zhì)提取率的影響。
[0020] 圖8纖維素酶用量對(duì)芒果葉黃酮類物質(zhì)提取率的影響。
[0021] 圖9乙醇濃度對(duì)芒果葉黃酮類物質(zhì)提取率的影響。 【【具體實(shí)施方式】】
[0022] 為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述說明，申請(qǐng)人給出了如下幾個(gè)實(shí)施例。需要說明的 是，本發(fā)明各實(shí)施例中所采用到的材料與試劑為：芒果葉（采自福建泉州師范學(xué)院校園）； 蘆丁（AR南京澤朗醫(yī)藥有限公司）；槲皮素（AR南京澤朗醫(yī)藥有限公司）；芒果苷（AR南京 澤朗醫(yī)藥有限公司）；纖維素酶（BR上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；100-200目柱層析硅膠 粉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉、亞硝酸鋁、硝酸鋁、無水乙酸鈉、甲醇、乙酸乙 酯、石油醚、乙酸、95 %乙醇、無水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br>[0023] 另外，本發(fā)明中涉及到的黃酮類化合物測(cè)定所采用的方法如下：
[0024] a、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用60%乙醇配制0. lmg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，而后分別取0. 0、 0· 5、1· 0、2· 0、3· 0、4· 0、5· OmL標(biāo)準(zhǔn)液于IOmL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0· 3mL，放置6min后 加入10%硝酸鋁0. 3mL，放置6min，再加4%氫氧化鈉2mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻， 放置IOmin后于510nm處測(cè)定吸光度，以試劑空白對(duì)照。依據(jù)測(cè)得的結(jié)果，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 見圖1 (橫坐標(biāo)代表蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)代表分光光度法所測(cè)得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 的吸光度A)，回歸得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度A與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度C(mg/mL)關(guān)系方程為 A=IL 503C+0. 0040 (R2= 0. 9992) 〇
[0025] b、芒果葉提取液黃酮類化合物含量測(cè)定及提取率計(jì)算：
[0026] 取0. 3mL芒果葉粗提取液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于IOmL容量瓶中，按照上述步驟a的操 作測(cè)定樣品的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出芒果葉提取液黃酮類物質(zhì)濃度。按下式計(jì) 算出黃酮類物質(zhì)提取率。
[0027] X(%) = CxV2xl° x ]〇〇〇/" L J M x Vi x 1000
[0028] 式中，X為黃酮提取率，C為根據(jù)吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出的提取液中黃酮類 物質(zhì)濃度（mg/mL) ;M為芒果葉樣品質(zhì)量（g) W1為提取液測(cè)定用試樣體積（mL) ;V2為提取 液總體積（mL) ; 10為測(cè)定體系體積（mL) ; 1000為g換算為mg。
[0029] 實(shí)施例1本發(fā)明提取方法的具體操作
[0030] I. 1芒果葉的預(yù)處理
[0031] 將鮮芒果葉采摘后洗凈，置于60°C烘箱中烘干，之后進(jìn)行粉碎，并過50目篩，得干 燥的芒果葉粉末。置于干燥器中備用。
[0032] 1. 2、纖維素酶輔助有機(jī)溶劑超聲提取芒果葉黃酮類物質(zhì)
[0033] 稱取步驟I. 1所得干燥的芒果葉粉末3g，加入60mL pH為5. 1的75%乙醇溶液， 之后再加入6. Omg纖維素酶，接著于55°C條件下浸泡酶解即水浴反應(yīng)70min，然后在100W 功率下超聲40min，真空抽濾得芒果葉黃酮類物質(zhì)粗提取液，通過前述黃酮類化合物測(cè)定方 法測(cè)粗提取液中黃酮含量并算出提取率。
[0034] 1. 3、硅膠柱層析純化芒果葉提取物得芒果苷和槲皮素
[0035] 將步驟1. 2所得芒果葉黃酮類物質(zhì)粗提液過硅膠層析柱分離純化，具體地：取適 量在IKTC烘箱中活化Ih后的硅膠粉末到燒杯中，與石油醚-乙酸乙酯-甲醇-乙酸（體 積比為1:4:0. 5:0. 5)混合液充分混合，混合時(shí)不斷攪拌，排出硅膠中的氣泡；然后采用濕 法裝柱，把硅膠裝到2. 6 X 30cm普通玻璃層析柱中，裝好平衡后上樣，接著向柱子中加入不 同梯度的洗脫劑梯度洗脫，各梯度洗脫劑分別依次為：體積比為1:4:0. 5:0. 5的石油醚-乙 酸乙酯-甲醇-乙酸、體積比為1:5:0. 5:0. 5的石油醚-乙